마우스의 실험 세균성 폐렴의 유도 및 표현형에 대한 비 침습적 및 기술적 비 집약적 인 방법

본 실험 프로토콜의 전반적인 목표는 마우스에서 세균성 폐렴을 유도하고, 이후 폐 내의 생체 내(in vivo) 숙주 방어 반응을 정량화하기 위한 비침습적이고 기술적 부담이 적은 절차를 제공하는 것입니다. 이 방법은 감염성 질환 및 면역학 분야에서 감염에 대한 숙주 반응을 조절하는 유전자와 분자 경로에 관한 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 폐 감염 방법의 주요 장점은 기술적인 간편함에 있습니다.

이를 통해 폐 절차에 대한 전문 지식이 부족한 실험실에서도 폐의 선천성 면역 반응을 연구할 수 있습니다. 생물 안전 2등급(biosafety level two) 시설에서 K.pneumoniae의 글리세롤 스톡을 해동하고, 박테리아 1 mL를 50 mL의 Tryptic Soy Broth가 들어있는 500 mL 배양 플라스크에 옮깁니다. 해당 현탁 배양액을 37 °C, 200~225 RPM에서 하룻밤 동안 배양합니다.

다음 날 아침, 1~5 mL의 박테리아 배양액을 50 mL의 Tryptic Soy Broth가 들어 있는 새 플라스크에 희석하고, 로그 상(log phase)에 도달하도록 진탕 배양기에서 37 °C로 2.5시간 더 배양합니다. 2차 배양이 끝나면, 2차 배양액에서 박테리아 1 mL를 취해 원심분리를 위해 1.5 mL 튜브로 옮깁니다. 펠렛이 흐트러지지 않도록 상층액을 제거하고, 멸균 식염수 1 mL로 박테리아를 부드럽게 재현탁하여 총 3회 세척합니다.

세 번째 세척 후, 박테리아를 또 다른 1 mL의 멸균 생리식염수에 재현탁하고, 접종액의 로그 단위 단계 희석액을 준비합니다. 세척된 K.pneumoniae의 OD600을 측정하기 위해 1:10 및 1:100 희석액 1 mL를 일회용 큐벳에 각각 두 번씩 분주하여 측정합니다. OD600 1.0은 대략 mL당 4~7 × 10⁸ CFU에 해당합니다.

각 희석액의 박테리아 농도를 계산한 후, 8~12주령의 수신 동물 한 마리당 50~60 µL의 멸균 생리식염수에 원하는 접종 CFU 용량을 재현탁합니다. 박테리아를 동물에게 투여하려면, 투여용 접종액을 P200 피펫 팁으로 흡입하고, 마취된 마우스를 경사형 Plexiglas 보드의 핀 사이에 연결된 고무줄에 상악 절치로 매달아 반-눕힌 상태의 배와위(semi-recumbent supine position)로 배치합니다. 끝이 뭉툭하고 홈이 없는 핀셋을 사용하여 혀를 조심스럽게 옆으로 당기고, 혀나 구강 인두에 외상을 입히지 않도록 주의하며 동물의 구강 내에 용량을 투여합니다.

혀를 뒤로 당긴 상태에서, 마우스가 두세 번 흡입할 때까지 장갑을 낀 손가락으로 코를 부드럽게 막습니다. 구강 내에 액체가 보이지 않을 때, 마우스가 회복되는 동안 콧구멍이 막히는 것을 방지하기 위해 마우스를 접종 보드에서 케이지로 똑바로 누운 자세로 옮깁니다. 흉골 바로 아래를 세로로 절개합니다.

그 다음, 핀셋으로 흉골을 들어 올린 후 횡격막에 작은 절개를 넣어 폐가 흉강 안으로 다시 들어가게 합니다. 혈관 양측을 따라 흉강 위쪽으로 절개를 계속 진행하고 목 부분까지 절개합니다. 기관이 보이면 목 중앙을 조심스럽게 절개하고, 주변 혈관이 손상되지 않도록 조직을 옆으로 밀어냅니다.

이제 머리에서 약 4분의 1 지점의 기관을 절개하고, 1 mL의 PBS가 미리 충전된 1 mL 주사기에 연결된 캐뉼라를 기관 내로 꼬리 방향으로 삽입합니다. 모든 폐엽이 팽창하도록 PBS를 폐 속으로 천천히 주입합니다. 그 후 주사기로 해당 용액을 다시 뽑아내어 수집된 세척액을 얼음 위의 15 mL 튜브에 모읍니다.

적절한 실험 종료 시점에 좌심실에서 혈액을 채취하여 응고를 방지하기 위해 헤파린 처리된 튜브에 옮깁니다. 그런 다음 5 mL의 PBS가 들어 있는 15 mL 튜브에 모든 폐엽을, 2 mL의 PBS가 들어 있는 15 mL 튜브에 비장을 각각 수확합니다. 다음으로, 샘플당 개별 일회용 균질기를 사용하여 얼음 위에서 조직을 마쇄한 후, 조직 슬러리를 단계별로 희석합니다.

희석액을 단일 TSA 플레이트의 서로 다른 면에 두 번씩 도말하고, 시료를 잠시 건조시킵니다. 그 다음 플레이트를 뒤집어 37 °C 정적 배양기에 넣고 하룻밤 동안 배양한 후, 다음 날 플레이트의 양면과 각 희석 단계에서 생성된 세균 콜로니의 평균값을 구합니다. K.pneumoniae 2000 CFU 농도에서 마우스는 일반적으로 감염 후 12~24시간 사이에 임상 증상을 나타내기 시작합니다.

48~72시간 이내에 많은 동물들이 질병 및 이환 증상을 보이며, 이는 통상적으로 평균 20%의 체중 감소가 선행됩니다. 그러나 LD50 용량은 실험군 내에서 상대적으로 증가하거나 감소한 생존율을 모두 검출할 수 있게 하여, 장기 연구에 더 적합할 수 있습니다. K.pneumoniae에 의한 하기도 감염은 감염 후 6시간 이내에 기도로 백혈구가 강력하게 유입되는 것이 특징이며, 이는 24시간에 정점에 도달하고 주로 호중구로 구성됩니다.

K.pneumoniae 감염 후 24시간과 48시간 시점 모두에서 기관지폐포 세척액 내 사이토카인을 검출할 수 있으며, 이를 통해 폐 미세환경과 세균 침입에 반응하는 면역 자가 모집에 대한 통찰을 얻을 수 있습니다. 폐, 혈액 및 비장의 세균 수치 또한 감염 후 24시간에서 48시간 사이에 급격히 증가합니다. 구강인두 흡인법을 통한 폐 감염 유도 방식은 숙달될 경우, 적절히 수행한다면 마우스 한 마리당 단 1~2분 만에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 수행할 때, 과도한 흡입량을 사용하지 않도록 주의하는 것이 중요합니다. 일반적으로 8~12주 된 생쥐의 경우 50~60 µL의 양이 적당합니다. 이 절차 이후, 폐 및 말초 조직에 대해 다양한 방법을 시행하여 병원체 제거 과정에서의 면역 반응을 정량화할 수 있습니다.

이 영상을 시청한 후, 귀하는 구인두 경로의 병원균 투여를 통해 실험적 세균성 폐렴을 유도하고 마우스의 병원균 부하를 측정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 미생물을 다루는 작업은 위험할 수 있으며, 이 절차를 수행하는 동안 항상 기본적인 BSL-2 예방 조치 및 수칙을 준수해야 함을 잊지 마십시오.