깊은 프로테옴 Isobaric 라벨, 광범위 한 액체 크로마토그래피, 질량 분석 및 소프트웨어 기반 정량화 하 여 프로 파일링

이 실험의 전반적인 목표는 10 이상, 다른 약 처리, 시간 과정 또는 생물학 조건에 의하여 용해된 세포 조직에서 단백질을 정확하게 확인하고 정량화하기 위한 것이다. 이 방법은 약물 또는 기타 생물학적 자극에 대한 반응으로 단백질이 어떻게 변화하는지와 같은 의학 또는 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 10가지 다른 실험 조건에서 발현된 단백질체의 70% 이상을 정확하게 정량화할 수 있다는 것입니다.

이 기술의 의미는 잠재적인 바이오마커 발견을 통해 인간 질병 진단으로 확장될 수 있습니다. 최적의 세포 용해 및 유체 추정이 다운스트림 분해, 라벨링 및 분리 절차에서 중요한 역할을 하기 때문에 이 방법을 시각적으로 시연하는 것이 중요합니다. 이 프로토콜을 시작하려면 관심 배양 세포를 얻습니다.

각 세척에 대해 10ml의 PBS를 사용하여 세포를 두 번 세척합니다. 세척된 세포를 긁어내어 1ml의 PBS가 들어 있는 1.5ml 튜브에 넣습니다. 600 회 g과 섭씨 4도에서 5 분 동안 원심 분리기

상층액을 제거하고 세포를 용해할 준비가 될 때까지 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 해부 후 신속하게 원하는 조직을 수집하고 무게를 잰다. 그 후, 즉시 액체 질소에 보관하고 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오.

텍스트 프로토콜에 설명된 대로 실험 당일에 lysis buffer를 준비합니다. 완충액 대 시료 비율이 10:1이고 최종 단백질 농도가 밀리리터당 5-10밀리그램이 되도록 동결 샘플에 용해 완충액을 추가합니다. 다음으로, 유리 구슬을 넣고 블렌더를 사용하여 섭씨 4도에서 샘플을 용해하고 30초 동안 블렌딩한 다음 5초 동안 휴지시켜 5회 또는 샘플이 균질화될 때까지 반복하여 8도의 속도를 냅니다.

표준 단백질 정량 분석 분석 또는 BSA를 표준으로 하는 Coomassie 염색 SDS 폴리아크릴아미드 겔을 사용하여 단백질 농도를 측정합니다. 그 후, 최종 농도가 10%이고 Lys-C 프로테아제가 효소 대 기질 비율이 1:100이 되도록 100% 아세토니트릴을 첨가합니다. 단백질 소화가 일어날 수 있도록 실온에서 2시간 동안 배양합니다.

그런 다음 최종 농도가 1밀리몰이 되도록 DTT를 추가합니다. 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 다음으로, 샘플의 요소 농도가 2 어금니로 희석 될 때까지 50 밀리 몰 HEPES를 첨가하십시오.

트립신을 1:50의 트립신 대 단백질 비율로 각 샘플에 추가합니다. 실온에서 최소 3시간 동안 배양합니다. 다음으로, 농도가 다시 1밀리몰이 될 때까지 DTT를 첨가하고 실온에서 2시간 동안 배양합니다.

최종 농도가 10밀리몰이 되도록 요오드아세트아미드를 첨가합니다. 실온에서 30분 동안 어두운 곳에서 배양합니다. 그런 다음 최종 농도가 30밀리몰이 되도록 DTT를 첨가하여 반응하지 않은 요오드아세트아미드를 담금

실온에서 30분 동안 배양합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 트립신 분해의 효율성을 확인합니다. 다음으로, 최종 농도가 1%가 되도록 각 샘플에 TFA를 추가합니다.pH 스트립을 사용하여 각 샘플의 pH를 측정하여 2에서 3 사이인지 확인합니다.

허용할 수 없는 pH에 도달하기 위해 필요한 경우 TFA 강하를 추가로 추가합니다. 20의, 000 시간 g 및 10 분 동안 실내 온도에 표본을 원심 분리하십시오. 상층액을 수집하고 샘플을 준비된 스핀 컬럼에 로드합니다.

g를 100배로 3분 동안 또는 샘플이 컬럼을 완전히 통과하여 샘플을 결합할 때까지 원심분리기를 사용합니다. 그런 다음 각 열에 0.5ml의 0.1%TFA를 추가합니다. 500회 g에서 30초 동안 원심분리기

그런 다음 각 컬럼에 60% 아세토니트릴과 0.1 TFA를 함유한 용액 125마이크로리터를 추가합니다. 100배 g에서 3분 동안 원심분리기를 사용하여 컬럼에서 펩타이드를 용리합니다. 각 탈염 펩타이드 샘플을 50마이크로리터의 50밀리몰 HEPES로 재구성합니다.

pH 스트립을 사용하여 각 샘플의 pH가 7에서 8 사이인지 확인합니다. 다음으로, TMT 시약을 무수 아세토니트릴에 용해시켜 샘플에 첨가한 다음 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 크로마토그래피 매체가 내장된 10마이크로리터 피펫 팁을 사용하여 각 샘플의 1마이크로그램을 탈염하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 라벨링 효율성을 분석합니다.

6-10개의 개별 펩타이드를 검사하여 라벨링되지 않은 펩타이드가 라벨링된 샘플에서 검출되지 않는지 확인합니다. 그런 다음 각 샘플을 약 2마이크로리터씩 섞습니다. 크로마토그래피 매체가 내장된 10마이크로리터 피펫 팁을 사용하여 이 혼합물을 탈염합니다.

텍스트 프로토콜에 설명된 대로 LC-MS/MS로 샘플을 분석합니다. 먼저 65마이크로리터의 완충액 A.에 탈염된 풀링 TMT 표지 펩타이드 샘플을 가용화합니다. pH 스트립을 사용하여 pH가 약 8.0인지 확인합니다. 샘플이 여전히 산성인 경우 수산화암모늄을 사용하여 필요에 따라 pH를 조정합니다.

다음으로, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 샘플을 분별합니다. 로딩 시간을 포함하여 2분마다 분수를 수집하도록 분획 수집기를 설정합니다. 유속을 분당 0.4밀리리터로 설정합니다.

총 80개의 분수를 모으십시오. 그런 다음 진공 농축기를 사용하여 다른 모든 샘플을 완전히 건조시킵니다. LC-MS/MS를 사용하여 80개의 모든 분획을 분석하여 매우 깊은 단백질체 커버리지를 달성합니다.

먼저, 1.9마이크로미터 C18 수지를 75마이크로미터 내경의 빈 컬럼에 포장하여 약 1.3마이크로리터의 베드 부피에 도달합니다. 버터플라이 포트폴리오 히터 내부에 컬럼을 두세 번 감아 전체 길이가 가열되도록 합니다. 히터의 온도 센서 위에 테이프를 붙이지 않도록 히터 내부에 기둥을 테이프로 붙입니다.

그런 다음 컬럼을 섭씨 65도까지 가열합니다. LC-MS/MS 시스템을 통해 100나노그램의 쥐 뇌 펩타이드를 실행하여 시스템의 품질을 평가합니다. 이 평가를 한 번 더 반복합니다.

그 후, 약 0.2마이크로그램의 재구성된 펩타이드를 컬럼에 로드하고 5%완충액 A를 흐르게 하고 컬럼에서 펩타이드를 용리하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 질량 분석기로 분석합니다. 이 연구에서는 10-plex isobaric labeling 전략을 사용하여 단백질을 정량화하기 위한 고처리량 방법에 대해 설명합니다. TMT 라벨링 효율성은 LC-MS/MS를 사용하여 TMT 라벨링 샘플 및 해당 라벨링되지 않은 샘플을 분석합니다.

보시다시피, 표지되지 않은 펩타이드 피크는 표지되지 않은 샘플에서만 발견되는 반면, TMT 표지된 펩타이드 피크는 표지된 샘플에서만 발견됩니다. 다음으로, MS2 격리 창이 간섭에 미치는 영향을 평가합니다. 모든 MS2 검사는 클린 스캔 또는 노이즈 스캔으로 지정됩니다.

클린 스캔은 라이신의 y1 이온만 나타내는 반면, 노이즈가 있는 스캔은 라이신과 아르기닌 모두에서 이온을 나타냅니다. 세 가지 다른 TMT 시약으로 개별적으로 라벨링된 E.coli 펩타이드를 사용한 대표적인 간섭 제거가 여기에 나와 있습니다. 합산된 상대 강도는 y1 이온 기반 보정이 TMT 기반 정량화에 더 정확하다는 것을 보여줍니다.

일단 마스터하면 이 프로토콜은 제대로 수행되면 4-5주 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 최종 데이터 세트가 가능한 한 정확한지 확인하기 위해 모든 품질 관리 단계가 완전히 수행되었는지 확인하는 것이 매우 중요합니다. 이 절차를 번역후 변형에 초점을 맞추면 유비퀴틴화(ubiquitination), 인산화(phosphorylation) 또는 아세틸화(acetylation)가 질병 진행 또는 약물 치료에 대응하여 어떻게 변화하고 있는지와 같은 다른 질문에 답할 수 있습니다.

개발 후 이 기술은 제품 분야의 연구자들이 세포와 조직의 단백질 변화를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 영상을 본 후에, 당신은 포유류 세포 또는 조직에서 10, 000의 단백질 이상 확인하고 정확하게 양을 정하는 방법의 아주 좋은 이해가 있어야 한다. 고압 UPLC와 소수의 실리카 컬럼으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 보안경 착용과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

우리는 등압 라벨링에서 발생하는 알려진 비율 압축 문제를 해결하기 시작했을 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 갖게 되었습니다. 우리는 광범위한 분획이 이 문제를 완화할 뿐만 아니라 단백질체 분석을 더욱 증가시키고 적응시킬 수 있는 단백질 및 펩타이드의 식별을 증가시키는 좋은 방법이라는 것을 깨달았습니다.