Name: 해부 현미경을 사용하여 시간 경과 영상과 Zebrafish의 신장 개발의 분석 광학 단면에 대한 장착 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: 배우세요 형광 해부 현미경을 이용한 제브라피시 신장 발달의 시간 경과 영상 분석 방법을. 이 기술은 살아있는 배아의 장기 발달을 직접 관찰하여 발달생물학 연구에 활용됩니다.

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우리는 비판적으로 읽고 원고를 개선 토마스 베이츠 감사합니다. 우리는 또한 물고기의 유지 보수를 위해 크리스티나 에버트와 사브리나 Stötzer 감사합니다.

모든 동물 실험은 &#39;실험 동물 관리의 원칙&#39;뿐만 아니라에 동물의 보호에 관한 독일 법률의 현재 버전에 따라 수행 하였다. 안티센스 - 모르 폴리 노의 1. 준비 (MO) <ol><li> , 3 mM의 MO 주식 솔루션을 준비 동결 건조 MO (유리 병에 300 nmol의)에 살균, 초순수 100 μl를 추가합니다. 완전한 용해를 들어, 5 분 동안 65 ° C까지 원액을 가열한다. 파라 필름과 유리 병을 밀봉하여 실온 (RT)에서 MO 주식 솔루션을 저장합니다. 그 유리 병 벽과 MO의 연결을 일으킬 수 있기 때문에 MO 원액을 진정하지 마십시오. </li><li> 멸균 초순수로 MO 원액을 희석함으로써 1㎜의 MO 작업 용액을 제조하고, 0.05 %의 최종 농도로 0.5 % 페놀 레드 용액을 추가한다. <ol><li> 하는 MO 작업 용액 10 μl를 얻을 3.3 μL MO 원액 5.7 ㎕의 물에 0.5 % 페놀 레드 시액 1 μl를 추가합니다. 있다솔루션을 작업의 새로운 배치를 준비하는 선수는 5 분 동안 65 ° C에 MO 원액을 가열한다. </li></ol></li><li> 바늘의 막힘을 방지하기 위해, 원심 MO 작업 용액을 사용하기 전에. 예를 들어, 5 분 (RT) 15,000 XG에 MO 원액의 10 μl를 스핀 주입 상층 액의 8 μl를 제거합니다. 참고 : 작업 손실 시간이 11 위에 모르 폴리 노 솔루션 발생할 수 있습니다. 이를 제외하도록 한 제조사에 의해 공급되는 프로토콜 다음 UV 분광법에 의해 용액을 테스트 할 수있다. 감소 된 효과가 장시간 방치 관측되지 않은 모르 폴리 사용한 wt1a 경우 (3 mM의 작업 용액이 더 이상 하나 이상의 저장된 년). </li></ol> 2. 결합 쌍을 설정 및 컬렉션 수정란의 <ol><li> 분리 이동식 체에 장착 된 사육 컨테이너 선, 각 (GFP wt1b) 이전에 미세 주입에 오후는 Tg가 5 쌍을 설정밤 동안 남성과 여성. 참고 : 짝짓기 쌍으로 사용되는 물고기가 사전 선별 및 좋은 &quot;생산자&quot;로 평가되어 있어야 충분한 계란이 성공적으로 주입 실험에 사용할 수 있도록합니다. </li><li> 조명이 켜지지 후 다음날 아침, 알을 먹는 물고기를 방지 체 위에 함께 남성과 여성을했습니다. </li><li> 산란을보세요. 4- 세포 단계 전에 주입 될 수 배치되어 계란의 양이 다시 암에서 (약 50), 분리 남성 도달하면. 주입의 첫 라운드를위한 배아 물이 가득 배양 접시에 파스퇴르 피펫으로 계란을 전송합니다. 계란의 추가 라운드를 얻으려면, 함께 별도 여러 번 상대 쌍을 배치합니다. </li></ol> 미세 주입 3. 준비 작업 참고 : 사전 단계 3.1 및 3.2를 수행합니다. <ol><li> 주입 (미세 주입 접시) 동안 위치에있는 배아를 보유하고 접시 GL를 삽입을 준비하려면액체, 투명, 순수, 식품 등급의 실리콘으로 가득 94mm 페트리 접시로 40 ~ 45 ° 각도로 엉덩이를 슬라이드. 실리콘 경화 될 때 슬라이드를 제거합니다. 즉, 상기 실리콘 층에 홈을 생성한다. 참고 : 또는 실리콘 아가로 오스 대신 1.5-3 %를 사용하고 4 ° C에서 접시를 저장합니다. </li><li> 바늘 풀러 유리 모세관에서 주사 바늘을 생성합니다. <ol><li> 내부 필라멘트를 포함 모세관을 사용합니다. 주 : 필라멘트 (3.3 참조) 메우기 후 바늘의 끝을 향해 MO 솔루션을 수송하는 데 도움이 될 것입니다. </li><li> 바늘 풀러에 적절한 설정을 설정합니다. 제브라 피쉬에 주입을위한 좋은 바늘은 가늘고 긴 팁 (12)이 있어야합니다. 약 10 mm의 길이 및 매우 끝에서 1.5 ㎛의 직경을 갖는 팁을 생성한다. = 속도 = 40 시간 = 100 0 당겨 열 = 330 : 예를 들어, 다음과 같은 설정으로 수평 바늘 풀러를 사용합니다. </li><li> 아래에있는 A 바늘의 품질을 검사현미경을 해부하고 짧거나 너무 긴 팁들을 정리. 참고 : 짧은 팁 바늘이 매우 길고 얇은 팁 벤드 등이 융모막을 터치 할 때 동안 배아를 손상하는 경향을 관통하지 않습니다. </li></ol></li><li> microloader 팁을 사용하여 MO 작업 용액 2 μL와 바늘을 백필 및 마이크로 인젝션 장치의 바늘 홀더에 삽입합니다. </li><li> 바늘이 선단 폐쇄 같이, 해부 현미경 날카로운 핀셋 바늘의 끝을 다시 협지하여 개구부를 생성한다. 또는 부드럽게 단단한 표면 (예. 작은 금속 블록 또는 핀셋의 뒷면)에 팁을 밀어 마이크로 인젝션 장치를 사용합니다. </li><li> 계수 배치 미네랄 오일 방울로 MO 작업 용액을 주입하여 주입 부피 보정. 약 200 (PL)의 사출 량을 얻기 위해 75 ㎛의 액적 직경 제조 분사의 기간을 조정한다. </li></ol><p클래스 = &quot;jove_title&quot;&gt; 4. 미세 주입 절차 <ol><li> 바늘이 (홈의 45 ° 각도 방향으로) 오는 곳에서 방향을 향해 식물 극 마이크로 인젝션 요리의 홈을 따라 한 세포 단계의 배아를 정렬합니다. </li><li> 융모막과 바늘에 노른자를 관통하는 2 세포 배아에 1의 노른자에 1 mM의 MO 작업 용액 (0.2 pmol의) 200 (PL)을 주입. </li><li> 넓은 개방과 파스퇴르 피펫을 사용하여 배아 물이 가득 페트리 접시에 주입 된 배아를 모두 수집하고 28.5 ° C에서 그들을 품어. </li><li> 오후에는 넓은 개구 파스퇴르 피펫을 이용하여 데드 배아를 제거하고 배아 물을 교체한다. </li></ol> 생체 내 이미징을위한 태아 5. 준비 <ol><li> 다음날 아침, melanization을 억제하는 0.003 % N-페닐 티오 요소 (Phenylthiourea) (PTU)를 포함하는 배아 물 배아 물을 교체합니다. 낭배의 끝 그것 때문에 INTERF 전에 PTU를 적용하지 마십시오초기 배아 발달과 ERES. 주의 : PTU는 독성 및 기형이다. 항상 장갑을 착용하고 흡입을 피하고 피부에 문의하십시오. </li><li> 원하는 발달 단계에서 해부 현미경으로 날카로운 핀셋으로 배아를 Dechorionate. 핀셋 한 쌍으로 융모막를 잡고 핀셋 한 쌍의 제 2과 융모막의 다른 쪽을 잡아보십시오. 조심스럽게 배아를 방해하지 않고 반대 방향으로 핀셋을 당깁니다. </li><li> PTU (0.003 %) 및 ​​0.02 % 에틸 3- 아미노 벤조 에이트, 메탄 술폰산 (Tricaine)를 함유 배아 물 PTU 함유 배아 물 (0.003 %)를 대체하여 배아 마취. </li><li> 아가로 오스 50 μm의 재배치 그리드와 커브 글라스 바닥 μ-접시에 저 융점의 배아를 포함. 적절한 삽입은 연습이 필요합니다. <ol><li> 1.5 ml의 반응 튜브에 0.7 % 아가로 오스 1 ml의 분취 량을 준비하고 36 ° C로 설정 열 블록에 넣어. TRA하는 넓은 개방과 파스퇴르 피펫을 사용하여μ-접시에 배아 nsfer. 울트라 얇은 팁과 파스퇴르 피펫을 사용하여 여분의 배아 물을 제거하고 강화 아가로 오스와 배아를 오버레이. </li><li> 아가로 오스는 여전히 액체 인 반면, 관심의 구성뿐만 아니라 이전 격자까지의 거리와 관련하여, 원하는 위치에 두 젤 로더 팁 배아의 방향. 그리드와 가까운 주변에서 :로 (아래 지느러미 여기에) 유리 바닥에 최대한 가까운 관심의 구조 (여기 pronephros)를 놓습니다. </li><li> 최적의 이미지 품질을 위해 바닥에 최대한 가깝게 배아 관심의 구조를 배치하여 배아 유리 바닥 간의 아가 층을 최소화한다. 게다가, 그리드에 가까운 부근에서 배아를 찾을 수 있지만, 그리드가 관심의 구조와 중첩되지 않습니다주의하십시오. 다른 μ-요리에 3-4 배아를 각각 포함하고 최고의 위치하는 하나를 사용하십시오. </li><li> 아가로 오스 열심히하면 충분히 2의 배아 대기를 개최합니다-3 분 및 0.003 %의 PTU 0.02 % Tricaine을 포함하는 배아 물에 포함 된 배아를 오버레이. 여분의 배아 물을 가만히 따르다 또는 매우 얇은 팁과 파스퇴르 피펫을 사용하여 제거합니다. 증발을 방지하기 위해 잠금 위치에서 μ 접시의 뚜껑을 닫는다. 참고 : 그들이 영상 기록을 손상 것 같이, μ-접시에 기포의 발생을 피하십시오. </li></ol></li></ol> 6. 현미경 참고 : 구조화 된 조명을 통해 광학 절편를 갖추고 현미경을 사용합니다. 멀티 채널, Z-스택, 시계열, 소프트웨어 자동 초점 및 확장 초점 : 다음과 같은 모듈을 포함하는 소프트웨어와 함께 기록 이미지. <ol><li> Z-스택의 취득 <ol><li> μ-요리 전환. 유리 바닥 이제 목적을 향 및 μ-접시 촬상 챔버로서 기능한다. </li><li> 그리드 위치로 슬라이더를 전환하고 소프트웨어 컨트롤의 구조화 된 조명 모드를 활성화합니다. </li><li> 보정시편과 선택의 채널 (들)에 대한 그리드 포커스는 초점 교정 마법사의 지침에 따라 (내장 배아)를 검사합니다. </li><li> 는 z-스택 획득 모드를 활성화하고 중앙 모드로 설정합니다. 시편의 중앙으로 집중하고 센터를 클릭하여 Z- 스택의 중심 평면으로 설정합니다. 중심 위치 주변의 영역을 정의하여, Z 스택의 치수를 설정한다. 주 : 객체 구조는 제 1 및 Z 스택의 마지막 평면 밖에서 크게 보이지 않을 것이다. </li><li> 광학 부분 사이의 간격을 조정합니다. 가장 Z-해결을 위해 최적의 버튼을 클릭합니다. 소프트웨어가 나이 퀴 스트 선정시 (50 % 오버랩) 다음과 같은 권장 거리를 설정합니다 필드의 목표 깊이를 기준으로합니다. 참고 : 작은 파일 크기와 구조의 허가를 목표로하는 경우, 수동으로 더 큰 간격의 크기를 설정합니다. 권장보다 작은 단계를 설정하는 것은 단지 이상 증가없이 큰 파일 크기가 발생합니다등의 정보를 제공합니다. </li></ol></li><li> 시간 경과 영상 <ol><li> 시계열 도구를 열고 시계열 실험의 간격을 설정합니다. 예 레코드 Z 스택 이미지 5 시간의 기간 동안 매 30 분. </li><li> 시간이 지남에 초점 드리프트를 보정하기 위해, 자동 초점 전략을 설정합니다. , 초점 전략 대화 상자를 선택 드롭 다운 목록에서 소프트웨어 자동 초점을 선택하고 기준 채널과 TL-브라이트 채널을 선택합니다. </li><li> 오토 포커스와 각 시점을 시작합니다. 최적 시간 내에 신뢰성있는 검색 범위를 확보하기 위해, 고정 된 200 ㎛의 상대적으로 탐색 범위를 설정한다. 이 범위는 완전히 최대 스텝 크기 (샘플링 매개 변수)의 기본 품질 (품질 매개 변수)와 (범위 범위 매개 변수)를 스캔됩니다. </li><li> 관심 (초점 ROI) 및 위치의 초점 영역 내에서 계량을 활성화, 자동 초점의 정밀도를 높이기 위해 관심의 구조를 중심으로 라이브 뷰 창에 초점 ROI 말했다. 참고 : 경우시스템이 시간 경과 기록하는 동안 자동으로 중앙 Z 위치를 업데이트 소프트웨어 자동 초점 모듈 부족, 주어진 시간에 실험을 일시 중지하고 수동으로 초점을 조정하고 실험을 계속한다. </li><li> 시계열 촬영 중에 잠재적 인 XY 드리프트를 보상하기 위해 소프트웨어의 십자선에 (이미징 챔버)를 각인 그리드의 특정 지점을 배치하고 스크린 샷을하여 위치를 저장합니다. </li><li> 시계열 실험을 시작한다. 시계열 간격이 끝나기 전에 필요한 경우, 위치 스크린 샷에 따라 재 조정, 실험을 일시 중지합니다. 실험을 계속합니다. </li></ol></li></ol> 7. 이미지 처리 <ol><li> 처리 탭으로 전환 및 방법 대화 상자에서 포커스 (EDF)의 확장 깊이를 선택합니다. 광학 부 취득하기 때문에, 화상 시리즈 최대 투영 알고리즘을 적용한다. 참고 : 다음은 알고리즘이 카에 투사됩니다ightest 또는 제 1 단계에서 복합 차원 이미지 스택의 가장 어두운 화소, 결국에는 각 시점에 대한 결과를 화상으로서 높은 분산이 하나를 사용한다. </li><li> EDF 이미지 시리즈에서 시간 경과 동영상 (예 : AVI 또는 이동 파일)을 생성하기 위해 영화 내보내기 방법을 사용합니다. </li></ol>

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</ol>

저자 마이클 그라프이 조에서 사용되는 악기를 생산 칼 자이스 현미경 GmbH의의 직원이다.

제브라 피쉬는 인간의 질병의 척추 동물 개발 및 모델링 연구를위한 인기있는 모델 생물되고있다. 제브라 피쉬 배아 투명 남아 있기 때문에, 뇌와 심장 등의 개발 기관은 표준 준비 현미경을 이용하여 관찰 할 수있다. 기관 특정 형광 유전자 변형 라인을 활용하여 형광 현미경으로 살아있는 배아에서 개발의 여러 단계에 걸쳐 기관 형성 평가를 할 수 있습니다. 표준 표면 형광 현미경 전체 장기의 세부 구조를 이미징하는 한 제한은 초점면의 상하에 물체로부터의 신호의 영향이다. 이 포커스 아웃 빛이되지 감소 이미지 대비 해상도 만 결과는 또한 관심 13,14의 중요한 구조를 모호하게 할 수있다. 디스크 confocal- 또는 다 광자 현미경 회전 레이저 스캐닝 confocal- 같은 몇 가지 기술은 아웃 - 오브 - 포커스 정보함으로써 increas을 최소화하기 위해 개발되어왔다전자 이미지 대비뿐만 아니라 축 해상도입니다. 광학 부분을 획득하기 위해 다른 방법으로는 레이저 가공 스캔 자유로운 구조 조명 현미경 정규 현미경 (15) 상에 구현하기가 간단하며 다양한 조명 필드 기반 기술이다. 여기에 제시된 결과는 해부 현미경에 구현 및 확장 초점 이미지의 재건과 결합 된 구조화 조명에 의해 달성 광학 절편은, 정상의 세부 구조의 시각화를 가능하게한다는 설명과 제브라 피쉬의 신장 발달을 방해. 특히, wt1a의 morphants에서 GFP 양성 세포는 다양한 초점 깊이에 분산되어, 밖으로 외 초점 흐림 하나의 평면의 이미지는 표현형의 세 차원 복잡성을 과소 평가합니다. 기관 조직, 재 배열 또는 중단의 역학을 수행하기 위해, 시간 경과 형광 현미경 복잡한 기술이기는하지만 강력한입니다. 시간 경과시이미지 약간의 진동이나 작은 온도 변화는 X, Y 또는 z 방향으로 드리프트가 발생합니다. 이는 안정적인 결과를 얻기 위해서는 추가적인 장비 (환경 챔버, 방진 테이블)을 요구한다. 제시된 방법은 추가적인 장치없이 저속 이미지를 기록하기위한 전동 포커스 드라이브 해부 현미경의 능력을 이용한다. 안정한 초점을 유지하기 위해 자동 초점 전략을 수립하고, 촬상 챔버의 바닥에 임프린트 재배치 그리드는 (X)의 보정 Y- 불안정성 사용 하였다. 배아의 적절한 삽입 프로토콜 내에서 중요한 단계입니다. 연습은 그와 중첩없이 그리드 등의 유리 바닥에 최대한 가까이 가까운 주변에 대한 관심의 구조를 배치 할 필요가있다. 이 방법의 가장 큰 장점은 이러한 생활의 성장 및 마이그레이션 등의 발달 과정을 직접 관찰 저렴하고 간단한 도구입니다 것입니다몇 시간 동안 배아. 또한, 이러한보기와 확장 된 작동 거리의 큰 필드로 해부 현미경 별 혜택은 전체 기관을 포함하여 더 큰 샘플의 검사를 용이하게한다. 그러나, 몇 가지 제한을 명심해야한다. 확인하고 위치를 재조정 할 수있는 실험의 일시 정지는 절차에 시간과 강력한 온도 제어의 부재는 제브라 피쉬 (16)에 대해 28.5 ° C에서 시간 게시물 수정으로 정의 된 &quot;표준&quot;개발 시간을 변경합니다. 또 다른 잠재적 인 문제는 관심의 구조는 배아 또는 유충 안에 위치 할 때, 특히, 동물에 이미징 제한된 깊이이다. 이러한 구조는 somites 및 난황 사이에 위치해 있습니다 제브라 피쉬 pronephric 사구체이다. 사구체을 이미징 제한 깊이는 약 200 ㎛의 개발 5 일 후에 도달 거리였다. 반대로, L 형광 구조임을긴 시간 동안 이미지화 될 수있는 동물의 표면에 가까운 ocated. 예를 들면 간 세포는 적어도 9 DPF까지 이미징 접근 가능하다. 또 다른 한계는 아가 로스 및 Tricaine 처리의 배아 또는 유충의 장기 고정 각각 성장 지연 심장 부종을 유발한다는 것이다. 이것은 정상적인 발달을 방해 할 수 있기 때문에 관심이 일정 기간 경과 녹화 시간을 제한 할 것을 권장한다. 관심의 영상 구조 과정을 확인하는 것이 동물의와 전체 모양이 같은 실험 조건 하에서 만 포함하고 마취없이 유지 (끝) 비교하는 것이 도움이된다 일반적으로 개발한다. 5 시간 초점 이미지의 확장 깊이의 후속 계산의 기간 동안 30 분마다 정상의 초기 이벤트에 대한 공간 및 시간 정보를 제공 및 광학 섹션의 Z-스택을 녹화 B를 유도 신장 개발을 방해y를 wt1a의 최저 모르 폴리 노를 매개. 고정 된 시간에 영상 pronephros 개발을위한 GFP 라인은 9,10 포인트 밝혀 :. 이전에 수행 모르 폴리 노 녹다운 실험은 이미 신장 마커 (17, 18) 및 형질 전환 wt1b의 고용과 현장 하이브리드에서 Wt1a가 pronephros 형성의 초기에 중요한 역할을 충족하는 것으로 나타났습니다 중단 사구체 형태 형성에서 그 wt1a 결핍 결과 및 발 세포 사양을 실패했습니다. 이러한 정적 인 방법과는 달리, 시간 경과 기록은 직접 초기 제어 배아에서 nephrogenesis 및 wt1a의 morphants에서 멀리 pronephric 지역에서 GFP 양성 세포의 이동의 역학을 시각화. 시간이 지남에 잘못 라우팅 세포를 추적 할 수있는 가능성은보다 상세한 표현형 분석을 허용한다. 일반적으로, 여기서 제시되는 방법은 제공하는 저렴하고 복잡 대안 사용하기 쉬운 덜 접근 SEtups 일반적 등 (환경 챔버 방진 테이블 장착) 레이저 주사 현미경 광 시트 현미경으로 촬영 된 영상에 사용. 드리프트 문제를 해결하는 기술 루틴은 또한 형광 스테레오 현미경 등의 광학 절편 옵션없이 설정에서 시간 경과 이미지를 수행하기 위해 적용 할 수 있습니다. 기술뿐만 아니라 신장의 개발을 조사하는 것이 적합하지만, 또한 심장, 간 또는 기타 기관의 정상적인 형태 형성 불량을 모니터에 적용 할 수있다. 또한, 본 방법은 상처 치유 나 재생 등의 배아 및 성체 유기체 모델의 다양한 역동적 공정을 관찰하는데 사용될 수있다.

낭배 이어 형성기 개인의 라이프 사이클의 다음 단계이다. 그것은 조직 및 기관을 생산하기위한 재 배열, 상호 작용 및 세포의 매우 자주 이동을 수반한다. 장기 발전 기본 프로세스의 부정확성들은 생활에 즉시 또는 나중에 또한 자신을 나타낼 수있는 질환으로 이끈다. 따라서, 기관 형성을 이해하는 것은 발달 생물학 및 생물 의학 연구에 큰 노력을하고있다. 특정 장기의 발달을 조사 할 수 있도록하기 위해서는,도 태아의 몸체 벽을 통해 표시한다. 이는 개발 과정에서 발생하는 공간 및 시간 변경의 기록을 할 수 있습니다. 또한, 기관 형성에 관여하는 인자의 중요성을 분석하기 위해서는, 변조 할 필요가있다. 생체 기관 형성의 조사를 위해 대단히 적합 하나의 유기체는 제브라 피쉬입니다. 그 transpar형광 형질 전환 라인의 사용과 함께 배아 발달 동안 ency 단백질 발현 및 분포 역학 관찰뿐만 아니라, 내부 기관 (1)의 시각화를 허용한다. 이것은 누구의 장기 현미경 분석에 액세스 할 수없는 포유 동물 모델에 비해 실시간으로 장기 개발의 조사에 관한 고유 한 이점을 제공한다. 또한, 다른 도구는 제브라 피쉬의 배아 발달을 조작 할 수 있습니다. 돌연변이 라인의 생성 옆 모르 안티센스 올리고 뉴클레오티드 (MO)는 특정 기관의 발달에 관여하는 특정 유전자의 활성을 넉다운하는데 사용될 수있다. 수법의는 스플 라이스 사이트 또는 번역 개시 코돈 (8월)을 대상으로, 따라서 사전의 mRNA 또는 번역의 접합을 방해 하나. 제브라 피쉬 배아 신장의 pronephros은 신장 개발과 세대의 기능을 연구하는 해부학 간단하지만 가치있는 모델입니다신장 질환이 관련 말이지. 그것은 네프론이라는 두 개의 기능 단위로 구성되어 있습니다. 각각의 네프론은 혈액 여과 장소 3를 취하는 사구체로 구성되어 있습니다. 추가의 성분은 짧은 목 영역뿐만 아니라, 4 배설강 만료 분비 용질의 재 흡수 및 덕트 세그먼트 세관이다. 상관없이 간단한 조성물의 조직 및 지브라 피쉬 pronephros의 다른 세포 유형의 포유류 신장 5,6- 매우 유사하다. 신장 개발에 매우 관여 한 인자는 상기 윌름 종양 억제 유전자 WT1 (7)에 의해 부호화된다. 제브라 피쉬는 wt1a라는 두 paralogs을 소유하고 pronephros 8의 개발 과정에서 중복하지만 동일한 패턴으로 표현되는 wt1b. GFP 표지 pronephros 구조를 갖는 형질 전환 지브라 피쉬를 사용함으로써, wt1a &lt;의 완전한 녹다운을 보였다/ EM&gt; 또는 특정 스플 라이스 형태는 배아 신장의 심각하거나 가벼운 기형, 각각 9, 10에 연결됩니다. 여기에 설명 된 방법은 구조화 된 조명을 통해 광학 절편를 갖추고 형광 해부 현미경을 이용하여 제브라 피쉬 배아에서 정상 및 장애인 nephrogenesis의 시간 경과 분석을 할 수 있습니다. 일반적으로 광학 부분은 인 - 포커스 정보를 포함하는 이미지의 인수를 할 수 있습니다. 포커스 아웃 정보는 그러한 수학적 알고리즘 (예. 컨벌루션), 광학 설계 (예를 들어 공 초점 레이저 주사 현미경) 또는 이들의 조합 (예를 들어 구조화 조명) 등 다양한 방식으로 회피 될 수있다. 신장 발달에 결함을 유도하기 위해 우리는 안티센스 형질 전환 제브라 피쉬 라인에 주입 wt1a에 대한 MO (: GFP)의 Tg (wt1b)을 사용했다. 이 줄은 사구체, 목, 전방에서 GFP 형광을 보여줍니다세뇨관 9, 10의 일부. 레이저 스캐닝 또는 빛 시트 현미경 등의 광학 절편과 시간 경과 기록에 대한 더 복잡한 설정과 비교, 줌 현미경은 취급이 용이하고 저렴합니다. 또한, 구조화 된 조명 장치는 쉽게 확장 작업 거리와도 큰 필드로서 종래 형광 장비 (예를 들면 형광 램프, 필터)와 현미경 특정 이점을 제공 해부와 결합 될 수있다. 드리프트의 문제는 일반적으로 안정한 결과 필요한 추가적인 장비 (환경 챔버, 방진 테이블)을 사용하지 않고 해결 하였다. 오토 포커스 전략이 설립 각인 이전 그리드와 영상 챔버가 X 또는 Y 방향으로 드리프트 다음 위치를 다시 조정하기 위해 사용 하였다 초점 드리프트를 보정합니다. 제시된 방법은 또한 형광 스테레오 m 광학 절편 옵션없이 현미경에 적용 할 수있다icroscopes 정상적으로 개발 조직과 장기 역학의 시간 경과 기록에 사용되는 더 복잡한 장비에 대한 대안을 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Control Morpholino</td><td>Gene tools, LLC</td><td>표준 제어 올리고</td><td>준비됨&nbsp; 제어&nbsp; oligo</td></tr><tr><td>wt1a 모르폴리노스&nbsp;</td><td>Gene tools, LLC</td><td></td>는 <td>Ref. 90.5%에 게시된 대로 첫 번째 스플라이스 기증자 부위를 대상으로 설계되었으며, 서열</td></tr>은 다음과 같습니다. <tr><td>페놀 레드 솔루션</td><td>Sigma</td><td>P0290</td><td>주입 추적자</td></tr><tr><td>peqGOLD 유니버설 아가로스</td><td>peqlab</td><td>35-1020</td><td>마이크로주입 접시를 준비하기 위해</td></tr><tr><td>유리 모세혈관을 준비하기 위해&nbsp; (GC100F-10)</td><td>Hugo Sachs Elektronik</td><td>30-0019</td><td>주사 바늘을 생성하기 위해&nbsp;</td></tr><tr><td>마이크로로더 팁</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td>마이크로주입 바늘을 로드하려면</td></tr><tr><td>Dumont 집게&nbsp;</td><td>Fine Sience Tools</td><td>91150-20</td><td>바늘 끝에 구멍을 생성하려면&nbsp;</td></tr><tr><td>배아 수(0.3x Danieaus&acute; 용액)</td><td></td><td></td><td>1x: 58 mM NaCl, 0.7 mM KCl, 0.4 mM MgSO4,&nbsp; 0.6 Ca(NO3)2, 5 mM Hepes, pH: 7,5; 메틸렌 블루를 추가하지 마십시오!</td></tr><tr><td>계수선 5mm/0.05mm</td><td>과학 서비스</td><td>PY68039-02</td><td>주입량 계산용</td></tr><tr><td>파스퇴르 피펫 137mm, 4.8ml</td><td>Roth</td><td>E305.1</td><td>난자 채취, 배아 이식 및 죽은 배아 제거</td></tr> 초<tr><td>박형 팁이 있는 파스퇴르 피펫 157mm, 3.5ml</td><td>Roth</td><td>E304.1</td><td>과도한 수분 제거&nbsp;</td></tr><tr><td>N-Phenylthiourea (PTU)</td><td>Sigma</td><td>P7629</td><td>멜라닌화 억제용</td></tr><tr><td>에틸 3-아미노벤조에이트 메탄설포네이트 (트리카인)</td><td>Sigma</td><td>E10521</td><td>제브라피쉬 마취</td></tr><tr><td>저융점 아가로스</td><td>Biozym</td><td>850111</td><td>포함용&nbsp;</td></tr><tr><td>&micro;-dish 35mm, high Glass Bottom Grid-50</td><td>ibidi</td><td>81148</td><td>이미징 챔버</td></tr><tr><td>젤 로더 팁</td><td>Hartenstein</td><td>GS05</td><td>적절한 포식을 위해 배아의 방향을 지정하려면</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>< 강력한>장비</강력한></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>마이크로피펫 풀러 (모델 P-97)</td><td>셔터 계기</td><td></td><td>주사 바늘을 생성하려면&nbsp;</td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Saur Laborbedarf</td><td></td><td>미세주입용</td></tr><tr><td>Thermomixer copact</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Thermoblock 저융점 아가로스</td></tr><tr><td>SZ61 (실체현미경)</td><td>Olympus</td><td></td><td>주입 제어용</td></tr><tr><td>Axio Zoom. V16</td><td>Zeiss</td><td></td><td>임베딩 및 이미징용</td></tr><tr><td>ApoTome.2 슬라이더</td><td>Zeiss</td><td></td><td>광학 절단용</td></tr><tr><td>AxioCam MRm</td><td>Zeiss</td><td></td><td>이미지 획득용&nbsp;</td></tr><tr><td>ZEN 2012</td><td>Zeiss</td><td></td><td>이미징 소프트웨어</td></tr></tbody></table>

해부 현미경을 사용하여 시간 경과 영상과 zebrafish의 신장 개발의 분석 광학 단면에 대한 장착

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

기관 형성을 이해하기 위하여 조직의 발달 과정에서 발생하는 공간 및 시간 변화는 기록 될 필요가있다. 여기에 기재된 방법은 구조화 조명 및 Z 스택 획득을 구비 한 형광 해부 현미경을 사용하여 제브라 피쉬 배아 정상적인 신장 장애 개발 경과 분석을 허용한다. 와 형광 표지 된 신장 구조가 사용되었다 : nephrogenesis, 형질 전환 제브라 피쉬 (GFP)의 Tg (wt1b)를 시각화합니다. 신장 결함은 윌름 종양 유전자 wt1a 신장 발달에 중요한 것으로 알려진 인자에 대한 안티센스 폴리 노 올리고 뉴클레오타이드를 주입함으로써 유발 하였다. 실험 장치의 장점은 추가 장비없이 X, Y 또는 z 방향으로 다시 조정 움직임에 대한 간단한 전략 줌 현미경의 조합입니다. 온도 변화와 기계적 진동에 의해 유도되는 초점 드리프트를 회피하려면, 오토 포커스 전략 대신 보통 필요한 환경 챔버를 이용하는 도포 하였다. 인해 XY 드리프트의 위치 변화를 재조정하기 위해, 각인 재배치 그리드와 촬상 챔버를 사용 하였다. 이러한 공 초점 레이저 주사 또는 빛 시트 현미경 등의 광학 절편과 시간 경과 기록에 대한 더 복잡한 설정과 비교, 줌 현미경은 취급이 용이하다. 게다가, 이러한 분야의 높은 농도 및 연장 된 작업 거리로서 현미경 특정 혜택을 제공 해부. 여기에 제시된 기관 형성을 연구하는 방법도 광학 절편 수없는 형광 입체 현미경으로 사용될 수있다. 높은 처리량을 한정하지만, 이러한 기법은 일반적으로 현상 조직 및 장기 다이나믹스의 저속 기록을 위해 사용되는보다 복잡한 장비에 대안을 제공한다.

저속 현미경 장기간에 걸쳐 동적 생물학적 과정을 시청할 수있는 강력한 기술이다. 시간 경과 이미징 동안 자주 발생하는 문제는 온도 변화와 기계적 진동에 의해 유도되는 드리프트라는 X, Y 또는 z 방향의 운동이다. 여기에 제시된 방법은 환경 챔버와 방진 테이블없이 해부 현미경에 제브라 피쉬 배아 또는 애벌레에서의 형광 표지 된 구조를 기록 시간 경과 수 있습니다. XY 드리프트의 보상을위한 시험편은 임프린트 이전 격자 (도 1)가 촬상 챔버에 삽입 하였다. 소프트웨어 툴의 십자선 관련된 그리드의 특정 포인트의 위치는 사전 조정 된 위치 (도 2a)로 시험편을 반환하는 데 사용 하였다. 제시된 결과는 줌 현미경을 사용하여 수득 하였다구조화 조명 (그림 2B)를 통해 광학 절편을위한 통합 슬라이더. 연속 초점 보정, 자동 초점 전략이 설립되었다. 이 전략에서, 소프트웨어 오토 매 시점 전에 최대 콘트라스트에 근거하여 초점을 찾기 위해 사용된다. 이 때문에 정의 초점면 후속 Z 스택 획득을위한 센터 계획으로 설정됩니다. 이 오토 포커스 공정 (도 2c) 중 충분히 짧은 노출 시간을 허용하는 샘플에서 광독성을 최소화하기 위해, 투과광 브라이트 채널을 기준 채널로서 사용된다. 상기 방법은 형질 전환 지브라 피쉬 라인 및 제어 - wt1a morphant 배아 (: GFP)의 Tg (wt1b) 신장 개발의 비교 분석에 적용 하였다. 초기 nephrogenesis 동안이 라인은 신장 전구 세포는 9, 10 이상에서 발생하고, 중간 중배엽에서 녹색 형광을 보여줍니다성형 세관 및 네프론의 primordia (그림 3)입니다. 시간 경과 영상 녹화 제어 모르 폴리 노 주입 된 배아에서 nephrogenesis이 (결과는 도시하지 않음) uninjected들에 비해 변경되지 않은이며, 초기 zebrafish의 신장 개발 (3)의 설명 단계에 따라 것을 알 수있다. 현상 pronephric 세뇨관 HPF (20)는 표시와 그 전방에있는 끝에서 형성 네프론의 primordia을 나타내는 세포의 구면 축적이 검출 될 수있다. 다음 시간 동안, 세관 및 네프론의 primordia 성장하고 나중에 primordia에는 ​​중간 선 (그림 4, 비디오 2)에 융합하기 시작합니다. 반면, nephrogenesis 심각 wt1a의 morphant 배아에서 중단된다. GFP 양성 관 모양의 구조가 20 HPF에서 볼 수 있지만, 그들은 더 확산과 덜 개발 된 것으로 보인다. 또한, 더 적절한 네프론의 primordia이 형성되지 않았다. 가장 눈에 띄는 차이점은 마에하기그러나 그는 현상 pronephros (도 4, 비디오 2) 외부에서 형광 세포의 다수의 등장이 시점에서 배아를 제어한다. 그 후,이 세포는 pronephric 경기장을 떠나지 및 복부 (비디오 2)를 마이그레이션 할 수 있습니다. 제어 배아와 wt1b 형질 전환 라인의 wt1a의 morphants에서 신장 개발은 이전에 다른 고정 된 시점 9,10에서 이미지를 복용하여 비교하고있다. 이 정적 인 방법과는 달리, 시간 경과 기록은 정상 nephrogenesis 및 wt1a 고갈로 인한 신장 전구 세포의 misrouting의 역학을 수행 할 수 있습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53921/53921fig1.jpg" /> 그림 1 : 이주 그리드와의 상용 상공 회의소에 포함 된 배아의 도식 그림. 요리는있다네 그리드 각 유리 커버 슬립의 저면에 인쇄 된 50 ㎛의 반복 거리로 나누어. 이미징 될 수있는 배아 관찰 광장에 근접 신장 구조, 거꾸로 포함하지만, 그리드 오버레이가 없습니다.되는 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53921/53921fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53921/53921fig2.jpg" /> 그림 2 :. 시간 경과 이미징 및 구조화 조명의 그리드 투사의 드리프트의 보상을위한 조정 재배치 그리드의 독특한 위치는 이미지 센터로 주어졌다 (노란색 십자선으로 표시) 이상 XY-정렬을위한 기준점 역할을 작은 변화의 경우입니다. 빨간색 사각형은 자동 초점 전략 (A)에 사용되는 관심 (ROI)의 영역을 나타냅니다. 광학 절편 WA구조화 조명에 의해 얻어진 s의. 이미지는 정확한 캘리브레이션 (B) 후 초점면에서 투영 된 격자 구조를 도시한다. 오토 포커스 전략 (빨간색 사각형)에 대한 ROI는 관심 (C)의 구조로 안정적인 자동 초점을 허용 (somites 여기) 대비 높은 특유의 배아 구조를 포함하도록 설정되어 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53921/53921fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/53921/53921fig3.jpg" /> 그림 3 : 형질 전환 wt1b :. 녹색 형광에 GFP 배아 개발 신장에 지느러미 (A) 또는 측면 (B) 전송 및 형광 이미지를 오버레이는 왼쪽 전방으로 표시됩니다. NP, 네프론의 primordium; 태평양 표준시, pronephric 세관; 그저 그래진드기. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53921/53921fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/53921/53921fig4.jpg" /> 그림 4 : wt1a의 최저은 배아 신장 개발을 방해 대표, 시간 경과 녹화에서 포커스 이미지의 확장 깊이를.. 제어 모르 폴리 노 주입 된 배아에서 신장 개발은 중간 선에 융합하기 시작 성장 세관 및 네프론의 primordia 정상 진행 상황을 보여줍니다. 반대로 wt1a의 morphants 적절한 네프론의 primordia 형성 못하고 GFP 양성 세포의 방대한 양 pronephric 필드의 외부. (NP, 네프론의 primordium, 태평양 표준시, pronephric 세관). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53921/53921fig4large.jpg" target="_blank">이 파이의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오</a>gure. <img alt="영화 1" src="/files/ftp_upload/53921/53921movie1.jpg" /> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53921/co-MO.mov" target="_blank">제어 모르 폴리 노 주입 된 배아에서 정상적인 신장 개발의 보충 비디오 1. 시간 경과 기록. . (오른쪽 다운로드 클릭)</a> 세관의 성장과 네프론의 primordia가 융합하기 시작하는 방법을 동영상을 보여줍니다. HPF (20)로부터 이미지를 5 시간에 걸쳐 30 분 간격으로 수행 하였다. <img alt="영화 2" src="/files/ftp_upload/53921/53921movie2.jpg" /> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53921/wt1a-MO.mov" target="_blank">wt1a의 morphant 배아에서 방해 nephrogenesis의 보충 비디오 2. 시간 경과 기록. (오른쪽 다운로드 클릭).</a> 비디오는 pronephric 지역 중 GFP 양성 세포의 이동을 보여줍니다. 20 HPF에서 시작, 이미지는 30 마일에서 찍은5 시간에 걸쳐 N 간격.

여기에 기재된 방법은 초점 및 평면 드리프트를 보정하는 광학 절편 및 재조정 간단한 전략을 수행 할 해부 현미경 형광을 사용하여 제브라 피쉬 배아 장기 발전 경과 분석을 허용한다.

해부 현미경을 사용하여 시간 경과 영상과 Zebrafish의 신장 개발의 분석 광학 단면에 대한 장착

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

이 실험 절차의 전체적인 목표는 모든 방향으로의 표류(drifting) 후 재정렬을 위한 간단한 전략을 적용하여, 형광 해부 현미경을 이용해 다양한 발달 과정의 타임랩스 분석을 가능하게 하는 것입니다. 이 방법은 살아있는 배아에서 수 시간 동안 조직 및 기관의 발달을 직접 관찰할 수 있게 하므로 발달 생물학 분야의 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법의 주요 장점은 레이저 스캐닝이나 광시야 현미경(lighted microscopy)과 같이 발달 중인 조직 및 기관의 타임랩스 기록에 통상적으로 사용되는 더 복잡한 기술들에 비해 비용이 저렴하고 사용하기 쉬운 대안이라는 점입니다.이 방법은 스위퍼 피시(sweeper fish) 배아 및 치어의 발달 과정 중에 발생하는 공간적, 시간적 변화에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 다른 모델 생물체의 초기 발달 과정을 조사하는 데에도 적용될 수 있습니다. 또한, 뿌리 치유 및 재생과 같이 성체 생물에서 일어나는 역동적인 과정을 관찰하는 데 적합합니다. 준비 단계에서는 GFP 발현 형질전환 라인에서 생식 능력이 높은 성체 물고기를 선별하십시오.식물 미세주입 전날 오후에, 다섯 쌍의 암수 생식성 물고기를 다섯 개의 번식 용기에 배치합니다. 용기 내에서 수컷과 암컷을 탈착 가능한 체로 나누어 하룻밤 동안 분리해 둡니다. 다음 날 아침, 조명이 켜진 직후에 수컷과 암컷을 체 위에 함께 둡니다. 이렇게 하면 물고기가 알을 먹어치우는 것을 방지할 수 있습니다.이제 물고기가 산란하는 모습을 관찰하십시오. 한 쌍이 약 50개의 알을 낳으면, 성어들을 분리하십시오. 그런 다음, 파스퇴르 피펫을 사용하여 알들을 1차 주입을 위해 배아수가 채워진 페트리 접시로 옮기십시오.각 교배 쌍에 대해 이 과정을 반복합니다. 추가적인 난자가 필요한 경우, 동일한 교배 쌍을 여러 번 합쳤다가 분리할 수 있습니다. 미세 주입을 위한 디시와 주입 바늘의 사전 준비는 상당히 표준적인 방식으로 수행합니다.자세한 내용은 텍스트 프로토콜에서 확인할 수 있습니다. 준비된 주입 바늘을 장착하는 것부터 시작하십시오. 마이크로 로더 팁을 사용하여 2 µL의 MO 작동 용액을 바늘에 역충전한 다음, 바늘을 마이크로 조작기에 부착하십시오.그 다음, 바늘 끝을 열 수 있습니다. 해부 현미경으로 관찰하면서 핀셋으로 끝부분을 집어 열거나, 단단한 표면에 바늘 끝을 밀어 넣습니다. 그런 다음, 눈금판 위의 미네랄 오일 한 방울에 MO 용액을 주입하여 주입량을 보정합니다.주입량을 조절하여 약 200 picoliters의 용액에 해당하는 75 micron 크기의 방울이 형성되도록 합니다. 다음으로, 주입할 배아를 준비합니다. 약 21 세포기 단계의 배아들을 미세 주입 접시의 홈을 따라 배열하되, 배아의 식물극이 홈으로부터 45도 각도로 접근하는 미세 주입 바늘 방향을 향하게 합니다.이제 배아에 주입합니다. 바늘로 장액막과 난황을 관통한 다음, 준비된 Morpholino 용액을 난황에 주입하십시오. 이 방법은 1세포기 또는 2세포기 배아에 적용 가능합니다.모든 배아에 주입을 마친 후, 광구 파스퇴르 피펫을 사용하여 배아를 수집하십시오. 주입된 배아를 배아 수가 채워진 페트리 접시에 옮기고 28.5 °C에서 배양하십시오. 당일 오후 늦게 죽은 배아를 사이펀으로 제거하고 배아 수를 교체하십시오.다음 날 아침, 배아가 낭배 형성을 거친 후, 극소량의 PTU가 포함된 배아수로 물을 교체하여 멜라닌 형성을 억제합니다. PTU는 낭배 형성 이전 단계에서 정상적인 발달을 방해하므로 주의하십시오. 이후 원하는 발달 단계에서 날카로운 핀셋으로 배아의 난막을 제거합니다.현미경을 사용하여 한 쌍의 핀셋으로 난막(chorion)을 잡고, 다른 한 쌍의 핀셋으로 난막의 반대편을 잡습니다. 그런 다음 배아에 충격을 주지 않도록 주의하며 핀셋을 서로 벌려 당깁니다. 이어서 Tricaine으로 배아를 마취시킨 후, 커버글라스 바닥의 마이크로 디쉬에 놓인 15 micron 재배치 그리드 위에 배아와 아가로스를 함께 임베딩합니다.그런 다음, 녹인 agarose를 1 mL씩 1.5 mL 반응 튜브에 분주합니다. 36 °C로 설정된 히트 블록에 튜브를 넣고 식을 때까지 기다립니다. 그런 다음, 와이드 보어 피펫을 사용하여 배아를 마이크로 디쉬로 옮깁니다.과잉 배아 배양액을 사이펀으로 제거하고 배아 위에 아가로스(agarose)를 덮습니다. 아가로스가 아직 액체 상태일 때, 두 개의 작은 피펫 팁을 사용하여 배아의 방향을 잡습니다. 관심 구조물(이 경우에는 전신장, pronephros)이 유리 바닥에 최대한 가깝게, 그리고 그리드 주변에 위치하도록 배치합니다.그리드가 관심 구조물을 덮지 않아야 합니다. 최대 4개의 배아를 서로 다른 마이크로 디쉬에 임베딩하고, 그중 가장 상태가 좋은 것을 촬영하도록 계획하는 것이 유리합니다. 적절한 임베딩을 위해서는 어느 정도의 연습이 필요합니다.아가로스가 아직 액체 상태일 때, 배아를 원하는 위치로 정렬해야 합니다. 이때 전신(pronephros)이 유리 바닥에 가깝게 위치하고, 재배치 그리드와 적절한 거리를 유지하고 있는지 확인하십시오. 아가로스의 상태를 주기적으로 확인하십시오.배아를 잡기에 충분히 굳으면, 2~3분 정도 더 그대로 둡니다. 그런 다음, 매립된 배아 위에 소량의 PTU와 tricaine이 포함된 배아수를 덮습니다. 과잉의 배아수를 따라내거나 사이펀으로 제거하고, 증발을 막기 위해 뚜껑을 닫습니다.결과물에 기포가 없어야 합니다. 이제 유리 바닥면이 대물렌즈를 향하게 하여 배아를 이미징할 수 있습니다. 예를 들어 수 시간 동안 주기적으로 Z-스택 이미지를 촬영하여 타임랩스 이미지를 제작할 때는 초점 드리프트(focal drift)를 보정해야 합니다.가능하다면 자동 초점 전략을 적용하십시오. 소프트웨어 제어 메뉴에서 자동 초점 옵션을 활성화하십시오. 광독성을 최소화하기 위해 참조 채널로는 투과광 명시야 채널을 선택하십시오.자동 초점이 제대로 작동하려면 검체 의존적 검색 범위를 충분히 크게 설정하는 것이 필수적입니다. 이미지를 수집하기 전, 각인된 그리드의 특정 지점을 소프트웨어의 십자선 내 관심 구조물 근처에 위치시킨 후, 스크린샷을 사용하여 이 위치를 저장하십시오. 그 다음, 각 이미지 촬영 시간 간격이 끝나기 직전에 스크린샷을 참조하여, 자동 초점을 사용하지 않는 경우 스테이지의 위치와 초점을 다시 조정하십시오.제시된 방법은 형질전환 제브라피쉬 라인의 WT1A 모포포(morphened) 배아에서 신장 발달을 분석하는 데 사용되었습니다. 초기 신장 형성기 동안, 이 라인은 신장 전구세포가 발생하는 중간 중배엽에서 녹색 형광을 나타냈으며, 이후 발달 과정 중 형성되는 세뇨관과 신단위 원기에서도 형광이 관찰되었습니다. 타임랩스 이미징 결과, 대조군 모폴리노가 주입된 배아에서는 정상적인 신장 형성 과정이 확인되었습니다.수정 후 20시간이 되었을 때, 발달 중인 전신관(pronephric tubules)이 관찰되었습니다. 전신관의 앞쪽 끝부분에서는 형성 중인 신단위 원기(nephron primordia)를 나타내는 구형의 세포 집합체를 확인할 수 있었습니다. 이후 몇 시간 동안 관과 신단위 원기가 성장하였으며, 원기들이 정중선에서 융합되기 시작했습니다.이와 대조적으로, 돌연변이체에서는 신장 형성 과정(nephrogenesis)이 심각하게 저해되었습니다. 수정 후 20시간에 GFP 양성 세뇨관 구조가 관찰되었으나, 이는 확산되어 있었고 발달이 미흡했습니다. 타임랩스 이미징 결과, 신단위 원기(nephron primorgia)가 전혀 형성되지 않았으며, 발달 중인 전신(pronephros) 외부에 위치한 수많은 형광 세포들이 복측으로 이동하며 전신 영역을 벗어나는 현상이 뚜렷하게 나타났습니다.본 프로토콜을 수행할 때, 온도 제어 장치나 증발 방지 테이블과 같은 추가 장비가 없는 경우에는 드리프트 현상이 있는지 정기적으로 확인하고 재조정해야 한다는 점을 유념하는 것이 중요합니다. 이 절차를 거친 후, 이미징된 배아를 면역조직화학, in situ hybridization 또는 실시간 PCR과 같은 다른 방법으로 처리하여 세포 및 조직의 특정 성분을 식별하거나 유전자 발현을 평가할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

우리는 이일 이후 fetilization (DPF) 급성 신장 손상 (아키)를 유도하기 위해 zebrafish의 유충에 aminoglycoside, gentamicin을 microinjecting의 기술을 설명합니다. 우리는 또한 전체 탑재 immunohistochemistry하는 방법을 설명, 플라스틱 포함하고 아키 인한 손상을 시각화하기 위해 zebrafish 애벌레의 sectioning.

급성 신장 상해를 공부하기 위해 Zebrafish 애벌레의 정맥 Microinjections

zebrafish의 신장은 모두 신장과 조혈 성인 줄기 / 전구 세포의 고향이며, 척추 모델 생물에서 이러한 세포 유형과 그들의 자손을 공부하기 위해 우수한 기회를 나타냅니다. 여기, 우리는 세포 분리, 이식 및 신장 및 / 또는 혈액 세포 집단의 표현 연구와 같은 애플 리케이션에 사용할 수있는 성인 zebrafish의 신장을 확인하고 수술 제거하는 연구자 수 있도록 상세한 해부 절차를 보여줍니다.

성인 Zebrafish의 신장의 해부

이 비디오는 성체 제브라피시 신장의 평평한 마운트를 해부하고 준비하는 방법을 보여줍니다. 준비된 플랫 마운트는 표본 분석을 위해 현미경으로 시각화할 수 있습니다.

Kidney Flat Mount Preparation: 성체 제브라피시 신장의 현미경 분석을 위해 Flat Mount를 해부하고 준비하는 절차

시간 경과 공 촛점 이미징은 배아 발달의 특성에 유용한 강력한 기술이다. 여기에서, 우리는 방법을 설명하고 두개 안면 야생 형에서 형태 형성뿐만 아니라 PDGFRA, smad5 및 SMO 돌연변이 배아를 특징.

4D 공 초점 현미경을 사용하여 제브라 피쉬의 두개 안면 형태 형성 분석

제브라 피쉬 배아 발달 생물학 연구를위한 훌륭한 모델입니다. 배아 동안, 제브라 피쉬의 샘플 관찰 및 분석을위한 세 가지 차원의 과제를 제시하는 노른자 대량으로 개발할 수 있습니다. 이 프로토콜은 현장 (WISH) 스테인드 제브라 피쉬 배아 표본 전체 마운트의 2 차원 평면 장착 준비를 만드는 방법에 대해 설명합니다.

전체 마운트하여 제브라 피쉬 배아 시편 스테인드 관찰 및 분석을위한 평면 마운트 준비<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드

우리는 다낭성 신장 질환의 가능한 제브라피시 모델을 생성하는 방법을 설명합니다. 신장 구조를 시각화하기 위해 Tg(wt1b:GFP) 물고기를 사용했습니다. wnt5a의 넉다운은 모르폴리노 주입에 의해 이루어졌습니다. wnt5a 녹다운 후 Pronephric 낭종 형성이 이 GFP 형질전환 제브라피시에서 관찰되었습니다.

다낭성 신장 질환의 가능한 제브라 피쉬 모델 :의 넉다운 wnt5a Zebrafish의 신장의 낭종 원인

명시야 기반 입체 현미경을 사용하여 전체 조직 규모에서 제브라피시 유충 꼬리 지느러미 재생의 역학을 캡처하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 기술을 사용하면 단일 세포 해상도로 재생 역학을 캡처할 수 있습니다. 이 방법론은 CCD 카메라와 타임랩스 소프트웨어가 장착된 모든 실체현미경에 적용할 수 있습니다.

시간 경과 브라이트 실체 현미경으로 Zebrafish의 애벌레에서 조직 복구를 캡처

광시트 형광 현미경은 배아 발달을 이미징하기 위한 훌륭한 도구입니다. 이를 통해 생리학적 조건에 가까운 살아있는 배아의 장시간 타임랩스 동영상을 녹화할 수 있습니다. 우리는 넓은 시공간 규모에 걸쳐 제브라피시 눈 발달을 이미징하기 위한 응용 프로그램을 시연하고 다중 보기 데이터 세트의 융합 및 디콘볼루션을 위한 파이프라인을 제시합니다.

이미지 Zebrafish의 눈 개발에 가벼운 시트 형광 현미경을 사용하여

이 작품은 신장 GFP 유전자 변형 제브라 피쉬를 사용하여 부분적인 신장 손상의 새로운 생체 내 모델을 제시합니다. 이 모델은 신장 상피 세포의 표적 절제를 유도하여 네프론 손상 및 수리의 세포 기작을 보여줍니다.

Zebrafish 개발에 급성 신부전 모델링을위한 정확한 세포 제거 방법

이 프로토콜은 제브라피시의 토토 라벨링 및 다차원 이미징의 접근 방식을 초기 눈 발달에 설명합니다. 당사는 레이저 스캐닝 공초점 현미경을 이용한 라벨링, 임베딩 및 4차원(4D) 이미징을 설명하고, 광학컵 형태발생의 해부 메커니즘을 위한 데이터 집합의 획득을 최적화하기 위한 고려 사항을 설명합니다.

제브라피쉬 광학컵 모르포발생4차원 이미징

여기서, 결과 데이터를 분석하기 위해 상용화된 라이트시트 현미경 및 이미지 프로세싱 워크스테이션을 이용한 안구 형태형성의 타임랩스 이미징을 위한 프로토콜이 제공된다. 이 프로토콜은 배아 마취, 낮은 용융 온도 아가로스에 매립, 이미징 챔버에 서스펜션, 이미징 매개 변수 설정, 마지막으로 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 이미징 데이터를 분석하는 절차를 자세히 설명합니다.

rx3:GFP 형질전환 제브라피쉬를 이용한 라이트시트 현미경으로 안구 형태생성 시각화

배우세요 형광 해부 현미경을 이용한 제브라피시 신장 발달의 시간 경과 영상 분석 방법을. 이 기술은 살아있는 배아의 장기 발달을 직접 관찰하여 발달생물학 연구에 활용됩니다.

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