탠덤 동질 정제를 사용하여 단백질 나누기 파트너의 식별

본 절차의 전반적인 목적은 탠덤 친화성 정제(Tandem affinity purification)라고 알려진 방법을 사용하여 단백질 결합 파트너를 분리하는 것입니다. 안녕하세요, 임페리얼 칼리지 런던 바이러스학 부문의 dLAN Bailey입니다. 저희 연구실에서는 다양한 바이러스 과의 구성원들에 대한 바이러스-숙주 상호작용을 연구하고 있습니다.

다른 세포 또는 바이러스 단백질과 상호작용하는 단백질을 식별하는 것은 감염 과정 중 바이러스와 숙주 사이의 상호작용을 조사하는 데 있어 훌륭한 출발점입니다. 본 영상에서는 저희 실험실에서 사용하는 방법 중 하나인 탠덤 친화성 정제(tandem affinity purification) 또는 TAP 태깅에 대해 설명하겠습니다. 본 연구에 사용된 TAP 태그는 두 개의 protein G 단위와 strep-avidin 결합 펩타이드로 구성된 N-말단 태그입니다.

이들은 bait 단백질의 특이적 용출을 가능하게 하는 TEV protease 절단 서열에 의해 분리되어 있습니다. 본 예시에서는 마우스 EIF4E가 이 융합 구조체의 C-말단에 위치합니다. TAP 태깅 프로토콜은 6단계 과정으로 이루어집니다.

형질전환 및 세포주 구축 후, 세포를 완만한 용해 버퍼로 용해시키기 전에 태그가 부착된 단백질을 발현하도록 유도합니다. 미끼 단백질과 잠재적인 상호작용 파트너를 정제하여 세포주를 생성하기 위해 두 단계의 친화성 정제 과정과 두 가지의 특이적 용액이 사용됩니다. HEC 2 93 세포에 해당 서열을 인코딩하는 P met four 발현 벡터를 형질전환시켜야 합니다.

그 다음, tap 태그가 붙은 bait 단백질 세포들을 100 µg/mL hygromycin B로 선택합니다. 플라스미드가 에피솜 형태로 유지되므로, 특정 클론을 분리할 필요는 없습니다. 10개의 confluence 상태인 세포 플라스크를 10 µM cadmium chloride로 16시간 동안 처리하여 유도한 후, 배지 속으로 긁어내어 수집합니다. 현탁된 세포들을 15 mL 튜브로 옮긴 후 원심분리를 통해 세포 펠릿을 형성합니다.

그 다음 이 세포들을 얼음처럼 차가운 PBS로 세 번 세척한 후 최종적으로 펠렛화합니다. 두 번째 단계인 세포 용해 과정에서는 세포를 5 mL의 차가운 용해 버퍼에 넣고 반복적인 피펫팅으로 용해시킨 후, 얼음 위에 5분 동안 둡니다. 효율적인 용해를 보장하기 위해, 세포를 좁은 게이지의 둔탁한 바늘을 통해 시린지로 통과시킨 후 동결-융해 과정을 거칩니다.

결과물을 1.5 ml 튜브에 나누어 담고 원심분리를 통해 미분해 세포와 잔해물을 제거합니다. 이때 원심분리 단계 이후 펠렛의 크기가 현저히 감소함에 유의하십시오. 그런 다음 용해물 상층액을 15 ml Falcon 튜브에 모으고 0.45 µm 필터에 통과시켜 추가적인 잔해물을 제거합니다.

이 용해물에서 50 µL의 분주량을 취하여 후속 분석에 사용합니다. 이 샘플을 샘플 1이라고 합니다. 3단계, rabbit IgG Aeros에 결합시키기입니다.

프로토콜의 이 단계에서는 rabbit IgG aros를 사용하여 protein G 태그를 면역 침전시킵니다. aros 비드를 분주하기 위해 파이펫 팁의 끝부분을 제거하십시오. 이는 비드의 손상을 방지하는 데 도움이 됩니다.

병을 가볍게 흔들어 rabbit IgG aro 용액을 부드럽게 재현탁시킨 후, aros를 15 ml 튜브로 옮깁니다. 각 단계에서 저속 원심분리를 이용하여 비드를 투명하게 만들면서, 차갑게 냉각된 lysis buffer로 aros를 3회 세척합니다. 원심분리 후 펠렛 형태의 rabbit IgG 비드가 보여야 합니다.

각 단계 후, 비드를 건드리지 않도록 주의하며 버퍼를 제거하십시오. 마지막 세척이 완료되면, 여과 및 정제된 용해물을 충전된 비드에 추가하고 3시간 또는 하룻밤 동안 배양하십시오. 회전 믹서를 사용하여 4°C에서 배양하는 것이 권장됩니다.

면역침전 후, 아가로스 비드를 원심분리하여 가라앉히고 후속 분석을 위해 상층액을 제거합니다. 필요한 경우, 미세 팁(fine build tip)을 사용하여 튜브에 남아 있는 액체를 제거할 수 있습니다. 이 상층액은 '단계 2-4 TEV 프로테아제 절단'의 샘플이 됩니다.

이 단계에서는 베이트(bait)를 단백질 G 태그로부터 절단합니다. 이 과정은 베이트 단백질을 특이적으로 절단하여 결과적으로 rabbit IgG 어로스(aros) 면역침전물로부터 용출시키는 단계가 됩니다. TEV 절단 혼합물을 준비하고, 끝부분을 제거한 피펫 팁을 사용하여 이를 어로스 비드에 첨가합니다. 이 혼합물을 실리콘 처리된 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고, 4°C에서 하룻밤 동안 배양하기 전에 어로스가 현탁액 상태가 되도록 뒤집어 섞어줍니다. 분석을 위해 이 TEV 절단 반응액의 일부를 소량 취합니다.

이것은 세 번째 샘플입니다. 회전 믹서에서 하룻밤 동안 배양하면 TEV 반응이 거의 완료될 때까지 진행될 것입니다. 다섯 번째 단계는 스트렙타비딘 비드를 결합시켜 고정하는 것입니다.

이 단계에서는 용액으로부터 Cleve 미끼와 잠재적 결합 파트너를 친화성 정제합니다. 먼저, rabbit IgG aros 비드가 포함된 TEV 절단 반응액을 원심 분리하십시오. aros를 펠릿화하기 위해, 분석용으로 정제된 상층액의 OTT를 제거하십시오.

이것은 샘플 4입니다. 미끼 단백질이 포함된 남은 상층액을 모두 조심스럽게 새 튜브로 옮기십시오. 다시 한번, 미세 팁을 사용하십시오.

가능한 모든 상층액을 제거하기 위해 피펫 팁을 제작하십시오. 후속 분석을 위해 rabbit IgG aros beads를 보관하십시오. 이것이 다섯 번째 샘플입니다.

strep adin 비드의 손상을 방지하려면, 펫 팁(pet tip)의 끝부분을 제거하십시오. 비드를 부드럽게 재현탁하고 알리코(alico)를 사용하여 실리콘 처리된 튜브로 옮깁니다. S 버퍼로 strep 비드를 세척하고, 저속 원심분리를 통해 정제합니다.

각 세척 단계 후에. 각 세척 단계 후, 버퍼를 조심스럽게 제거합니다. Streptavidin 비드는 매우 작아서 미세 팁을 사용하더라도 쉽게 유실될 수 있습니다.

비즈를 준비합니다. strept adin 비즈를 세척한 후, TEV 절단 반응의 상층액을 이 비즈에 추가하고 회전 혼합기를 사용하여 4 °C에서 3시간 또는 하룻밤 동안 반응을 배양합니다.

배양 후 원심분리하여 streptavidin 비드를 회수하고 상층액을 제거합니다. 이것이 샘플 6입니다. 참고하십시오.

이제 미끼 단백질이 튜브 내의 남은 비드에 결합되었습니다. 미끼 단백질이 포함된 스트렙타비딘 비드를 용해 버퍼로 세척하십시오. 추가적인 오염 단백질을 제거하기 위해 비드에서 남은 세척액을 제거하고 얼음 위에 보관하십시오.

6단계, 비오틴 용출입니다. 이 단계에서는 스트렙타비딘 비드에 비오틴을 첨가합니다. 비오틴과 스트렙타비딘 비드 사이의 상호작용으로 인해 베이트(bait)가 치환되어 다시 용액 상태로 돌아갑니다.

비오틴 용액을 비드에 직접 첨가하고 뒤집어서 섞습니다. 회전 믹서 원심분리기를 사용하여 4°C에서 3시간 또는 하룻밤 동안 반응물을 배양하고, 비오틴 에어로스 혼합물을 조심스럽게 새 튜브에 수집합니다. 이것이 샘플 7로 지칭되는 최종 EIT입니다.

남은 strept havein 비드는 8번 샘플입니다. 단백질 농도가 낮기 때문에, 이 마지막 용출액은 분석 전에 농축해야 합니다. 이는 저분자량 컷오프(cut off) 스핀 컬럼을 사용하여 수행하며, 원심분리를 통해 부피를 줄이면서 과정을 정기적으로 모니터링합니다.

이 농축된 샘플은 분할하여 Coomassie 및 silver 염색을 통한 SDS page gel로 분석할 수 있습니다. 질량 분석법(mass spec)으로 샘플을 분석하려는 경우, 기성 상용 젤(precast commercial gels)을 사용할 것을 권장합니다. 이후 개별 밴드를 추출하여 질량 분석법으로 단백질을 식별할 수 있습니다.

본 사례에서 미끼(bait)는 E 단백질에 대한 마우스 EIF였습니다. TAP 시스템의 장점은 특정 세포주에서 관심 단백질을 발현시킬 수 있다는 점이며, 선택한 세포주에 따라 단백질을 상대적으로 낮은 수준으로 발현시킬 수 있는 능력을 제공합니다. 사용자가 결정하는 대로 모든 번역 후 변형 및 국소화가 유지되므로, 종종 천연 복합체를 정제할 수 있습니다.