Name: 성인 Zebrafish의 신장에서 네프론의 구성 및 기능 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: 배우세요 성인 제브라피쉬 신장의 네프론 구성 및 기능 분석 방법을 형광 표지와 면역형광 현미경 기술을 활용하여. 이 연구는 신장 재생 및 질병 연구에 중요한 통찰을 제공합니다.

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이 작품은 다음에서 RAW로 자금에 의해 지원되었다 : 건강의 국립 연구소는 K01 DK083512, DP2 OD008470 및 R01 DK100237을 부여; 십센트 바 오코너 초보 학술 보조금 수상 # 5 - FY12-75 년 3 월; 과학 및 생물 과학학과의 노트르담 대학의 대학에서 기금을 시작; 그리고 갤러거 가족을 대신하여 엘리자베스와 마이클 갤러거에서 노트르담 대학에 관대 한 선물은 줄기 세포 연구를 촉진한다. 자금 제공자는 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 게시하는 결정, 또는 원고의 준비에서 어떤 역할을 없었다. 우리는 그들의 지원을 위해 생명 과학의 부서의 직원을 감사하고, 우리의 제브라 피쉬 식민지의 보호 및 복지에 뛰어난 헌신 노트르담 Zebrafish의 연구 센터. 마지막으로, 우리는이 작품에 대한 자신의 의견, 토론과 통찰력에 대한 우리의 연구 실험실의 구성원을 감사드립니다.

저자가 공개하는 게 없다.

여기서는 성인 지브라 피쉬의 네프론 세그먼트 성분의 시각화를 가능하게 방법을 설명 하였다. 형광 덱스 트란 복합체의 주입이 근위 세뇨관 세포 30,38의 세포 내 이입 특성으로 인해 특혜 PCT 라벨링을 할 수 있습니다. 이 방법 때문에 다른 형광 결합체 떼 얻을 수있다 덱스 트란의 존재를 매우 유연 수행 될 수있다. 보조 라벨 절차가 요구되지 않기 때문에 또한, 라이신 정착 덱스 트란의 사용은, PCT 세그먼트에 레이블 특히 편리하다. 이것은 비교적 간단한 신호 검출을 가능하게하고 많은 다른 형광 라벨, immunolabeling 및 트랜스 제닉 리포터 라인의 사용과 호환 가능하다. 알카라인 포스파타제는 또한 PST에서 PCT 강한 반응성이 약간 약한 반응성, 근위 세뇨관을 표시합니다. 마지막으로, DBA 염색 채널을 표시 원위 세뇨관 세그먼트의 표시를 할 수 있습니다aracteristic는 형태를 분기. 면역성 원산지 설탕 결합 단백질 아르 다양한 렉틴 분자, 포유 동물 네프론 세그먼트 47을 구별하기 위해 광범위하게 사용되어왔다. 그것은이 포유 동물의 신장 47에서 수집 덕트를 표시하는 데 사용되는 것과 제브라 피쉬의 DBA는 원위 세뇨관 세그먼트와 관련이 있다는 흥미로운 일이다. 종합적으로, 이들 방법은 조성물 및 신장 기능을 문서화하는 다양한 조합으로 사용될 수있다. 이들 방법 모두는 전체 신장 제제에 사용될 수 있기 때문에, 이들은 전적으로 더 시간 소모적 인 지루한 방법, 예를 들면, 동결 절단 (Cryosections) 작업과 immunolabeling의 사용에 의존하지 않고도 장기에 걸쳐 네프론의 구조와 기능을 평가하는 툴을 제공한다. 그러나,이 방법 문서에서 설명 얼룩을 동결 절단 (Cryosections)에서 실행 가능하다. 동결 절단 (Cryosections) 분석은 면역 조직 화학 특정 pepti을 감지하기에 더 적합합니다 (전체 마운트에 비해) 샘플을 생성DES는 물론 비록 이러한 유형의 분석은 적절한 일차 항체의 가용성을 필요로한다. 불행하게도 제브라 피쉬 동물 모델 작업에서 하나의 주요 제한은 항체의 가난한 가용성 남아있다. 따라서 WISH는, 즉, 가장 널리 사용되는 유지 &#39;고우에&#39;유전자 발현 분석을위한 절차. 보라색 ​​또는 적색 침전물을 생성 BCIP, NBT, 및 / 또는 기판 INT 반응을 이용하면 WISH 저온부에 형광 염색법과 호환되지. 하나의 옵션은 형광 검출 WISH, 제브라 피쉬 배아 샘플을 위해 최적화되었으며 성인 신장 함께 사용하도록 맞추어 질 수있는 절차의 사용을 호출하는 것이다. 이 비디오 문서의 방법에 대한 설명은 각각의 세그먼트가 같은 eGFP는 또는 mCherry 등의 기자로 표지 된 형질 전환 제브라 피쉬 라인과 함께 형광 WISH 같은 기술을 추가 실험을 허용해야합니다. 대안 적으로, 방법은 여기에 기재된 coul다른 중요한 염료, 예를 들어, 다른 렉틴와 함께 테스트를 할 거라고. 따라서, 상기 적응 및 여기에 기술 된 방법의 확장은 전체의 마운트 신장 준비 및 분석을위한 연구자의 필요에 따라 호출 될 수있다. 따라서,이 방법은 지속적인 재생 연구 제브라 피쉬 모델 구현 및 유전 적 질병 모델링 광범위한 잠재력을 가지고있다. 신장 고통 혁신적인 연구 및 치료에 대한 필요성이 높아지고있다. 수백만 명의 사람들이, 선천성 급성 및 / 또는 만성 원인의 결과 매년 신장 질환의 일부 양식에서 고통 받고 있습니다. 또한, 신장 질환의 유병률은 이러한 질병 글로벌 공중 보건 문제 (14, 15)을 전 세계적으로 증가하고 있습니다. 외부 투석 기계가 자신의 신장이이 역할을 수행 할 수없는 경우 신진 대사 폐기물의 환자의 혈액을 제거하는 역할을함으로써 이러한 혈액 투석 등의 치료를 사용할 수 있습니다. 불행하게도지속적인 치료가 생존을 위해 필요하므로이 개입, 제한 사항이 있습니다. 또한, 환자는 결국 환자가 대기자 명단에 배치되면받을 수 년이 걸릴 수있는 신장 이식을 필요로 할 것이다. 심지어 신장 이식을 획득 한 후, 많은 환자는 프로 시저의 결과로 부작용을 고통과 그들의 삶의 나머지 부분에 대한 이러한 효과를 전투해야합니다. 이러한 어려움은 신장 질환을 예방 혹은 조직 재생 8,16,52,53을 확대하는 데 도움이 중 하나를 새로운 치료법의 개발에 대한 심각한 필요성을 보여줍니다. 생물 의학 실험실에서 인간 피험자의 사용의 명백한 윤리적 한계를 감안하면, 동물 모델은 인간 질병의 발병 기전 연구를위한 새로운 치료법의 테스트를 위해 필수적이다. 그 해부학 적 유사성 진화 근접성 결과, 마우스는 인간의 질병 (45)의 모델에 가장 널리 사용되고있다. 그러나이 동물과 특정 제한 includ,가무능력을 보내고 것은 생체 내 및 대규모 유전자 스크린을 완성 실용성 장기 개발을 시각화한다. 제브라 피쉬는 인간의 질병 45, 46의 장기 개발 및 모델링 연구를위한 적절하고 유용한 모델 생물이다. 인간의 질병에 관해서는, 제브라 피쉬의 기능 동족체는 인간의 모든 유전자 (54, 55)의 약 70 % 존재한다. 최근 연구는 신장 연구 31,37,56 여러 지역의 제브라 피쉬의 유용성을 강조하고있다. AKI 후 제브라 피쉬의 재생 및 수리의 연구는 세관 상피 재생 및 neonephrogenesis가 발생 30,37 timecourse 재생에 걸쳐 중복이 프로세스가 있음을 시사한다. 아미노 글리코 사이드 항생제라는 겐타 마이신의 사용은 성인 제브라 피쉬 29,30,37에서 AKI의 결과를 연구를 통해 부상 패러다임으로 활용되고있다. 겐타 마이신에서 약 2 주간의 기간에 다음과 같은 부상에 걸쳐, 근위부 tubul에스 다시 생성하고, 그 사이에 새로운 네프론은 장기 29,30,37에 걸쳐 형성한다. 일반적으로, 상피 재생을 조절하는 메커니즘이 매우 논란 남아있다. 복구 프로세스의 일 제안 된기구에서, 루멘으로 사균의 벗기이어서 초기 급성 부상 이벤트가있다. 다음으로, 새로운 세포가 분화 한 후, 역 분화, 증식 및 마이그레이션 일련의 이벤트, 부상 기저막을 다시 채우기 및 부상 사이트에 기능을 복원을있다. 또한, 다른 연구는 대체 세포가 네프론의 세관 내에 상주 줄기 / 전구 세포에서 발생하는 것을 제안했다. 제브라 피쉬에 neonephrogenesis의 프로세스에 관해서는, 세포 응집체 29,30 겐타 마이신 주입하여 다음 AKI 관찰되었다. 이 집계는 나중에 기존 세관 (29, 30)에 연결 (plumb) 새로운 네프론에 성숙. 네프론 상피 재생 및 neonephr을 통합하는 공통점ogenesis는 깎아 지른듯한 미스터리 요소 : 현재이 재생 업적을 사용할 수 통찰력이보다 발생 방법에 대한 기하 급수적으로 더 많은 질문이 있습니다. 그러나 현재까지의 증거 몇 가지 흥미로운 라인은 제브라 피쉬를 사용하여 신 재생 조사 사실도 직접 번역 잠재적 인 56-58가있을 수 있습니다 인간의 AKI에 관련 비교 통찰력을 제공 할 수있는 개념을 지원합니다. 화학적 스크리닝 최근 히스톤 데 아세틸 라제 억제제 메틸 4 - (페닐 티오) -butanoate (m4PTB) 56,57 식별되었다 제브라 피쉬 배아 신장 전구 세포의 증식을 증가 작은 분자의 동정을 행 하였다. 겐타 마이신에 의한 AKI와 제브라 피쉬의 유충이 화합물의 관리 애벌레의 생존이 증가하고 신 세뇨관 증식 (56, 58)를 향상되었습니다 것으로 나타났습니다. 중간 허혈 유발 AKI와 마우스가 m4PTB로 처리되었을 때, 자신의 회복 ASSOC 가속화되었다세뇨관 세포 증식 (58)의 양쪽 관상 위축 및 세포주기 정지에 감소 iation. 이러한 연구 결과는 정상적인 제브라 피쉬의 신장 개발 및 / 또는 AKI에 회생 응답에 책임이있는 경로는 포유류 56과 보존된다는 것을 시사한다. 따라서, 더 많은 연구가 관여하는 신호 전달 경로를 확인하고 상호 작용 - 제브라 피쉬는 신장학 분야에서 중요한 목표를 추구하는 하나의 약속 수단을 제공 이해하는 재생 - 즉의 메커니즘을 떨어져 애타게하는 데 필요한있다. 이와 프로토콜에 설명 네프론 셀 라벨 같은 도구 AKI 모델에서 신장 조성물 및 기능성을 평가하기 위해 이용 될 수 분석법 중 하나기를 나타낸다. 또한, 이들은 신장 질환의 트랜스 제닉 모델을 특성화하기 위해 적용 할 수있는 신장 네프론 후 댐 구조의 복원을 촉진 할 수있는 화학 치료제를 식별하는 방법을 제공 할 수있다연령.

신장은 체내에서 생리 기능의 다수를 만족 복잡한 기관이다. 신장의 가장 중요한 기능은 신진 대사 폐기물 배출하고,이 작업은 밀접하게 유체 항상성의 유지와 얽혀있다. 신장 병용 혈압, 전해질 수준, 산 - 염기 평형을 조절하면서, 혈액을 여과하고 소변을 형성하여 이러한 작업을 수행한다. 네프론이라는 고도의 전문 상피 세관은 신장 1, 2의 기본 기능 단위의 역할을한다. 성인 척추 동물에서 네프론은 일반적으로 많은 세관은 매우 작은 장기로 포장하는, 따라서 수 있도록 중앙 집중식 배수 시스템을 둘러싼 단단히 코일 배열로 구성됩니다. 예를 들어, 각 인간의 신장 이상 1,000,000 네프론 세를 포함 할 수 있습니다. 마우스와 같은 다른 포유류 신장 4 당 8-10000 네프론의 순서에 가지고있다. 신장 복잡성의 정도는이 포유류와 다른 높이 요 사이에 차이가전체 네프론의 수가 변형 및 신장 내에서의 구조적 배치로 인한 ebrates. pronephros, mesonephros 및 metanephros : 척추 동물의 종은 최대 3 개의 연속 개발하는 동안 신장의 구조 및 네프론 자질 및 배치와 관련하여 복잡성을 증가 각 양식에 표시를 형성한다. 유지하는 구조는 최종 신장 성인 신장 장기 전형적 mesonephros 또는 metanephros이 역할을한다. 각 신장 형태는, 그러나, 네프론 계 조성물이있다. 네프론은 신​​장의 주력이고 대사 분비 및 재 흡수와 함께 혈액 여과를 담당합니다. 네프론은 상피 세포로 구성된 간단한 관상 구조입니다 차별화 된 상피 세포의 분리, 고도의 전문 도메인이 특정 작업을 수행하는 분절 조직을 보유하고 있습니다. 네프론을 통한 여과 유량 위하여, 일반적으로 3 주요 부를 compris 그 존재각 전자 장치 (1) 신장 소체, 기단, 중간 및 원위 세그먼트 (2) 세뇨관, 및 (3) 집합관 1. 근위 세뇨관 유기 용질, 특히 포도당과 아미노산을 하나의 재 흡수에 대한 책임이있다. 중간 가느 다란 관 (또는 헨레 루프)는 소금과 물 규제가 하나의 주요 사이트입니다. 마지막으로, 소금과 다른 이온의 미세 조정은 원위 세뇨관과 집합관에서 발생하는 높은 내분비 시스템 (1)에 의해 조절된다. 거기에서, 여액은 궁극적 노폐물 한 바와 같이 본체를 종료, 및 방광 요관을 통해 여행. 신장 기능의 감소는 정상적인 활동 네프론을 방지 원인 다수 유래 할 수있다. 이러한 원인은 신장 개발, 예를 들면, 부상의 다른 유형에서 네프론 5, 또는 원인의 기형을 초래할 선천성 결함 (유전 및 environme 모두에 따른 중에 발생할 수ntal 기원). 획득 부상은 크게 급성 신장 손상 (AKI) 또는 만성 신장 손상 (CKD)으로 분류됩니다. AKI는 종종 허혈이나 독소에 노출 6,7로 인한 신장 기능의 급격한 손실을 포함한다. 포유 동물에서 상피 수리 네프론은 부상 후 8 가능하고, 많은 사람들은 AKI 후 신장 기능의 완전한 회복을 나타낸다. 70 %의 발생 범위 6,7 - 그러나, AKI는 넓은 (30)를 통해보고 된 높은 이환율과 사망률과 관련이 있습니다. CKD는 대조적으로, 일반적으로 섬유화 8,9과 관련된 장기 손상의 년의 결과 신장 기능의 점진적인 감소와 연관되어 있습니다. 어느 하나가 다른 10 ~ 12에 개인을 걸리기 수 또한, 상호 작용은 AKI와 CKD 사이에 존재합니다. 예를 들어, AKI에서 고통을 사람들은 CKD와 죽음 (13)에 더 민감하다. 신장 질환의 발생률은 미국 및 전 세계적으로 모두 epide에 도달했습니다마이크 비율과는 세 인구는 신장 (14, 15)에 대한 재생 의학의 개입을 식별 할 필요성이있다 - 따라서 확장으로 증가 할 것으로 예상된다. AKI 환자가 회복 할 수있는 지식에도 불구하고, 긴 신장이 선천적 인 재생 능력이없는 기관이라고 생각하고있다. 이 전통적인보기는 극적으로 최근 16 년에 개정되었다. AKI 후 마우스 및 쥐에서 신장 손상을 조사하는 연구는 네프론의 세뇨관 상피 세포 증식 및 기능 네프론 17-20를 재 구축 할 수 있습니다 것으로 나타났습니다. 포유 동물은 네프론을 다시 생성이 적응 능력을 가지고 있지만, 신장 섬유증 및 CKD 21로 이어질 트리거 할 수 있습니다 주목할만한 한계와 부적응 반응이있다. 예를 들어, 최근의 연구는 쥐의 네프론에서 반복 상피 세포의 박리가 감소 된 재생 및 근래 신장 섬유증 - 제안 네프론와 관련이 있음을 증명EA는 재생 임계 값 (22)을 제한했다. 성인 포유 동물의 신장, 분실 또는 손상된 것들을 대체 할 새로운 네프론을 형성하여 자신의 파괴는 영구적 인 네프론 적자 8,9 리드 있다는 증거는 없습니다. 흥미롭게도, 어떤 척추 동물은 콩팥의 상피를 재생하여도 새로운 네프론을 생산하여 AKI에 응답 마십시오 과정은 neonephrogenesis 또는 네프론 신생 (23)라고 함. Neonephrogenesis 독소에 노출 또는 부분 절제술 후 물고기에서 발생, 부상 모델은 역사적으로 최근에는 금붕어 24, 25, 틸라피아 (26), 스케이트 (27), 송사리 (28), 그리고 제브라 피쉬 (29, 30)을 포함했다. 이들 중, 제브라 피쉬 신장 재생에 책임 세포 및 분자 경로를 발견하도록 가능한 유전자 연구 모델을 제공한다. 이 비디오 문서에서는, 우리는 성인 제브라 피쉬에서 네프론 세그먼트 레이블을하는 방법을 보여줍니다. 네프론의 해부학, 분자 기능에 대한 지식,기능적인 특성은 제브라 피쉬를 사용하여 성공적인 미래 신장 연구에 필수적이다. 성인 zebrafish의 신장은 mesonephros 구조입니다 성인 포유류, avians, 파충류 31에있는 metanephros 구조보다 네프론의 수와 조직의 관점에서 본질적으로 덜 복잡하다. 그러나, 제브라 피쉬 네프론 세그먼트는 포유 동물 조직과 유사하며, 제 유전자 발현 연구에 기초하여 31-35 배아 신장에서 설명 하였다. 제브라 피쉬 배아 네프론은 근위 세뇨관 (PCT)를 포함 선형 세관 세그먼트, 근위 곧은 세관 (PST), 말초 초기 (DE) 및 말초 말 (DL) 31 ~ 35 (그림 1)이 포함되어 있습니다. Zebrafish의 성인 네프론 유사한 관 세그먼트에게 30,31,36,37 (그림 1)를 가지고있다. PCT 또한 기능적 표현형에 의해 식별 될 수있다 : PCT 상피 세포에 존재하는 형광 표지 덱스 트란 화합물 (10-70 kDa의 크기)를 포함한다배아 및 성인 지브라 피쉬 신장 모두에서 사용되어왔다 순환 이러한 근위 세뇨관 세포 38-41 (도 1)에 의해 세포 내 이입 흡수를 평가한다. 제브라 피쉬와 포유류 사이의 네프론 분야에서 한 가지 차이점은 제브라 피쉬는 중간 세관 또는 헨레 30-37의 루프 부족이다; 포유 동물에서이 세그먼트 기능은 물을 절약하고, 제브라 피쉬는 소변을 집중 긴급없는 담수 종 때문에, 제브라 피쉬는이 세그먼트 (32, 33)이 부족한 것은 놀라운 일이 아니다. 따라서, 전체적인 네프론 조성물은 크게 제브라 피쉬 및 포유류 신장 32,33간에 보존된다. 이러한 유사성은 발달 nephrogenesis 32-35,42 중에 신장 발현 유전자의 기능을 조사함으로써, 인간 일 수 조건의 실질적인리스트에 추가하는, 수많은 신장병 43, 44를 모델링하기 위해 효과적인 연구 도구로 지브라 피쉬를 활성화 사용하여 조사제브라 피쉬의 45, 46. 오늘날, 성인 zebrafish의 신장으로 인해 유전 온순함이 종의 유전자 기능과 신호 전달 경로를 심문 할 수 기술 자원의 확대 입맛에 신 재생의 비교 연구를위한 매력적인 모델입니다. 여러 연구 AKI 29,30,37 후 재생의 메커니즘을 조사하기 위해 제브라 피쉬 mesonephros을 사용했다. 성인 zebrafish의 신장을 계속 사용 AKI 연구의 경우, 네프론의 기능을 조사하기 위해 다른 네프론 지역과 방법에 레이블 절묘한 방법이 필수적이다. 성인 신장의 분석을위한 여러 가지 방법이 배아 신장 프로토콜에서 적응하고있다. 성인 제브라 피쉬의 형광 표지 덱스 트란의 복강 내 주사는 제브라 피쉬 배아 38-41 (그림 1)에서와 같이, 엔도 시토 시스 (30)를 통해 mesonephros의 네프론의 PCT 상피 레이블. 이 방법은 visualiz하는 데 사용되었습니다근위 세뇨관 복원 생리 기능 30 (그림 1)의 한 평가를 할 수 AKI을, 다음 자신의 재 흡수 특성을 회복 전자. 네프론 근위 세뇨관의 또 다른 특징은이 분야에서 상피 세포가 내인성 알칼리 포스파타제 활성의 높은 수준을 나타내고 브러시 테두리 (37)를 갖고 있다는 점이다. 따라서, 근위 상피 ELF- (효소 형광 표지)로 알려진 형광 기반 기술 -97 (47)를 사용하여 성인 제브라 신장 시각적 지역화 될 수있다. 여기서는 근위 세뇨관의 기능 평가를 획득하고이 세뇨관 세그먼트의 크기 및 형상을 매핑하도록, 제브라 피쉬 신장 성인 형광 덱스 트란 흡수 분석법 30,48보기를 수행하는 방법을 설명한다. 다음으로는 형광 라벨 알칼리 포스 파타 아제 (alkaline phosphatase)와 성인 네프론의 근위 세뇨관 영역을 레이블 기술을 설명합니다. 셋째, 우리는 처음으로로드 &#39;게재아민 태그 렉틴 Dolichos는 포유류 낭 (49)에 포집 관의 일반적인 마커로 사용되었다 응집소 (DBA) biflorus, 제브라 피쉬 성인 신장의 원위 세관을 표시한다. DBA는 알칼리성 포스 파타 아제 염색에 상호 배타적이기 때문에,이 라벨은 크게 성인 zebrafish의 네프론의 팬 원심 뻗어 대 팬 근위을 구별 할 수있는 방법을 제공합니다. 전체 마운트 및 저온 유지 조직 학적 섹션 모두에서 이러한 형광 얼룩의 구현을 통해, 우리는 고유 각 네프론 세그먼트를 식별 용질 수송 유전자의 발현 도메인과이 라벨의 상관 관계. 따라서이 프로토콜은 또한 우리의 배아 WISH 프로토콜 50을 기반으로 현장 하이브리드 (WISH) 분석에서 성인 조직 전체 마운트에 대한 수정 된 조직 처리 절차에 대한 안내가 포함되어 있습니다. 이러한 절차는 O 형태 학적 및 기능적 특성을 문서화하는 다양한 조합으로 (그림 2)을 사용할 수 있습니다F 성인 zebrafish의 신장 네프론. 따라서,이 프로토콜은 재생 연구, 다른 신장 질환 모델의 표현형 특성에 적용 할 수 있으며, 심지어 신장 성인의 형성을 연구하는 데 사용.

<table><tbody><tr><td>1X PBS</td><td></td><td></td><td>10 X PBS를 증류수에 희석하여 만듭니다.</td></tr><tr>1 X <td>PBS에 PBST</td><td></td><td></td><td>0.1% 트윈-20 세제 1개.</td></tr><tr>1 X <td>PBS에 0.05% 트윈</td><td></td><td></td><td>0.05% 트윈-20 세제가 포함된 1X PBS.</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB02038</td><td></td></tr><tr><td>4% PFA/1X PBS</td><td></td><td></td><td>1 X PBS에 4% PFA(w/v)(Electron Microscopy Sciences, Cat # 19210)를 용해하고 흄 후드의 핫 플레이트에서 끓입니다. 부분 표본을 식히고 냉동실에 보관하기 위해 -20°C에서 얼립니다. 사용 직전에 해동하고 재고를 다시 얼리지 마십시오.&nbsp;</td></tr><tr><td>세밀한 펜치</td><td>Roboz</td><td>RS-1050</td><td>Dumont 핀셋 패턴 #55&nbsp;</td></tr><tr><td>유리 슬라이드</td><td>Thermo-Fisher</td><td>4445</td><td>White Frost&nbsp;</td></tr><tr><td>유리 커버슬립</td><td>Thermo-Fisher</td><td>12-540A</td><td>18 x 18 mm</td></tr><tr><td>모델링 클레이</td><td>Hasbro</td><td>Playdoh</td><td>다른 모델링 클레이로 대체하여 유사하게 작동할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>슬라이드 홀더</td><td>Thermo-Fisher</td><td>12-587</td><td>옵션: 슬라이드를 평평하게 보관할 수 있는 판지 트레이</td></tr><tr><td>표백 용액</td><td></td><td></td><td>표백제 혼합 공식 (20ml 용액 용) : 10 % 수산화 칼륨 용액 1.6 ml 30 % 과산화수소 용액 0.6 ml 100 &mu; 20 % Tween 증류수</td></tr> 수산화 <tr><td>칼</td>륨 <td>시그마</td><td>221473</td><td></td></tr><tr><td>과산화수소</td><td>시그마</td><td>H1009</td><td></td></tr><tr><td>차단 솔루션</td><td></td><td></td><td>차단 솔루션 (10 ml 용액 용) 20 ml에 채우기 : 0.05 % Tween 태아 송아지 혈청 2ml와 1X PBS의 8 ml 150 &mu; DMSO</td></tr><tr><td>알칼리성 인산가수분해효소 활성 검출</td><td>Invitrogen</td><td>E6601</td><td>우리는 ELF 97 내인성 인산가수분해효소 검출 키트를 사용합니다.&nbsp; 작업 기판 용액을 준비하려면 제조업체의 지침에 따라 검출 버퍼에서 기판을 20배 희석하십시오.&nbsp;</td></tr><tr><td>알칼리성 포스파타제 세척 용액</td><td></td><td></td><td>세척 버퍼 용액 레시피(100ml 용액용): 0.5M EDTA 5ml 레바미솔 120mg 1X PBS</td></tr><tr><td>덱스트란 95ml, 플루오레세인, 40,000MW</td><td>Invitrogen</td><td>D1844</td><td>증류수로 희석하여 50mg/ml 원액 만들기, 부분 표본은 -20°C의 냉동고에 보관하십시오.</td></tr><tr><td>덱스트란, 캐스케이드 블루, 10,000MW</td><td>Invitrogen</td><td>D1976</td><td>증류수로 희석하여 50mg/ml 원액을 만들고 부분 표본을 -20°C의 냉동고에 보관합니다.</td></tr><tr><td>덱스트란, 루시퍼 옐로우, 10,000MW</td><td>Invitrogen</td><td>D1825</td><td>증류수로 희석하여 50mg/ml 원액을 만들고 분취액을 -20°C의 냉동고에 보관합니다.</td></tr><tr><td>덱스트란, 테트라메틸로다민(플루오로루비), 10,000MW</td><td>Invitrogen</td><td>D1817</td><td>증류수로 희석하여 50mg/ml 원액을 만들고 분취액을 -20°C의 냉동고에 보관합니다.</td></tr><tr><td>Dolichos biflorus agglutinin (DBA)-rhodamine</td><td>Vector laboratories</td><td>RL-10-32</td><td>DBA 염색 용액 (for a 100 &mu; l 솔루션) : 1 &mu; DBA의 l 99 &mu; l 1X PBS</td></tr><tr><td>Propidium iodide</td><td>Invitrogen</td><td>E6601</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>P1304MP</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield 하드 세트 장착 매체</td><td>Vector laboratories</td><td>H-1400</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 커버 유리</td><td>VWR</td><td>48393081</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide, DMSO</td><td>American Bioanalytical</td><td>67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S0289</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, 0.5m 용액, pH 8.0</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00502</td><td></td></tr><tr><td>Levamisole</td><td>Sigma</td><td>L-9756</td><td></td></tr><tr><td>조직 동결 매체</td><td>Triangle Biomedical Sciences, Inc.</td><td>TFM-C</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Cryomold 생검, 10 x 10x 5 mm</td><td>Sakura Finetek</td><td>4565</td><td></td></tr><tr><td>TruBond 380 접착 현미경 슬라이드</td><td>Tru Scientific</td><td>0380W</td><td></td></tr><tr><td>액체 차단제 &ndash; 슈퍼 PAP 펜</td><td>전자 현미경 과학</td><td>71312</td><td></td></tr><tr><td>면역 염색 수분 챔버</td><td>Evergreen Scientific</td><td>240-9020-Z10</td><td></td></tr><tr><td>저온 유지 장치</td><td>Therm</td><td>Microm&trade; HM 525 저온 유지 장치</td><td></td></tr><tr><td>실체 현미경</td><td>Nikon</td><td>SMZ645; SMZ1000; 83455 P-블루 GFP/DAPI; 83457 P-엔도우 GFP/FITC; 사용된 83457 P-TRITC</td><td>필터 세트는 다음과 같습니다: Hoechst/DAPI 필터는 DAPI, 프로피듐 요오드화물, 덱스트란 캐스케이드 블루 및 알칼리성 인산가수분해효소 검출에 사용되었습니다. GFP/FITC 필터는 dextran-FITC, dextran lucifer yellow 및 anti-GFP 검출에 사용되었습니다. TRITC 필터는 덱스트란-플루오로-루비, PI 및 DBA 검출에 사용되었습니다.</td></tr><tr><td>복합 현미경</td><td>Nikon</td><td>96310 C-FL UV-2E/C DAPI; 96311 C-FL B-2E/C FITC; 96313 C-FL Y-2E/C Texas Red</td><td>Filter 세트는 다음과 같습니다: Hoechst/DAPI 필터는 DAPI, 프로피듐 요오드화물, 덱스트란-캐스케이드 블루 및 알칼리성 인산가수분해효소 검출에 사용되었습니다. GFP/FITC 필터는 dextran-FITC, dextran lucifer yellow 및 anti-GFP 검출에 사용되었습니다. Texas Red 필터는 덱스트란-플루오로-루비, PI 및 DBA 검출에 사용되었습니다.&nbsp; &nbsp;</td></tr></tbody></table>

성인 zebrafish의 신장에서 네프론의 구성 및 기능 분석

Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

제브라 피쉬 모델은 신장 개발, 재생과 질병을 연구하는 중요한 시스템으로 떠오르고있다. 모두 배아와 성인 zebrafish의 신장이 높은 포유 동물을 포함한 다른 척추 동물에 보존되어 네프론로 알려진 기능 단위로 구성되어있다. 제브라 피쉬의 연구는 최근 성인 네프론 손상이 발생 후 2 독특한 현상이 발산 것을 증명하고있다 : 첫째, 파괴 세관 상피 세포를 대체 기존의 네프론 내에서 강력한 재생이; 둘째, 완전히 새로운 네프론은 neonephrogenesis으로 알려진 과정에서 신장 전구 세포로부터 생성된다. 대조적으로, 인간과 다른 포유류 네프론 상피 재생을위한 제한된 능력을 가지고있는 것처럼 보인다. 현재까지, 이러한 신장 재생 현상에 대한 책임이 메커니즘은 제대로 이해 남아있다. 성인 zebrafish의 신장이 모두 네프론 상피 재생 및 neonephrogenesis를 받아야하기 때문에, 그들은 뛰어난 실험 항을 제공이러한 이벤트를 공부 다임. 또한, 신 재생을 조절 세포와 분자 메커니즘을 서술하기 위해 사용될 수있다 제브라 피쉬 모델에서 사용할 수있는 약리학 적 및 유전 적 다양한 도구가있다. 이러한 연구의 한 중요한 양태는 네프론의 구조와 기능의 평가이다. 이 프로토콜은 성인 zebrafish의 신장에 신장 조성물 및 테스트 네프론 기능을 측정하는 데 사용할 수있는 표시 기술의 집합을 설명한다. 따라서, 이들 방법은 다음을 포함하지만 이에 한정되지 않는다 성인 지브라 피쉬 신장 손상 패러다임, nephrotoxicant 노광 체제 또는 nitroreductase 매개 세포 어블 레이션 기술로서 표적 세포 사멸 유전자 방법 미래 표현형 특성에 널리 적용 할 수있다. 또한, 이들 방법은 성인의 신장 형성 유전 섭동을 연구하는데 사용될 수 있으며, 만성 질환 모델링시 신장 상태를 평가하기 위해 적용될 수있다.

제브라 피쉬의 성인 신장은 신장 재생과 질병 연구를위한 훌륭한 시스템입니다. 이러한 연구의 중요한 양태는 네프론의 구조와 기능의 평가이다. 이 프로토콜은 네프론의 세뇨관 조성물을 평가하기 위해 신장 재 흡수를 평가하도록 구현 될 수있는 몇 가지 방법론을 설명한다.

성인 Zebrafish의 신장에서 네프론의 구성 및 기능 분석

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...

다음 실험의 전반적인 목표는 성체 제브라 피쉬의 신장에서 네프론 분절 구성과 기능을 평가하는 것입니다. 이것은 먼저 얼룩말 물고기를 묶는 둥지에 형광 표지된 덱스트린을 주입함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 신장을 제거하고 고정하여 후속 라벨링 방법을 위한 조직을 준비하는 것입니다.다음으로, 신장을 표백하여 색소 침착을 제거한 다음 원하는 네프론 세그먼트를 형광 표지하도록 염색합니다. 결과는 면역형광, 현미경 검사 및/또는 명시야 이미징을 사용하여 얻은 것으로, 선택한 염색을 기반으로 신장 해부학적 구조를 시각화할 수 있습니다. 다음 라벨링 방법은 장기 해부학에 관한 신장 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며, 네프론 구성을 연구하고 부상 전후에 신장 기능을 평가하는 데 사용할 수 있습니다.이러한 기술의 의미는 성인 신장 형성의 유전적 이상 연구로 확장되며 만성 질환 모델링 중 신장 상태를 평가하는 데에도 적용될 수 있습니다. 시작하려면 마취 된 물고기의 용액을 디캔팅하고 동물을 젖은 스폰지 곰팡이 복부 쪽에 조심스럽게 놓습니다. 다음으로, 인슐린 주사기에 20마이크로리터의 해동 덱스트린 스톡 용액을 채웁니다.복부의 복부 정중선에서 얕은 각도로 삽입이 이루어지도록 바늘을 놓습니다. 장기에 약간 주입하는 것을 피하기 위해서는 주입 직후 바늘을 올려 체벽을 들어 올리고 용액을 주입 할 공간을 만듭니다. 주사 후 물고기를 수조로 부드럽게 되돌려 마취에서 회복하십시오.마취된 물고기의 추가 용액을 디캔팅으로 제거하고 티슈나 종이 타월 위에 올려 놓습니다. 머리와 내장을 제거한 후 초미세 해부 바늘을 사용하여 체벽을 핀으로 엽니다. 동물의 등벽에 붙어 있는 신장 기관을 찾습니다.가는 집게를 사용하여 등벽에서 신장을 분리합니다. XPBS 1개가 들어 있는 5ml 유리 바이알에 신장을 부드럽게 넣고 5분씩 3회 세척합니다. 전사 피펫으로 신장을 제거하고 깨끗한 유리 슬라이드에 XPBS 1-2방울을 떨어뜨립니다.가는 집게를 사용하여 슬라이드의 신장을 평평하게 만들고 조직이 말리거나 뒤집히지 않았는지 확인합니다. 텅스텐 와이어 도구를 사용하여 결합 조직에 작은 절개를 만들어 신장의 평평한 위치를 용이하게하는 데 사용할 수 있습니다. 그런 다음 18 x 18mm 유리 커버 슬립의 각 모서리에 작은 모델링 점토 조각을 놓습니다.약간의 각도를 유지하면서 커버 슬립을 신장에 천천히 놓습니다. 기포 갇힘을 최소화하려면 필요한 경우 XPBS 한 방울을 추가하여 커버 슬립과 슬라이드 사이의 공간을 채웁니다. 별도의 제브라피시 그룹은 안락사되어 밤새 고정제에 담가둡니다.준비가 되면 가는 집게를 사용하여 등쪽 몸벽에서 신장을 조심스럽게 분리하고 장기를 유리병에 넣습니다. 절개된 신장을 3-5밀리리터의 XPBS 1개에 0.05%트윈으로 각각 5분씩 3회 세척합니다. 다음으로, PBS 용액을 제거하고 5% 자당 용액 3ml로 신장을 30분 동안 헹굽니다.이 시간이 지나면 용액을 30% 자당 3ml로 교체하고 다음날 섭씨 4도에서 밤새 보관하십시오. 용액을 제거하고 신장을 두 번 씻은 후 3-5ml의 표백 용액을 첨가하십시오. 신장 기관에 존재하는 멜라닌 세포 색소 침착을 제거하려면 유리 바이알을 회전기에 놓고 색소 침착이 사라지는 것을 주의 깊게 관찰하십시오.탈색은 일반적으로 약 20분이 소요되지만 경우에 따라 60분까지 걸릴 수 있습니다. 표백 용액을 너무 오래 방치하면 분해가 발생할 수 있으므로 신장에서 색소 침착이 두 번 제거되었을 때 무결성을 확인하기 위해 10-15분마다 샘플을 모니터링하고 실온에서 1시간 동안 4% PFA 용액으로 배양하는 것이 좋습니다. 다음으로, 4% PFA 용액을 제거하고 3-5ml의 차단 용액으로 마지막 세척 후 신장을 3회 세척하고 실온에서 2시간 동안 신장을 배양합니다.차단이 완료되면 선택한 염색 프로토콜로 바로 진행합니다. 차단 용액을 제거하고 신장을 세 번 씻은 후 신장을 XPBS 1회에 최소 10분 동안 담가둡니다. 이 기간 동안 신장을 12웰 또는 24웰 배양 접시로 옮깁니다.XPBS 1개를 충분히 작동하는 알칼리성 인산가수분해효소 기질 용액으로 교체하여 시료를 덮고 시료를 실온에서 30분 동안 회전기에 놓습니다. 이 시간이 지나면 알칼리성 인산가수분해효소 세척 완충액으로 신장을 세척하여 반응을 멈춥니다. 10-15분에 걸쳐 세척 완충액을 세 번 갈아서 신장을 헹굽니다.다음으로, 세척 완충액을 제거하고 깨끗한 유리잔에 신장을 장착합니다. 라벨링 키트에 포함된 인산가수분해효소 장착 매체를 밀어 넣습니다. 실체 현미경 또는 Debbie 필터 세트에 걸린 복합 현미경을 사용하여 알칼리성 인산가수분해효소 염색 신장을 시각화합니다.먼저, DBA를 하나의 XPBS에 희석하여 200마이크로리터 작동 DBA 솔루션을 준비합니다. PBS 용액을 200마이크로리터의 DBA 용액으로 교체하고 샘플을 실온에서 1시간 동안 회전기에 놓습니다. 이 시간이 지나면 DBA 용액을 제거하고 XPBS 1개 3-5ml로 각각 5분씩 신장을 3회 세척합니다.하나의 XPBS를 제거하고 깨끗한 유리 슬라이드에 신장을 장착합니다. 앞에서 설명한 바와 같이, 형광 실체 현미경 또는 복합 현미경에 설정된 표준 Trixie 또는 Texas red 필터를 사용하여 DBA로 염색된 신장의 원위 분절을 시각화합니다. 표백되지 않은 신장의 이 명시야 이미지에서 검은색 색소 침착은 흩어져 있는 멜라닌 세포 집단에 해당합니다.여기서 네프론 PCT 세그먼트는 덱스트린 주입 후 3일 후에 시각화됩니다. 삽입에는 멜라닌 세포가 있는 단일 네프론의 이미지가 포함되어 있습니다. 이 이미지는 멜라닌 세포 색소 침착을 제거한 후의 성인 신장을 보여줍니다.이러한 대표적인 이미지는 PCT 분절 간의 약간의 형태학적 변화를 나타내는 반면, 많은 네프론 PCT는 단단히 감겨 있습니다. 다른 네프론은 최소 코일링을 가진 PCT 영역을 포함합니다: 덱스트린, 캐스케이드 블루, 덱스트린, 루시퍼 옐로우, 덱스트린 플루오로 루비는 모두 신장 네프론의 PCT 분절을 우선적으로 라벨링하며, 덱스트린 캐스케이드 블루와 루시퍼 옐로우는 모두 루시퍼 옐로우 처리된 신장에서 관찰되는 훨씬 더 높은 배경의 일부 비특이적 라벨링을 보여줍니다. 대조적으로, 덱스트린 플루오로 루비는 강렬한 PCT 라벨링으로 인해 배경이 극적으로 감소된 것으로 나타났습니다.PCT 수송체 세포 유형의 특정 마커를 검출하고자 하는 욕구에 의해 염색된 성인 신장은 다양하고 단단히 감긴 고리 모양의 PCT 도메인과 일관되게 넓은 직경을 보여주는 더 길쭉한 PCT 스트레치의 분포를 통해 덱스트린 흡수의 특징적인 발현 패턴을 보여줍니다. 이 비디오를 시청한 후에는 알칼리성 포스파타아제(alkaline phosphatase)가 있는 근위세뇨관 및 DBA가 있는 메딕 원위세뇨관(medic distal tubule)과 같은 성체 제브라피시 신장 내의 네프론 분절을 성공적으로 라벨링하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 4% 파라알데히드로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 항상 코트, 장갑 및 안경을 착용하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

analysis-nephron-composition-function-adult-zebrafish

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 프로토콜은 성인 zebrafish에서 장기를 식별하고 해부를위한 절차를 설명합니다.

성인 Zebrafish에서 기관의 해부

zebrafish의 신장은 모두 신장과 조혈 성인 줄기 / 전구 세포의 고향이며, 척추 모델 생물에서 이러한 세포 유형과 그들의 자손을 공부하기 위해 우수한 기회를 나타냅니다. 여기, 우리는 세포 분리, 이식 및 신장 및 / 또는 혈액 세포 집단의 표현 연구와 같은 애플 리케이션에 사용할 수있는 성인 zebrafish의 신장을 확인하고 수술 제거하는 연구자 수 있도록 상세한 해부 절차를 보여줍니다.

성인 Zebrafish의 신장의 해부

인간의 급성 신장 상해 (아키)는 신장 nephrons을 구성하는 상피 세포 손상으로 인한 일반적인 임상 문제, 그리고 아키는 50~70% 1 높은 사망률 속도와 연결되어 있습니다. 이 현상을 안내하는 메커니즘과 한계가 제대로 이해 남아 있지만 상피 세포의 파괴에 따라 nephrons은 재생에 제한 기능이 있습니다. 이 비디오를 문서에서, 우리는 타겟 레이저 zebrafish 배아 신장의 신장 nephron 세포의 박리 또는 pronephros위한 기술을 설명합니다. 새로운 방법은 아키의 nephrotoxicity 유도된 모델을 보완하고 신장 nephron의 상피 조직이 재생된과 관련된 세포 및 분자 변경의 고해상도 이해하는 데 사용할 수 있습니다.

Zebrafish의 Pronephros의 레이저 절제는 신장 상피 조직이 재생된를 공부

이 비디오는 성체 제브라피시 신장의 평평한 마운트를 해부하고 준비하는 방법을 보여줍니다. 준비된 플랫 마운트는 표본 분석을 위해 현미경으로 시각화할 수 있습니다.

Kidney Flat Mount Preparation: 성체 제브라피시 신장의 현미경 분석을 위해 Flat Mount를 해부하고 준비하는 절차

이 비디오에서는 성체 제브라피시 신장의 탈색과 염색 절차를 위한 후속 준비를 보여줍니다. 염색 후, 성체 제브라피시 신장은 신장 재생, 신장 질환 모델의 표현형 특성 분석 및 네프론 기능을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

제브라피쉬 신장의 탈색 및 선염색: 염색을 위해 성체 제브라피시 신장을 준비하는 기술

여기에서는 겐타마이신 주사로 급성 신장 손상을 유발하여 성인 신장 재생을 연구하는 신뢰할 수 있는 방법을 제시합니다. 우리는 부상이 겐타마이신 투여량과 환경 온도에 따라 달라진다는 것을 보여주며, LHX1a+가 새로운 네프론을 개발하기 위해 현장 교잡법을 사용합니다.

겐타 마이신 유도 부상으로 성인 Zebrafish의에서 신장 재생

제브라 피쉬는 만성 신장 질환 (CKD)을 모델로 인기있는 도구입니다. 그러나, 작은 크기 것이 불가능 전통적인 방법을 이용하여 신장 기능을 평가한다. 우리는 CKD에 제브라 피쉬의 신장 기능의 정량 분석을 할 수있는 형광 염료 신장 클리어런스 분석 한 설명합니다.

형광 정리 분석을 사용하여 Zebrafish의 신장 기능의 평가

여기에 기재된 방법은 초점 및 평면 드리프트를 보정하는 광학 절편 및 재조정 간단한 전략을 수행 할 해부 현미경 형광을 사용하여 제브라 피쉬 배아 장기 발전 경과 분석을 허용한다.

해부 현미경을 사용하여 시간 경과 영상과 Zebrafish의 신장 개발의 분석 광학 단면에 대한 장착

화학 요법으로 항생제에 이르기까지 약물을 포함 nephrotoxins에서 발생하는 신장 손상은, 그 발병 기전 불완전하게 이해 남아 복잡한 질환이 발생할 수 있습니다. 이 프로토콜은 제브라는 신장 보호 대책의 식별에 적용 할 수있는 이러한 조건의 질병 모델에 사용할 수있는 방법을 보여준다.

Zebrafish의에서 콩팥 세포 독소 미세 주입은 급성 신장 손상을 모델링하기

이 프로토콜은 신장 독성 제로 cisplatin를 사용하여 성인 얼룩말 피시에 급성 신장 상해 (AKI)를 유도하는 절차를 설명합니다. 신장 조직에서 염증및 세포사멸을 분석하기 위한 기술과 2가지 기술의 재현성을 평가하는 단계, 각각 세포측정및 TUNEL을 상세히 설명했다.

성인 얼룩말 피시에 있는 Cisplatin에 의해 유도된 급성 신장 상해 모형

제브라피쉬는 신장 발달을 이해하는 중요한 모델입니다. 여기서, 시투 혼성화 프로토콜은 메소네프로스 개발 중 제브라피시 애벌레및 청소년의 유전자 발현을 검출하도록 최적화된다.

시투에서 메소네프로스 개발 중 제브라피시 애벌레와 청소년의 혼성화

배우세요 성인 제브라피쉬 신장의 네프론 구성 및 기능 분석 방법을 형광 표지와 면역형광 현미경 기술을 활용하여. 이 연구는 신장 재생 및 질병 연구에 중요한 통찰을 제공합니다.

성인 Zebrafish의 신장에서 네프론의 구성 및 기능 분석

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