탠덤 동질 정제를 사용하여 단백질 나누기 파트너의 식별

이 절차의 전반적인 목표는 Tandem affinity purification(탠덤 친화성 정제)으로 알려진 방법을 사용하여 단백질 결합 파트너를 분리하는 것입니다. 안녕하세요, 저는 임페리얼 칼리지 런던(Imperial College London)의 바이러스학 부서의 dLAN Bailey입니다. 저희 연구실에서는 바이러스과의 다양한 구성원에 대한 바이러스 숙주 상호 작용에 대해 연구합니다.

다른 세포 또는 바이러스 단백질과 상호 작용하는 단백질을 식별하는 것은 감염 중 바이러스와 숙주 간의 상호 작용을 조사하기 위한 훌륭한 출발점입니다. 이 비디오에서는 실험실에서 사용하는 한 가지 접근 방식인 탠덤 및 전자 정제 또는 탭 태깅에 대해 설명하겠습니다. 이 연구에서 사용된 Tap 태그는 두 단위의 단백질 G와 연쇄상구균 아딘 결합 펩타이드로 구성된 N 말단 태그입니다.

이들은 미끼 단백질을 특이적으로 용출할 수 있는 TEV 프로테아제 절단 서열에 의해 분리됩니다. 이 예에서 쥐, EIF 4 E는 이 융합 구조체의 C 말단에 있습니다. 탭 태깅 프로토콜은 6단계 절차입니다.

transfection 및 세포주 생성 후, 세포는 가벼운 용해 완충액에 놓이기 전에 태그 감소 단백질을 발현하도록 유도됩니다. 두 가지 친화성 정제 단계와 두 가지 특정 용액을 사용하여 미끼와 잠재적인 상호 작용 파트너를 정제하여 세포주를 생성합니다. HEC 2 93 세포는 P met four expression vector encoding으로 transfection해야 합니다.

탭 태그가 지정된 미끼 단백질 세포는 밀 하이그로마이신 B당 100마이크로그램으로 선택됩니다.플라스미드가 에피소로 유지되기 때문에 특정 클론을 분리할 필요가 없습니다. 세포의 10개 융합 플라스는 배지로 긁어내기 전에 16시간 동안 10마이크로몰 카듐 클로라이드로 처리하여 유도됩니다. 그런 다음 부유 세포는 15M 튜브로 옮겨지고 세포는 원심분리에 의해 펠릿화됩니다.

그런 다음 이 세포를 얼음처럼 차가운 PBS로 세 번 세척한 후 최종적으로 펠릿화합니다. 2단계 세포 용해 세포는 얼음 위에서 5분 동안 방치하기 전에 반복적인 피펫팅을 통해 5mil의 저온 용해 완충액에 있습니다. 효율적인 용해를 보장하기 위해 세포는 좁은 게이지를 통해 주사되고 뭉툭한 바늘을 통해 동결 해동됩니다.

생성된 sate는 1.5mil 튜브와 unli 세포 및 파편에 할당되어 원심분리에 의해 제거됩니다. 참고로, 펠릿 크기는 이 원심분리 단계에서 현저히 감소합니다. 그런 다음 용해물 상등액을 15mil Falcon 튜브에 결합하고 0.45마이크로미터 필터를 통과시켜 추가 파편을 제거합니다.

후속 분석을 위해 이 용해물의 50마이크로리터 분취량을 취해야 합니다. 이 샘플을 샘플 1이라고 합니다. 3단계, 토끼 IgG Aeros에 바인딩.

프로토콜의 이 단계에서 단백질 G 태그는 토끼 IgG aros에 의해 침전됩니다. aros 구슬을 할당하려면 원숭이 끝의 끝을 제거하십시오. 이렇게 하면 비드 손상을 방지하는 데 도움이 됩니다.

아로스를 15mil 튜브로 제거하기 전에 병을 휘젓는 토끼 IgG 아로 용액을 부드럽게 재현탁합니다. 저속 원심분리를 사용하여 냉각된 용해 버퍼에서 aros를 세 번 세척하여 각 단계에서 비드를 투명하게 합니다. 펠릿 토끼 IgG 구슬은 원심분리 후에 볼 수 있어야 합니다.

각 단계 후에 비드를 방해하지 않고 버퍼를 조심스럽게 제거합니다. 최종 세척이 완료된 후, 여과 및 정화된 용해물을 포장된 비드에 첨가하고 3시간 또는 하룻밤 동안 배양합니다. 회전 믹서를 사용하여 섭씨 4도에서 선호되었습니다.

면역침전 후 아그로스 비드를 스핀다운하고 후속 분석을 위해 상층액을 제거합니다. 필요한 경우 미세한 빌드 팁을 사용하여 이 튜브에 남아 있는 액체를 제거할 수 있습니다. 이 상등액은 샘플 2 단계 4 TEV 프로테아제 절단입니다.

이 단계에서는 단백질 G 태그에서 미끼를 절단합니다. 이 단계는 토끼 IgG의 용출 단계인 미끼 단백질의 특정 절단을 효과적으로 허용합니다. TEV 절단 혼합물을 준비하고 끝이 제거된 원숭이 팁을 사용하여 aros 비드에 추가하고, 이 혼합물을 실리콘화된 마이크로 원심분리기 튜브로 옮기고 4°C에서 하룻밤 배양 전에 aros를 현탁액으로 혼합하도록 반전시키고 분석을 위해 이 TEV 절단 반응의 알리코를 제거합니다.

이것은 샘플 3입니다. 회전 믹서에서 하룻밤 동안 배양하면 TEV 반응이 거의 완료될 때까지 진행될 수 있습니다. 5 단계, strept adin beads를 고정시키기 위해 바인딩합니다.

이 단계에서 Cleve 미끼 및 잠재적 결합 파트너는 용액에서 친화성 정제됩니다. 먼저, 토끼 IgG aros 비드를 포함하는 TEV 절단 반응을 원심분리합니다. aros를 펠릿화하려면 분석을 위해 정화된 상층액의 OTT를 제거합니다.

이것은 샘플 4입니다. 새 튜브에 미끼 단백질이 들어 있는 남아 있는 모든 상등액을 조심스럽게 제거합니다. 다시 말하지만, 잘 사용하십시오.

가능한 모든 상층액을 제거하기 위해 peppe 팁을 만드십시오. 후속 분석을 위해 토끼 IgG aros beads를 보관합니다. 이것은 샘플 5입니다.

연쇄상구균 아딘 비드의 손상을 방지하려면 애완 동물 팁에서 끝을 제거하십시오. 비드를 부드럽게 다시 매달고 알리코를 실리콘 튜브에 제거합니다. 비드에 함유된 연쇄상구균을 S 완충액으로 세척하고 저속 원심분리로 정화합니다.

세탁 할 때마다. 세탁할 때마다 버퍼를 조심스럽게 제거하십시오. 스트렙 아딘 구슬은 매우 작아서 미세하게 사용해도 쉽게 변위할 수 있습니다.

애완 동물 팁을 만드십시오. 스트렝트 후 아딘 구슬을 씻었습니다. TEV 절단 반응의 상등액을 이 비드에 첨가하고 회전 믹서를 사용하여 섭씨 4도에서 3시간 또는 밤새 반응을 배양합니다.

배양 후 원심 분리기는 hadin 구슬을 strection하고 sup natum을 제거합니다. 이것은 샘플 6입니다. 참고로.

Beit 단백질은 이제 튜브에 남아 있는 구슬과 관련이 있습니다. 미끼 단백질이 들어 있는 스트렙타비딘 비드를 용해 완충액으로 세척합니다. 추가로 오염시키는 단백질을 제거하려면 비드에 남아 있는 세척 용액을 제거하고 얼음 위에 두십시오.

6단계, 비오틴 용출. 이 단계에서는 스트렙타비딘 비드에 비오틴을 첨가합니다. 비오틴과 스트렙타비딘 비드 사이의 상호 작용은 미끼를 대체하여 용액으로 다시 들어갑니다.

비오틴 용액을 비드에 직접 첨가하고 뒤집어 섞습니다. 회전 믹서 원심 분리기, 비오틴 에어로스 혼합물을 사용하여 4°C에서 3시간 또는 밤새 반응을 배양하고 혼합물을 새 튜브에 조심스럽게 수집합니다. 이것은 샘플 7이라고 하는 최종 EIT입니다.

나머지 strept havein 비드는 샘플 8입니다. 단백질 농도가 낮기 때문에 이 최종 용리액은 분석 전에 농축해야 합니다. 이는 저분자량을 사용하고, 스핀 컬럼을 차단하고, 공정을 정기적으로 원심분리하여 부피를 줄임으로써 달성됩니다.

이 농축된 샘플은 kumasi 및 silver stain에 의해 SDS 페이지 젤에서 분할 및 분석할 수 있습니다. 샘플을 질량 분석기로 분석해야 하는 경우 프리캐스트 상업용 겔을 사용하는 것이 좋습니다. 그런 다음 개별 밴드를 추출하고 단백질을 질량 분석기로 식별할 수 있습니다.

이 경우, 미끼는 쥐, E 단백질의 경우 EIF였습니다. 탭 시스템의 장점은 특정 세포주에서 관심 단백질을 발현할 수 있는 능력이 있으며, 관심 있는 세포주에 따라 상대적으로 낮은 수준에서 단백질을 발현할 수 있는 능력도 제공한다는 것입니다. 사용자가 결정하면 모든 번역 후 수정 및 국소화가 유지되므로 종종 네이티브 복합체를 정제할 수 있습니다.