해부 현미경을 사용하여 시간 경과 영상과 Zebrafish의 신장 개발의 분석 광학 단면에 대한 장착

이 실험 절차의 전체적인 목표는 모든 방향으로의 표류(drifting) 후 재정렬을 위한 간단한 전략을 적용하여, 형광 해부 현미경을 이용해 다양한 발달 과정의 타임랩스 분석을 가능하게 하는 것입니다. 이 방법은 살아있는 배아에서 수 시간 동안 조직 및 기관의 발달을 직접 관찰할 수 있게 하므로 발달 생물학 분야의 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법의 주요 장점은 레이저 스캐닝이나 광시야 현미경(lighted microscopy)과 같이 발달 중인 조직 및 기관의 타임랩스 기록에 통상적으로 사용되는 더 복잡한 기술들에 비해 비용이 저렴하고 사용하기 쉬운 대안이라는 점입니다.

이 방법은 스위퍼 피시(sweeper fish) 배아 및 치어의 발달 과정 중에 발생하는 공간적, 시간적 변화에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 다른 모델 생물체의 초기 발달 과정을 조사하는 데에도 적용될 수 있습니다. 또한, 뿌리 치유 및 재생과 같이 성체 생물에서 일어나는 역동적인 과정을 관찰하는 데 적합합니다. 준비 단계에서는 GFP 발현 형질전환 라인에서 생식 능력이 높은 성체 물고기를 선별하십시오.

식물 미세주입 전날 오후에, 다섯 쌍의 암수 생식성 물고기를 다섯 개의 번식 용기에 배치합니다. 용기 내에서 수컷과 암컷을 탈착 가능한 체로 나누어 하룻밤 동안 분리해 둡니다. 다음 날 아침, 조명이 켜진 직후에 수컷과 암컷을 체 위에 함께 둡니다. 이렇게 하면 물고기가 알을 먹어치우는 것을 방지할 수 있습니다.

이제 물고기가 산란하는 모습을 관찰하십시오. 한 쌍이 약 50개의 알을 낳으면, 성어들을 분리하십시오. 그런 다음, 파스퇴르 피펫을 사용하여 알들을 1차 주입을 위해 배아수가 채워진 페트리 접시로 옮기십시오.

각 교배 쌍에 대해 이 과정을 반복합니다. 추가적인 난자가 필요한 경우, 동일한 교배 쌍을 여러 번 합쳤다가 분리할 수 있습니다. 미세 주입을 위한 디시와 주입 바늘의 사전 준비는 상당히 표준적인 방식으로 수행합니다.

자세한 내용은 텍스트 프로토콜에서 확인할 수 있습니다. 준비된 주입 바늘을 장착하는 것부터 시작하십시오. 마이크로 로더 팁을 사용하여 2 µL의 MO 작동 용액을 바늘에 역충전한 다음, 바늘을 마이크로 조작기에 부착하십시오.

그 다음, 바늘 끝을 열 수 있습니다. 해부 현미경으로 관찰하면서 핀셋으로 끝부분을 집어 열거나, 단단한 표면에 바늘 끝을 밀어 넣습니다. 그런 다음, 눈금판 위의 미네랄 오일 한 방울에 MO 용액을 주입하여 주입량을 보정합니다.

주입량을 조절하여 약 200 picoliters의 용액에 해당하는 75 micron 크기의 방울이 형성되도록 합니다. 다음으로, 주입할 배아를 준비합니다. 약 21 세포기 단계의 배아들을 미세 주입 접시의 홈을 따라 배열하되, 배아의 식물극이 홈으로부터 45도 각도로 접근하는 미세 주입 바늘 방향을 향하게 합니다.

이제 배아에 주입합니다. 바늘로 장액막과 난황을 관통한 다음, 준비된 Morpholino 용액을 난황에 주입하십시오. 이 방법은 1세포기 또는 2세포기 배아에 적용 가능합니다.

모든 배아에 주입을 마친 후, 광구 파스퇴르 피펫을 사용하여 배아를 수집하십시오. 주입된 배아를 배아 수가 채워진 페트리 접시에 옮기고 28.5 °C에서 배양하십시오. 당일 오후 늦게 죽은 배아를 사이펀으로 제거하고 배아 수를 교체하십시오.

다음 날 아침, 배아가 낭배 형성을 거친 후, 극소량의 PTU가 포함된 배아수로 물을 교체하여 멜라닌 형성을 억제합니다. PTU는 낭배 형성 이전 단계에서 정상적인 발달을 방해하므로 주의하십시오. 이후 원하는 발달 단계에서 날카로운 핀셋으로 배아의 난막을 제거합니다.

현미경을 사용하여 한 쌍의 핀셋으로 난막(chorion)을 잡고, 다른 한 쌍의 핀셋으로 난막의 반대편을 잡습니다. 그런 다음 배아에 충격을 주지 않도록 주의하며 핀셋을 서로 벌려 당깁니다. 이어서 Tricaine으로 배아를 마취시킨 후, 커버글라스 바닥의 마이크로 디쉬에 놓인 15 micron 재배치 그리드 위에 배아와 아가로스를 함께 임베딩합니다.

그런 다음, 녹인 agarose를 1 mL씩 1.5 mL 반응 튜브에 분주합니다. 36 °C로 설정된 히트 블록에 튜브를 넣고 식을 때까지 기다립니다. 그런 다음, 와이드 보어 피펫을 사용하여 배아를 마이크로 디쉬로 옮깁니다.

과잉 배아 배양액을 사이펀으로 제거하고 배아 위에 아가로스(agarose)를 덮습니다. 아가로스가 아직 액체 상태일 때, 두 개의 작은 피펫 팁을 사용하여 배아의 방향을 잡습니다. 관심 구조물(이 경우에는 전신장, pronephros)이 유리 바닥에 최대한 가깝게, 그리고 그리드 주변에 위치하도록 배치합니다.

그리드가 관심 구조물을 덮지 않아야 합니다. 최대 4개의 배아를 서로 다른 마이크로 디쉬에 임베딩하고, 그중 가장 상태가 좋은 것을 촬영하도록 계획하는 것이 유리합니다. 적절한 임베딩을 위해서는 어느 정도의 연습이 필요합니다.

아가로스가 아직 액체 상태일 때, 배아를 원하는 위치로 정렬해야 합니다. 이때 전신(pronephros)이 유리 바닥에 가깝게 위치하고, 재배치 그리드와 적절한 거리를 유지하고 있는지 확인하십시오. 아가로스의 상태를 주기적으로 확인하십시오.

배아를 잡기에 충분히 굳으면, 2~3분 정도 더 그대로 둡니다. 그런 다음, 매립된 배아 위에 소량의 PTU와 tricaine이 포함된 배아수를 덮습니다. 과잉의 배아수를 따라내거나 사이펀으로 제거하고, 증발을 막기 위해 뚜껑을 닫습니다.

결과물에 기포가 없어야 합니다. 이제 유리 바닥면이 대물렌즈를 향하게 하여 배아를 이미징할 수 있습니다. 예를 들어 수 시간 동안 주기적으로 Z-스택 이미지를 촬영하여 타임랩스 이미지를 제작할 때는 초점 드리프트(focal drift)를 보정해야 합니다.

가능하다면 자동 초점 전략을 적용하십시오. 소프트웨어 제어 메뉴에서 자동 초점 옵션을 활성화하십시오. 광독성을 최소화하기 위해 참조 채널로는 투과광 명시야 채널을 선택하십시오.

자동 초점이 제대로 작동하려면 검체 의존적 검색 범위를 충분히 크게 설정하는 것이 필수적입니다. 이미지를 수집하기 전, 각인된 그리드의 특정 지점을 소프트웨어의 십자선 내 관심 구조물 근처에 위치시킨 후, 스크린샷을 사용하여 이 위치를 저장하십시오. 그 다음, 각 이미지 촬영 시간 간격이 끝나기 직전에 스크린샷을 참조하여, 자동 초점을 사용하지 않는 경우 스테이지의 위치와 초점을 다시 조정하십시오.

제시된 방법은 형질전환 제브라피쉬 라인의 WT1A 모포포(morphened) 배아에서 신장 발달을 분석하는 데 사용되었습니다. 초기 신장 형성기 동안, 이 라인은 신장 전구세포가 발생하는 중간 중배엽에서 녹색 형광을 나타냈으며, 이후 발달 과정 중 형성되는 세뇨관과 신단위 원기에서도 형광이 관찰되었습니다. 타임랩스 이미징 결과, 대조군 모폴리노가 주입된 배아에서는 정상적인 신장 형성 과정이 확인되었습니다.

수정 후 20시간이 되었을 때, 발달 중인 전신관(pronephric tubules)이 관찰되었습니다. 전신관의 앞쪽 끝부분에서는 형성 중인 신단위 원기(nephron primordia)를 나타내는 구형의 세포 집합체를 확인할 수 있었습니다. 이후 몇 시간 동안 관과 신단위 원기가 성장하였으며, 원기들이 정중선에서 융합되기 시작했습니다.

이와 대조적으로, 돌연변이체에서는 신장 형성 과정(nephrogenesis)이 심각하게 저해되었습니다. 수정 후 20시간에 GFP 양성 세뇨관 구조가 관찰되었으나, 이는 확산되어 있었고 발달이 미흡했습니다. 타임랩스 이미징 결과, 신단위 원기(nephron primorgia)가 전혀 형성되지 않았으며, 발달 중인 전신(pronephros) 외부에 위치한 수많은 형광 세포들이 복측으로 이동하며 전신 영역을 벗어나는 현상이 뚜렷하게 나타났습니다.

본 프로토콜을 수행할 때, 온도 제어 장치나 증발 방지 테이블과 같은 추가 장비가 없는 경우에는 드리프트 현상이 있는지 정기적으로 확인하고 재조정해야 한다는 점을 유념하는 것이 중요합니다. 이 절차를 거친 후, 이미징된 배아를 면역조직화학, in situ hybridization 또는 실시간 PCR과 같은 다른 방법으로 처리하여 세포 및 조직의 특정 성분을 식별하거나 유전자 발현을 평가할 수 있습니다.