Name: 마우스의 실험 세균성 폐렴의 유도 및 표현형에 대한 비 침습적 및 기술적 비 집약적 인 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: 배우세요 마우스에서 비침습적 기술로 세균성 폐렴을 유도하고 폐 선천성 면역 반응을 정량화하는 방법입니다. K. pneumoniae를 이용하여 감염 질환과 면역학 연구에 활용할 수 있습니다.

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이 작업은 미국 국립보건원(National Institutes of Health), 국립환경보건과학연구소(National Institute of Environmental Health Sciences, Z01 ES102005)의 교내 연구 프로그램(Intramural Research Program)의 지원을 받았습니다.

모든 실험은 동물 관리 및 NIEHS의 사용위원회의 검토 후 동물 복지법과 동물 애호 관리 및 실험 동물의 사용에 미국 공중 보건 서비스 정책에 따라 수행 하였다. K. 1. 준비 폐렴 문화 주의 : 바이오 안전성 레벨 2 (BSL2) 후드 또는 다른 BSL2 지정된 지역의 모든 단계를 수행하고 연구소 BSL2 가이드 라인에 따라 폐기물을 폐기합니다. <ol><li> K.의 서스펜션 성장 폐렴, 세균의 글리세롤 주식을 해동 및 K. 1 ㎖를 전송하여 작업 문화를 접종 500 ml의 이상 플라스크에서 트립신 간장 국물 (TSB)의 50 ㎖에 폐렴 재고. </li><li> 배양 로그 상 K. 900 μl를 추가하여 글리세롤 주식을 폐렴 멸균 글리세롤 100 ㎕ 및 -20 ° C 또는 -80 ° C ~에서 동결. 장기 저장을 위해, -80 ° C 권장합니다. </li><li> s의 문화 박테리아밤새 진탕 플라스크에서 1.1 TEP - 200-225 rpm.In 로그 상 성장을 촉진하기 위해 37 ℃에서 (14-18 시간)를 아침에 50 ㎖ TSB를 함유하는 플라스크에이 밤새 배양 1-5 mL로 희석 ~ 2.5 시간 동안 진탕 37 ° C에서 다시 배치합니다. </li><li> K. 1 ㎖로 이동 2 분 동안 7,500 XG에 1.5 ML 튜브와 스핀에 마지막 단계에서 폐렴 문화. 흰색 펠렛을 볼 수 있어야합니다. 부드럽게 멸균 생리 식염수 1 ㎖에 피펫으로 박테리아를 재현 탁, 펠렛을 방해하지 않고 뜨는을 제거하고 2 분 동안 7,500 XG에 다시 스핀. <ol><li> 이 세척 단계의 2 배를 수행 멸균 생리 식염수 1 ml의 최종 세척 펠릿을 가져. </li></ol></li><li> 이 깔끔한 접종의 로그 현명한 연속 희석을 수행합니다. 예를 들어, 직렬 10 -1 -10 -9 희석 시리즈를 만들기 위해 멸균 생리 식염수 3.6 ml의로 접종의 400 μl를 추가합니다. </li><li> 세척 K.의 OD 600 결정 폐렴의 1 ml에 두어1:10 1 : 멸균 식염수 제 블랭킹 일회용 큐벳하고 OD 600 (100)로 측정 희석. 정확성을 보장하기 위해 중복 측정한다. 1.0의 OD (600)는 4-7 × 10 8 CFU / ㎖와 거의 동일합니다. OD 및 CFU 사이의 관계가 / ㎖ 선형하지 않을 수 있습니다. <ol><li> K.의 농도를 계산하기 위해 희석에서 OD (600)를 사용하여 폐렴의 OD를 적용 : CFU / ㎖의 위의 변환 및 인수 분해를 희석. </li></ol></li><li> K.를 사용하여 폐렴 농도 (아래 참조) 마우스에 전달하는 &lt;100 μL 부피 원하는 접종 CFU 도즈를 제조 하였다. </li><li> 또한 10-6 -10 -9 희석액 100 ㎕ 및 RT에서 개별 트립신 대두 한천 (TSA) 플레이트 상에 멸균 생리 식염수 100 ㎕를 접시. 37 ℃에서 밤새 인큐베이션하고 실험에 사용하고, 오염 제어하는 ​​정확한 농도를 계산하기 위해 박테리아 콜로니를 열거. 참고 : 최종 접종의 실제 세균 농도는 500 CFU / 흡수에 의해 예측 ml의 ± 수있다. 개인의 경험을 바탕으로 CFU / ㎖ 변환 : 경험적으로 OD 600 재조정, 마우스의 생체 내에서 사용하기 전에 파일럿 연구에서 CFU / ㎖ 관계 : 실험자는 이상적으로 OD (600)를 확인해야합니다. </li></ol> K. 2. 쥐 기관 내 (IT) 흡인 구강 인두에서 폐렴 <ol><li> 그 쥐를 확인하는 고유 꼬리 마크, 문신, 또는 기타 승인 된 식별자에 의해 식별된다. </li><li> 절차를 신속히 처리하기 위해 이소 플루 란에서 쥐를 제거하기 전에 P200 피펫을 사용하여 박테리아의 접종을 투여까지 그립니다. 그것은 열망과 최상의 결과를 얻으려면, 오버 플로우를 방지하기 위해 &lt;100 μL의 볼륨을 사용합니다. 여기서, K. 2000 CFU / 50 μl를 사용 폐렴. </li><li> 이소 플루 란 가스 (1 L / 분의 유량으로 예를 들면, 2 % 이소 플루 란)와 투명한 챔버 또는 instit 따라 마우스를 마취utional 가이드 라인. 함께 마취 된 마우스의 수는 실험자의 쾌적함 수준 한번에 전형적으로 1-2에 의해 결정된다. 호흡을 관찰하고 심호흡을 볼 수 있으며 2 ~ 3 초이 호흡 사이에 계산 될 수있다 일단 마취의 수준을 확인합니다. 주 : 휘발성 (흡입) 마취제 가능한 교란 영향에 대한 우려가있는 경우, 마취 케타민 / 자일 라진의 복강 내 주사로 대신 이루어질 수있다. 상술 한 방법에 깊은 마취는 몇 분 정도. 더 장기간 마취 유도되면, 안연고는 안구 건조를 방지하기 위해 사용되어야한다. </li><li> 마우스가 마취되면, 경사 플렉시 글라스 보드의 못 (그림 1) 사이에 뻗어 고무 밴드에서 상악 절치에 의해 중단 semirecumbent 부정사 위치에 놓습니다. </li><li> 부드럽게 P200의 pipett와 구강에 무딘 비 래치의 집게 한 쌍의 예금 복용량 옆으로 마우스 혀를 당겨이자형. 혀 또는 구강 인두 하나에 외상을 유발하지 않도록 세심한주의를 운동. </li><li> 수축 혀를 유지하면서 마우스를 흡입 할 때까지 부드럽게 장갑을 낀 손가락으로 코를 폐색. 마우스 둘 이상의 흡입제를 가지고 있으며, 어떠한 액체 구강 보이지까지 코를 덮도록 계속. 코를 커버하는 마우스는 의무적 코 숨을 쉬는만큼 마우스, 폐에 세균을 흡입 할 수 있도록하는 데 도움이됩니다. </li><li> 접종 보드에서 마우스를 제거하고 마우스가 마취에서 회복되는 동안 콧 구멍을 차단하는 침구 또는 파편을 방지하기 위해 뒷면에 마우스를 배치, 새장으로 돌아갑니다. </li><li> 일단 모든 마우스는 투여 된 마취에서 해제 한 K. 투여 된 경우에만 마우스를 포함하는 칸막이 / 방에서 집 마우스 48 시간 게시물 감염을 넘어 경우 폐렴. 체중을 포함, 매일 쥐를 모니터링합니다. </li><li> 마우스가 48을 넘어 할 수있는 경우 매일 매시 및 / 또는 보조 열을 사용하여시간. </li></ol> 3. 기관지 세척액 (BALF) 수집 및 분석 <ol><li> 제도적 지침에 따라 쥐를 안락사. 이 CO 2 흡입 자궁 전위와 관련된 폐 합병증을 피할 여기, 150 ㎎ / ㎏ 나트륨 펜토 바르 비탈 또는 방혈 다음에 상업 안락사 솔루션의 등가 선량의 독극물 주사를 사용합니다. </li><li> 뒷면에 위치 마우스와 특히 가슴과 목 영역에 70 % 에탄올로 모피를 분사하여 마우스를 소독. </li><li> 다음 집게로 흉골을 잡고, 바로 흉골 아래에 세로 컷을 확인, 닉은 폐를 허용 다이어프램은 흉강에 다시 가을. 기관을 노출, 혈관의 양쪽에 흉강을 통해 잘라 후 목을 통해입니다. </li><li> 기관이 양쪽에 세로 근육으로 둘러싸여으로 조심스럽게 같이 중간의 실수로 측면에 조직을 밀어이 기관에 혈액을 소개 할 수있는 주변의 혈관을 절단 방지 할 수 있습니다. 혈관이 다친 경우, 이전 기관 루멘에 액세스하는 거즈와 주변 지역을 청소하십시오. </li><li> 닉 기관 다운 헤드에서 길의 약 ¼을 수술 용 가위 또는 바늘을 사용하여 꼬리 쪽 기관에 1X 인산 완충 식염수 (PBS) 1 ml의 미리로드 1 mL의 주사기에 부착 된 캐 뉼러를 삽입한다. 사용 마우스는 연령이나 여성 8 주 &lt;경우, 600-800 μL에 lavaging 볼륨을 줄일 수 있습니다. </li><li> 모든 로브가 팽창하고 배를 반복, 주사기와 함께 다시 밖으로 볼륨을 풀 수 있도록 천천히 폐에 볼륨을 누릅니다. PBS는 콧 구멍에서 나오는 경우 캐 뉼러는 기관에 충분히 밀어되지 않았거나 인플레이션이 너무 빨리 발생한다. 폐이 잘 팽창되지 않은 경우 또는, 캐 뉼러 너무 멀리 밀어 된, 약간 철회. </li><li> 얼음에 15 ML 튜브에서 풀링 세척를 수집합니다. </li><li> 회전5 분 1,200 XG에 영공의 세척 유체는 1.5 ML 튜브에 뜨는 수집 및 -80 ° C에서 동결. 그 후, 단백질, 사이토 카인 등에 대한 다양한 생화학 적 분석의 측정에 뜨는 (즉, BALF)를 사용합니다. 펠렛은 기관지 공간에서 세포를 나타냅니다. </li><li> 적혈구 (적혈구)의 색상에 기초하여 세포 펠렛에서 명백한 경우, 1X PBS 5ml를 첨가하여 1 분간 ACK 용해 완충액 1 ㎖로를 Lyse는 분해 반응을 중단하고 버퍼에 희석. ACK 용해 버퍼 처리 여부 역시 동일하게 모든 표본을 처리합니다. </li><li> 스핀 셀을 5 분 동안 1,200 XG에서, 상청액을 가만히 따르다 및 1X PBS 1 ml의 세포를 가져온다. </li><li> 총 영공 세포의 열거에 대한 혈구에 소용돌이 카운트 세포. </li><li> 세포의 밀도를 바탕으로 (80 감염된 마우스 μL와 순진 마우스 ~ 150 ~)은 cytospin 원심 분리기에서 슬라이드 챔버에 약 80-150 μl를 추가합니다. 스핀 셀현미경 상으로의 세포 차동 인구를 결정하기 위해 다음 염색을 위해 슬라이드. </li><li> 세포가 하룻밤 슬라이드에 건조하도록 허용합니다. 얼룩 얼룩 2 슬라이드를 정착의 7 배, 얼룩 1에서 9 번, 7 번 찍기로 트라이 얼룩 (예를 들어, 헤마 (3) [표 참조])와 세포 (얼룩 사이에 린스), 그리고 건조 할 수 있습니다. 얼룩 건조 후, 수동으로 커버 슬립 슬라이드 및 현미경에 의한 차이를 계산합니다. 일반적으로, 호중구 및 단핵 세포 / 대 식세포는 쉽게 크기 및 핵의 형태에 의해 구별된다. </li></ol> 4. 폐 및 주변 조직에 세균 부하 결정 <ol><li> 시작하기 전에 : 폐와 비장에 대한 1X PBS 900 ㎕의 혈액에 대한 1X PBS의 90 μl를 희석 튜브를 준비합니다. 박테리아를 배양하고, 실온에서 설정 라벨 플레이트; 따라서, 조직이 수집 한 후 시간이 박테리아 성장을위한 균질화 및 도금 사이 최소화됩니다. 참고 : 인해 이종 deposi에흡인 발생할 수 있습니다 폐에 세균 기, 각각의 마우스는 총기도 세포 수 또는 총 (양자) 폐 세균 부담 중 하나의 분석을 위해 사용하는 것이 좋습니다. </li><li> 단계 3.1에 따라 마우스를 안락사이어서 응고를 방지하기 위하여 헤파린 튜브에 배치 좌심실로부터 혈액을 수집한다. 1X PBS 2 ㎖로 비장과 배치 제거하여 1X PBS 5 ㎖를 포함하는 15 ML 튜브의 모든 폐 로브와 장소를 제거합니다. 얼음에 튜브를 놓습니다. 각 조직 / 마우스 사이의 에탄올로 악기를 청소주의하십시오. </li><li> 바람직하게는, 각 샘플 사이에 변경 될 수 일회용 균질하여, 얼음 조직 균질화. 일회용 균질 팁 실험 사이의 재사용을 위해 멸균 할 수 있습니다. </li><li> 조직이 균질화되면, 직렬 희석 및 플레이트를 수행합니다. 플라스틱에 분할 선을 그려서 하나의 TSA 접시에 중복 주어진 조직 / 희석의 플레이트 샘플. 도금 및 디lution 제안은 다음과 같습니다 (모든 경우에, 시료 10 μl를 접시에 퍼져)과 24 시간 후 감염 부검을 기반으로합니다. 48-72 시간 샘플을 분석하는 경우, 희석 더 많은 수의 나중 시점에서 세균 부담 증가로 인한 도금 될 필요가있다. <ol><li> 혈액 - 멸균 1X PBS의 90 μL에 혈액의 10 μl를 추가하여 1:10 희석. 플레이트 단정하고 중복 1:10 희석 샘플. 혈액이 도금 된 후 10 분 사이토 카인과 케모카인의 측정을 위해 플라즈마를 추출하기 위해, 9300 XG에 잔류 혈액을 회전. </li><li> 직렬 멸균 1X PBS 900 μL로 균질화 폐의 100 μl를 추가하여 100 : 폐를 들어 - 1 - 1:10 희석. 플레이트 깔끔한 균질 중복의 모든 희석. </li><li> 비장를 들어 1 - 희석 : 10-1 : (100)를 직렬로 멸균 1X PBS 900 μL로 균질화 비장의 100 μl를 추가하여. 플레이트 깔끔한 균질 중복 모두 희석. </li></ol></li><li> 확산 샘플을 간략하게 건조 할 수 있습니다. </li&gt; <li> 밤새 정적 37 ° C 배양기에서 TSA 판과 장소를 반전. </li><li> 상기 플레이트의 양측에서 각각 희석로부터 세균 콜로니를 평균하여 정착하고 박테리아의 수를 결정한다. 폐 5 mL 및 비장 2 ml의 초기 희석의 요인은 전체 조직 CFUs를 결정합니다. </li></ol>

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저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

세균성 폐렴의 쥐 모델은 폐 호스트 방어 반응에 중요한 통찰력을 제공하고, 유전자 타겟팅 및 생체 생물학 및 약리학 적 개입에 협력. 위대한 진보는 감염된 영공 10, 11에 호중구 모집을 지배하는 케모카인 및 접착 분자에 대한 우리의 이해에 특히되었습니다. 폐렴의 생체 모델을, 셀 기반 또는 대체 접근 방식과는 달리, 또한 내분비에 중요한 통찰력을 제공하고 있습니다 감염된 폐 및 간 (급성 위상 응답)과 같은 다른 기관 사이에 발생하는 통신 (12)와 부신 (스트레스 글루코 코르티코이드) 13. 마지막으로, 생체 폐렴 모델에 의해 밝혀 중요한 임상 적 관련성이 높은 점은 성공적인 병원체 간격이 호스트의 성공에 동등하지 않다는 것이다. 많은 경우에서, overexuberant 면역 반응은 호스트의 죽음의 원인때문에 심지어는 성공 병원체 통관 8, 14의 얼굴에 과도한 와키 폐 손상에. ...

지역 사회 획득 폐렴은 예방 접종의 개선 및 항생제 전략 1, 2에도 불구하고 지난 40 년 동안 사망률이 거의 전반적인 변화, 미국의 감염으로 인한 사망의 주요 원인 남아있다. 보건 수준인지 진행의 부족에도 불구하고, 최근 몇 년 동안 극적인 진보 순방향 폐 감염 마우스 모델의 사용에 의해 가능하게 이러한 많은 단계와, 폐렴 분자 세포 병인에 대한 이해 만들어왔다. 마우스의 유전 취급 용이성은 쥐와 인간의 면역 시스템, 상업적으로 사용할 수있게 한 쥐의 표적 면역 시약의 광대 한 배열의 유사성은 함께 필드의 급속한 발전을 촉진했다. 문헌에 기술 세균성 폐렴의 마우스 모델은 일반적 병원균 접종 1 내지 4의 기술 경로에 의존했다 : I)을 에어로졸; ⅱ) INTRanasal 전달; ⅲ) 경구 전달; 및 ⅳ) 수술 기관 내 주입 (즉, 기관 절개술) 3. 감염의 모든 노선 장점과 단점 3 있습니다. oronasal 식물, 전신 마취에 대한 요구 사항의 혼합물 특히, 상대적으로 상부기도의 노출 가능성에서, 말초 폐에 전달 접종, 전달 된 병원균의 엽성 분포, 전문 기술 요구 사항 및 절차 사망률의 변동이 걸쳐 다양 구혼. 일반적으로 사용되는 경구 감염 기법, 또는 직접 후두 시각화 3-5 아래 &#39;블라인드&#39;(비 시각) 접근법을 통해 기관 내 (translaryngeal) 삽관을 포함한다. 두 방법 모두 강력한 반면, 상당한 훈련이 필요하며 또한 상부기도에 외상의 위험을 수행한다. 본 보고서에서, 우리는 승, 경구 감염의 기술적, 비 집약적 비 침습적, 저렴하고 빠른 방법을 설명이에 박테리아 (제공된 예에서 클레 브시 엘라 폐렴)을 흡인 (즉, 흡입)를 통해 폐에 전달 마취 된 쥐의 구강 인두로 피펫. 우리와 다른 사람은 성공적으로 6-9 흡인 성 폐렴 기술을 사용했다. 이 다양하고 쉽게 배울 폐 배달 방법은 사이토 카인과 다른 단백질, 병원체 관련 분자 (예를 들면, 리포 폴리 사카 라이드), 셀 (즉, 입양 전송)를 포함하여 폐, 많은 추가 비 부식성 요원의 전달에 확장 될 수있다 독소 (예컨대, 블레오 마이신). 중요한 기술적 사항을 논의에 더하여, 또한 하류 세균 클리어런스 측정 (즉, 집락 형성 단위 [CFU 상기 폐 및 말초 기관에서 정량) 백혈구를 포함한 폐렴 후속 호스트 응답을 평가하는 통합 정량 방법을 설명 영공에 축적.

<table><tbody><tr><td>Klebsiella pneumoniae, serotype 2</td><td>ATCC</td><td>43816</td><td></td></tr><tr><td>Tryptic soy broth</td><td>Becton Dickenson 211825</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Excel Safelet IV 카테터, 18 G x 1 1/4"</td><td>Claflin Medical Equipment</td><td>MEDC-031122</td><td></td></tr><tr><td>Hema 3 Solution 1</td><td>Fisher</td><td>23-122-937</td><td></td></tr><tr><td>Hema 3 Solution 2</td><td>Fisher</td><td>23-122-952</td><td></td></tr><tr><td>Hema 3 고정식</td><td>Fisher</td><td>23-122-929</td><td></td></tr><tr><td>27&frac12; 게이지 투베르큘린 주사기</td><td>Fisher</td><td>14-826-87</td><td></td></tr><tr><td>리튬 헤파린 플라즈마 수집기</td><td>Fisher</td><td>2675187</td><td></td></tr><tr><td>L자형 일회용 스프레더</td><td>Lab Scientific</td><td>DSC</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS, pH 7.4</td><td>자체 준비</td><td>사항 없음</td><td>증류수 (5 L), NaCl (40 g), KCl (1 g), Na2HPO4 (5.75 g), KH2PO4 (1 g)&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td></td><td>사내에서 n</td><td>/a</td><td>NH4Cl (4.145 g), KHCO3 (0.5 g), EDTA (18.6 mg)를 자체 준비하여 증류수와 pH 7.4로 최대 500ml를 준비합니다</td></tr></tbody></table>.

마우스의 실험 세균성 폐렴의 유도 및 표현형에 대한 비 침습적 및 기술적 비 집약적 인 방법

A Non-invasive and Technically Non-intensive Method for Induction and Phenotyping of Experimental Bacterial Pneumonia in Mice

지역 사회 획득 폐렴이 중요한 공중 보건 문제로 남아 있지만, 세균성 폐렴의 쥐 모델은 최근 기본 세포 및 분자 기전에 대한 우리의 이해에 중요한 임상 발전을 촉진하고있다. 생체 마우스 모델에서 호스트 방어 반응의 통합 생리학과 탄력성을 캡처 방식은 대안, 단순화 된 생체 접근 방식에 의해 공개되지. 여러 방법 폐내 에어로졸 포함 생쥐 박테리아의 접종, 비내 전달 &#39;블라인드&#39;및 가시 조건 경구 기관 내 삽관 한 경피 기관 내 삽관에 대한 문헌에 기술되어있다. 모든 방법은 상대적인 장점과 한계가 있습니다. 여기서, 우리는 상세히 마우스로 흡입 (즉, 흡입) 관련 박테리아의 기관 내 전달을위한 비 침습적 기술적 비 집약 저렴하고 빠른 방법을 서술동안 전신 마취하에 구강 인두로 피펫 감염성 접종의. 이 방법은 비 - 부식성 생물학 및 화학 물질의 다양한 폐 전달을 위해 사용되며, 심지어 폐 절차 최소한 이전 경험 실험실 학습 비교적 쉽게 할 수있다. 흡인 성 폐렴 방법을 설명하는 이외에, 우리는 또한, 특히, 생체 내 마우스 폐 선천성 면역 반응 후의을 분석하기위한 단계별 과정을 제공하는 박테리아 간극 감염된기도의 세포 성 면역 반응을 정량화하는 방법에 관한 것이다. 폐렴 평가에이 통합 간단한 방법은 폐의 선천성 면역에 따라 유전 적, 환경 적 조작의 효과를 신속하고 강력한 평가를 할 수 있습니다.

C57BL / 6 마우스 K. 2000 CFU에 감염되었다 폐에 인두 흡인을 통해 폐렴 43816 (혈청 형 2). 이 용량에서, 마우스는 일반적으로 임상 증상을 혼수, 프릴 모피, 및 5 ~ 10 % (그림 2A)의 체중 감소를 포함하여 12 ~ 24 시간 게시물 감염을 표시하기 시작합니다. 48 ~ 72 시간의 후 감염 내에서 마우스의 대부분은 일반적으로 감소 활동 구부리고 자세에서 20 %의 체중 감소 및 결과의 평균 앞에 자극에 응답을 감소 질병과 병적 증상을 보여줍니다. 오랜 기간의 연구는 K.의 낮은 복용량을 요구할 수있다 폐렴. K. 500 CFU 감염 폐렴 회수 및 체중 증가는 5-6 일 (도 2b)에 의해 처음 10-15 %의 중량 손실을 특징으로 3-5 D 감염 후 피킹 온화한 질병을 초래한다. ...

여러 가지 방법 마우스에서 세균성 폐렴 모델링 문헌에 기재되어있다. 여기서, 우리는 구강 인두로 피펫 세균 접종의 흡인 (즉, 흡입)를 통해 폐렴을 유도하기위한 비 침습적, 저렴하고 빠른 방법을 설명합니다. 폐 선천성 면역 반응의 평가를위한 다운 스트림 방법도 자세히 설명되어 있습니다.

Although community-acquired pneumonia remains a major public health problem, murine models of bacterial pneumonia have recently facilitated significant ...

본 실험 프로토콜의 전반적인 목표는 마우스에서 세균성 폐렴을 유도하고, 이후 폐 내의 생체 내(in vivo) 숙주 방어 반응을 정량화하기 위한 비침습적이고 기술적 부담이 적은 절차를 제공하는 것입니다. 이 방법은 감염성 질환 및 면역학 분야에서 감염에 대한 숙주 반응을 조절하는 유전자와 분자 경로에 관한 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 폐 감염 방법의 주요 장점은 기술적인 간편함에 있습니다.이를 통해 폐 절차에 대한 전문 지식이 부족한 실험실에서도 폐의 선천성 면역 반응을 연구할 수 있습니다. 생물 안전 2등급(biosafety level two) 시설에서 K.pneumoniae의 글리세롤 스톡을 해동하고, 박테리아 1 mL를 50 mL의 Tryptic Soy Broth가 들어있는 500 mL 배양 플라스크에 옮깁니다. 해당 현탁 배양액을 37 °C, 200~225 RPM에서 하룻밤 동안 배양합니다.다음 날 아침, 1~5 mL의 박테리아 배양액을 50 mL의 Tryptic Soy Broth가 들어 있는 새 플라스크에 희석하고, 로그 상(log phase)에 도달하도록 진탕 배양기에서 37 °C로 2.5시간 더 배양합니다. 2차 배양이 끝나면, 2차 배양액에서 박테리아 1 mL를 취해 원심분리를 위해 1.5 mL 튜브로 옮깁니다. 펠렛이 흐트러지지 않도록 상층액을 제거하고, 멸균 식염수 1 mL로 박테리아를 부드럽게 재현탁하여 총 3회 세척합니다.세 번째 세척 후, 박테리아를 또 다른 1 mL의 멸균 생리식염수에 재현탁하고, 접종액의 로그 단위 단계 희석액을 준비합니다. 세척된 K.pneumoniae의 OD600을 측정하기 위해 1:10 및 1:100 희석액 1 mL를 일회용 큐벳에 각각 두 번씩 분주하여 측정합니다. OD600 1.0은 대략 mL당 4~7 × 10⁸ CFU에 해당합니다.각 희석액의 박테리아 농도를 계산한 후, 8~12주령의 수신 동물 한 마리당 50~60 µL의 멸균 생리식염수에 원하는 접종 CFU 용량을 재현탁합니다. 박테리아를 동물에게 투여하려면, 투여용 접종액을 P200 피펫 팁으로 흡입하고, 마취된 마우스를 경사형 Plexiglas 보드의 핀 사이에 연결된 고무줄에 상악 절치로 매달아 반-눕힌 상태의 배와위(semi-recumbent supine position)로 배치합니다. 끝이 뭉툭하고 홈이 없는 핀셋을 사용하여 혀를 조심스럽게 옆으로 당기고, 혀나 구강

a-non-invasive-technically-non-intensive-method-for-induction

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

독감 바이러스에 동시 감염 asymptomatic 동안 침투 폐렴 구균 질환의 유도에 연루 요인 중...

사이 Synergism을 맡은 이후로 발광 생물 이미징을 사용하여 연쇄상 구균 pneumoniae</em유아 마우스에서>와 인플루엔자 바이러스

출처: 마덴스파허, J. H. 및 페슬러, M. B. 쥐에서 실험적 세균성 폐렴을 유도하고 표현형을 구분하는 비침습적이고 기술적으로 비집약적인 방법. J. Vis. 경험 (2016)이 영상은 감염된 쥐의 비장 내 박테리아 부하를 정량화하여 감염의 심각성을 평가하는 과정을 보여줍니다. 균질화된 비장은 연속적으로 희석되어 도판을 하여 총 박테리아 부하를 측정합니다. 그 결과 얻은 데이터는 전신 조직 내 숙주-병원체 상호작용에 대한 통찰을 제공합니다.

감염 연구를 위한 쥐 비장 내 박테리아 부하 평가

이 비디오는 삽관 및 폐엽에 박테리아 현탁액 설치를 통해 면역 능력이 있는 설치류 모델에서 폐 감염이 확립되는 것을 보여줍니다. 이 모델은 면역 능력이 있는 동물에서 항균 효능 연구를 가능하게 합니다.

면역 역량이 있는 설치류 모델에서 폐렴 연쇄상구균의 기관지 내 주입

폐렴 구균은 중증 지역 사회 획득 폐렴과 전 세계적으로 2 백만 이상의 죽음에 책임을 일으키는 주요 병원균이다. 적합성 또는 병독성에서 내포 세균성 요인의 영향은 생물 발광 박테리아를 이용한 급성 마우스 폐렴이나 균​​혈증 모델에서 실시간으로 모니터링 할 수있다.

생물 발광 박테리아를 사용하여 실시간으로 급성 폐렴 마우스 모델에서 폐렴 구균 독성 요인의 영향에 따라

병원균 감염에 대한 숙주 면역 반응은 긴밀하게 규제 과정이다. 생쥐의 리포 다당류 폐 노광 모델을 이용해서, 그 질병 병인과 관련된 복잡한 메커니즘은 고해상도 평가를 수행하는 것이 가능하다.

마우스의 호스트 면역 반응을 평가하기 위해 구인두 기관 내 PAMP 관리 및 폐포의 활용

우리는 쥐의 하기도에 헤모필루스 인플루엔자를 기관 내 접종하는 절차를 보여줍니다. 이것은 마우스 모델에서 기도 염증을 조절하는 신호 경로를 연구하는 데 매우 유용한 도구입니다.

의 내부 기관 관리<em&gt; 헤모필루스 인플루엔자</em&gt; 마우스 모델에서기도 염증을 연구하는

면역 능력이 있는 설치류에서 폐 감염을 확립하는 방법이 설명되어 있습니다. 숙련되면 이 방법을 빠르고 쉽게 수행하여 S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae 및 A. baumannii의 많은 분리물에서 안정적인 감염을 유도할 수 있습니다.

면역 적격 설치류에서 강력한 폐렴 모델에 대해 항균 효능을 평가하기<i&gt; S. 폐렴</i&gt;<i&gt; H. 인플루엔자</i&gt;<i&gt; K. 폐렴</i&gt;<em&gt; P. 녹농균</em&gt; 또는<em&gt;를했다. baumannii가</em

감염 성 폐 렴은 인간에서 가장 일반적인 감염 중 하나입니다. 적절 한 생체 내에서 모델은 질병 병 인을 이해 하 고 새로운 치료제의 효능을 테스트 중요 합니다. 이 murine oropharyngeal 포부 폐 염 모델 하나 pathogenesis 및 이러한 치명적인 감염에 대 한 새로운 치료를 확인할 수 있습니다.

호흡기 관련 및 병원-획득 세균성 폐 렴의 murine Oropharyngeal 포부 모델

여기 선물이 vivo에서 백신의 평가 위한 우아한 프로토콜 효과 호스트 면역 반응. 이 프로토콜은 바이러스 성, 세균성, 백신 모델 또는 기생 병원 균에 대 한 적응 될 수 있다.

호스트 병원 체 응답 및 쥐에 백신의 효능 평가

여기에서, 우리는 병원체 복구 및 전사체 분석에 선행된 더 낮은 호흡기관에 주입의 비침범성 경로를 제공함으로써 이차 세균성 폐렴 연구를 향상시키는 방법을 제시한다. 이러한 절차는 재현 가능하며 캐뉼라, 가이드 와이어 또는 광섬유 케이블과 같은 특수 장비 없이도 수행할 수 있습니다.

이차 세균성 폐렴의 뮤린 모델을 위한 정확한 병원균 전달 및 회복 시스템

이 원고는 생쥐에서 폐렴의 전염성 모델을 확립하고 손상 해결의 각각의 특성과 함께 박테리아 성장 및 기관 내 점안 방법을 설명합니다. 고차원 유세포 분석을 사용하여 면역 환경을 평가하는 새로운 접근 방식도 설명합니다.

폐렴의 해결을 평가하기 위한 실험모델

배우세요 마우스에서 비침습적 기술로 세균성 폐렴을 유도하고 폐 선천성 면역 반응을 정량화하는 방법입니다. K. pneumoniae를 이용하여 감염 질환과 면역학 연구에 활용할 수 있습니다.

마우스의 실험 세균성 폐렴의 유도 및 표현형에 대한 비 침습적 및 기술적 비 집약적 인 방법

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