형광 정리 분석을 사용하여 Zebrafish의 신장 기능의 평가

본 실험 절차의 전반적인 목표는 제브라피쉬에서 신장 기능을 정량적으로 분석하는 어세이를 구축하는 것입니다. 이를 위해 먼저 72 HPF의 제브라피쉬 배아를 마취시킵니다. 그 다음, 배아를 주입용 몰드로 옮기고 심장이 시야의 왼쪽에 위치하도록 방향을 잡습니다.

그런 다음 심낭강에 루민 덱스트라(rumine dextra) 형광 염료를 주입하고, 에피 형광 해부 현미경을 사용하여 심장 부위의 형광 이미지를 촬영합니다. 최종적으로 에피 형광 현미경을 이용하여 형광 염료의 신장 배출 능력을 평가합니다. 이 기술의 주요 장점은 제브라피쉬에서는 불가능한 혈액 검사나 소변 검사 없이도 제브라피쉬 신장 기능에 대한 정량적 판독값을 얻을 수 있다는 점입니다.

이 방법은 제브라피쉬 질환 모델에서 신장 기능을 평가하기 위한 강력한 도구를 제공합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 바늘을 뽑고 몰드를 준비한 후, 먼저 어류용수로 만든 2% agarose 용액을 90 mm 페트리 접시에 부어 몰드를 캐스팅하십시오. 몰드를 페트리 접시 위에 올려놓고, 쌓아 올린 슬라이드 가장자리가 agarose 표면 아래로 비스듬히 잠기게 하십시오.

30분 동안 그대로 둡니다. 슬라이드 캐스트를 제거하고 1:25 비율의 trica 마취제가 포함된 신선한 어류용수를 사용합니다. 슬라이드에 각인된 aros를 덮어 제브라피쉬에 형광 염료를 주입합니다.

1.0 외경 모세관에 사용할 수 있는 직선 피펫 홀더로 이어지는 압력 조절 시스템과 연결된 공기 압축기로 구성된 표준 미세주입 장치를 사용하십시오. 피펫 홀더는 MN 33 compact 내에 배치되어야 합니다. 자석 스탠드를 통해 강철 베이스 플레이트에 고정된 3축 제어 미세 조작기와 해부 현미경을 사용하여, 텍스트 프로토콜에 기술된 표준 조건으로 제브라피시를 유지하면서 배아를 시각화하고 조작하며 주입하십시오.

실험에 적절한 야생형 또는 형질전환 제브라피쉬 라인을 사용하십시오. 물고기에게 스트레스를 주지 않으면서 최대한의 알을 수집할 수 있도록 8L 수조당 수컷 15마리와 암컷 15마리의 사육 밀도를 유지하십시오. 수집 전날 저녁에 산란 수조를 야생형 스톡 수조 안에 담가 두십시오.

채집 당일, 물고기가 산란할 수 있도록 30분에서 40분 정도 기다립니다. 그 후 메시 스트레이너와 깨끗한 어항물을 사용하여 알을 수집하고 헹굽니다. 세척된 알을 배아 배지가 담긴 90 mm 페트리 접시에 옮기고, 근육 형성(myogenesis)을 억제하기 위해 28.5 °C에서 배양합니다.

수정 후 8시간(HPF)이 되면, 생존 가능한 배아를 최소량의 액체와 함께 100 µM PTU가 포함된 배아 배지가 든 새 페트리 접시로 옮긴 후 28.5 °C에서 추가로 배양합니다.

끝이 뾰족한 핀셋을 사용하여 바늘 끝을 부러뜨립니다. 그 다음, 펄스 지속 시간을 분(minute) 설정으로 최대화하여 RD를 바늘 끝으로 이동시킵니다. 용액이 끝에 도달하면 다시 밀리초(milliseconds) 설정으로 전환합니다.

마이크로미터를 현미경 스테이지 위에 놓고, 압력 조절기와 바늘 팁 조정을 통해 주입 전 배출 액적의 크기를 지름 100 microns 또는 부피 0.5 nanoliters로 조정하십시오. 5 milliliters의 배아 배지를 각각 담은 35 millimeter 페트리 접시 2개를 준비하고, 하나에는 trica, 다른 하나에는 recovery라고 표시하십시오.

trica라고 표시된 디시에 stock trica 200 µL를 추가합니다. 주입 준비가 되면 72 HPF의 개별 배아를 선택합니다. 최소량의 액체를 trica 디시로 옮기고 배아의 활동을 모니터링합니다.

배아를 마취시킨 후, 주입 몰드로 옮기고 좌측면이 위를 향하도록 홈에 배치합니다. 이때 심장이 시야의 왼쪽에 위치하도록 합니다. 심장에 RD를 주입하려면, 바늘로 심낭을 뚫고 심낭강 내에 1 nanoliter의 RD를 주입합니다.

바늘을 뺀 후, 주입된 배아를 최소량의 액체와 함께 회복 접시로 옮겨 1분 동안 관찰합니다. 그런 다음 개별 배아를 PTU가 포함된 신선한 배아 배지 1 mL가 들어 있는 24웰 플레이트로 옮기고 적절하게 라벨을 부착합니다. 실험군당 최소 10개의 배아에 주입을 마친 후 28.5 °C에서 3시간 동안 배양합니다.

주사 후 3시간(HPI)에 앞서 설명한 대로 배아를 마취합니다. 그리고 3% methyl cellulose가 담긴 35 millimeter 페트리 접시에 옮깁니다. 배아를 methyl cellulose 속으로 조심스럽게 밀어 넣고 측면을 촬영할 수 있도록 방향을 잡습니다.

UV 광원을 위해 570 nanometers 방출 필터를 사용하여 배아의 이미지를 획득합니다. 배아를 지정된 웰로 옮기기 전 회복 시간을 둡니다. 모든 주입된 배아의 이미지를 획득한 후, 28.5 degrees Celsius에서 계속 배양합니다. 24 HP에 두 번째 이미지 획득을 마친 후, Image J 소프트웨어로 이미지를 열고 관심 영역(ROI)을 지정하여 각 주입된 배아의 형광 강도를 정량화합니다.

편집 선택(edit selection)을 통해 ROI의 값을 100 square pixels로 지정하고 설정합니다. 심장을 ROI의 중앙에 위치시킨 후 분석(analyze)을 선택하고, 측정 항목(measurements)에서 평균 그레이 스케일(mean gray scale)과 면적(area)이 포함되도록 설정합니다. 그 다음 측정을 수행하여 배아당 3 HPI 및 24 HPI의 각 이미지 세트에 대한 형광 강도를 정량화하고, 평균 그레이 스케일 값을 추가 처리를 위해 스프레드시트로 옮깁니다.

적절한 소프트웨어를 사용하여 통계 분석을 수행하고, 여기에 표시된 것과 같이 student's T-test를 통해 그룹 간의 통계적 유의성을 비교하십시오. Morpho가 주입된 물고기에 RD를 주입한 결과, 수정 후 5일까지 배아의 40%에서 prone fric cysts가 발생했습니다. 또한, morphin 물고기는 대조군과 비교하여 24 HPI 이후 형광 염료를 제거하는 능력이 감소한 것으로 나타났습니다.

물고기 10마리로 구성된 한 그룹은 15분 이내에 주사 처리를 완료해야 합니다. 이 영상을 시청하고 나면, 제브라피시의 광학적 투명성을 활용하여 미세 주입된 형광 염료의 시간적 소실을 정량적으로 모니터링함으로써 제브라피시의 신장 기능을 효과적으로 판독하는 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다.