단백질 상호 작용을 발견하고 HaloTag 기술을 사용하여 단백질의 기능을 특성화

이 절차의 전반적인 목표는 포유류 세포로부터 단백질 복합체를 효율적으로 분리하는 것입니다. 이를 위해 먼저 HaloTag 융합 컨스트럭트로 세포를 형질전환하여 목적 단백질을 발현시킵니다. 두 번째 단계로 세포를 파쇄하고 HaloTag를 통해 수지에 단백질 복합체를 공유 결합으로 캡처합니다.

다음으로, 비특이적 상호작용을 제거하기 위해 레진 위의 단백질 복합체를 부드럽게 세척합니다. 마지막 단계는 레진으로부터 단백질 복합체를 용출하는 것입니다. 결과적으로, halo tag pull down은 포유류 시스템에서 새로운 단백질 상호작용을 분리하고 발견하는 데 사용됩니다.

오늘 저희가 시연할 방법들은 새로운 단백질 상호작용의 확인 및 세포 내 단백질 위치 결정을 포함하여 기능적 프로테오믹스 분야의 핵심적인 발견을 가능하게 할 수 있습니다. 오늘 이 절차를 수행할 분들은 저희의 선임 과학자인 Jackie Mendez와 Alen Beek입니다. 먼저, 각 융합 단백질 또는 대조군에 대해, 3~4 × 10⁵ cells/mL 농도의 세포 30 mL 또는 컨스트럭트당 총 1~1.2 × 10⁷ cells가 포함된 15 cm 디쉬를 하나씩 준비하십시오.

세포를 37°C, 5% CO2 조건에서 18~24시간 동안 배양합니다. 배양 후, 원하는 transfection 시약을 사용하여 컨스트럭트를 transfection합니다. transfection 후 24~24시간이 지나면 배지를 제거하고 20~25 mL의 ice cold PBS로 세포층을 부드럽게 세척합니다. PBS 세척액을 제거하고 4°C로 냉각된 PBS 25~30 mL를 첨가합니다.

이어서, 셀 스크레이퍼를 사용하여 디시에서 세포를 부드럽게 긁어냅니다. 세포를 원추형 튜브에 수집한 후, 2000 ×g, 4 °C에서 5~10분 동안 샘플을 원심 분리합니다. 상층액을 제거한 후, 세포 펠릿을 -80 °C에서 최소 30분에서 최대 6개월 동안 보관합니다.

각 융합 또는 대조군 샘플에 대해 18 mL의 레진 평형 세척 완충액을 준비합니다. 바이알을 뒤집어 레진을 부드럽게 혼합하여 균일한 현탁액을 얻습니다. 각 풀다운 실험을 위해 200 µL의 레진을 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브에 분주합니다.

샘플을 800 ×g에서 1분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후, 튜브 바닥의 레진이 흐트러지지 않도록 주의하며 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 상층액을 버린 후, 샘플에 800 µL의 레진 평형화 세척 버퍼를 첨가하고 튜브를 여러 번 뒤집어 충분히 혼합합니다. 그 후.

샘플을 800 ×g에서 2분 동안 원심분리합니다. 상층액을 조심스럽게 제거하여 버립니다. 이전 단계들을 두 번 더 반복하여 총 세 번 세척합니다.

해동된 세포 펠릿을 이전에 준비한 포유류 세포 용해 버퍼 300 µL에 넣고 피펫팅하여 현탁합니다. 그런 다음 새로운 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고 50x 프로테아제 억제제 칵테일 6 µL를 추가합니다.

그 다음, 3 µL의 RQ one DNAs를 첨가하고 샘플을 10분 동안 반전 혼합합니다. 상온에서 샘플을 25 또는 27 gauge 주사기 바늘로 5~10회 통과시켜 세포를 용해합니다. 샘플을 4 °C에서 14,000 ×g로 5분 동안 원심분리한 후, 투명한 용해물을 새 튜브로 옮겨 얼음 위에 둡니다.

다음으로, 미리 준비한 1X TBS 버퍼 700 µL를 투명한 용해물에 추가하고 피펫팅으로 잘 섞어줍니다. 각 튜브 바닥의 레진이 흐트러지지 않도록 주의하며, 미리 준비하여 평형화한 레진 튜브에서 마지막 세척액을 제거합니다. 그런 다음 희석된 용해물 1 mL를 각 튜브에 추가합니다.

튜브 회전기(tube rotator)를 사용하여 22 °C에서 15분 동안 샘플을 혼합하며 배양합니다. 그 후, 레진 튜브를 800 ×g에서 2분 동안 원심 분리합니다. 상층액을 제거한 후, 1 mL의 레진 평형 세척 버퍼(resin equilibration wash buffer)를 첨가하고, 각 레진 튜브를 손으로 여러 번 뒤집어 충분히 혼합한 다음 800 ×g에서 2분 동안 다시 원심 분리합니다. 이전의 세척 단계를 총 3회 반복한 후 세척액을 제거합니다.

샘플을 22 °C에서 5분 동안 일정하게 회전시키며 배양한 후, 수지 평형 세척 완충액 1 mL를 튜브에 추가하고, 수지 튜브를 800 ×g에서 2분 동안 원심 분리한 뒤 세척액을 버립니다. 이 시점에서 각 샘플의 수지를 50 µL의 SDS 용출 완충액에 재현탁합니다. 자동 마이크로 원심 분리 튜브 쉐이커를 사용하여 상온에서 튜브를 30분 동안 흔들어 줍니다.

800 ×g에서 2분 동안 원심분리한 후, 분석을 위해 EIT를 새 튜브로 옮깁니다. Western blot 또는 silver stain의 경우, 질량 분석용 SDS 변성 젤에 시료 5~10 µL를 로딩합니다. 향후 분석을 위해 각 시료 40 µL를 -20 °C에 보관합니다. 각 융합 단백질 또는 대조군 플레이트에 해당하는 8-well chambered cover glass의 각 웰에, 1~2 × 10⁵ cells/mL 밀도의 HELOC 세포를 적절한 배지와 함께 400 µL씩 분주합니다.

세포를 37°C, 5%CO2 조건에서 18~24시간 동안 배양한 후, 원하는 transfection 시약을 사용하여 transfection을 수행합니다. transfection 후 18~24시간이 지나면 TMR 리간드를 적절한 세포 배지로 1:200 비율로 희석합니다. 그다음 이 용액 100 µL를 각 웰에 넣고 부드럽게 혼합합니다. 이어서 리간드가 포함된 transfection된 세포를 37°C, 5%CO2 조건에서 15분 동안 배양합니다.

완료되면 리간드가 포함된 배지를 흡입하여 제거하고, 37°C로 예열된 단백질 융합 태그 리간드가 없는 적절한 배지 500 µL로 교체하십시오. 이전 단계를 두 번 더 반복하여 총 세 번 세척한 후, 세포를 인큐베이터에 넣고 30분 동안 배양하십시오.

30분 동안 배양한 후 배지를 흡입하여 제거하고, 37°C로 예열한 적절한 배지 500 µL로 교체합니다. 이어서 적절한 획득 파라미터를 사용하여 현미경으로 세포를 관찰함으로써 halo, BRD4 및 halo tag 대조군 발현을 확인합니다. 융합 단백질 발현은 anti-halo tag 항체 또는 베이트 단백질 항체를 이용한 Western blot으로도 검출할 수 있습니다.

Halo BRD four 및 대조군 풀다운(pulldown) 생물학적 반복 실험의 실버 염색 젤은 높은 재현성을 보여주며 BRD four 단백질과 상호작용하는 단백질들을 나타냅니다. PTF B, CDK nine, Cyclin T 성분과 BRD nine 단백질이 다량 존재함은 BRD four 복합체가 특이적으로 캡처되었음을 확인시켜 줍니다. 젤에서는 BRD four의 잠재적 상호작용 인자로 확인된 다른 단백질들도 관찰되었습니다.

추가적인 예시로, Halo HD one 단백질을 이용하여 복합체 분리를 수행하였습니다. 이 경우, Halo 태그와 H DAC one 사이의 링커 부위를 절단하기 위해 TEV protease를 사용하였으며, 이를 통해 상당량의 HD one 미끼 단백질이 방출되는 것을 확인하였습니다.

HD one 풀다운 샘플은 높은 수준의 HD one 활성을 보였으며, 이는 HDA 억제제인 saha에 의해 억제되었습니다. 특이성을 추가로 입증하기 위해, sirtuin family 억제제인 EX 5 27에서는 HDA 억제가 관찰되지 않았으며, 버퍼만 사용했을 때는 신호가 검출되지 않았습니다. Halo BRD four 및 Halo HDAC one이 형질전환된 He A 세포는 TMR로 형광 표지되었습니다.

리간드 이미징 결과, 두 단백질 모두 핵으로 국소화되었으며, 태그가 융합 파트너의 생리학적 세포 내 국소화를 변화시키지 않았음을 보여주었습니다. 따라서 이 절차를 통해 분리된 단백질과 그 상호작용 파트너를 식별할 수 있으며, 질량 분석법 및 웨스턴 블로팅과 같은 다양한 분석 방법을 사용하여 추가로 분석할 수 있습니다.