성인 Zebrafish의 신장에서 네프론의 구성 및 기능 분석

다음 실험의 전반적인 목표는 성체 제브라 피쉬의 신장에서 네프론 분절 구성과 기능을 평가하는 것입니다. 이것은 먼저 얼룩말 물고기를 묶는 둥지에 형광 표지된 덱스트린을 주입함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 신장을 제거하고 고정하여 후속 라벨링 방법을 위한 조직을 준비하는 것입니다.

다음으로, 신장을 표백하여 색소 침착을 제거한 다음 원하는 네프론 세그먼트를 형광 표지하도록 염색합니다. 결과는 면역형광, 현미경 검사 및/또는 명시야 이미징을 사용하여 얻은 것으로, 선택한 염색을 기반으로 신장 해부학적 구조를 시각화할 수 있습니다. 다음 라벨링 방법은 장기 해부학에 관한 신장 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며, 네프론 구성을 연구하고 부상 전후에 신장 기능을 평가하는 데 사용할 수 있습니다.

이러한 기술의 의미는 성인 신장 형성의 유전적 이상 연구로 확장되며 만성 질환 모델링 중 신장 상태를 평가하는 데에도 적용될 수 있습니다. 시작하려면 마취 된 물고기의 용액을 디캔팅하고 동물을 젖은 스폰지 곰팡이 복부 쪽에 조심스럽게 놓습니다. 다음으로, 인슐린 주사기에 20마이크로리터의 해동 덱스트린 스톡 용액을 채웁니다.

복부의 복부 정중선에서 얕은 각도로 삽입이 이루어지도록 바늘을 놓습니다. 장기에 약간 주입하는 것을 피하기 위해서는 주입 직후 바늘을 올려 체벽을 들어 올리고 용액을 주입 할 공간을 만듭니다. 주사 후 물고기를 수조로 부드럽게 되돌려 마취에서 회복하십시오.

마취된 물고기의 추가 용액을 디캔팅으로 제거하고 티슈나 종이 타월 위에 올려 놓습니다. 머리와 내장을 제거한 후 초미세 해부 바늘을 사용하여 체벽을 핀으로 엽니다. 동물의 등벽에 붙어 있는 신장 기관을 찾습니다.

가는 집게를 사용하여 등벽에서 신장을 분리합니다. XPBS 1개가 들어 있는 5ml 유리 바이알에 신장을 부드럽게 넣고 5분씩 3회 세척합니다. 전사 피펫으로 신장을 제거하고 깨끗한 유리 슬라이드에 XPBS 1-2방울을 떨어뜨립니다.

가는 집게를 사용하여 슬라이드의 신장을 평평하게 만들고 조직이 말리거나 뒤집히지 않았는지 확인합니다. 텅스텐 와이어 도구를 사용하여 결합 조직에 작은 절개를 만들어 신장의 평평한 위치를 용이하게하는 데 사용할 수 있습니다. 그런 다음 18 x 18mm 유리 커버 슬립의 각 모서리에 작은 모델링 점토 조각을 놓습니다.

약간의 각도를 유지하면서 커버 슬립을 신장에 천천히 놓습니다. 기포 갇힘을 최소화하려면 필요한 경우 XPBS 한 방울을 추가하여 커버 슬립과 슬라이드 사이의 공간을 채웁니다. 별도의 제브라피시 그룹은 안락사되어 밤새 고정제에 담가둡니다.

준비가 되면 가는 집게를 사용하여 등쪽 몸벽에서 신장을 조심스럽게 분리하고 장기를 유리병에 넣습니다. 절개된 신장을 3-5밀리리터의 XPBS 1개에 0.05%트윈으로 각각 5분씩 3회 세척합니다. 다음으로, PBS 용액을 제거하고 5% 자당 용액 3ml로 신장을 30분 동안 헹굽니다.

이 시간이 지나면 용액을 30% 자당 3ml로 교체하고 다음날 섭씨 4도에서 밤새 보관하십시오. 용액을 제거하고 신장을 두 번 씻은 후 3-5ml의 표백 용액을 첨가하십시오. 신장 기관에 존재하는 멜라닌 세포 색소 침착을 제거하려면 유리 바이알을 회전기에 놓고 색소 침착이 사라지는 것을 주의 깊게 관찰하십시오.

탈색은 일반적으로 약 20분이 소요되지만 경우에 따라 60분까지 걸릴 수 있습니다. 표백 용액을 너무 오래 방치하면 분해가 발생할 수 있으므로 신장에서 색소 침착이 두 번 제거되었을 때 무결성을 확인하기 위해 10-15분마다 샘플을 모니터링하고 실온에서 1시간 동안 4% PFA 용액으로 배양하는 것이 좋습니다. 다음으로, 4% PFA 용액을 제거하고 3-5ml의 차단 용액으로 마지막 세척 후 신장을 3회 세척하고 실온에서 2시간 동안 신장을 배양합니다.

차단이 완료되면 선택한 염색 프로토콜로 바로 진행합니다. 차단 용액을 제거하고 신장을 세 번 씻은 후 신장을 XPBS 1회에 최소 10분 동안 담가둡니다. 이 기간 동안 신장을 12웰 또는 24웰 배양 접시로 옮깁니다.

XPBS 1개를 충분히 작동하는 알칼리성 인산가수분해효소 기질 용액으로 교체하여 시료를 덮고 시료를 실온에서 30분 동안 회전기에 놓습니다. 이 시간이 지나면 알칼리성 인산가수분해효소 세척 완충액으로 신장을 세척하여 반응을 멈춥니다. 10-15분에 걸쳐 세척 완충액을 세 번 갈아서 신장을 헹굽니다.

다음으로, 세척 완충액을 제거하고 깨끗한 유리잔에 신장을 장착합니다. 라벨링 키트에 포함된 인산가수분해효소 장착 매체를 밀어 넣습니다. 실체 현미경 또는 Debbie 필터 세트에 걸린 복합 현미경을 사용하여 알칼리성 인산가수분해효소 염색 신장을 시각화합니다.

먼저, DBA를 하나의 XPBS에 희석하여 200마이크로리터 작동 DBA 솔루션을 준비합니다. PBS 용액을 200마이크로리터의 DBA 용액으로 교체하고 샘플을 실온에서 1시간 동안 회전기에 놓습니다. 이 시간이 지나면 DBA 용액을 제거하고 XPBS 1개 3-5ml로 각각 5분씩 신장을 3회 세척합니다.

하나의 XPBS를 제거하고 깨끗한 유리 슬라이드에 신장을 장착합니다. 앞에서 설명한 바와 같이, 형광 실체 현미경 또는 복합 현미경에 설정된 표준 Trixie 또는 Texas red 필터를 사용하여 DBA로 염색된 신장의 원위 분절을 시각화합니다. 표백되지 않은 신장의 이 명시야 이미지에서 검은색 색소 침착은 흩어져 있는 멜라닌 세포 집단에 해당합니다.

여기서 네프론 PCT 세그먼트는 덱스트린 주입 후 3일 후에 시각화됩니다. 삽입에는 멜라닌 세포가 있는 단일 네프론의 이미지가 포함되어 있습니다. 이 이미지는 멜라닌 세포 색소 침착을 제거한 후의 성인 신장을 보여줍니다.

이러한 대표적인 이미지는 PCT 분절 간의 약간의 형태학적 변화를 나타내는 반면, 많은 네프론 PCT는 단단히 감겨 있습니다. 다른 네프론은 최소 코일링을 가진 PCT 영역을 포함합니다: 덱스트린, 캐스케이드 블루, 덱스트린, 루시퍼 옐로우, 덱스트린 플루오로 루비는 모두 신장 네프론의 PCT 분절을 우선적으로 라벨링하며, 덱스트린 캐스케이드 블루와 루시퍼 옐로우는 모두 루시퍼 옐로우 처리된 신장에서 관찰되는 훨씬 더 높은 배경의 일부 비특이적 라벨링을 보여줍니다. 대조적으로, 덱스트린 플루오로 루비는 강렬한 PCT 라벨링으로 인해 배경이 극적으로 감소된 것으로 나타났습니다.

PCT 수송체 세포 유형의 특정 마커를 검출하고자 하는 욕구에 의해 염색된 성인 신장은 다양하고 단단히 감긴 고리 모양의 PCT 도메인과 일관되게 넓은 직경을 보여주는 더 길쭉한 PCT 스트레치의 분포를 통해 덱스트린 흡수의 특징적인 발현 패턴을 보여줍니다. 이 비디오를 시청한 후에는 알칼리성 포스파타아제(alkaline phosphatase)가 있는 근위세뇨관 및 DBA가 있는 메딕 원위세뇨관(medic distal tubule)과 같은 성체 제브라피시 신장 내의 네프론 분절을 성공적으로 라벨링하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 4% 파라알데히드로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 항상 코트, 장갑 및 안경을 착용하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.