Name: 깊은 프로테옴 Isobaric 라벨, 광범위 한 액체 크로마토그래피, 질량 분석 및 소프트웨어 기반 정량화 하 여 프로 파일링 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 37 s
Description: 배우세요 아이소바릭 라벨링과 광범위한 액체 크로마토그래피 및 질량 분석을 활용한 심층 프로테옴 정량화 방법을. 이 기술은 10,000개 이상의 단백질을 정확하게 정량하여 질병 바이오마커 발견에 활용할 수 있습니다.

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저자는 모든 다른 연구소 및 시설 회원을 도움이 토론에 대 한 감사합니다. 이 작품에 의해 부분적으로 지원 되었다 NI H R01GM114260, R01AG047928, R01AG053987, 및 ALSAC 부여. MS 분석 세인트 주드 어린이 연구 병원 Proteomics 시설, 보건원 암 센터 지원 그랜트 P30CA021765에 의해 부분적으로 지원 되는에서 수행 되었다. 저자에 대 한 원고를 편집 도움말 Nisha Badders 감사 합니다.

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저자는 공개 없다.

여러 출판물12,,1314,32에서에서 성공적으로 구현 되었습니다는 10-플렉스 isobaric 라벨 전략으로 단백질의 정량에 대 한 높은 처리 프로토콜 설명 . 이 프로토콜에서 우리 1 실험에서 최대 10 다른 생물학 단백질 견본을 분석할 수 있습니다. 우리는 정기적으로 식별 하 고 높은 자신감을가지고 잘 10000 단백질을 quantitate 수 있습니다. Isobaric 라벨은 단백질을 quantitate에 효과적인 기술, 비록 양적 부정확성으로 이어질 수 있는 비율 압축에 의해 제한 됩니다. LC/LC의 최적화와 함께 y1 이온 기반 post-MS 교정, MS/MS 설정 등 다양 한 전략을 사용 하 여 우리의 프로토콜 효과적으로 대부분의 간섭 효과 제거 하 고 따라서 상당히의...

차세대 시퀀싱 기술의 발전은 생물 학적 시스템을 연구 하 고 인간의 질병에 대 한 새로운 풍경에 이르렀다. 이 게놈, transcriptome, 프로테옴, 대사체, 및 유형 될 다른 분자 시스템의 측정의 많은 허용 하고있다. 질량 분석 (MS) 분석 화학에서 가장 중요 한 방법 중 하나 이며 proteomics에의 응용 인간 게놈 시퀀싱 후 급속 하 게 확장 했다. 프로 테오 믹스 분야에서 지난 몇 년 동안 MS 기반 정량 분석, isobaric 라벨 및 멀티플렉싱 계측 뿐만 아니라 광범위 한 액체 크로마토그래피와 결합 하는 기능을 포함 하 여 주요 기술 발전을 굴복 했다 진보, 더 빨리, 더 정확한 측정을 위해 필요한 적은 샘플 자료 허용. 양이 많은 proteomics 단백질과 posttranslational 수정 매우 복잡 한 생물 학적 샘플1,2,,34 에 수천 수만의 프로 파일링을 위한 주류 접근 되고있다 , 5 , 6.
멀티플렉스 isobaric 라벨 isobaric 태그 등 상대 및 절대 정량 (즉, iTRAQ) 및 탠덤 질량 태그 (TMT) MS는 크게 샘플 처리량 향상 방법과 단일에서 분석할 수 있는 샘플 수를 증가 실험1,6,,78. 다른 MS 기반 정량 방법과 함께 레이블 없는 정량 등 안정 동위 원소는 proteomics에 이러한 기술의 잠재력 세포 배양 (즉, 단기), 아미노산 라벨 필드는 상당한9 10,11. 예를 들어 방송 통신 방법 10 단백질 샘플 10 플렉스 시 약을 사용 하 여 1 실험에 함께 분석을 허용 한다. 이러한 구조적으로 동일 TMT 태그 같은 전체 질량, 하지만 무거운 동위 원소는 차동 상대 정량 함으로써 각 태그의 MS/MS 조각화 동안 독특한 기자 이온 인 탄소 또는 질소 원자에 배포 10 샘플 사이. 방송 통신 전략 생물 학적 경로, 질병의 진행 및 세포질 과정12,,1314에 정기적으로 적용 됩니다.
실질적인 기술 향상 액체 크로마토그래피 (LC)-MS/MS 시스템, LC 분판와 정량 정확도 희생 하지 않고도 단백질 식별을 최대화 하기 위해 MS 매개 변수 향상 했습니다. 에 2 차원 높은 직교로 분리 기술에 의해 펩 티 드의 첫 번째 차원 분리는이 유형의20최대 결과 달성 하기 위해 샷건 proteomics 방법에 중요 합니다. 높은 pH 반전 단계 액체 착 색 인쇄기 (RPLC)에 기존의 강한 이온-교환 크로마토그래피20보다 더 나은 성능을 제공 합니다. 분석 동적 범위와 단백질 범위 개선 높은 pH RPLC 낮은 pH RPLC의 두 번째 차원, 결합 될 때, 전체 프로테옴 분석15 를 수행할 때 표현한 단백질의 대량을 식별 하는 기능 결과 16,,1718. 기타 기술 진보 작은 C18 입자 (1.9 µ m)를 포함 하 고 긴 열 (~ 1 m)19를 확장. 또한, 다른 주목할 만한 개선 빠른 스캔 속도, 향상 된 감도 및 해상도20, MS 데이터 마이닝21에 대 한 정교한 생물 정보학 파이프라인 질량 분석기의 새 버전을 포함합니다.
여기, 우리는 실험을 통해 품질 관리 메커니즘에 집중 하면서 감도 처리량을 개선 하기 위해 수정 최신 방법론을 통합 하는 상세한 프로토콜을 설명 합니다. 프로토콜 포함 단백질 추출 및 소화, TMT 10-플렉스 라벨, 기본적인 pH 및 산 성 pH RPLC 분류, 고해상도 MS 검출 및 MS 데이터 처리 (그림 1). 또한, 우리는 문제 해결 하 고 실험적인 변화를 평가 하기 위한 여러 가지 품질 관리 단계를 구현 합니다. 이 상세한 프로토콜 연구원은 새로운 분야를 정기적으로 확인 하 고 정확 하 게는 lysate에서 단백질의 수천을 quantitate 도움을 것입니다 또는 조직.

<table><tbody><tr><td>1220 LC 시스템</td><td>애질런트</td><td>G4288B</td><td></td></tr><tr><td>50% 하이드록실아민</td><td>Thermo Scientific</td><td>90115</td><td></td></tr><tr><td>아세토니트릴</td><td>버딕 & Jackson</td><td>AH015-4</td><td></td></tr><tr><td>총알 블렌더</td><td>Next Advance</td><td>BB24-AU</td><td></td></tr><tr><td>버터플라이 포트폴리오 히터</td><td>Phoenix S& T</td><td>PST-BPH-20</td><td></td></tr><tr><td>C18 팁</td><td>Harvard Apparatus</td><td>74-4607</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma</td><td>D5545</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>41648</td><td></td></tr><tr><td>포름산</td><td>Sigma</td><td>94318</td><td></td></tr><tr><td>분획 수집기</td><td>Gilson</td><td>FC203B</td><td></td></tr><tr><td>유리 구슬</td><td>다음 Advance</td><td>GB05</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>시그마</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>요오드 아세트 아미드 (IAA)</td> <td>시그마</td><td>I6125</td><td></td></tr><tr><td>Lys-C</td><td>Wako</td><td>125-05061</td><td></td></tr><tr><td>메탄올</td><td>Burdick & Jackson</td><td>AH230-4</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA 단백질 분석 키트</td><td>, Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>질량 분석기</td>, <td>Thermo Scientific</td><td>Q Exactive HF</td><td></td></tr><tr><td>nanoflow UPLC</td><td>, Thermo Scientific</td><td>Ultimate 3000</td><td></td></tr><tr><td>ReproSil-Pur C18 resin, 1.9um</td><td>Dr. Maisch GmbH</td><td>r119.aq.0003</td><td></td></tr><tr><td>Self Pck Columns</td><td>New Objective</td><td>PF360-75-15-N-5</td><td></td></tr><tr><td>소듐 데옥시콜레이트</td><td>Sigma</td><td>30970</td><td></td></tr><tr><td>Speedva</td><td>Thermo Scientific</td><td>SPD11V</td><td></td></tr><tr><td>TMT 10plex 등압 라벨 시약</td><td>Thermo Scientific</td><td>90110</td><td></td></tr><tr><td>트리플루오로아세트산(TFA)</td><td>Applied Biosystems</td><td>400003</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Promega</td><td>V511C</td><td></td></tr><tr><td>요소</td><td>Sigma</td><td>U5378</td><td></td></tr><tr><td>Xbridge 컬럼 C18 컬럼</td><td>Waters</td><td>186003943</td><td></td></tr><tr><td>Ziptips C18</td><td>Millipore</td><td>ZTC18S096</td><td></td></tr><tr><td>SepPak 1cc 50mg</td><td>Waters</td><td>WAT054960</td><td></td></tr></tbody></table>

깊은 프로테옴 isobaric 라벨, 광범위 한 액체 크로마토그래피, 질량 분석 및 소프트웨어 기반 정량화 하 여 프로 파일링

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

많은 뛰어난 발전 질량 분석 (MS)에서 만들어진-proteomics, 액체 크로마토그래피 (LC)에 특정 기술 진보와 함께 탠덤 질량 분석 (LC-MS/MS)을 isobaric 라벨 멀티플렉싱 용량 결합을 기반으로. 여기, 우리는 광범위 한 LC/LC-MS/MS 플랫폼, 그리고 정확 하 게 전체 proteomes을 quantitate 후 MS 전산 간섭 보정 10-플렉스 연동 대량 태그 (TMT) 라벨을 결합 하는 깊은 단백질 프로 파일링 프로토콜을 소개 합니다. 다음과 같은 주요 단계를 포함 하는이 프로토콜: 단백질 추출 및 소화, TMT 라벨, 2 차원 (2D) LC, 고해상도 질량 분석 및 전산 데이터 처리. 품질 관리 단계는 문제 해결 및 실험적인 변화를 평가 합니다. 포유류 샘플에서 10000 개 이상의 단백질이 프로토콜 자신 있게 quantitated 될 수 있습니다. 이 프로토콜의 사소한 변화를 가진 포스트 번역 상 수정 정량에도 적용할 수 있습니다. 다중화, 강력한 방법이 다양 한 세포 배양, 동물의 조직, 그리고 인간의 임상 들을 포함 하 여 복잡 한 샘플에서에서 proteomic 분석을 위한 강력한 도구를 제공 합니다.

우리는 pre-MS 분류, MS 설정 및 post-MS 수정23를 포함 하 여 3 주요 프로토콜 단계에서 비율 압축의 효과 체계적으로 분석 하는 앞에서 설명한 간 종 펩 티 드 믹스를 사용. Pre-MS 분류 평가 되었고 기본적인 pH RPLC의 조합 및 산 성 pH RPLC 사용 하 여 최적화 된. Post-MS 분석만 종의 펩 티 드로 간주 됐다. 이 간섭 모델 LC/LC-MS/MS, MS2 격리 창, 온라인 액정 해상도, 로드 양의 온라인 산 성 pH RPLC, 및 오프 라인 높은 pH RPLC의 해상도 포함 하 여 매개 변수를 검사 하는을 사용 하는 우리 (참조 그림 3 참조 29)입니다.
오프 라인 LC 중 해상도 변...

우리는 정확 하 게 액체 크로마토그래피 고해상도 질량 분석기에 인터페이스와 isobaric 라벨, 광범위 한 분류, 생물 정보학 도구, 그리고 품질 관리 단계에에서는 단백질을 quantitate 프로토콜을 제시.

깊은 프로테옴 Isobaric 라벨, 광범위 한 액체 크로마토그래피, 질량 분석 및 소프트웨어 기반 정량화 하 여 프로 파일링

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

이 실험의 전반적인 목표는 10 이상, 다른 약 처리, 시간 과정 또는 생물학 조건에 의하여 용해된 세포 조직에서 단백질을 정확하게 확인하고 정량화하기 위한 것이다. 이 방법은 약물 또는 기타 생물학적 자극에 대한 반응으로 단백질이 어떻게 변화하는지와 같은 의학 또는 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 10가지 다른 실험 조건에서 발현된 단백질체의 70% 이상을 정확하게 정량화할 수 있다는 것입니다.이 기술의 의미는 잠재적인 바이오마커 발견을 통해 인간 질병 진단으로 확장될 수 있습니다. 최적의 세포 용해 및 유체 추정이 다운스트림 분해, 라벨링 및 분리 절차에서 중요한 역할을 하기 때문에 이 방법을 시각적으로 시연하는 것이 중요합니다. 이 프로토콜을 시작하려면 관심 배양 세포를 얻습니다.각 세척에 대해 10ml의 PBS를 사용하여 세포를 두 번 세척합니다. 세척된 세포를 긁어내어 1ml의 PBS가 들어 있는 1.5ml 튜브에 넣습니다. 600 회 g과 섭씨 4도에서 5 분 동안 원심 분리기.상층액을 제거하고 세포를 용해할 준비가 될 때까지 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 해부 후 신속하게 원하는 조직을 수집하고 무게를 잰다. 그 후, 즉시 액체 질소에 보관하고 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오.텍스트 프로토콜에 설명된 대로 실험 당일에 lysis buffer를 준비합니다. 완충액 대 시료 비율이 10:1이고 최종 단백질 농도가 밀리리터당 5-10밀리그램이 되도록 동결 샘플에 용해 완충액을 추가합니다. 다음으로, 유리 구슬을 넣고 블렌더를 사용하여 섭씨 4도에서 샘플을 용해하고 30초 동안 블렌딩한 다음 5초 동안 휴지시켜 5회 또는 샘플이 균질화될 때까지 반복하여 8도의 속도를 냅니다.표준 단백질 정량 분석 분석 또는 BSA를 표준으로 하는 Coomassie 염색 SDS 폴리아크릴아미드 겔을 사용하여 단백질 농도를 측정합니다. 그 후, 최종 농도가 10%이고 Lys-C 프로테아제가 효소 대 기질 비율이 1:100이 되도록 100% 아세토니트릴을 첨가합니다. 단백질 소화가 일어날 수 있도록 실온에서 2시간 동안 배양합니다.그런 다음 최종 농도가 1밀리몰이 되도록 DTT를 추가합니다. 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 다음으로, 샘플의 요소 농도가 2 어금니로 희석 될 때까지 50 밀리 몰 HEPES를 첨가하십시오.트립신을 1:50의 트립신 대 단백질 비율로 각 샘플에 추가합니다. 실온에서 최소 3시간 동안 배양합니다. 다음으로, 농도가 다시 1밀리몰이 될 때까지 DTT를 첨가하고 실온에서 2시간 동안 배양합니다.최종 농도가 10밀리몰이 되도록 요오드아세트아미드를 첨가합니다. 실온에서 30분 동안 어두운 곳에서 배양합니다. 그런 다음 최종 농도가 30밀리몰이 되도록 DTT를 첨가하여 반응하지 않은 요오드아세트아미드를 담금질합니다.실온에서 30분 동안 배양합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 트립신 분해의 효율성을 확인합니다. 다음으로, 최종 농도가 1%가 되도록 각 샘플에 TFA를 추가합니다.pH 스트립을 사용하여 각 샘플의 pH를 측정하여 2에서 3 사이인지 확인합니다.허용할 수 없는 pH에 도달하기 위해 필요한 경우 TFA 강하를 추가로 추가합니다. 20의, 000 시간 g 및 10 분 동안 실내 온도에 표본을 원심 분리하십시오. 상층액을 수집하고 샘플을 준비된 스핀 컬럼에 로드합니다.g를 100배로 3분 동안 또는 샘플이 컬럼을 완전히 통과하여 샘플을 결합할 때까지 원심분리기를 사용합니다. 그런 다음 각 열에 0.5ml의 0.1%TFA를 추가합니다. 500회 g에서 30초 동안 원심분리기.그런 다음 각 컬럼에 60% 아세토니트릴과 0.1 TFA를 함유한 용액 125마이크로리터를 추가합니다. 100배 g에서 3분 동안 원심분리기를 사용하여 컬럼에서 펩타이드를 용리합니다. 각 탈염 펩타이드 샘플을 50마이크로리터의 50밀리몰 HEPES로 재구성합니다.pH 스트립을 사용하여 각 샘플의 pH가 7에서 8 사이인지 확인합니다. 다음으로, TMT 시약을 무수 아세토니트릴에 용해시켜 샘플에 첨가한 다음 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 크로마토그래피 매체가 내장된 10마이크로리터 피펫 팁을 사용하여 각 샘플의 1마이크로그램을 탈염하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 라벨링 효율성을 분석합니다.6-10개의 개별 펩타이드를 검사하여 라벨링되지 않은 펩타이드가 라벨링된 샘플에서 검출되지 않는지 확인합니다. 그런 다음 각 샘플을 약 2마이크로리터씩 섞습니다. 크로마토그래피 매체가 내장된 10마이크로리터 피펫 팁을 사용하여 이 혼합물을 탈염합니다.텍스트 프로토콜에 설명된 대로 LC-MS/MS로 샘플을 분석합니다. 먼저 65마이크로리터의 완충액 A.에 탈염된 풀링 TMT 표지 펩타이드 샘플을 가용화합니다. pH 스트립을 사용하여 pH가 약 8.0인지 확인합니다. 샘플이 여전히 산성인 경우 수산화암모늄을 사용하여 필요에 따라 pH를 조정합니다.다음으로, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 샘플을 분별합니다. 로딩 시간을 포함하여 2분마다 분수를 수집하도록 분획 수집기를 설정합니다. 유속을 분당 0.4밀리리터로 설정합니다.총 80개의 분수를 모으십시오. 그런 다음 진공 농축기를 사용하여 다른 모든 샘플을 완전히 건조시킵니다. LC-MS/MS를 사용하여 80개의 모든 분획을 분석하여 매우 깊은 단백질체 커버리지를 달성합니다.먼저, 1.9마이크로미터 C18 수지를 75마이크로미터 내경의 빈 컬럼에 포장하여 약 1.3마이크로리터의 베드 부피에 도달합니다. 버터플라이 포트폴리오 히터 내부에 컬럼을 두세 번 감아 전체 길이가 가열되도록 합니다. 히터의 온도 센서 위에 테이프를 붙이지 않도록 히터 내부에 기둥을 테이프로 붙입니다.그런 다음 컬럼을 섭씨 65도까지 가열합니다. LC-MS/MS 시스템을 통해 100나노그램의 쥐 뇌 펩타이드를 실행하여 시스템의 품질을 평가합니다. 이 평가를 한 번 더 반복합니다.그 후, 약 0.2마이크로그램의 재구성된 펩타이드를 컬럼에 로드하고 5%완충액 A를 흐르게 하고 컬럼에서 펩타이드를 용리하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 질량 분석기로 분석합니다. 이 연구에서는 10-plex isobaric labeling 전략을 사용하여 단백질을 정량화하기 위한 고처리량 방법에 대해 설명합니다. TMT 라벨링 효율성은 LC-MS/MS를 사용하여 TMT 라벨링 샘플 및 해당 라벨링되지 않은 샘플을 분석합니다.보시다시피, 표지되지 않은 펩타이드 피크는 표지되지 않은 샘플에서만 발견되는 반면, TMT 표지된 펩타이드 피크는 표지된 샘플에서만 발견됩니다. 다음으로, MS2 격리 창이 간섭에 미치는 영향을 평가합니다. 모든 MS2 검사는 클린 스캔 또는 노이즈 스캔으로 지정됩니다.클린 스캔은 라이신의 y1 이온만 나타내는 반면, 노이즈가 있는 스캔은 라이신과 아르기닌 모두에서 이온을 나타냅니다. 세 가지 다른 TMT 시약으로 개별적으로 라벨링된 E.coli 펩타이드를 사용한 대표적인 간섭 제거가 여기에 나와 있습니다. 합산된 상대 강도는 y1 이온 기반 보정이 TMT 기반 정량화에 더 정확하다는 것을 보여줍니다.일단 마스터하면 이 프로토콜은 제대로 수행되면 4-5주 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 최종 데이터 세트가 가능한 한 정확한지 확인하기 위해 모든 품질 관리 단계가 완전히 수행되었는지 확인하는 것이 매우 중요합니다. 이 절차를 번역후 변형에 초점을 맞추면 유비퀴틴화(ubiquitination), 인산화(phosphorylation) 또는 아세틸화(acetylation)가 질병 진행 또는 약물 치료에 대응하여 어떻게 변화하고 있는지와 같은 다른 질문에 답할 수 있습니다.개발 후 이 기술은 제품 분야의 연구자들이 세포와 조직의 단백질 변화를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 영상을 본 후에, 당신은 포유류 세포 또는 조직에서 10, 000의 단백질 이상 확인하고 정확하게 양을 정하는 방법의 아주 좋은 이해가 있어야 한다. 고압 UPLC와 소수의 실리카 컬럼으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 보안경 착용과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.우리는 등압 라벨링에서 발생하는 알려진 비율 압축 문제를 해결하기 시작했을 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 갖게 되었습니다. 우리는 광범위한 분획이 이 문제를 완화할 뿐만 아니라 단백질체 분석을 더욱 증가시키고 적응시킬 수 있는 단백질 및 펩타이드의 식별을 증가시키는 좋은 방법이라는 것을 깨달았습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

여기에서 우리는 완전히 15 N 표시 애기 장대 세포 배양 레이블의 혼합물에 따라 세제 저항하고 세제 용해 막에 식물 세포막의 분별과 생체 내에서 강력한 방법을 설명합니다. 절차는 시그널링 프로세스를 이해하기 위해, 비교 단백체 연구에 적용된다.

비교 단백체 분석을위한 신진 대사 라벨링 및 막 분별<em&gt; 애기 장대</em&gt; 서스펜션 세포 배양

환원 디메틸 화 (REDI 라벨)에 의해 펩티드의 안정 동위 원소 표지 정확한 질량 분석 기반의 정량 프로테오믹스에 대한 신속하고 저렴한 전략이다. 여기에서 우리는 거의 모든 샘플 유형에 적용 할 수있는 한 Redi 방식을 사용하여 단백질의 혼합물의 제조 및 분석을위한 강력한 방법을 보여준다.

안정 동위 원소 라벨링 환원성 디메틸 화를 사용하여 정량 프로테오믹스

암세포 단백질체에 대한 심층 분석은 새로운 약물 표적 및 진단 바이오마커의 식별을 용이하게 합니다. 우리는 액체 및 고체 종양에서 유래한 암세포 하위 집단에서 (인) 단백질체의 정량 분석을 위한 실험적 워크플로우를 설명합니다. 이는 세포 농축 전략과 정량적 Super-SILAC 기반 질량 분석법을 결합하여 달성됩니다.

액체 및 고체 종양 유래의 암세포 프로테옴 정량적 질량 분석 프로파일

결합 전구체 동위 원소 라벨 및 동중 태그 (cPILOT)은 동중 태그의 샘플 다중화 기능을 향상 정량 프로테오믹스 전략이다. 이 프로토콜은 알츠하이머 병 마우스 모델 및 야생 형 컨트롤에서 조직에 cPILOT의 응용 프로그램을 설명합니다.

향상된 샘플 복합 전구체 동위 원소 표지 및 동중 태그를 사용하여 조직의 다중 (cPILOT)

여기에서 우리는 라벨 무료 양적 질량 분석을 사용하여 단백질 상관 프로파일 다음에 친 화성이 단백질 복합체의 정화 및 파란색 기본 페이지에서 자신의 분리를위한 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 서로 다른 단백질 복합체에 상호 작용 체를 해결하는 데 유용합니다.

블루 기본 페이지와 단백질 상관 관계 프로파일 링에 의한 선호도 정제 단백질 복합체 해결

기재된 단백질 은 관심 있는 주어진 단백질및 무표지 질량 분석법의 면역친화성 농축을 사용하여 핵 세포 분획으로부터 단백질 상호작용 파트너를 식별하기 위한 프로테오믹스 워크플로우이다. 워크플로우에는 세포외 분획, 면역 침전, 필터 보조 시료 준비, 오프라인 정리, 질량 분석 법 및 다운스트림 생물 정보학 파이프라인이 포함됩니다.

대규모 핵 상호 작용 프로파일링을 위한 라벨 없는 면역 침전 질량 분광 워크플로우

단백질 추출, 정량화, 강수량, 소화, 라벨링, 프로테오믹스 시설에 대한 제출, 데이터 분석 등 각 단계에 대한 자세한 정보를 포함하는 최적화된 탠덤 질량 태그(TMT) 라벨링 프로토콜을 제시합니다.

프로테오믹스 시설 제출 및 후속 데이터 분석을 위한 TMT 샘플 준비

결합된 전구체 동위원소 라벨링 및 동위원소 태그(cPILOT)는 사용 가능한 동면 태그와 함께 동시에 분석할 수 있는 샘플 수를 증가시킬 수 있는 향상된 샘플 멀티플렉스 전략입니다. 로봇 플랫폼의 통합은 실험 처리량, 재현성 및 정량적 정확도를 크게 증가시켰습니다.

결합된 전구체 이소토픽 라벨링 및 동서성 태그(cPILOT)를 사용하여 자동화된 샘플 멀티플렉스

설명된 프로토콜은 라벨 기반 및 라벨 자유 양수의 두 가지 접근법을 사용하여 조직 샘플의 최적화된 정량 적 프로테오믹스 분석을 제공합니다. 라벨 기반 접근법은 단백질의 보다 정확한 양을 얻을 수 있는 장점이 있으며, 라벨없는 접근법은 비용 효율적이며 코호트의 수백 가지 샘플을 분석하는 데 사용됩니다.

조직 샘플의 질량 분광계 기반 산탄총 프로테오믹스의 포괄적인 워크플로우

단백질 티올 산화는 정상적인 생리적 및 병리생리학적 조건 하에서 중요한 의미를 갖는다. 자사는 수지 보조 포획, 등압 표지 및 질량분석법을 활용하여 단백질의 가역적으로 산화된 시스테인 잔기의 부위별 식별 및 정량화를 가능하게 하는 정량적 산화 환원 단백질체학 방법의 세부 사항을 설명합니다.

단백질 티올 산화의 다중화 정량화를 위한 등압 탠덤 질량 태그 라벨링과 결합된 수지 보조 포획

배우세요 아이소바릭 라벨링과 광범위한 액체 크로마토그래피 및 질량 분석을 활용한 심층 프로테옴 정량화 방법을. 이 기술은 10,000개 이상의 단백질을 정확하게 정량하여 질병 바이오마커 발견에 활용할 수 있습니다.

깊은 프로테옴 Isobaric 라벨, 광범위 한 액체 크로마토그래피, 질량 분석 및 소프트웨어 기반 정량화 하 여 프로 파일링

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