단백질 상호 작용을 발견하고 HaloTag 기술을 사용하여 단백질의 기능을 특성화

이 절차의 전반적인 목표는 포유류 세포에서 단백질 복합체를 효율적으로 분리하는 것입니다. 이는 먼저 관심 단백질을 발현하기 위해 halo tag fusion 구조체로 세포를 transection함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 세포를 절단하고 헤일로 태그를 통해 수지의 단백질 복합체를 공유 포획하는 것입니다.

다음으로, 수지의 단백질 복합체를 부드럽게 세척하여 비특이적 상호 작용을 제거합니다. 마지막 단계는 수지에서 단백질 복합체를 용리하는 것입니다. 궁극적으로 헤일로 태그 풀다운은 포유류 시스템에서 새로운 단백질 상호 작용을 분리하고 발견하는 데 사용됩니다.

오늘 여기에서 시연할 방법은 새로운 단백질 상호 작용의 식별 및 세포 내 단백질 국소화 측정을 포함하여 기능적 단백질체학 분야에서 중요한 발견을 가능하게 할 수 있습니다. 현재 이러한 절차를 수행하는 두 명의 선임 과학자인 Jackie Mendez와 Alen Beek이 수행합니다. 먼저, 각 융합 또는 대조군에 대해 30 밀리리터의 세포가 들어 있는 15cm 접시 하나를 10에서 밀리리터당 5번째 세포의 3 - 4배 또는 구성물당 총 7개의 세포에 1 - 1.2 곱하기 10으로 준비합니다.

섭씨 37도, CO2 5%에서 18-24시간 동안 세포를 배양합니다. 배양 후, 원하는 transfection 시약으로 구조체를 transfection합니다. 24 내지 48시간 후, 형질주입 후, 배지를 제거하고 20 내지 25 밀리리터의 얼음처럼 차가운 PBS로 세포층을 부드럽게 세척하고, PBS 세척을 제거하고, 25 내지 30 밀리리터의 섭씨 4도의 냉각 PBS를 첨가한다.

그런 다음 세포 스크레이퍼로 접시에서 세포를 부드럽게 긁어냅니다. 세포가 원뿔형 튜브에 수집되면 2000배 G 및 섭씨 4도에서 5-10분 동안 샘플을 원심분리합니다. 상층액을 버린 후 세포 펠릿을 섭씨 영하 80도에서 최소 30분 또는 최대 6개월 동안 놓습니다.

각 융합 또는 대조군 샘플에 대해 18ml의 수지 평형 세척 버퍼를 준비합니다. 바이알을 뒤집어 수지를 부드럽게 혼합하여 균일한 현탁액을 얻습니다. 각 풀다운 실험에 대해 200마이크로리터의 수지를 1.5밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브에 분배합니다.

800회 G. 원심분리 후 1분 동안 샘플을 원심분리합니다. 튜브 바닥의 수지를 방해하지 않고 상등액을 조심스럽게 제거합니다. 상등액을 버리면 800마이크로리터의 수지 평형 세척 완충액을 샘플에 추가하고 튜브를 여러 번 뒤집어 완전히 혼합합니다. 후.

800회에서 2분 동안 샘플을 원심분리. G. 상층액을 조심스럽게 제거하여 버립니다. 이전 단계를 두 번 더 반복하여 총 세 번 세탁합니다.

세포 펠릿을 해동한 후 미리 준비된 포유류 용해 300마이크로리터에 현탁시킵니다. 위아래로 피펫팅하여 버퍼링합니다. 그런 다음 새 마이크로 원심분리기 튜브로 옮기고 6마이크로리터의 50 x 프로테아제 억제제 칵테일을 추가합니다.

그런 다음 3마이크로리터의 RQ one DNA를 추가하고 10분 동안 샘플을 반전시킵니다. 실온에서 25 또는 27 게이지 주사기 바늘을 통해 샘플을 5-10회 통과시켜 세포를 만듭니다. 일단 표본이 14, 000 시간, 4 섭씨 온도에 5 분 동안 G에 원심 분리되면, 명확한 용해물을 새로운 관으로 옮기고 얼음에 두십시오.

다음으로, 이전에 준비된 XTBS 완충액 700마이크로리터를 투명 용해물에 추가로 첨가하고 위아래로 피펫팅하여 잘 혼합합니다. 각 튜브의 바닥에 있는 수지를 방해하지 않고 이전에 준비된 평형 수지 튜브에서 최종 세척을 제거합니다. 그런 다음 각 튜브에 희석된 용해물 1ml를 추가합니다.

튜브 로테이터에서 혼합하여 섭씨 22도에서 15분 동안 샘플을 배양합니다. 이 원심분리기에 이어 수지관을 800회에서 2분간 G.상층액을 버린 후 1ml의 수지평형 세척액을 넣고 수지관을 800회에서 2분간 원심분리한 후 각 수지관을 수작업으로 수차례 뒤집어 철저히 혼합한다. G. 이전 및 세탁 단계를 세 번 반복한 후 세탁을 폐기하십시오.

섭씨 22도에서 일정한 회전으로 5분 동안 샘플을 배양한 후 튜브에 1ml의 수지 평형 세척 버퍼를 추가하고 800배 G에서 2분 동안 수지 튜브를 원심분리한 후 세척액을 폐기합니다. 이 시점에서 resus는 각 샘플의 수지를 50마이크로리터의 SDS 용리 완충액에 현탁시킵니다. 자동 마이크로 원심분리기 튜브 셰이커를 사용하여 실온에서 튜브를 30분 동안 흔듭니다.

800 회에 2 분 동안 원심 분리 후 G.Transfer는 분석을 위해 EIT를 새로운 튜브로 옮깁니다 웨스턴 블롯 또는은 염색 젤의 경우 질량 분석을 위해 SDS 변성 겔에 샘플의 5-10 마이크로 리터를로드합니다. 향후 분석을 위해 각 시료 40마이크로리터를 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오. 각 융합 단백질 또는 대조 플레이트에 대한 8개의 웰 챔버 커버 유리에서, 400마이크로리터의 HELOC 세포를 각 웰의 적절한 배지에 1-2배의 밀도로 10에서 5번째 셀

세포를 섭씨 37도 및 5%CO2에서 18 - 24시간 동안 배양한 후, 18 - 24시간 후에 원하는 형질주입 시약으로 세포를 형질주입한 후, 적절한 세포 배지에서 TMR 리간드를 1 - 200 정도로 형질주입 후 희석합니다. 그런 다음 이 용액 100마이크로리터를 각 웰에 넣고 부드럽게 섞습니다. 다음으로, 리간드를 포함하는 형질주입된 세포를 섭씨 37도 및 5%CO2에서 15분 동안 배양합니다.

완료되면 리간드를 포함하는 매체를 흡입하고 섭씨 37도까지 사전 경고된 단백질 융합 태그 리간드가 없는 500마이크로리터의 적절한 배지로 교체합니다. 한 번, 이전 단계를 두 번 반복하여 총 세 번의 세척을 수행합니다. 세포를 다시 인큐베이터에 30분 동안 넣습니다.

30분 배양 후 배지를 흡입하고 섭씨 37도로 예열된 500마이크로리터의 적절한 배지로 교체합니다. 이 이미지에 이어, 프로토콜 halo, BRD four 및 halo tag control expression을 사용하여 적절한 획득 매개변수를 사용하는 현미경의 세포가 관찰됩니다. 융합 단백질 발현은 안티 헤일로 태그 항체 또는 미끼 단백질에 대한 항체가 있는 웨스턴 블롯을 사용하여 검출할 수도 있습니다.

Halo BRD 4 및 제어 풀다운의 생물학적 복제물의 실버 염색 겔은 높은 재현성을 보여주고 BRD 4 단백질과 상호 작용하는 단백질을 보여줍니다. BRD nine 단백질뿐만 아니라 PTF B, CDK nine 및 Cyclin T의 성분이 풍부하다는 것은 BRD 4 복합체의 특이적 포획을 확인합니다. 겔은 BRD 4의 잠재적 상호작용 인자로 확인된 다른 단백질을 보여주었습니다.

추가 예로, Halo HD one 단백질을 사용하여 복합 분리를 수행했습니다. 이 경우, TEV 프로테아제를 사용하여 Halo 태그와 H DAC one 사이의 링커 영역을 절단하여 상당한 양의 HD one 미끼 단백질을 방출했습니다. 관찰된 바와 같이.

HD one 풀다운 샘플은 HDA 억제제 saha에 의해 억제된 높은 수준의 HD one 활성을 보여주었습니다. 특이성을 추가로 입증하기 위해, 시르투인 계열 억제제 EX 5 27에서 HDA 억제가 관찰되지 않았으며 완충액 단독을 사용해도 신호가 검출되지 않았습니다. Halo BRD 4 및 Halo HDAC 1로 형질 주입된 He A 세포는 TMR로 형광 표지되었습니다.

리간드 이미징(Ligand Imaging)은 둘 다 핵에 국한되어 있음을 보여주었고 태그가 융합 파트너의 생리학적 세포 국소화를 변경하지 않았음을 입증했습니다. 따라서 이 절차에 따라 분리된 단백질과 이들의 상호 작용 파트너를 식별하고 질량 분석법 및 웨스턴 블로팅과 같은 다양한 분석 방법을 사용하여 추가로 분석할 수 있습니다.