형광 정리 분석을 사용하여 Zebrafish의 신장 기능의 평가

이 절차의 전반적인 목표는 제브라 피쉬에서 정량적 신장 기능 분석을 생성하는 것입니다. 이는 먼저 72 HPF에서 제브라 피쉬 배아를 마취함으로써 이루어집니다. 다음으로, 배아를 사출 금형으로 옮기고 심장이 시야의 왼쪽에 오도록 방향을 잡습니다.

그런 다음 심낭강에 반추위 엑스트라 형광 염료를 주입하고 에피 형광 해부 현미경을 사용하여 심장 부위의 형광 이미지를 요구합니다. 궁극적으로 형광 염료의 신장 청소율은 epi 형광 현미경을 사용하여 평가됩니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 혈액이나 비뇨기 검사 없이 제브라 피쉬의 신장 기능을 정량적으로 판독할 수 있다는 것인데, 이는 제브라 피쉬에서는 불가능합니다.

이 방법은 제브라피시 질병 모델에서 신장 기능을 평가하기 위한 강력한 도구를 제공합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 바늘을 뽑고 금형을 준비한 후 먼저 생선 물로 만든 2%aro 용액을 90mm 페트리 접시에 붓고 금형을 주조합니다. 페트리 접시에 금형을 놓고 쌓인 슬라이드 가장자리가 농업 표면 아래에 비스듬히 잠기도록 합니다.

30분 동안 굳게 기다립니다. 슬라이드 캐스트를 제거하고 트리카 마취제가 함유된 민물고기 물을 1:25 비율로 사용합니다. 슬라이드를 덮기 위해 얼룩말 물고기 형광 염료 주입을 수행하기 위해 각인된 aros.

1.0 외경 모세관과 함께 사용하기 위해 직선 피펫 홀더에 공급되는 압력 조절기 시스템에 연결된 공기 압축기로 구성된 표준 미세주입 설정을 사용하십시오. 피펫 홀더는 MN 33 컴팩트 내에 보관해야 합니다. 3축 제어 마이크로 매니퓰레이터는 텍스트 프로토콜에 설명된 표준 조건을 사용하여 제브라 피쉬를 유지하면서 배아를 시각화, 조작 및 주입하기 위해 현미경을 해부하는 마그네틱 스탠드 사용자에 의해 강철 베이스 플레이트에 고정됩니다.

실험에 적합한 야생형 또는 형질전환 제브라 피쉬 라인을 사용합니다. 물고기를 방해하지 않고 최대한의 알을 수집할 수 있도록 8리터 수조당 수컷 15마리에서 암컷 15마리의 사육 밀도를 유지합니다. 사육 탱크를 수집 전날 저녁에 야생형 스톡 탱크에 담그십시오.

채취 당일에는 물고기가 산란할 때까지 30-40분 정도 기다립니다. 그런 다음 메쉬 스트레이너와 신선한 수족관 물을 사용하여 계란을 모으고 헹굽니다. 세척된 난자를 배아, 배지가 들어 있는 90mm 페트리 접시에 넣고 섭씨 28.5도에서 부화하여 근형성을 억제합니다.

여덟 시간에. 수정 후 또는 HPF. 최소한의 액체로 생존 가능한 배아를 1-100 PTU를 포함하는 신선한 페트리 접시에 배아 배지로 옮기고 섭씨 28.5도에서 추가로 배양합니다.

끝이 가는 집게를 사용하여 바늘 끝을 부러뜨립니다. 그런 다음 펄스 지속 시간을 분 설정으로 최대화하여 RD를 바늘 끝으로 이동합니다. 솔루션이 팁에 도달하면 밀리초로 다시 전환합니다.

현미경 스테이지에 마이크로미터를 놓고 압력 조절기와 바늘 끝을 미세 조정한 후 주입 전에 배출 액적의 크기를 직경 100미크론 또는 0.5나노리터의 부피로 조정합니다. 2 35mm 페트리 접시를 설정합니다. 각각 5ml의 배아를 함유하고 있으며, 배지는 하나는 트리카(trica)이고 다른 하나는 회복량입니다.

트리카라고 표시된 접시에 200마이크로리터의 스톡 트리카를 추가합니다. 주입할 준비가 되면 72 HPF에서 개별 배아를 선택합니다. trica 접시에 최소한의 액체를 옮기고 배아의 활동을 모니터링합니다.

배아가 마취되면 사출 금형으로 옮기고 왼쪽이 위를 향하도록 여물통의 방향을 지정합니다. 심장을 시야의 왼쪽에 배치합니다. RD를 심장에 주입하려면 바늘을 사용하여 심낭을 뚫고 1나노리터의 RD를 심낭강에 주입합니다.

바늘을 빼낸 후 주입된 배아를 최소한의 액체로 회수 접시에 옮기고 1분 동안 모니터링합니다. 그런 다음 개별 배아를 PTU를 포함하는 1ml의 신선한 배아 배지가 들어 있는 24웰 플레이트로 옮기고 적절하게 라벨을 붙입니다. 실험군당 최소 10개의 배아를 주입한 후 섭씨 28.5도에서 3시간 동안 배양합니다.

앞서 설명한 바와 같이 주사 또는 HPI로 배아를 마취한 후 3시간. 그리고 35% 메틸 셀룰로오스가 함유된 3mm 페트리 접시로 옮깁니다. 배아를 메틸 셀룰로오스 안으로 부드럽게 밀어 넣고 측면이 이미지화될 수 있도록 방향을 잡습니다.

570나노미터의 자외선 방출 필터를 사용하여 배아의 이미지를 획득합니다. 배아가 지정된 웰에서 교체되기 전에 회복될 때까지 기다렸다가 주입된 모든 배아에 대한 이미지를 획득한 다음 섭씨 28.5도에서 계속 배양합니다. 24 HP에서 두 번째 이미지를 획득한 후, 이미지 J 소프트웨어를 사용하여 이미지를 열고 관심 영역 또는 ROI를 지정하여 주입된 각 배아의 형광 강도를 정량화합니다.

선택 항목 편집을 선택하여 값을 100제곱 픽셀로 지정하고 설정합니다. ROI의 중앙에 심장을 배치하고 분석을 선택하고, 측정값을 설정하고, 평균 그레이 스케일과 면적을 포함하도록 측정값을 설정합니다. 그런 다음 측정을 수행하고 배아당 3HPI 및 24HPI에서 각 이미지 세트에 대한 형광을 정량화하고 추가 처리를 위해 평균 그레이 스케일 값을 스프레드시트로 전송합니다.

적절한 소프트웨어를 사용하여 통계 분석을 수행하고 여기에 표시된 대로 학생의 T-test를 사용하여 통계적 유의성에 대해 그룹을 비교합니다. 9개의 Morpho 주입된 물고기에 RD를 주입한 결과, 수정 후 5일까지 배아의 40%가 엎드린 프릭 낭종이 발생했다. 또한, 모르핀 피쉬는 대조군에 비해 24 HPI 후 형광 염료를 제거하는 능력이 감소한 것으로 나타났습니다.

한 번은 10 마리의 물고기 그룹을 15 분 이내에 주입 할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 제브라피쉬의 광학적 투명도를 활용하여 제브라피시 신장 기능의 효과적인 판독으로 마이크로 주입 형광 염료의 시간적 청소를 정량적으로 모니터링하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.