단일 셀 게놈 시퀀싱 초고 처리량 미세 플랫폼

이 실험의 전반적인 목표는 일련의 미세유체 장치를 사용하여 수만 개의 단일 세포에서 바코드가 있는 게놈 염기서열 분석 데이터를 생성하는 것입니다. 이 방법은 비교할 수 없는 단일 세포 염기서열분석 처리량을 달성합니다. 당사는 미세유체역학(microfluidics)을 사용하여 세포를 개별적으로 캡슐화, 용해 및 바코드화하여 염기서열분석 연구에서 기존의 충격으로 인해 손실되는 기본 게놈 이질성을 보존합니다.

이 기술의 주요 장점은 처리량이 높고 수만 개의 셀에서 단일 셀 데이터를 생성할 수 있다는 것입니다. 이 시연에서는 미생물을 대상으로 작업하지만, 워크플로우는 미세유체 장치 치수를 약간 수정하여 다양한 세포 유형에 사용하도록 조정할 수 있습니다. 프로토콜을 시작하려면 1X Tris-EDTA 또는 TE 완충액에서 부피당 3%중량의 저용융 온도 아가로스 1ml를 준비합니다.

주사기가 장전될 때까지 아가로스 용액을 섭씨 90도의 열 블록에 보관하십시오. 1ml의 인산염 완충 식염수(PBS)에 세포를 재현탁시키고 세포를 회전시킵니다. 상등액을 흡인하고 PBS에서 17% 부피 대 부피 밀도 구배 매체의 1밀리리터에 세포 펠릿을 재현탁하고 주사기가 로딩될 때까지 세포를 얼음 위에 유지합니다.

다음으로, 3밀리리터 주사기에 중량당 2%의 PFPE-PEG 계면활성제가 함유된 불소화 오일(HFE)을 로드합니다. 27게이지 바늘로 끼우고 주사기 펌프에 넣습니다. 세포 현탁액과 용융된 아가로스를 27게이지 바늘이 맞는 1밀리리터 주사기에 넣고 주사기 펌프에 넣습니다.

그런 다음 실내 히터를 높게 설정하고 가열 표면을 주사기에서 10cm 떨어진 곳에 배치합니다. 주사기에서 측정한 온도가 약 섭씨 80도인지 확인하십시오. 튜브를 장치에 삽입하기 전에 펌프를 프라이밍하여 라인에서 공기를 제거하십시오.

폴리에틸렌 또는 PE 튜브 조각을 사용하여 주사기 바늘을 미세유체 장치 입구에 연결합니다. 튜브 조각을 콘센트에 연결하고 자유 끝을 15ml 수집 튜브에 넣습니다. 드랍메이킹 후 수집 튜브를 섭씨 4도에서 30분 동안 놓아 아가로스가 완전히 겔화되도록 합니다.

20게이지 바늘이 장착된 3ml 주사기를 사용하여 수집 튜브에서 오일의 아래쪽 층을 제거하고 아가로스 방울의 최상층을 방해하지 않도록 주의합니다. HFE에서 부피 PFO당 10%부피 1밀리리터를 추가하여 계면활성제 층에서 아가로스 방울을 끊습니다. 용액을 1분 동안 위아래로 피펫팅하여 에멀젼을 철저히 코팅하며, 에멀젼은 균질하고 덩어리가 없어야 합니다.

원뿔형 튜브를 2, 000 회 g에서 1 분 동안 회전시켜 아가로스 마이크로겔을 수집합니다. PFO/HFE 상등액을 흡인하고 마이크로겔이 이제 계면활성제 층에서 벗어나 투명한지 확인합니다. 마이크로겔을 세척한 후 10마이크로리터의 겔 분취액을 1X 핵산 염색으로 염색하여 현미경으로 400X 배율로 마이크로겔의 세포 캡슐화를 확인합니다.

co-flow dropmaker 장치의 셀 입구를 작은 납 땜납 조각으로 막습니다. 튜브를 장치에 삽입하기 전에 펌프를 프라이밍하여 라인에서 공기를 제거하십시오. 튜브 조각을 콘센트에 연결하고 자유 끝을 0.2ml PCR 튜브에 넣습니다.

드롭메이킹을 위해 화면의 유속을 사용합니다. 각 튜브에 약 50마이크로리터의 방울이 있는 PCR 튜브에 방울을 수집합니다. 드롭메이킹 후 겔 로딩 피펫 팁을 사용하여 에멀젼에서 HFE 오일의 하부층을 조심스럽게 제거하고 중량당 5% 중량의 PFPE-PEG 계면활성제를 함유한 FC-40 불소화 오일로 교체합니다.

그런 다음 열 주기를 프로그래밍합니다. 튜브를 장치에 삽입하기 전에 펌프를 프라이밍하여 라인에서 공기를 제거하십시오. PE 튜빙 조각을 사용하여 HFE, 태그 부착 혼합물 및 마이크로겔이 포함된 주사기를 미세유체 장치 주입구에 연결합니다.

튜브 조각을 콘센트에 연결하고 플런저를 1밀리리터 선으로 당겨 빈 1밀리리터 주사기에 자유 끝을 놓습니다. 다음으로, 400X 배율에서 광학 현미경으로 마이크로겔 캡슐화 속도를 확인합니다. 태그멘테이션 에멀젼이 들어있는 주사기를 바늘로 끼우고 섭씨 55도의 열 블록이나 오븐에서 1시간 동안 똑바로 세워 배양하여 게놈 DNA를 단편화합니다.

FC-40 오일 분획을 HFE 2%중량 당 중량 PFPE-PEG로 교체하여 합병을 위한 바코드 방울을 준비합니다. 방울을 1ml 주사기에 조심스럽게 옮기고 바늘로 끼운 다음 주사기 펌프에 넣습니다. 배양 및 태그가 부착된 마이크로겔 액적 주사기를 주사기 펌프에 로드합니다.

다음으로, PE 튜브 조각을 사용하여 3개의 염화나트륨 주사기를 2개의 전극 입구와 단일 해자 입구에 연결합니다. 튜브를 장치에 삽입하기 전에 펌프를 프라이밍하여 라인에서 공기를 제거하십시오. PE 튜빙 조각을 사용하여 펌프에 장착된 3개의 HFE 주사기를 2개의 스페이서 오일 주입구와 적하 오일 주입구에 연결합니다.

그런 다음 튜브를 주사기 바늘에 연결하기 전에 정전기 방지 건으로 모든 액적 재주입 튜브를 쏘십시오. PCR 혼합 주사기, 마이크로겔 드롭 주사기 및 바코드 드롭 주사기를 PE 튜브를 사용하여 해당 주둥이에 연결합니다. 전극 주사기의 바늘을 앨리게이터 클립을 사용하여 냉음극 형광 인버터에 연결합니다.

인버터의 DC 전원 공급 장치를 2볼트로 설정합니다. 권장 유속으로 이중 병합 장치를 실행합니다. 각 튜브에 약 50마이크로리터의 에멀젼이 있는 PCR 튜브에 방울을 수집합니다.

열 사이클링 전에 겔 로딩 피펫 팁을 사용하여 에멀젼에서 HFE 오일의 하부층을 조심스럽게 제거하고 중량당 5% 중량의 PFPE-PEG 계면활성제를 함유한 FC-40 불소화 오일로 교체합니다. 그런 다음 주기를 프로그래밍합니다. 열 사이클 방울에서 DNA를 회수하려면 방울을 마이크로 원심분리기 튜브에 모으고 20마이크로리터의 PFO를 사용하여 에멀젼을 분해합니다.

10초 동안 소용돌이치며 섞입니다. 튜브를 돌립니다. 피펫을 사용하여 튜브에서 상부 수성층을 조심스럽게 제거하고 새 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다.

오일 상을 버리십시오. 그런 다음 마지막으로 라이브러리 준비, 염기서열분석 및 분석 단계를 진행합니다. 그룹 크기 대비 바코드 개수의 히스토그램은 유효한 바코드 그룹의 상당 부분이 그룹 임계값 크기당 7.5킬로베이스 쌍 바로 위에 있음을 보여주며, 이는 PCR 돌연변이 고아 바이러스를 제외합니다.

3개의 gram 음성 박테리아, 5개의 gram 양성 박테리아 및 2개의 효모로 구성된 합성 10개 세포 군집의 세포 유형의 상대적 풍부도는 raw read와 barcode group을 계산하여 계산되었습니다. 모든 바코드 그룹에서 B.subtilis 판독값의 원형 커버리지 맵은 관찰 가능한 드롭아웃 영역이 없는 SiC-seq 판독의 균일성을 보여주며, 평균 커버리지는 5.55X입니다. 커버리지의 균일성은 정규화된 커버리지 값의 빈도 분포로 검증되었습니다.

이 절차를 시도하는 동안 10방울당 약 1개의 바코드 또는 셀의 캡슐화 속도를 유지하는 것이 중요합니다. 이는 단일 셀 데이터를 복잡하게 만들 수 있는 이중 캡슐화 이벤트의 가능성을 제한합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 단일 세포 염기서열분석 데이터를 생성하는 데 사용되는 미세유체 장치를 설정하고 작동하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

이 기술을 숙달하면 8시간 또는 4시간씩 하루 2회 실행할 수 있습니다.