마이크로 소용돌이를 이용한 순차 분자 전달을위한 Electroporator을

이 절차의 전체적인 목표는 Vortex 보조 미세유체 포어러(Vortex assisted microfluidic porer)를 사용하여 생물학적으로 유의미한 다양한 종류의 분자들을 고효율로, 순차적이며 용량 조절이 가능한 방식으로 전달하는 것입니다. 이는 먼저 세포와 생체 분자가 포함된 DPBS 용액을 각각 담은 4개의 50 milliliter 원심분리 튜브를 준비하고, 각 튜브를 공압 유량 제어 시스템에 연결된 해당 바이알 홀더에 부착함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 각 바이알의 유입 튜브를 15핀 전극이 내장된 미세유체 장치에 삽입하는 것입니다. 다음으로, 세포를 장치 내부로 흘려보내면 전기천공 챔버 내에 형성된 마이크로 규모의 와류(vortex)에 세포들이 포획됩니다.

마지막 단계는 포획된 세포에 짧은 전기 펄스를 가한 직후, 세포질로 전달할 생체 분자가 포함된 용액을 주입하는 것입니다. 최종적으로, 이 과정을 통해 얻은 세포를 방출시켜 후속 분석을 위해 수집할 수 있습니다. 기존 방법과 비교하여 이 기술의 주요 장점은, 제안된 기술이 미리 선택된 동일한 세포 집단에 여러 분자를 정해진 양만큼 순차적으로 고효율 및 높은 생존율로 전달할 수 있다는 점입니다.

각 용액 단계에서 콜드 플로우(cold flow) 단계의 타이밍이 세포 트래핑의 안정성을 결정하므로, 유체 교환 단계가 학습하기 어렵기 때문에 이 방법의 시각적 시연이 매우 중요합니다. 본 실험에서는 전이성 유방암 세포주 M-D-A-M-B 2 31을 사용할 것이며, 10% v/v 태아 송아지 혈청과 1% penicillin이 첨가된 Leibovitz's L 15 배지가 담긴 T 75 조직 배양 플라스크당 10 mL 부피에 1 × 10⁵ cells/mL 농도로 배양합니다.

Streptomycin과 함께 세포를 37 °C의 가습 배양기 내 0% 이산화탄소 환경에서 배양합니다. 세포 파종 2일 후, 실험을 위해 세포를 수확합니다. PBS 또는 DPBS로 세포를 세척한 후, 0.25% trypsin EDTA로 2분 동안 처리합니다.

8 mL의 성장 배지를 추가하고, 200 ×g에서 5분 동안 원심분리하여 효소 활성을 불활성화시킨 후 펠릿 세포를 재현탁하여 최종 농도를 5 × 10⁵ cells/mL로 맞춥니다. 미세유체 전기천공 장치의 설계 및 제작 과정은 본 영상에서 보여주지 않으나, 동반된 논문에 상세히 기술되어 있습니다. 이 시스템은 세포, 분자 및 세척액을 위한 입구들로 구성됩니다.

관성 집중(inertial focusing)이 일어나는 두 개의 직선 채널입니다. 유동 실험 설정을 위한 전극이 포함된 10개의 전기천공 챔버와 배출구가 있습니다. 마이크로채널의 구멍을 통해 지정된 위치에 배출구, 폴리에테르에테르케톤(PEEK) 튜빙, 그리고 단펄스 고전압 인가를 위한 15핀 알루미늄 전극을 삽입하십시오.

15핀 전극은 10개의 양극과 5개의 음극으로 구성됩니다. 각 양극은 음극과 1.5 millimeters 간격을 두고 배치되며, 동일한 극성의 전극 간 간격은 1.35 millimeters입니다. 고전압 단일 사각파 펄스를 생성하는 전기 장비를 유동 용액과 접촉해 있는 알루미늄 전극에 연결하십시오.

PDMS 몰드의 경우, 장비는 펄스 발생기와 자체 제작한 고전압 증폭기로 구성되어야 합니다. DPBS와 세포 및 분자가 포함된 용액을 각각 담은 50 milliliter 원심분리 튜브 4개를 준비합니다. 각 튜브를 공압 유량 제어 시스템에 연결된 해당 바이알 홀더에 부착합니다.

바이알 홀더의 유입 피크 튜빙을 마이크로유체 장치의 각 유입 홀에 연결합니다. 다음으로, 사각파 펄스의 전압 크기를 100 volts로 설정합니다.

전기천공 챔버 전체의 전계 강도가 0.7 kilovolts per centimeter가 되도록 설정합니다. 압력 조절기를 40 PSIA로 설정하며, 수동으로 조정 가능한 단일 질소 공급원을 사용하여 모든 샘플 바이알에 균일하게 가압하고, 고속 매니폴드를 이용하여 개별 용액 포트를 적시에 활성화합니다. 밸브 제어에는 맞춤 제작된 LabVIEW 소프트웨어를 사용합니다.

Valve runner라고 표시된 lab view 소프트웨어를 열고 Operate라는 드롭다운 메뉴에서 run을 클릭하십시오. DPBS 리저버의 밸브를 열기 위해 해당 밸브 아이콘인 valve one을 클릭하여, 안정적인 세포 트래핑을 위한 와류 생성에 필요한 유속을 1.5분 동안 프라이밍하십시오. 밸브가 활성화되면 밸브 아이콘이 회색에서 녹색으로 변해야 하며, 세포 트래핑 단계 이전에 세척액과 세포 용액을 모두 10초 동안 장치에 동시에 흘려주십시오.

용액 교체 단계 동안 흐름이 중단되지 않도록 하려면, 이 짧은 공동 흐름 단계를 각 용액 교체 단계마다 반복해야 합니다. 활성 용액 포트를 세척액에서 세포 용액으로 전환하여 전기천공 챔버에 세포를 30초 동안 포획하십시오. 이 영상에서 파란색 형광 신호는 생존 가능한 훅(hook)을 나타냅니다.

3, 3, 3, 4, 5 단계 세포입니다. 세척 포트를 켜고 장치를 20초 동안 플러싱하십시오. 포획되지 않은 오염 세포를 제거하기 위해 관심 대상의 첫 번째 분자가 포함된 용액을 흘려보냅니다.

시각화를 위해 Propidium iodide를 장치에 넣습니다. 이번 시연에서는 염료의 신호 대 잡음비가 더 우수하기 때문에 형광 표지된 DExT 가닥 대신 핵산 염료를 사용합니다. 분자 용액을 주입한 직후 5회의 짧은 펄스를 즉시 가하고, 오실로스코프를 사용하여 인가된 전기 펄스의 크기와 횟수를 실시간으로 모니터링합니다. 분자의 형광 신호는 현미경 하에서 관찰할 수 있으며, 세포를 분자 용액에서 100초 동안 배양합니다. 다음으로, 두 번째 분자인 핵산 염료 yo-yo one이 포함된 용액을 장치 내로 흘려보냅니다.

이 시연에서는 추가적인 전기 펄스 인가 없이 두 번째 분자가 전달됩니다. 이 영상은 세포가 이제 세 가지 형광 신호를 모두 발현함을 확인시켜 줍니다. yo-yo-1은 녹색, propidium iodide는 적색, hooks는 청색으로 나타납니다.

3, 3, 3, 4, 5. 작동 압력을 5 PSI 미만으로 낮추어 세포를 96웰 플레이트에 방출하고 후속 분석을 진행합니다. 각 방출 시 약 100 µL의 용액과 100개의 세포가 수집됩니다.

유세포 분석 원심분리에 충분한 수의 세포를 수집하려면 전기천공법 과정을 최소 3회 반복해야 합니다. 가공된 세포가 담긴 96-웰 플레이트를 228 ×g에서 5분간 원심분리합니다. 상온에서 과잉 형광 분자가 포함된 상층액을 제거하고 세포를 DPBS에 재현탁합니다.

형광 표지된 DExT 가닥이 전달된 경우, 이후 세포의 분자 흡수 여부를 분석합니다. 유세포 분석법을 통해 효율성을 측정합니다. 전기천공된 궤도 세포의 형광 강도 변화를 모니터링하여 분자 전달 성공 여부를 정성적으로 결정하였으며, 그 결과 처리된 세포의 90%가 70, 000 Dalton의 음이온성 DExT 가닥 분자를 흡수했음을 확인하였습니다.

관심 분자를 성공적으로 흡수한 세포 수와 처리된 총 세포 수의 비율로 정의된 각 전이 덱스트란 분자의 효율은 분자량이나 전기 전하에 따라 크게 달라지지 않았습니다. 테스트한 모든 덱스트란 분자는 70% 이상의 효율로 세포질 내로 전달되었습니다. 여기 제시된 데이터는 전기천공법을 처리하지 않은 세포의 대표적인 유세포 분석 프로필입니다. 성공적인 분자 전달을 나타내는 형광 임계값은 대조군 샘플의 신호가 임계값 아래에 위치하도록 데이터에 따라 설정되었습니다.

순차적으로 전기천공법을 적용한 세포의 대표적인 유세포 분석 데이터로, 유세포 분석 플롯과 형광 스트라이프 이미지를 함께 보여줍니다. 녹색 상자는 3000 Dalton 중성 덱스트란만 흡수한 세포의 신호를 나타내며, 빨간색 상자는 3000 Dalton 이온성 DExT 가닥만 흡수한 세포의 신호를 나타냅니다. 노란색으로 표시된 두 가지 DExT 가닥 분자를 모두 흡수한 세포의 형광 신호는 56%의 이중 분자 전달 효율을 나타냅니다. 개발된 이 기술은 의학, 생명공학 및 약리학 분야의 연구자들이 복합 질환 치료에서 시너지 효과를 거두기 위한 치료제 조합을 탐구하는 데 유용하게 활용될 것입니다.

고전압 전기 펄스를 사용하는 작업은 매우 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안에는 항상 접지를 확인하는 등의 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.