마이크로 소용돌이를 이용한 순차 분자 전달을위한 Electroporator을

이 절차의 전반적인 목표는 Vortex에 의하여 원조된 microfluidic porer를 사용하여 고능률로 연속적이고 복용량 통제할 수 있는 방법에 있는 생물학적으로 의미심장한 분자의 각종 유형을 전달하기 위한 것인데, 이것은 첫째로 세포와 생체 분자를 가진 DPBS 해결책을 개인적으로 포함하는 4개의 50 밀리리터 분리기 관을 준비하고, 압축 공기를 넣은 순서 조절 체계에 연결된 그것의 각각 바이알 홀더에 각 관을 붙임으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 각 바이알의 입구 튜브를 15핀 전극이 내장된 미세유체 장치에 삽입하는 것입니다. 다음으로, 세포는 전기천공실에 형성된 미세한 소용돌이에 갇히는 장치로 흘러 들어갑니다.

마지막 단계는 갇힌 세포에 짧은 전기 펄스를 가한 다음 즉시 생체 분자가 포함된 용액을 주입하여 세포질로 전달하는 것입니다. 궁극적으로 이 과정에서 얻은 세포는 다운스트림 분석을 위해 방출 및 수집될 수 있습니다. 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 제안된 기술이 높은 효율성과 생존력으로 미리 선택된 동일한 세포 집단에 제어된 양의 여러 분자를 순차적으로 전달할 수 있다는 것입니다.

이 방법의 시각적 시연은 각 솔루션에서 저온 흐름 단계의 타이밍으로 인해 유체 교환 단계를 배우기 어렵기 때문에 매우 중요합니다. 스위칭 단계는 셀 트래핑의 안정성을 결정합니다. 전이성 유방암 세포주 M-D-A-M-B 2 31을 본 실험 플레이트에 10 회 내지 5 밀리리터 당 5 세포를 Leibovitz의 L 15 배지에서 T 75 당 10 밀리리터의 부피로 사용하며, 부피 당 10 %의 부피, 소 태아 혈청 및 1 %의 페니실린을 보충한다.

스트렙토마이신은 이산화탄소가 0%인 환경에서 섭씨 37도의 가습된 인큐베이터에서 세포를 배양합니다. 파종 2일 후 실험을 위해 세포를 수확합니다. 세포를 bukos phosphate buffered saline 또는 DPBS로 세척한 후 2분 동안 0.25% tripsin EDTA로 세포를 처리합니다.

8ml의 성장 배지를 첨가하여 200배 G에서 5분 동안 원심 주입하여 효소 활성 펠렛 세포를 비활성화하고 재현탁 배지를 5배 10의 최종 농도로 10배하여 밀리리터당 5번째 세포로 만듭니다. microfluidic electroporation 장치의 디자인 그리고 제작은 이 영상에서 보이지 않을 것입니다, 그러나 동반되는 원고에서 기술됩니다. 이 시스템은 세포, 분자 및 플러시 용액을 위한 입구로 구성됩니다.

관성 초점이 발생하는 두 개의 직선 채널.유동 실험을 위해 설정할 수 있는 전극과 배출구가 있는 10개의 전기천공설 챔버. 콘센트, 폴리 에테르, 에테르 케톤 또는 피크 튜브와 15핀 알루미늄 전극을 짧은 펄스, 높은 볼륨용 전극을 삽입합니다.tage 마이크로 채널의 구멍을 통해 지정된 위치에 적용합니다.

15핀 전극은 10개의 양극과 5개의 음극으로 구성됩니다. 각 양극은 음극과 1.5mm 떨어져 있고 동일한 극성의 각 전극은 1.35mm 떨어져 있습니다. 고전압 단구파 펄스를 생성하기 위한 전기 장비를 유동 용액과 접촉하는 알루미늄 전극에 연결합니다.

PDMS 금형에서 장비는 펄스 발생기와 사내에서 제작한 고전압 증폭기로 구성되어야 합니다. DPBS와 세포 및 분자가 있는 용액을 개별적으로 포함하는 4개의 50ml 원심분리 튜브를 준비합니다. 각 튜브를 공압 유량 제어 시스템에 연결된 해당 바이알 홀더에 부착합니다.

바이알 홀더의 입구 피크 튜브를 미세유체 장치의 각 입구 구멍에 연결합니다. 다음으로 설정합니다. 구형파의 크기는 볼트를 100볼트로 펄스합니다.

electroporation 약실을 가로지르는 전기장 힘이 centimeter 당 0.7 킬로볼트와 동등하기 위하여. 압력 조절기를 40PSIA로 설정하고, 수동으로 조정 가능한 단일 질소 공급원을 사용하여 모든 시료 바이알을 균일하게 가압하고, 고속 매니폴드를 사용하여 개별 용액 포트를 적시에 활성화합니다. 밸브 제어를 위해 맞춤형으로 제작된 실험실 보기 소프트웨어를 사용합니다.

밸브 러너(Valve Runner)라고 표시된 랩 뷰 소프트웨어를 열고 Operate(작동)라는 드롭다운 메뉴에서 run(실행)을 클릭합니다. 해당 밸브 아이콘인 밸브 1을 클릭하여 DPBS 저장소의 밸브를 열고 1.5분 동안 안정적인 셀 트래핑 와류 생성에 필요한 유속을 프라이밍합니다. 밸브 아이콘은 흐름이 활성화될 때 회색에서 녹색으로 바뀌어야 하며, 세포 트래핑 단계 전에 10초 동안 장치를 통해 세척 및 셀 용액이 동시에 작동해야 합니다.

용액 전환 단계에서 중단 없는 흐름을 보장하려면 각 용액 전환 단계에서 이 간단한 CO flow 단계를 반복해야 합니다. 활성 용액 포트를 세척 용액에서 셀 용액으로 전환하여 30초 동안 전기천공법 챔버에 세포를 가둡니다. 이 영화에서 파란색 형광 신호는 실행 가능한 갈고리를 나타냅니다.

3, 3, 3, 4, 5 단계 세포. 세척 포트를 켜고 20초 동안 장치를 세척하십시오. nont 포획된 오염 세포를 제거하기 위해 첫 번째 관심 분자를 포함하는 용액이 흐릅니다.

시각화 목적으로 Propidium iodide를 장치에 넣습니다. 이 시연에서는 염료의 신호 대비 잡음 비율이 우수하기 때문에 형광 태그가 지정된 DExT 가닥 대신 핵산 염료를 사용하여 분자 용액 주입 직후 5개의 짧은 펄스를 적용하고 오실로스코프를 사용하여 실시간으로 적용된 전기 펄스의 크기와 수를 모니터링하며 분자의 형광 신호를 현미경으로 시각화할 수 있으며, 분자 용액에서 100초 동안 세포를 배양합니다. 다음으로 두 번째 분자를 포함하는 용액, 핵산 염료 요요 하나를 장치로 이동합니다.

이 시연에서 두 번째 분자는 추가 전기 펄스 응용 분야 없이 전달됩니다. 이 동영상은 세포가 이제 세 가지 형광 신호를 모두 발현한다는 것을 확인시켜줍니다. 초록색은 요요, 하나는 프로피듐, 요오드화물은 빨간색, 갈고리는 파란색입니다.

3, 3, 3, 4, 5. 작동 압력을 5PSI 미만으로 낮춰 다운스트림 분석을 위해 셀을 96웰 플레이트로 방출합니다. 100개의 세포가 있는 약 100마이크로리터의 용액이 각 릴리스에서 수집됩니다.

전기천공법(electroporation) 절차는 유세포분석 원심분리에 충분한 세포를 수집하기 위해 최소 3회 반복되어야 합니다. 처리된 세포를 228배 G로 5분 동안 포함하는 96웰 플레이트. 실온에서 과도한 형광 분자를 포함하는 상등액을 제거하고 DPBS에 세포를 재현탁합니다.

형광 표지된 DExT 가닥이 전달된 경우, 세포의 분자 흡수를 분석합니다. 유세포 분석에 의한 효율성. 성공적인 분자 전달은 C 2에서 전기천공된 궤도 세포의 형광 강도 변화를 모니터링하여 정성적으로 결정되었으며, 이를 통해 처리된 세포의 90%가 70, 000 Dalton 이온 DExT 가닥 분자를 흡수하는 것을 확인했습니다.

처리된 세포의 총 수에 대한 관심 분자를 성공적으로 흡수하는 세포의 수의 비율로 정의되는 각 전달된 덱스트란 분자의 효율은 분자량 또는 전하에 따라 크게 변하지 않았습니다. 테스트된 모든 dextran 분자는 70% 이상의 효율로 cytosol에 전달되었습니다.여기에 표시된 것은 electroporation으로 처리되지 않은 세포에 대한 대표적인 유세포 분석 프로파일입니다. 성공적인 분자 전달을 나타내는 형광 역치는 대조군 샘플의 신호가 역치 미만으로 발견되도록 데이터에서 설정됩니다.

순차적으로 전기천공된 세포에 대한 이 대표적인 유세포 분석 데이터는 형광 줄무늬 이미지 옆에 유세포 분석 플롯을 표시하고, 녹색 상자는 3000을 흡수하는 세포의 신호를, Dalton neutral dextran만, 빨간색 상자는 세포의 신호를 나타냅니다. 이온 DExT 가닥인 3000 Dalton을 흡수하면 세포의 형광 신호만 흡수하며, 노란색으로 표시된 두 DExT 가닥 분자는 발달 후 56%의 이중 분자 전달 효율을 나타냅니다. 이 기술은 의학, 생명 공학 및 약리학 분야의 연구자들이 복잡한 질병을 치료하는 데 시너지 효과를 달성하기 위해 치료 시약의 조합을 탐구하는 데 유용할 것입니다.

고전압 전기 펄스로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 접지되었는지 확인하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.