마우스의 실험 세균성 폐렴의 유도 및 표현형에 대한 비 침습적 및 기술적 비 집약적 인 방법

이 실험 프로토콜의 전반적인 목표는 마우스에서 세균성 폐렴을 유발하고 폐에서 생체 내 숙주 방어 반응을 정량화하기 위한 비침습적이고 기술적으로 집약적이지 않은 절차를 제공하는 것입니다. 이 방법은 감염성 질환 및 면역학 분야에서 감염에 대한 숙주 반응을 제어하는 유전자 및 분자 경로에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 폐 감염 방법의 주요 장점은 기술적 단순성입니다.

이를 통해 폐 시술에 대한 전문 지식이 거의 없는 실험실에서도 폐 선천성 면역 반응을 연구할 수 있습니다. 생물 안전성 레벨 2 시설에서 K.폐렴의 글리세롤 스톡을 해동하고 박테리아 1ml를 50mL의 트립틱 소이 육수가 들어 있는 500ml 배양 플라스크로 옮깁니다. 현탁액 배양을 섭씨 37도 및 200-225RPM에서 밤새 배양합니다.

다음날 아침, 50ml의 Tryptic Soy Broth가 들어 있는 새 플라스크에 1-5ml의 박테리아 배양액을 희석하고 셰이커에서 섭씨 37도에서 추가로 2.5시간 동안 배양하여 로그 단계를 달성합니다. 두 번째 배양이 끝나면 두 번째 배양에서 1ml의 박테리아를 원심분리를 위해 1.5ml 튜브로 옮깁니다. 팔레트를 방해하지 않고 상층액을 제거하고 1ml의 멸균 식염수에 박테리아를 부드럽게 재현탁시켜 세 번 세척합니다.

세 번째 세척 후 박테리아를 다른 1ml의 멸균 식염수에 다시 부유시키고 접종물의 로그 단위 연속 희석을 설정합니다. 일회용 큐벳에서 1-10 및 1-100 희석액 중 1 밀리리터를 복제하여 세척 된 K.폐렴의 OD600을 측정합니다. 1.0의 OD600은 밀리리터당 10의 8번째 CFU의 4-7에 대략 해당합니다.

각 희석액에서 박테리아의 농도를 계산한 후, 8주에서 12주 된 수혜 동물 당 50-60마이크로리터의 멸균 식염수에 원하는 접종물 CFU 용량을 재현탁합니다. 박테리아를 동물에게 전달하려면 투여 접종물을 P200 피펫 팁에 넣고 마취된 마우스를 기울어진 플렉시글라스 보드의 못 사이에 뻗어 있는 고무 밴드에서 상악 앞니에 매달려 있는 반쯤 누운 누운 자세로 놓습니다. 뭉툭하고 융기가 없는 집게를 사용하여 혀를 부드럽게 옆으로 당기고 혀나 구강 인두에 외상을 입히지 않도록 주의하면서 동물의 구강에 투여량을 넣습니다.

혀를 움츠러든 채로 장갑을 낀 손가락으로 코를 부드럽게 막아 집이 두세 번 숨을 들이쉴 때까지 한다. 구강에 액체가 보이지 않으면 마우스가 회복하는 동안 콧구멍이 막히는 것을 방지하기 위해 접종 보드에서 누운 자세로 케이지로 마우스를 옮깁니다. 흉골 바로 아래에 세로로 자릅니다.

그런 다음 집게로 흉골을 들어 올려 횡격막을 긁어 폐가 흉강 안으로 다시 떨어지도록 합니다. 혈관 구조 양쪽의 흉강을 통해 목을 통해 위로 절개를 계속합니다. 기관이 보이면 목 중앙을 조심스럽게 자르고 조직을 옆으로 밀어 주변 혈관이 손상되지 않도록 합니다.

이제 머리에서 약 1/4 정도 떨어진 곳에 기관을 긁어내고, 1밀리리터의 PBS가 미리 장전된 1밀리리터 주사기에 부착된 캐뉼라를 꼬리 쪽으로 기관에 삽입합니다. 볼륨을 폐 안으로 천천히 밀어 넣어 모든 엽이 팽창하도록 합니다. 그런 다음 주사기로 볼륨을 다시 당겨 빼내고 수집된 세척액을 얼음 위에 15ml 튜브에 모읍니다.

적절한 실험 종료 지점에서 좌심실에서 혈액을 채취하여 혈액 응고를 방지하기 위해 헤파린 처리된 튜브로 이식합니다. 그런 다음 5밀리리터의 PBS가 들어 있는 15밀리리터 튜브에서 모든 폐엽을 채취하고 2밀리리터의 PBS가 들어 있는 15밀리리터 튜브에서 비장을 채취합니다. 다음으로, 샘플당 개별 일회용 균질기를 사용하여 얼음 위에서 조직을 침식한 다음 조직 슬러리를 연속적으로 희석합니다.

단일 TSA 플레이트의 별도 면에 희석액을 복제하여 플레이트하고 샘플을 잠시 건조시킵니다. 그런 다음 플레이트를 뒤집고 섭씨 37도의 정적 인큐베이터에서 밤새 샘플을 배양하고 플레이트의 양쪽과 다음 날 아침 각 희석액에서 박테리아 콜로니의 평균을 구합니다. K.pneumoniae의 2000 CFU에서 생쥐는 일반적으로 감염 후 12-24시간 후에 임상 증상을 보이기 시작합니다.

48시간에서 72시간 이내에 많은 동물들이 질병 및 질병 증상을 보이며 일반적으로 평균 20%의 체중 감소가 선행됩니다. 그러나 LD50 투여량은 실험군 내에서 상대적으로 증가한 생존율과 감소된 생존율을 모두 검출할 수 있게 해주며, 장기 연구에 선호될 수 있습니다. K.pneumoniae에 의한 하기도 감염은 감염 후 6시간 이내에 백혈구가 기도로 강력하게 유입되는 것이 특징이며, 이는 24시간까지 최고조에 달하며 대부분 호중구에 의해 나타납니다.

사이토카인은 K.폐렴에 감염된 후 24시간 및 48시간 이내에 기관지폐포 세척액에서 검출될 수 있으며, 폐 미세환경과 폐의 세균 침입에 대한 면역 자가 동원에 대한 통찰력을 제공합니다. 폐, 혈액 및 비장의 박테리아 부하도 감염 후 24시간에서 48시간 사이에 급격히 증가합니다. 폐 감염의 구인두 흡인법은 일단 숙달되면 제대로 수행된다면 쥐 한 마리당 1-2분 만에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 과도한 흡인 볼륨을 사용하지 않도록 기억하는 것이 중요합니다. 50-60마이크로리터 용량은 일반적으로 8-12주 된 마우스에 적합합니다. 이 절차에 따라 폐 및 말초 조직에 다양한 방법을 수행하여 병원체 제거에서 면역 반응을 정량화할 수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 구인두 병원체 전달을 통해 실험적 세균성 폐렴을 유도하는 방법과 마우스의 병원체 부담을 결정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 미생물을 다루는 작업은 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 기본 BSL-2 예방 조치와 관행을 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.