Name: 마우스의 실험 세균성 폐렴의 유도 및 표현형에 대한 비 침습적 및 기술적 비 집약적 인 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: 배우세요 마우스에서 비침습적 기술로 세균성 폐렴을 유도하고 폐 선천성 면역 반응을 정량화하는 방법입니다. K. pneumoniae를 이용하여 감염 질환과 면역학 연구에 활용할 수 있습니다.

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이 작업은 미국 국립보건원(National Institutes of Health), 국립환경보건과학연구소(National Institute of Environmental Health Sciences, Z01 ES102005)의 교내 연구 프로그램(Intramural Research Program)의 지원을 받았습니다.

모든 실험은 동물 관리 및 NIEHS의 사용위원회의 검토 후 동물 복지법과 동물 애호 관리 및 실험 동물의 사용에 미국 공중 보건 서비스 정책에 따라 수행 하였다. K. 1. 준비 폐렴 문화 주의 : 바이오 안전성 레벨 2 (BSL2) 후드 또는 다른 BSL2 지정된 지역의 모든 단계를 수행하고 연구소 BSL2 가이드 라인에 따라 폐기물을 폐기합니다. <ol><li> K.의 서스펜션 성장 폐렴, 세균의 글리세롤 주식을 해동 및 K. 1 ㎖를 전송하여 작업 문화를 접종 500 ml의 이상 플라스크에서 트립신 간장 국물 (TSB)의 50 ㎖에 폐렴 재고. </li><li> 배양 로그 상 K. 900 μl를 추가하여 글리세롤 주식을 폐렴 멸균 글리세롤 100 ㎕ 및 -20 ° C 또는 -80 ° C ~에서 동결. 장기 저장을 위해, -80 ° C 권장합니다. </li><li> s의 문화 박테리아밤새 진탕 플라스크에서 1.1 TEP - 200-225 rpm.In 로그 상 성장을 촉진하기 위해 37 ℃에서 (14-18 시간)를 아침에 50 ㎖ TSB를 함유하는 플라스크에이 밤새 배양 1-5 mL로 희석 ~ 2.5 시간 동안 진탕 37 ° C에서 다시 배치합니다. </li><li> K. 1 ㎖로 이동 2 분 동안 7,500 XG에 1.5 ML 튜브와 스핀에 마지막 단계에서 폐렴 문화. 흰색 펠렛을 볼 수 있어야합니다. 부드럽게 멸균 생리 식염수 1 ㎖에 피펫으로 박테리아를 재현 탁, 펠렛을 방해하지 않고 뜨는을 제거하고 2 분 동안 7,500 XG에 다시 스핀. <ol><li> 이 세척 단계의 2 배를 수행 멸균 생리 식염수 1 ml의 최종 세척 펠릿을 가져. </li></ol></li><li> 이 깔끔한 접종의 로그 현명한 연속 희석을 수행합니다. 예를 들어, 직렬 10 -1 -10 -9 희석 시리즈를 만들기 위해 멸균 생리 식염수 3.6 ml의로 접종의 400 μl를 추가합니다. </li><li> 세척 K.의 OD 600 결정 폐렴의 1 ml에 두어1:10 1 : 멸균 식염수 제 블랭킹 일회용 큐벳하고 OD 600 (100)로 측정 희석. 정확성을 보장하기 위해 중복 측정한다. 1.0의 OD (600)는 4-7 × 10 8 CFU / ㎖와 거의 동일합니다. OD 및 CFU 사이의 관계가 / ㎖ 선형하지 않을 수 있습니다. <ol><li> K.의 농도를 계산하기 위해 희석에서 OD (600)를 사용하여 폐렴의 OD를 적용 : CFU / ㎖의 위의 변환 및 인수 분해를 희석. </li></ol></li><li> K.를 사용하여 폐렴 농도 (아래 참조) 마우스에 전달하는 &lt;100 μL 부피 원하는 접종 CFU 도즈를 제조 하였다. </li><li> 또한 10-6 -10 -9 희석액 100 ㎕ 및 RT에서 개별 트립신 대두 한천 (TSA) 플레이트 상에 멸균 생리 식염수 100 ㎕를 접시. 37 ℃에서 밤새 인큐베이션하고 실험에 사용하고, 오염 제어하는 ​​정확한 농도를 계산하기 위해 박테리아 콜로니를 열거. 참고 : 최종 접종의 실제 세균 농도는 500 CFU / 흡수에 의해 예측 ml의 ± 수있다. 개인의 경험을 바탕으로 CFU / ㎖ 변환 : 경험적으로 OD 600 재조정, 마우스의 생체 내에서 사용하기 전에 파일럿 연구에서 CFU / ㎖ 관계 : 실험자는 이상적으로 OD (600)를 확인해야합니다. </li></ol> K. 2. 쥐 기관 내 (IT) 흡인 구강 인두에서 폐렴 <ol><li> 그 쥐를 확인하는 고유 꼬리 마크, 문신, 또는 기타 승인 된 식별자에 의해 식별된다. </li><li> 절차를 신속히 처리하기 위해 이소 플루 란에서 쥐를 제거하기 전에 P200 피펫을 사용하여 박테리아의 접종을 투여까지 그립니다. 그것은 열망과 최상의 결과를 얻으려면, 오버 플로우를 방지하기 위해 &lt;100 μL의 볼륨을 사용합니다. 여기서, K. 2000 CFU / 50 μl를 사용 폐렴. </li><li> 이소 플루 란 가스 (1 L / 분의 유량으로 예를 들면, 2 % 이소 플루 란)와 투명한 챔버 또는 instit 따라 마우스를 마취utional 가이드 라인. 함께 마취 된 마우스의 수는 실험자의 쾌적함 수준 한번에 전형적으로 1-2에 의해 결정된다. 호흡을 관찰하고 심호흡을 볼 수 있으며 2 ~ 3 초이 호흡 사이에 계산 될 수있다 일단 마취의 수준을 확인합니다. 주 : 휘발성 (흡입) 마취제 가능한 교란 영향에 대한 우려가있는 경우, 마취 케타민 / 자일 라진의 복강 내 주사로 대신 이루어질 수있다. 상술 한 방법에 깊은 마취는 몇 분 정도. 더 장기간 마취 유도되면, 안연고는 안구 건조를 방지하기 위해 사용되어야한다. </li><li> 마우스가 마취되면, 경사 플렉시 글라스 보드의 못 (그림 1) 사이에 뻗어 고무 밴드에서 상악 절치에 의해 중단 semirecumbent 부정사 위치에 놓습니다. </li><li> 부드럽게 P200의 pipett와 구강에 무딘 비 래치의 집게 한 쌍의 예금 복용량 옆으로 마우스 혀를 당겨이자형. 혀 또는 구강 인두 하나에 외상을 유발하지 않도록 세심한주의를 운동. </li><li> 수축 혀를 유지하면서 마우스를 흡입 할 때까지 부드럽게 장갑을 낀 손가락으로 코를 폐색. 마우스 둘 이상의 흡입제를 가지고 있으며, 어떠한 액체 구강 보이지까지 코를 덮도록 계속. 코를 커버하는 마우스는 의무적 코 숨을 쉬는만큼 마우스, 폐에 세균을 흡입 할 수 있도록하는 데 도움이됩니다. </li><li> 접종 보드에서 마우스를 제거하고 마우스가 마취에서 회복되는 동안 콧 구멍을 차단하는 침구 또는 파편을 방지하기 위해 뒷면에 마우스를 배치, 새장으로 돌아갑니다. </li><li> 일단 모든 마우스는 투여 된 마취에서 해제 한 K. 투여 된 경우에만 마우스를 포함하는 칸막이 / 방에서 집 마우스 48 시간 게시물 감염을 넘어 경우 폐렴. 체중을 포함, 매일 쥐를 모니터링합니다. </li><li> 마우스가 48을 넘어 할 수있는 경우 매일 매시 및 / 또는 보조 열을 사용하여시간. </li></ol> 3. 기관지 세척액 (BALF) 수집 및 분석 <ol><li> 제도적 지침에 따라 쥐를 안락사. 이 CO 2 흡입 자궁 전위와 관련된 폐 합병증을 피할 여기, 150 ㎎ / ㎏ 나트륨 펜토 바르 비탈 또는 방혈 다음에 상업 안락사 솔루션의 등가 선량의 독극물 주사를 사용합니다. </li><li> 뒷면에 위치 마우스와 특히 가슴과 목 영역에 70 % 에탄올로 모피를 분사하여 마우스를 소독. </li><li> 다음 집게로 흉골을 잡고, 바로 흉골 아래에 세로 컷을 확인, 닉은 폐를 허용 다이어프램은 흉강에 다시 가을. 기관을 노출, 혈관의 양쪽에 흉강을 통해 잘라 후 목을 통해입니다. </li><li> 기관이 양쪽에 세로 근육으로 둘러싸여으로 조심스럽게 같이 중간의 실수로 측면에 조직을 밀어이 기관에 혈액을 소개 할 수있는 주변의 혈관을 절단 방지 할 수 있습니다. 혈관이 다친 경우, 이전 기관 루멘에 액세스하는 거즈와 주변 지역을 청소하십시오. </li><li> 닉 기관 다운 헤드에서 길의 약 ¼을 수술 용 가위 또는 바늘을 사용하여 꼬리 쪽 기관에 1X 인산 완충 식염수 (PBS) 1 ml의 미리로드 1 mL의 주사기에 부착 된 캐 뉼러를 삽입한다. 사용 마우스는 연령이나 여성 8 주 &lt;경우, 600-800 μL에 lavaging 볼륨을 줄일 수 있습니다. </li><li> 모든 로브가 팽창하고 배를 반복, 주사기와 함께 다시 밖으로 볼륨을 풀 수 있도록 천천히 폐에 볼륨을 누릅니다. PBS는 콧 구멍에서 나오는 경우 캐 뉼러는 기관에 충분히 밀어되지 않았거나 인플레이션이 너무 빨리 발생한다. 폐이 잘 팽창되지 않은 경우 또는, 캐 뉼러 너무 멀리 밀어 된, 약간 철회. </li><li> 얼음에 15 ML 튜브에서 풀링 세척를 수집합니다. </li><li> 회전5 분 1,200 XG에 영공의 세척 유체는 1.5 ML 튜브에 뜨는 수집 및 -80 ° C에서 동결. 그 후, 단백질, 사이토 카인 등에 대한 다양한 생화학 적 분석의 측정에 뜨는 (즉, BALF)를 사용합니다. 펠렛은 기관지 공간에서 세포를 나타냅니다. </li><li> 적혈구 (적혈구)의 색상에 기초하여 세포 펠렛에서 명백한 경우, 1X PBS 5ml를 첨가하여 1 분간 ACK 용해 완충액 1 ㎖로를 Lyse는 분해 반응을 중단하고 버퍼에 희석. ACK 용해 버퍼 처리 여부 역시 동일하게 모든 표본을 처리합니다. </li><li> 스핀 셀을 5 분 동안 1,200 XG에서, 상청액을 가만히 따르다 및 1X PBS 1 ml의 세포를 가져온다. </li><li> 총 영공 세포의 열거에 대한 혈구에 소용돌이 카운트 세포. </li><li> 세포의 밀도를 바탕으로 (80 감염된 마우스 μL와 순진 마우스 ~ 150 ~)은 cytospin 원심 분리기에서 슬라이드 챔버에 약 80-150 μl를 추가합니다. 스핀 셀현미경 상으로의 세포 차동 인구를 결정하기 위해 다음 염색을 위해 슬라이드. </li><li> 세포가 하룻밤 슬라이드에 건조하도록 허용합니다. 얼룩 얼룩 2 슬라이드를 정착의 7 배, 얼룩 1에서 9 번, 7 번 찍기로 트라이 얼룩 (예를 들어, 헤마 (3) [표 참조])와 세포 (얼룩 사이에 린스), 그리고 건조 할 수 있습니다. 얼룩 건조 후, 수동으로 커버 슬립 슬라이드 및 현미경에 의한 차이를 계산합니다. 일반적으로, 호중구 및 단핵 세포 / 대 식세포는 쉽게 크기 및 핵의 형태에 의해 구별된다. </li></ol> 4. 폐 및 주변 조직에 세균 부하 결정 <ol><li> 시작하기 전에 : 폐와 비장에 대한 1X PBS 900 ㎕의 혈액에 대한 1X PBS의 90 μl를 희석 튜브를 준비합니다. 박테리아를 배양하고, 실온에서 설정 라벨 플레이트; 따라서, 조직이 수집 한 후 시간이 박테리아 성장을위한 균질화 및 도금 사이 최소화됩니다. 참고 : 인해 이종 deposi에흡인 발생할 수 있습니다 폐에 세균 기, 각각의 마우스는 총기도 세포 수 또는 총 (양자) 폐 세균 부담 중 하나의 분석을 위해 사용하는 것이 좋습니다. </li><li> 단계 3.1에 따라 마우스를 안락사이어서 응고를 방지하기 위하여 헤파린 튜브에 배치 좌심실로부터 혈액을 수집한다. 1X PBS 2 ㎖로 비장과 배치 제거하여 1X PBS 5 ㎖를 포함하는 15 ML 튜브의 모든 폐 로브와 장소를 제거합니다. 얼음에 튜브를 놓습니다. 각 조직 / 마우스 사이의 에탄올로 악기를 청소주의하십시오. </li><li> 바람직하게는, 각 샘플 사이에 변경 될 수 일회용 균질하여, 얼음 조직 균질화. 일회용 균질 팁 실험 사이의 재사용을 위해 멸균 할 수 있습니다. </li><li> 조직이 균질화되면, 직렬 희석 및 플레이트를 수행합니다. 플라스틱에 분할 선을 그려서 하나의 TSA 접시에 중복 주어진 조직 / 희석의 플레이트 샘플. 도금 및 디lution 제안은 다음과 같습니다 (모든 경우에, 시료 10 μl를 접시에 퍼져)과 24 시간 후 감염 부검을 기반으로합니다. 48-72 시간 샘플을 분석하는 경우, 희석 더 많은 수의 나중 시점에서 세균 부담 증가로 인한 도금 될 필요가있다. <ol><li> 혈액 - 멸균 1X PBS의 90 μL에 혈액의 10 μl를 추가하여 1:10 희석. 플레이트 단정하고 중복 1:10 희석 샘플. 혈액이 도금 된 후 10 분 사이토 카인과 케모카인의 측정을 위해 플라즈마를 추출하기 위해, 9300 XG에 잔류 혈액을 회전. </li><li> 직렬 멸균 1X PBS 900 μL로 균질화 폐의 100 μl를 추가하여 100 : 폐를 들어 - 1 - 1:10 희석. 플레이트 깔끔한 균질 중복의 모든 희석. </li><li> 비장를 들어 1 - 희석 : 10-1 : (100)를 직렬로 멸균 1X PBS 900 μL로 균질화 비장의 100 μl를 추가하여. 플레이트 깔끔한 균질 중복 모두 희석. </li></ol></li><li> 확산 샘플을 간략하게 건조 할 수 있습니다. </li&gt; <li> 밤새 정적 37 ° C 배양기에서 TSA 판과 장소를 반전. </li><li> 상기 플레이트의 양측에서 각각 희석로부터 세균 콜로니를 평균하여 정착하고 박테리아의 수를 결정한다. 폐 5 mL 및 비장 2 ml의 초기 희석의 요인은 전체 조직 CFUs를 결정합니다. </li></ol>

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저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

세균성 폐렴의 쥐 모델은 폐 호스트 방어 반응에 중요한 통찰력을 제공하고, 유전자 타겟팅 및 생체 생물학 및 약리학 적 개입에 협력. 위대한 진보는 감염된 영공 10, 11에 호중구 모집을 지배하는 케모카인 및 접착 분자에 대한 우리의 이해에 특히되었습니다. 폐렴의 생체 모델을, 셀 기반 또는 대체 접근 방식과는 달리, 또한 내분비에 중요한 통찰력을 제공하고 있습니다 감염된 폐 및 간 (급성 위상 응답)과 같은 다른 기관 사이에 발생하는 통신 (12)와 부신 (스트레스 글루코 코르티코이드) 13. 마지막으로, 생체 폐렴 모델에 의해 밝혀 중요한 임상 적 관련성이 높은 점은 성공적인 병원체 간격이 호스트의 성공에 동등하지 않다는 것이다. 많은 경우에서, overexuberant 면역 반응은 호스트의 죽음의 원인때문에 심지어는 성공 병원체 통관 8, 14의 얼굴에 과도한 와키 폐 손상에. ...

지역 사회 획득 폐렴은 예방 접종의 개선 및 항생제 전략 1, 2에도 불구하고 지난 40 년 동안 사망률이 거의 전반적인 변화, 미국의 감염으로 인한 사망의 주요 원인 남아있다. 보건 수준인지 진행의 부족에도 불구하고, 최근 몇 년 동안 극적인 진보 순방향 폐 감염 마우스 모델의 사용에 의해 가능하게 이러한 많은 단계와, 폐렴 분자 세포 병인에 대한 이해 만들어왔다. 마우스의 유전 취급 용이성은 쥐와 인간의 면역 시스템, 상업적으로 사용할 수있게 한 쥐의 표적 면역 시약의 광대 한 배열의 유사성은 함께 필드의 급속한 발전을 촉진했다. 문헌에 기술 세균성 폐렴의 마우스 모델은 일반적 병원균 접종 1 내지 4의 기술 경로에 의존했다 : I)을 에어로졸; ⅱ) INTRanasal 전달; ⅲ) 경구 전달; 및 ⅳ) 수술 기관 내 주입 (즉, 기관 절개술) 3. 감염의 모든 노선 장점과 단점 3 있습니다. oronasal 식물, 전신 마취에 대한 요구 사항의 혼합물 특히, 상대적으로 상부기도의 노출 가능성에서, 말초 폐에 전달 접종, 전달 된 병원균의 엽성 분포, 전문 기술 요구 사항 및 절차 사망률의 변동이 걸쳐 다양 구혼. 일반적으로 사용되는 경구 감염 기법, 또는 직접 후두 시각화 3-5 아래 &#39;블라인드&#39;(비 시각) 접근법을 통해 기관 내 (translaryngeal) 삽관을 포함한다. 두 방법 모두 강력한 반면, 상당한 훈련이 필요하며 또한 상부기도에 외상의 위험을 수행한다. 본 보고서에서, 우리는 승, 경구 감염의 기술적, 비 집약적 비 침습적, 저렴하고 빠른 방법을 설명이에 박테리아 (제공된 예에서 클레 브시 엘라 폐렴)을 흡인 (즉, 흡입)를 통해 폐에 전달 마취 된 쥐의 구강 인두로 피펫. 우리와 다른 사람은 성공적으로 6-9 흡인 성 폐렴 기술을 사용했다. 이 다양하고 쉽게 배울 폐 배달 방법은 사이토 카인과 다른 단백질, 병원체 관련 분자 (예를 들면, 리포 폴리 사카 라이드), 셀 (즉, 입양 전송)를 포함하여 폐, 많은 추가 비 부식성 요원의 전달에 확장 될 수있다 독소 (예컨대, 블레오 마이신). 중요한 기술적 사항을 논의에 더하여, 또한 하류 세균 클리어런스 측정 (즉, 집락 형성 단위 [CFU 상기 폐 및 말초 기관에서 정량) 백혈구를 포함한 폐렴 후속 호스트 응답을 평가하는 통합 정량 방법을 설명 영공에 축적.

<table><tbody><tr><td>Klebsiella pneumoniae, serotype 2</td><td>ATCC</td><td>43816</td><td></td></tr><tr><td>Tryptic soy broth</td><td>Becton Dickenson 211825</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Excel Safelet IV 카테터, 18 G x 1 1/4"</td><td>Claflin Medical Equipment</td><td>MEDC-031122</td><td></td></tr><tr><td>Hema 3 Solution 1</td><td>Fisher</td><td>23-122-937</td><td></td></tr><tr><td>Hema 3 Solution 2</td><td>Fisher</td><td>23-122-952</td><td></td></tr><tr><td>Hema 3 고정식</td><td>Fisher</td><td>23-122-929</td><td></td></tr><tr><td>27&frac12; 게이지 투베르큘린 주사기</td><td>Fisher</td><td>14-826-87</td><td></td></tr><tr><td>리튬 헤파린 플라즈마 수집기</td><td>Fisher</td><td>2675187</td><td></td></tr><tr><td>L자형 일회용 스프레더</td><td>Lab Scientific</td><td>DSC</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS, pH 7.4</td><td>자체 준비</td><td>사항 없음</td><td>증류수 (5 L), NaCl (40 g), KCl (1 g), Na2HPO4 (5.75 g), KH2PO4 (1 g)&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td></td><td>사내에서 n</td><td>/a</td><td>NH4Cl (4.145 g), KHCO3 (0.5 g), EDTA (18.6 mg)를 자체 준비하여 증류수와 pH 7.4로 최대 500ml를 준비합니다</td></tr></tbody></table>.

마우스의 실험 세균성 폐렴의 유도 및 표현형에 대한 비 침습적 및 기술적 비 집약적 인 방법

A Non-invasive and Technically Non-intensive Method for Induction and Phenotyping of Experimental Bacterial Pneumonia in Mice

지역 사회 획득 폐렴이 중요한 공중 보건 문제로 남아 있지만, 세균성 폐렴의 쥐 모델은 최근 기본 세포 및 분자 기전에 대한 우리의 이해에 중요한 임상 발전을 촉진하고있다. 생체 마우스 모델에서 호스트 방어 반응의 통합 생리학과 탄력성을 캡처 방식은 대안, 단순화 된 생체 접근 방식에 의해 공개되지. 여러 방법 폐내 에어로졸 포함 생쥐 박테리아의 접종, 비내 전달 &#39;블라인드&#39;및 가시 조건 경구 기관 내 삽관 한 경피 기관 내 삽관에 대한 문헌에 기술되어있다. 모든 방법은 상대적인 장점과 한계가 있습니다. 여기서, 우리는 상세히 마우스로 흡입 (즉, 흡입) 관련 박테리아의 기관 내 전달을위한 비 침습적 기술적 비 집약 저렴하고 빠른 방법을 서술동안 전신 마취하에 구강 인두로 피펫 감염성 접종의. 이 방법은 비 - 부식성 생물학 및 화학 물질의 다양한 폐 전달을 위해 사용되며, 심지어 폐 절차 최소한 이전 경험 실험실 학습 비교적 쉽게 할 수있다. 흡인 성 폐렴 방법을 설명하는 이외에, 우리는 또한, 특히, 생체 내 마우스 폐 선천성 면역 반응 후의을 분석하기위한 단계별 과정을 제공하는 박테리아 간극 감염된기도의 세포 성 면역 반응을 정량화하는 방법에 관한 것이다. 폐렴 평가에이 통합 간단한 방법은 폐의 선천성 면역에 따라 유전 적, 환경 적 조작의 효과를 신속하고 강력한 평가를 할 수 있습니다.

C57BL / 6 마우스 K. 2000 CFU에 감염되었다 폐에 인두 흡인을 통해 폐렴 43816 (혈청 형 2). 이 용량에서, 마우스는 일반적으로 임상 증상을 혼수, 프릴 모피, 및 5 ~ 10 % (그림 2A)의 체중 감소를 포함하여 12 ~ 24 시간 게시물 감염을 표시하기 시작합니다. 48 ~ 72 시간의 후 감염 내에서 마우스의 대부분은 일반적으로 감소 활동 구부리고 자세에서 20 %의 체중 감소 및 결과의 평균 앞에 자극에 응답을 감소 질병과 병적 증상을 보여줍니다. 오랜 기간의 연구는 K.의 낮은 복용량을 요구할 수있다 폐렴. K. 500 CFU 감염 폐렴 회수 및 체중 증가는 5-6 일 (도 2b)에 의해 처음 10-15 %의 중량 손실을 특징으로 3-5 D 감염 후 피킹 온화한 질병을 초래한다. ...

여러 가지 방법 마우스에서 세균성 폐렴 모델링 문헌에 기재되어있다. 여기서, 우리는 구강 인두로 피펫 세균 접종의 흡인 (즉, 흡입)를 통해 폐렴을 유도하기위한 비 침습적, 저렴하고 빠른 방법을 설명합니다. 폐 선천성 면역 반응의 평가를위한 다운 스트림 방법도 자세히 설명되어 있습니다.

Although community-acquired pneumonia remains a major public health problem, murine models of bacterial pneumonia have recently facilitated significant ...

본 실험 프로토콜의 전반적인 목표는 마우스에서 세균성 폐렴을 유도하고, 이후 폐 내의 생체 내(in vivo) 숙주 방어 반응을 정량화하기 위한 비침습적이고 기술적 부담이 적은 절차를 제공하는 것입니다. 이 방법은 감염성 질환 및 면역학 분야에서 감염에 대한 숙주 반응을 조절하는 유전자와 분자 경로에 관한 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 폐 감염 방법의 주요 장점은 기술적인 간편함에 있습니다.이를 통해 폐 절차에 대한 전문 지식이 부족한 실험실에서도 폐의 선천성 면역 반응을 연구할 수 있습니다. 생물 안전 2등급(biosafety level two) 시설에서 K.pneumoniae의 글리세롤 스톡을 해동하고, 박테리아 1 mL를 50 mL의 Tryptic Soy Broth가 들어있는 500 mL 배양 플라스크에 옮깁니다. 해당 현탁 배양액을 37 °C, 200~225 RPM에서 하룻밤 동안 배양합니다.다음 날 아침, 1~5 mL의 박테리아 배양액을 50 mL의 Tryptic Soy Broth가 들어 있는 새 플라스크에 희석하고, 로그 상(log phase)에 도달하도록 진탕 배양기에서 37 °C로 2.5시간 더 배양합니다. 2차 배양이 끝나면, 2차 배양액에서 박테리아 1 mL를 취해 원심분리를 위해 1.5 mL 튜브로 옮깁니다. 펠렛이 흐트러지지 않도록 상층액을 제거하고, 멸균 식염수 1 mL로 박테리아를 부드럽게 재현탁하여 총 3회 세척합니다.세 번째 세척 후, 박테리아를 또 다른 1 mL의 멸균 생리식염수에 재현탁하고, 접종액의 로그 단위 단계 희석액을 준비합니다. 세척된 K.pneumoniae의 OD600을 측정하기 위해 1:10 및 1:100 희석액 1 mL를 일회용 큐벳에 각각 두 번씩 분주하여 측정합니다. OD600 1.0은 대략 mL당 4~7 × 10⁸ CFU에 해당합니다.각 희석액의 박테리아 농도를 계산한 후, 8~12주령의 수신 동물 한 마리당 50~60 µL의 멸균 생리식염수에 원하는 접종 CFU 용량을 재현탁합니다. 박테리아를 동물에게 투여하려면, 투여용 접종액을 P200 피펫 팁으로 흡입하고, 마취된 마우스를 경사형 Plexiglas 보드의 핀 사이에 연결된 고무줄에 상악 절치로 매달아 반-눕힌 상태의 배와위(semi-recumbent supine position)로 배치합니다. 끝이 뭉툭하고 홈이 없는 핀셋을 사용하여 혀를 조심스럽게 옆으로 당기고, 혀나 구강 인두에 외상을 입히지 않도록 주의하며 동물의 구강 내에 용량을 투여합니다.혀를 뒤로 당긴 상태에서, 마우스가 두세 번 흡입할 때까지 장갑을 낀 손가락으로 코를 부드럽게 막습니다. 구강 내에 액체가 보이지 않을 때, 마우스가 회복되는 동안 콧구멍이 막히는 것을 방지하기 위해 마우스를 접종 보드에서 케이지로 똑바로 누운 자세로 옮깁니다. 흉골 바로 아래를 세로로 절개합니다.그 다음, 핀셋으로 흉골을 들어 올린 후 횡격막에 작은 절개를 넣어 폐가 흉강 안으로 다시 들어가게 합니다. 혈관 양측을 따라 흉강 위쪽으로 절개를 계속 진행하고 목 부분까지 절개합니다. 기관이 보이면 목 중앙을 조심스럽게 절개하고, 주변 혈관이 손상되지 않도록 조직을 옆으로 밀어냅니다.이제 머리에서 약 4분의 1 지점의 기관을 절개하고, 1 mL의 PBS가 미리 충전된 1 mL 주사기에 연결된 캐뉼라를 기관 내로 꼬리 방향으로 삽입합니다. 모든 폐엽이 팽창하도록 PBS를 폐 속으로 천천히 주입합니다. 그 후 주사기로 해당 용액을 다시 뽑아내어 수집된 세척액을 얼음 위의 15 mL 튜브에 모읍니다.적절한 실험 종료 시점에 좌심실에서 혈액을 채취하여 응고를 방지하기 위해 헤파린 처리된 튜브에 옮깁니다. 그런 다음 5 mL의 PBS가 들어 있는 15 mL 튜브에 모든 폐엽을, 2 mL의 PBS가 들어 있는 15 mL 튜브에 비장을 각각 수확합니다. 다음으로, 샘플당 개별 일회용 균질기를 사용하여 얼음 위에서 조직을 마쇄한 후, 조직 슬러리를 단계별로 희석합니다.희석액을 단일 TSA 플레이트의 서로 다른 면에 두 번씩 도말하고, 시료를 잠시 건조시킵니다. 그 다음 플레이트를 뒤집어 37 °C 정적 배양기에 넣고 하룻밤 동안 배양한 후, 다음 날 플레이트의 양면과 각 희석 단계에서 생성된 세균 콜로니의 평균값을 구합니다. K.pneumoniae 2000 CFU 농도에서 마우스는 일반적으로 감염 후 12~24시간 사이에 임상 증상을 나타내기 시작합니다.48~72시간 이내에 많은 동물들이 질병 및 이환 증상을 보이며, 이는 통상적으로 평균 20%의 체중 감소가 선행됩니다. 그러나 LD50 용량은 실험군 내에서 상대적으로 증가하거나 감소한 생존율을 모두 검출할 수 있게 하여, 장기 연구에 더 적합할 수 있습니다. K.pneumoniae에 의한 하기도 감염은 감염 후 6시간 이내에 기도로 백혈구가 강력하게 유입되는 것이 특징이며, 이는 24시간에 정점에 도달하고 주로 호중구로 구성됩니다.K.pneumoniae 감염 후 24시간과 48시간 시점 모두에서 기관지폐포 세척액 내 사이토카인을 검출할 수 있으며, 이를 통해 폐 미세환경과 세균 침입에 반응하는 면역 자가 모집에 대한 통찰을 얻을 수 있습니다. 폐, 혈액 및 비장의 세균 수치 또한 감염 후 24시간에서 48시간 사이에 급격히 증가합니다. 구강인두 흡인법을 통한 폐 감염 유도 방식은 숙달될 경우, 적절히 수행한다면 마우스 한 마리당 단 1~2분 만에 완료할 수 있습니다.이 절차를 수행할 때, 과도한 흡입량을 사용하지 않도록 주의하는 것이 중요합니다. 일반적으로 8~12주 된 생쥐의 경우 50~60 µL의 양이 적당합니다. 이 절차 이후, 폐 및 말초 조직에 대해 다양한 방법을 시행하여 병원체 제거 과정에서의 면역 반응을 정량화할 수 있습니다.이 영상을 시청한 후, 귀하는 구인두 경로의 병원균 투여를 통해 실험적 세균성 폐렴을 유도하고 마우스의 병원균 부하를 측정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 미생물을 다루는 작업은 위험할 수 있으며, 이 절차를 수행하는 동안 항상 기본적인 BSL-2 예방 조치 및 수칙을 준수해야 함을 잊지 마십시오.

a-non-invasive-technically-non-intensive-method-for-induction

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

독감 바이러스에 동시 감염 asymptomatic 동안 침투 폐렴 구균 질환의 유도에 연루 요인 중...

사이 Synergism을 맡은 이후로 발광 생물 이미징을 사용하여 연쇄상 구균 pneumoniae</em유아 마우스에서>와 인플루엔자 바이러스

출처: 마덴스파허, J. H. 및 페슬러, M. B. 쥐에서 실험적 세균성 폐렴을 유도하고 표현형을 구분하는 비침습적이고 기술적으로 비집약적인 방법. J. Vis. 경험 (2016)이 영상은 감염된 쥐의 비장 내 박테리아 부하를 정량화하여 감염의 심각성을 평가하는 과정을 보여줍니다. 균질화된 비장은 연속적으로 희석되어 도판을 하여 총 박테리아 부하를 측정합니다. 그 결과 얻은 데이터는 전신 조직 내 숙주-병원체 상호작용에 대한 통찰을 제공합니다.

감염 연구를 위한 쥐 비장 내 박테리아 부하 평가

이 비디오는 삽관 및 폐엽에 박테리아 현탁액 설치를 통해 면역 능력이 있는 설치류 모델에서 폐 감염이 확립되는 것을 보여줍니다. 이 모델은 면역 능력이 있는 동물에서 항균 효능 연구를 가능하게 합니다.

면역 역량이 있는 설치류 모델에서 폐렴 연쇄상구균의 기관지 내 주입

폐렴 구균은 중증 지역 사회 획득 폐렴과 전 세계적으로 2 백만 이상의 죽음에 책임을 일으키는 주요 병원균이다. 적합성 또는 병독성에서 내포 세균성 요인의 영향은 생물 발광 박테리아를 이용한 급성 마우스 폐렴이나 균​​혈증 모델에서 실시간으로 모니터링 할 수있다.

생물 발광 박테리아를 사용하여 실시간으로 급성 폐렴 마우스 모델에서 폐렴 구균 독성 요인의 영향에 따라

병원균 감염에 대한 숙주 면역 반응은 긴밀하게 규제 과정이다. 생쥐의 리포 다당류 폐 노광 모델을 이용해서, 그 질병 병인과 관련된 복잡한 메커니즘은 고해상도 평가를 수행하는 것이 가능하다.

마우스의 호스트 면역 반응을 평가하기 위해 구인두 기관 내 PAMP 관리 및 폐포의 활용

우리는 쥐의 하기도에 헤모필루스 인플루엔자를 기관 내 접종하는 절차를 보여줍니다. 이것은 마우스 모델에서 기도 염증을 조절하는 신호 경로를 연구하는 데 매우 유용한 도구입니다.

의 내부 기관 관리<em&gt; 헤모필루스 인플루엔자</em&gt; 마우스 모델에서기도 염증을 연구하는

면역 능력이 있는 설치류에서 폐 감염을 확립하는 방법이 설명되어 있습니다. 숙련되면 이 방법을 빠르고 쉽게 수행하여 S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae 및 A. baumannii의 많은 분리물에서 안정적인 감염을 유도할 수 있습니다.

면역 적격 설치류에서 강력한 폐렴 모델에 대해 항균 효능을 평가하기<i&gt; S. 폐렴</i&gt;<i&gt; H. 인플루엔자</i&gt;<i&gt; K. 폐렴</i&gt;<em&gt; P. 녹농균</em&gt; 또는<em&gt;를했다. baumannii가</em

감염 성 폐 렴은 인간에서 가장 일반적인 감염 중 하나입니다. 적절 한 생체 내에서 모델은 질병 병 인을 이해 하 고 새로운 치료제의 효능을 테스트 중요 합니다. 이 murine oropharyngeal 포부 폐 염 모델 하나 pathogenesis 및 이러한 치명적인 감염에 대 한 새로운 치료를 확인할 수 있습니다.

호흡기 관련 및 병원-획득 세균성 폐 렴의 murine Oropharyngeal 포부 모델

여기 선물이 vivo에서 백신의 평가 위한 우아한 프로토콜 효과 호스트 면역 반응. 이 프로토콜은 바이러스 성, 세균성, 백신 모델 또는 기생 병원 균에 대 한 적응 될 수 있다.

호스트 병원 체 응답 및 쥐에 백신의 효능 평가

여기에서, 우리는 병원체 복구 및 전사체 분석에 선행된 더 낮은 호흡기관에 주입의 비침범성 경로를 제공함으로써 이차 세균성 폐렴 연구를 향상시키는 방법을 제시한다. 이러한 절차는 재현 가능하며 캐뉼라, 가이드 와이어 또는 광섬유 케이블과 같은 특수 장비 없이도 수행할 수 있습니다.

이차 세균성 폐렴의 뮤린 모델을 위한 정확한 병원균 전달 및 회복 시스템

이 원고는 생쥐에서 폐렴의 전염성 모델을 확립하고 손상 해결의 각각의 특성과 함께 박테리아 성장 및 기관 내 점안 방법을 설명합니다. 고차원 유세포 분석을 사용하여 면역 환경을 평가하는 새로운 접근 방식도 설명합니다.

폐렴의 해결을 평가하기 위한 실험모델

배우세요 마우스에서 비침습적 기술로 세균성 폐렴을 유도하고 폐 선천성 면역 반응을 정량화하는 방법입니다. K. pneumoniae를 이용하여 감염 질환과 면역학 연구에 활용할 수 있습니다.

마우스의 실험 세균성 폐렴의 유도 및 표현형에 대한 비 침습적 및 기술적 비 집약적 인 방법

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