Name: 깊은 프로테옴 Isobaric 라벨, 광범위 한 액체 크로마토그래피, 질량 분석 및 소프트웨어 기반 정량화 하 여 프로 파일링 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 37 s
Description: 배우세요 아이소바릭 라벨링과 광범위한 액체 크로마토그래피 및 질량 분석을 활용한 심층 프로테옴 정량화 방법을. 이 기술은 10,000개 이상의 단백질을 정확하게 정량하여 질병 바이오마커 발견에 활용할 수 있습니다.

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저자는 모든 다른 연구소 및 시설 회원을 도움이 토론에 대 한 감사합니다. 이 작품에 의해 부분적으로 지원 되었다 NI H R01GM114260, R01AG047928, R01AG053987, 및 ALSAC 부여. MS 분석 세인트 주드 어린이 연구 병원 Proteomics 시설, 보건원 암 센터 지원 그랜트 P30CA021765에 의해 부분적으로 지원 되는에서 수행 되었다. 저자에 대 한 원고를 편집 도움말 Nisha Badders 감사 합니다.

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저자는 공개 없다.

여러 출판물12,,1314,32에서에서 성공적으로 구현 되었습니다는 10-플렉스 isobaric 라벨 전략으로 단백질의 정량에 대 한 높은 처리 프로토콜 설명 . 이 프로토콜에서 우리 1 실험에서 최대 10 다른 생물학 단백질 견본을 분석할 수 있습니다. 우리는 정기적으로 식별 하 고 높은 자신감을가지고 잘 10000 단백질을 quantitate 수 있습니다. Isobaric 라벨은 단백질을 quantitate에 효과적인 기술, 비록 양적 부정확성으로 이어질 수 있는 비율 압축에 의해 제한 됩니다. LC/LC의 최적화와 함께 y1 이온 기반 post-MS 교정, MS/MS 설정 등 다양 한 전략을 사용 하 여 우리의 프로토콜 효과적으로 대부분의 간섭 효과 제거 하 고 따라서 상당히의...

차세대 시퀀싱 기술의 발전은 생물 학적 시스템을 연구 하 고 인간의 질병에 대 한 새로운 풍경에 이르렀다. 이 게놈, transcriptome, 프로테옴, 대사체, 및 유형 될 다른 분자 시스템의 측정의 많은 허용 하고있다. 질량 분석 (MS) 분석 화학에서 가장 중요 한 방법 중 하나 이며 proteomics에의 응용 인간 게놈 시퀀싱 후 급속 하 게 확장 했다. 프로 테오 믹스 분야에서 지난 몇 년 동안 MS 기반 정량 분석, isobaric 라벨 및 멀티플렉싱 계측 뿐만 아니라 광범위 한 액체 크로마토그래피와 결합 하는 기능을 포함 하 여 주요 기술 발전을 굴복 했다 진보, 더 빨리, 더 정확한 측정을 위해 필요한 적은 샘플 자료 허용. 양이 많은 proteomics 단백질과 posttranslational 수정 매우 복잡 한 생물 학적 샘플1,2,,34 에 수천 수만의 프로 파일링을 위한 주류 접근 되고있다 , 5 , 6.
멀티플렉스 isobaric 라벨 isobaric 태그 등 상대 및 절대 정량 (즉, iTRAQ) 및 탠덤 질량 태그 (TMT) MS는 크게 샘플 처리량 향상 방법과 단일에서 분석할 수 있는 샘플 수를 증가 실험1,6,,78. 다른 MS 기반 정량 방법과 함께 레이블 없는 정량 등 안정 동위 원소는 proteomics에 이러한 기술의 잠재력 세포 배양 (즉, 단기), 아미노산 라벨 필드는 상당한9 10,11. 예를 들어 방송 통신 방법 10 단백질 샘플 10 플렉스 시 약을 사용 하 여 1 실험에 함께 분석을 허용 한다. 이러한 구조적으로 동일 TMT 태그 같은 전체 질량, 하지만 무거운 동위 원소는 차동 상대 정량 함으로써 각 태그의 MS/MS 조각화 동안 독특한 기자 이온 인 탄소 또는 질소 원자에 배포 10 샘플 사이. 방송 통신 전략 생물 학적 경로, 질병의 진행 및 세포질 과정12,,1314에 정기적으로 적용 됩니다.
실질적인 기술 향상 액체 크로마토그래피 (LC)-MS/MS 시스템, LC 분판와 정량 정확도 희생 하지 않고도 단백질 식별을 최대화 하기 위해 MS 매개 변수 향상 했습니다. 에 2 차원 높은 직교로 분리 기술에 의해 펩 티 드의 첫 번째 차원 분리는이 유형의20최대 결과 달성 하기 위해 샷건 proteomics 방법에 중요 합니다. 높은 pH 반전 단계 액체 착 색 인쇄기 (RPLC)에 기존의 강한 이온-교환 크로마토그래피20보다 더 나은 성능을 제공 합니다. 분석 동적 범위와 단백질 범위 개선 높은 pH RPLC 낮은 pH RPLC의 두 번째 차원, 결합 될 때, 전체 프로테옴 분석15 를 수행할 때 표현한 단백질의 대량을 식별 하는 기능 결과 16,,1718. 기타 기술 진보 작은 C18 입자 (1.9 µ m)를 포함 하 고 긴 열 (~ 1 m)19를 확장. 또한, 다른 주목할 만한 개선 빠른 스캔 속도, 향상 된 감도 및 해상도20, MS 데이터 마이닝21에 대 한 정교한 생물 정보학 파이프라인 질량 분석기의 새 버전을 포함합니다.
여기, 우리는 실험을 통해 품질 관리 메커니즘에 집중 하면서 감도 처리량을 개선 하기 위해 수정 최신 방법론을 통합 하는 상세한 프로토콜을 설명 합니다. 프로토콜 포함 단백질 추출 및 소화, TMT 10-플렉스 라벨, 기본적인 pH 및 산 성 pH RPLC 분류, 고해상도 MS 검출 및 MS 데이터 처리 (그림 1). 또한, 우리는 문제 해결 하 고 실험적인 변화를 평가 하기 위한 여러 가지 품질 관리 단계를 구현 합니다. 이 상세한 프로토콜 연구원은 새로운 분야를 정기적으로 확인 하 고 정확 하 게는 lysate에서 단백질의 수천을 quantitate 도움을 것입니다 또는 조직.

<table><tbody><tr><td>1220 LC 시스템</td><td>애질런트</td><td>G4288B</td><td></td></tr><tr><td>50% 하이드록실아민</td><td>Thermo Scientific</td><td>90115</td><td></td></tr><tr><td>아세토니트릴</td><td>버딕 & Jackson</td><td>AH015-4</td><td></td></tr><tr><td>총알 블렌더</td><td>Next Advance</td><td>BB24-AU</td><td></td></tr><tr><td>버터플라이 포트폴리오 히터</td><td>Phoenix S& T</td><td>PST-BPH-20</td><td></td></tr><tr><td>C18 팁</td><td>Harvard Apparatus</td><td>74-4607</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma</td><td>D5545</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>41648</td><td></td></tr><tr><td>포름산</td><td>Sigma</td><td>94318</td><td></td></tr><tr><td>분획 수집기</td><td>Gilson</td><td>FC203B</td><td></td></tr><tr><td>유리 구슬</td><td>다음 Advance</td><td>GB05</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>시그마</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>요오드 아세트 아미드 (IAA)</td> <td>시그마</td><td>I6125</td><td></td></tr><tr><td>Lys-C</td><td>Wako</td><td>125-05061</td><td></td></tr><tr><td>메탄올</td><td>Burdick & Jackson</td><td>AH230-4</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA 단백질 분석 키트</td><td>, Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>질량 분석기</td>, <td>Thermo Scientific</td><td>Q Exactive HF</td><td></td></tr><tr><td>nanoflow UPLC</td><td>, Thermo Scientific</td><td>Ultimate 3000</td><td></td></tr><tr><td>ReproSil-Pur C18 resin, 1.9um</td><td>Dr. Maisch GmbH</td><td>r119.aq.0003</td><td></td></tr><tr><td>Self Pck Columns</td><td>New Objective</td><td>PF360-75-15-N-5</td><td></td></tr><tr><td>소듐 데옥시콜레이트</td><td>Sigma</td><td>30970</td><td></td></tr><tr><td>Speedva</td><td>Thermo Scientific</td><td>SPD11V</td><td></td></tr><tr><td>TMT 10plex 등압 라벨 시약</td><td>Thermo Scientific</td><td>90110</td><td></td></tr><tr><td>트리플루오로아세트산(TFA)</td><td>Applied Biosystems</td><td>400003</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Promega</td><td>V511C</td><td></td></tr><tr><td>요소</td><td>Sigma</td><td>U5378</td><td></td></tr><tr><td>Xbridge 컬럼 C18 컬럼</td><td>Waters</td><td>186003943</td><td></td></tr><tr><td>Ziptips C18</td><td>Millipore</td><td>ZTC18S096</td><td></td></tr><tr><td>SepPak 1cc 50mg</td><td>Waters</td><td>WAT054960</td><td></td></tr></tbody></table>

깊은 프로테옴 isobaric 라벨, 광범위 한 액체 크로마토그래피, 질량 분석 및 소프트웨어 기반 정량화 하 여 프로 파일링

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

많은 뛰어난 발전 질량 분석 (MS)에서 만들어진-proteomics, 액체 크로마토그래피 (LC)에 특정 기술 진보와 함께 탠덤 질량 분석 (LC-MS/MS)을 isobaric 라벨 멀티플렉싱 용량 결합을 기반으로. 여기, 우리는 광범위 한 LC/LC-MS/MS 플랫폼, 그리고 정확 하 게 전체 proteomes을 quantitate 후 MS 전산 간섭 보정 10-플렉스 연동 대량 태그 (TMT) 라벨을 결합 하는 깊은 단백질 프로 파일링 프로토콜을 소개 합니다. 다음과 같은 주요 단계를 포함 하는이 프로토콜: 단백질 추출 및 소화, TMT 라벨, 2 차원 (2D) LC, 고해상도 질량 분석 및 전산 데이터 처리. 품질 관리 단계는 문제 해결 및 실험적인 변화를 평가 합니다. 포유류 샘플에서 10000 개 이상의 단백질이 프로토콜 자신 있게 quantitated 될 수 있습니다. 이 프로토콜의 사소한 변화를 가진 포스트 번역 상 수정 정량에도 적용할 수 있습니다. 다중화, 강력한 방법이 다양 한 세포 배양, 동물의 조직, 그리고 인간의 임상 들을 포함 하 여 복잡 한 샘플에서에서 proteomic 분석을 위한 강력한 도구를 제공 합니다.

우리는 pre-MS 분류, MS 설정 및 post-MS 수정23를 포함 하 여 3 주요 프로토콜 단계에서 비율 압축의 효과 체계적으로 분석 하는 앞에서 설명한 간 종 펩 티 드 믹스를 사용. Pre-MS 분류 평가 되었고 기본적인 pH RPLC의 조합 및 산 성 pH RPLC 사용 하 여 최적화 된. Post-MS 분석만 종의 펩 티 드로 간주 됐다. 이 간섭 모델 LC/LC-MS/MS, MS2 격리 창, 온라인 액정 해상도, 로드 양의 온라인 산 성 pH RPLC, 및 오프 라인 높은 pH RPLC의 해상도 포함 하 여 매개 변수를 검사 하는을 사용 하는 우리 (참조 그림 3 참조 29)입니다.
오프 라인 LC 중 해상도 변...

우리는 정확 하 게 액체 크로마토그래피 고해상도 질량 분석기에 인터페이스와 isobaric 라벨, 광범위 한 분류, 생물 정보학 도구, 그리고 품질 관리 단계에에서는 단백질을 quantitate 프로토콜을 제시.

깊은 프로테옴 Isobaric 라벨, 광범위 한 액체 크로마토그래피, 질량 분석 및 소프트웨어 기반 정량화 하 여 프로 파일링

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

이 실험의 전반적인 목표는 10 이상, 다른 약 처리, 시간 과정 또는 생물학 조건에 의하여 용해된 세포 조직에서 단백질을 정확하게 확인하고 정량화하기 위한 것이다. 이 방법은 약물 또는 기타 생물학적 자극에 대한 반응으로 단백질이 어떻게 변화하는지와 같은 의학 또는 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 10가지 다른 실험 조건에서 발현된 단백질체의 70% 이상을 정확하게 정량화할 수 있다는 것입니다.이 기술의 의미는 잠재적인 바이오마커 발견을 통해 인간 질병 진단으로 확장될 수 있습니다. 최적의 세포 용해 및 유체 추정이 다운스트림 분해, 라벨링 및 분리 절차에서 중요한 역할을 하기 때문에 이 방법을 시각적으로 시연하는 것이 중요합니다. 이 프로토콜을 시작하려면 관심 배양 세포를 얻습니다.각 세척에 대해 10ml의 PBS를 사용하여 세포를 두 번 세척합니다. 세척된 세포를 긁어내어 1ml의 PBS가 들어 있는 1.5ml 튜브에 넣습니다. 600 회 g과 섭씨 4도에서 5 분 동안 원심 분리기.상층액을 제거하고 세포를 용해할 준비가 될 때까지 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 해부 후 신속하게 원하는 조직을 수집하고 무게를 잰다. 그 후, 즉시 액체 질소에 보관하고 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오.텍스트 프로토콜에 설명된 대로 실험 당일에 lysis buffer를 준비합니다. 완충액 대 시료 비율이 10:1이고 최종 단백질 농도가 밀리리터당 5-10밀리그램이 되도록 동결 샘플에 용해 완충액을 추가합니다. 다음으로, 유리 구슬을 넣고 블렌더를 사용하여 섭씨 4도에서 샘플을 용해하고 30초 동안 블렌딩한 다음 5초 동안 휴지시켜 5회 또는 샘플이 균질화될 때까지 반복하여 8도의 속도를 냅니다.표준 단백질 정량 분석 분석 또는 BSA를 표준으로 하는 Coomassie 염색 SDS 폴리아크릴아미드 겔을 사용하여 단백질 농도를 측정합니다. 그 후, 최종 농도가 10%이고 Lys-C 프로테아제가 효소 대 기질 비율이 1:100이 되도록 100% 아세토니트릴을 첨가합니다. 단백질 소화가 일어날 수 있도록 실온에서 2시간 동안 배양합니다.그런 다음 최종 농도가 1밀리몰이 되도록 DTT를 추가합니다. 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 다음으로, 샘플의 요소 농도가 2 어금니로 희석 될 때까지 50 밀리 몰 HEPES를 첨가하십시오.트립신을 1:50의 트립신 대 단백질 비율로

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

여기에서 우리는 완전히 15 N 표시 애기 장대 세포 배양 레이블의 혼합물에 따라 세제 저항하고 세제 용해 막에 식물 세포막의 분별과 생체 내에서 강력한 방법을 설명합니다. 절차는 시그널링 프로세스를 이해하기 위해, 비교 단백체 연구에 적용된다.

비교 단백체 분석을위한 신진 대사 라벨링 및 막 분별<em&gt; 애기 장대</em&gt; 서스펜션 세포 배양

환원 디메틸 화 (REDI 라벨)에 의해 펩티드의 안정 동위 원소 표지 정확한 질량 분석 기반의 정량 프로테오믹스에 대한 신속하고 저렴한 전략이다. 여기에서 우리는 거의 모든 샘플 유형에 적용 할 수있는 한 Redi 방식을 사용하여 단백질의 혼합물의 제조 및 분석을위한 강력한 방법을 보여준다.

안정 동위 원소 라벨링 환원성 디메틸 화를 사용하여 정량 프로테오믹스

암세포 단백질체에 대한 심층 분석은 새로운 약물 표적 및 진단 바이오마커의 식별을 용이하게 합니다. 우리는 액체 및 고체 종양에서 유래한 암세포 하위 집단에서 (인) 단백질체의 정량 분석을 위한 실험적 워크플로우를 설명합니다. 이는 세포 농축 전략과 정량적 Super-SILAC 기반 질량 분석법을 결합하여 달성됩니다.

액체 및 고체 종양 유래의 암세포 프로테옴 정량적 질량 분석 프로파일

결합 전구체 동위 원소 라벨 및 동중 태그 (cPILOT)은 동중 태그의 샘플 다중화 기능을 향상 정량 프로테오믹스 전략이다. 이 프로토콜은 알츠하이머 병 마우스 모델 및 야생 형 컨트롤에서 조직에 cPILOT의 응용 프로그램을 설명합니다.

향상된 샘플 복합 전구체 동위 원소 표지 및 동중 태그를 사용하여 조직의 다중 (cPILOT)

여기에서 우리는 라벨 무료 양적 질량 분석을 사용하여 단백질 상관 프로파일 다음에 친 화성이 단백질 복합체의 정화 및 파란색 기본 페이지에서 자신의 분리를위한 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 서로 다른 단백질 복합체에 상호 작용 체를 해결하는 데 유용합니다.

블루 기본 페이지와 단백질 상관 관계 프로파일 링에 의한 선호도 정제 단백질 복합체 해결

기재된 단백질 은 관심 있는 주어진 단백질및 무표지 질량 분석법의 면역친화성 농축을 사용하여 핵 세포 분획으로부터 단백질 상호작용 파트너를 식별하기 위한 프로테오믹스 워크플로우이다. 워크플로우에는 세포외 분획, 면역 침전, 필터 보조 시료 준비, 오프라인 정리, 질량 분석 법 및 다운스트림 생물 정보학 파이프라인이 포함됩니다.

대규모 핵 상호 작용 프로파일링을 위한 라벨 없는 면역 침전 질량 분광 워크플로우

단백질 추출, 정량화, 강수량, 소화, 라벨링, 프로테오믹스 시설에 대한 제출, 데이터 분석 등 각 단계에 대한 자세한 정보를 포함하는 최적화된 탠덤 질량 태그(TMT) 라벨링 프로토콜을 제시합니다.

프로테오믹스 시설 제출 및 후속 데이터 분석을 위한 TMT 샘플 준비

결합된 전구체 동위원소 라벨링 및 동위원소 태그(cPILOT)는 사용 가능한 동면 태그와 함께 동시에 분석할 수 있는 샘플 수를 증가시킬 수 있는 향상된 샘플 멀티플렉스 전략입니다. 로봇 플랫폼의 통합은 실험 처리량, 재현성 및 정량적 정확도를 크게 증가시켰습니다.

결합된 전구체 이소토픽 라벨링 및 동서성 태그(cPILOT)를 사용하여 자동화된 샘플 멀티플렉스

설명된 프로토콜은 라벨 기반 및 라벨 자유 양수의 두 가지 접근법을 사용하여 조직 샘플의 최적화된 정량 적 프로테오믹스 분석을 제공합니다. 라벨 기반 접근법은 단백질의 보다 정확한 양을 얻을 수 있는 장점이 있으며, 라벨없는 접근법은 비용 효율적이며 코호트의 수백 가지 샘플을 분석하는 데 사용됩니다.

조직 샘플의 질량 분광계 기반 산탄총 프로테오믹스의 포괄적인 워크플로우

단백질 티올 산화는 정상적인 생리적 및 병리생리학적 조건 하에서 중요한 의미를 갖는다. 자사는 수지 보조 포획, 등압 표지 및 질량분석법을 활용하여 단백질의 가역적으로 산화된 시스테인 잔기의 부위별 식별 및 정량화를 가능하게 하는 정량적 산화 환원 단백질체학 방법의 세부 사항을 설명합니다.

단백질 티올 산화의 다중화 정량화를 위한 등압 탠덤 질량 태그 라벨링과 결합된 수지 보조 포획

배우세요 아이소바릭 라벨링과 광범위한 액체 크로마토그래피 및 질량 분석을 활용한 심층 프로테옴 정량화 방법을. 이 기술은 10,000개 이상의 단백질을 정확하게 정량하여 질병 바이오마커 발견에 활용할 수 있습니다.

깊은 프로테옴 Isobaric 라벨, 광범위 한 액체 크로마토그래피, 질량 분석 및 소프트웨어 기반 정량화 하 여 프로 파일링

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