Name: 단일 셀 게놈 시퀀싱 초고 처리량 미세 플랫폼 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: 학습하세요 단일 세포 게놈 시퀀싱을 위한 초고처리량 미세유체 플랫폼을 활용한 방법입니다. 이 기술은 수만 개의 세포를 개별적으로 캡슐화하고 바코딩하여 게놈 이질성을 보존합니다.

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이 작품 경력 수상 (DBI-1253293 번호 부여);를 통해 국립 과학 재단에 의해 지원 되었다 국립 보건원 (NIH) (보조금 번호 HG007233-01, R01-EB019453-01, 1R21HG007233, DP2-AR068129-01, R01-HG008978); 그리고 방위 고급 연구 프로젝트 기관 생활 파운드리 프로그램 (계약 번호 HR0011-12-C-0065, N66001-12-C-4211, HR0011-12-C-0066).

<ol><li>Navin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+evolution+inferred+by+single-cell+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tumour evolution inferred by single-cell sequencing.</a> Nature. 472 (7341), 90-94 (2011).</li>
<li>Ni, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducible+copy+number+variation+patterns+among+single+circulating+tumor+cells+of+lung+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Reproducible copy number variation patterns among single circulating tumor cells of lung cancer patients.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (52), 21083-21088 (2013).</li>
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<li>Martínez, J. L., Baquero, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+among+strategies+associated+with+bacterial+infection%3A+pathogenicity+epidemicity%2C+and+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Interactions among strategies associated with bacterial infection: pathogenicity epidemicity, and antibiotic resistance.</a> Clinical Microbiology Reviews. 15 (4), 647-679 (2002).</li>
<li>Rinke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obtaining+genomes+from+uncultivated+environmental+microorganisms+using+FACS-based+single-cell+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Obtaining genomes from uncultivated environmental microorganisms using FACS-based single-cell genomics.</a> Nature Protocols. 9 (5), 1038-1048 (2014).</li>
<li>Rinke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+the+phylogeny+and+coding+potential+of+microbial+dark+matter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Insights into the phylogeny and coding potential of microbial dark matter.</a> Nature. 499 (7459), 431-437 (2013).</li>
<li>Zhang, H., Liu, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+tweezers+for+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Society+Interface%22%5BJournal%5D)">Optical tweezers for single cells.</a> Journal of the Royal Society Interface. 5 (24), 671-690 (2008).</li>
<li>Xu, L., Brito, I. L., Alm, E. J., Blainey, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virtual+microfluidics+for+digital+quantification+and+single-cell+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Virtual microfluidics for digital quantification and single-cell sequencing.</a> Nature Methods. 13 (9), 759-762 (2016).</li>
<li>Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+clonal+origins+of+childhood+acute+lymphoblastic+leukemia+by+single-cell+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dissecting the clonal origins of childhood acute lymphoblastic leukemia by single-cell genomics.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (50), 17947-17952 (2014).</li>
<li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+parallel+genome-wide+expression+profiling+of+individual+cells+using+nanoliter+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets.</a> Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).</li>
<li>Klein, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+barcoding+for+single-cell+transcriptomics+applied+to+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells.</a> Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).</li>
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<li>Amini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haplotype-resolved+whole-genome+sequencing+by+contiguity-preserving+transposition+and+combinatorial+indexing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Haplotype-resolved whole-genome sequencing by contiguity-preserving transposition and combinatorial indexing.</a> Nature Reviews Genetics. 46 (12), 1343-1349 (2014).</li>
<li>Zheng, G. X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haplotyping+germline+and+cancer+genomes+with+high-throughput+linked-read+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Haplotyping germline and cancer genomes with high-throughput linked-read sequencing.</a> Nature Biotechnology. 34 (3), 303-311 (2016).</li>
<li>Lan, F., Haliburton, J. R., Yuan, A., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+barcoding+for+massively+parallel+single-molecule+deep+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Droplet barcoding for massively parallel single-molecule deep sequencing.</a> Nature Communications. 7, 11784(2016).</li>
<li>Rotem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+ChIP-seq+reveals+cell+subpopulations+defined+by+chromatin+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state.</a> Nature Biotechnology. 33 (11), 1165-1172 (2015).</li>
<li>Lan, F., Demaree, B., Ahmed, N., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+genome+sequencing+at+ultra-high-throughput+with+microfluidic+droplet+barcoding%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Single-cell genome sequencing at ultra-high-throughput with microfluidic droplet barcoding.</a> Nature Biotechnology. 35 (7), 640-646 (2017).</li>
<li>Novak, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+multiplex+gene+detection+and+sequencing+with+microfluidically+generated+agarose+emulsions%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+Internation+Edition%22%5BJournal%5D)">Single-cell multiplex gene detection and sequencing with microfluidically generated agarose emulsions.</a> Angewandte Chemie Internation Edition. 50 (2), 390-395 (2011).</li>
<li>Gill, C., Van De Wijgert, J. H. H. M., Blow, F., Darby, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+lysis+methods+for+the+extraction+of+bacterial+DNA+for+analysis+of+the+vaginal+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Evaluation of lysis methods for the extraction of bacterial DNA for analysis of the vaginal microbiota.</a> PLoS One. 11 (9), 1-16 (2016).</li>
<li>Picelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tn5+transposase+and+tagmentation+procedures+for+massively+scaled+sequencing+projects%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Tn5 transposase and tagmentation procedures for massively scaled sequencing projects.</a> Genome Research. 24 (12), 2033-2040 (2014).</li>
<li>Abate, A. R., Chen, C. H., Agresti, J. J., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beating+Poisson+encapsulation+statistics+using+close-packed+ordering%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Beating Poisson encapsulation statistics using close-packed ordering.</a> Lab on a Chip. 9 (18), 2628(2009).</li>
<li>Jain, A., Yang, A. H. J., Erickson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gel-based+optical+waveguides+with+live+cell+encapsulation+and+integrated+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Optic+Letters%22%5BJournal%5D)">Gel-based optical waveguides with live cell encapsulation and integrated microfluidics.</a> Optic Letters. 37 (9), 1472(2012).</li>
<li>Karbaschi, M., Shahi, P., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+chemical-free+breaking+of+microfluidic+emulsions+with+a+hand-held+antistatic+gun%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Rapid chemical-free breaking of microfluidic emulsions with a hand-held antistatic gun.</a> Biomicrofluidics. 11 (4), 1-6 (2017).</li>
<li>Gole, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+polymerase+cloning+and+genome+sequencing+of+single+cells+using+nanoliter+microwells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Massively parallel polymerase cloning and genome sequencing of single cells using nanoliter microwells.</a> Nature Biotechnology. 31 (12), 1126-1132 (2013).</li>
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<li>Fierer, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-biome+metagenomic+analyses+of+soil+microbial+communities+and+their+functional+attributes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cross-biome metagenomic analyses of soil microbial communities and their functional attributes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (52), 21390-21395 (2012).</li>
<li>Mande, S. S., Mohammed, M. H., Ghosh, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classification+of+metagenomic+sequences%3A+methods+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Classification of metagenomic sequences: methods and challenges.</a> Briefings in Bioinformatics. 13 (6), 669-681 (2012).</li>
<li>Eastburn, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+droplet+enrichment+for+targeted+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Microfluidic droplet enrichment for targeted sequencing.</a> Nucleic Acids Research. 43 (13), e86(2015).</li>
<li>Clark, I. C., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finding+a+helix+in+a+haystack%3A+nucleic+acid+cytometry+with+droplet+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Finding a helix in a haystack: nucleic acid cytometry with droplet microfluidics.</a> Lab on a Chip. 17 (12), 2032-2045 (2017).</li>
</ol>

이에 관련 된 특허 수 있습니다 주주 이다 임무 바이오는 아담 R. Abate의 허가.

SiC-seq 미세 워크플로 세균성 세포의 수천에서 단일 셀 게놈 시퀀싱 데이터를 생성합니다. Microgel-캡슐화 된 세포의 유전자에 접합 하는 디지털 바코드는 철에 deconvolution NGS 데이터의 바코드 읽기 같은 셀에서 발생의 그룹으로 허용 합니다. 알려진된 구성의 미생물 지역 사회와 함께 제어 실험은 바코드 그룹의 순도 평가 하는 데 필요 합니다. 저 순도 그룹의 큰 분수 셀 캡슐화 속도가 너무 높습니다 하거나 중요 한 물방울 교차 오염을 미세 처리 단계 동안 발생 하는 나타냅니다. 통계에 따르면 푸아송, 바코드와 셀 모든 비어 있지 않은 물방울의 5% 미만에 다중 캡슐화 이벤트의 속도 제한에 모든 10 드랍 스에 대 한 1 입자의 대상 비에 캡슐화 한다. Dropmaking 과정에서 캡슐화 비율의 확인은 매우 중요 하므로 이것 보다 더 높은 요금을 캡슐화 기 하 급수적으로, 남자의 속도 증가 시킵니다. 사용자가 읽기 같은 바코드 순서를 공유 하는 다른 세포에서 분리 된 bioinformatically 수 없습니다 하기 때문에 단일 microgel에 여러 셀의 캡슐화의 특히 신중 해야 합니다. 경우에는 1 셀 수신 2 다른 바코드, 바코드 그룹 순수성 비록 풍부한 통계는 비뚤어진 바코드 시퀀스에 의해 계산 하는 때 영향을 받지 않습니다.
드롭릿 교차 오염 또한 차선 합병 조건으로 인해 발생할 수 있습니다. 성공적인 작업 중 미세 합병 장치 (그림 5) 1 microgel와 1 바코드 물방울과 PCR 시 약의 볼륨 controllably 쌍 수 있습니다. 비-이상적인 흐름 속도 잘못 된 비율에서 쌍 방울 귀 착될 것 이다: 1 바코드 예 2 microgels와 결합 수 있습니다. 프로토콜에 나열 된 모든 흐름 율 추정 될 것입니다 그리고 장치 형상과 방울 크기에 약간의 변화에 따라 조정 해야 할 수 있습니다. 고속 녹화 기능으로 카메라에 액세스할 수 있는 사용자 (> 10000 프레임/s) 시작 및 미세 작업의 과정을 통해 올바른 드롭릿 합병을 확인 해야 합니다. 고속 카메라에 액세스 하지 않고 사용자가 병합 된 출력의 작은 볼륨을 수집 하 고 수동으로 측정 현미경으로 작은 물방울 크기 수 있습니다. 작은 물방울 크기 균일 해야: 병합 되지 않은 바코드 또는 microgel 상품의 초과 나타냅니다 reinjection 요금 따라 감소 되어야 한다.
몇 가지 일반적인 예방 조치 취해야 한다 microgels와 microdroplets를 처리 하는 때 그들의 무결성을 유지 하. Microgels, 비록 기계적으로 강력 하 고, 해야 될 충분히 냉각 침입 및 완전 한 겔 화 되도록 조치를 세척 하기 전에. 비 구형 microgels는 표시는 agarose을 강화 하기 위해 충분 한 시간을 주어진. Microgels 세척 할 경우 제품의 손실을 방지 하기 위해 필요한 속도에서 정지 아래로 회전 합니다. Agarose 히드로 밀접 하 게 일치는 물의 굴절률 있으며 사용자가 신중 하 게 포부 전에 젤-액체 경계를 식별 해야 하므로 튜브22볼 하기 어려울 수 있습니다. 물에 기름 방울 정적 세력23 실험실 장갑과 튜브에의 하 여 접착을 따르게 됩니다. 이러한 이유로, 맨 손으로 물방울 reinjection 주사기를 로드 하 고 모든 reinjection 라인 펌프 못쓰게 하기 전에 정전기 방지 총을 치료 하는 것이 좋습니다. 큰 병합된 방울 주사기에 유화 액을 천천히 회전 하 고 수동으로 그들의 더 큰 부 력 힘 때문에 위쪽에 축적 큰 방울을 발음 하 여 제거할 수 있습니다.
SiC-seq는의 단일 셀 게놈 시퀀싱을 보여 주기 위해 첫 번째 기술 > 50000 세균성 세포. 이 플랫폼 기존 접근에 비해 처리량에 상당한 이점을 제공 하 고 이기종 미생물 커뮤니티의 깊은 샘플링을 수 있습니다. 날짜 하려면, 단일 셀 게놈 시퀀싱에 대 한 미세 기술 microchambers9 와 microwells24 셀 절연 및 증폭, 하지만 처리량만 수십 수백 개의 셀의 범위에서 고용 했다. Wellplates5,6 으로 단일 셀의 흐름 정렬 없음 특수 미세 계측을 필요 하지만 마찬가지로 낮은 처리량을 소유한 다. 토양 및 물 샘플 환경에서 일반적으로 있다의 알파 다양성을 감안할 때 > 종에 1, 000 레벨25,26, SiC seq 생물의 훨씬 더 큰 수를 샘플링 하는 기능 덕택으로 매우 유리 하다. SiC-seq 워크플로 실험실 문화, 자연 환경 또는 생활 호스트에서 셀 입력을 적응할 수 있습니다. 셀 샘플 필요만 수성 현 탁 액 및 큰 입자의 무료 (> 10 µ m) 미세 캡슐화에 대 한 적합 하다. 예를 들어 메서드는 세척의 시리즈를 사용 하 여 및 캡슐화17이전 셀을 전처리 하는 단계를 필터링 해 수의 샘플에 이전 적용 되었다.
SiC-seq 프로토콜 각 단일 셀에서 시퀀싱 데이터의 상대적으로 부족 한 금액을 생성 하 고 모든 응용 프로그램에 적합 하지 않을 수 있습니다. 전화 드 노 보 게놈 어셈블리 또는 단일 뉴클레오티드 변종 (SNV) 같은 생물 정보학 알고리즘 일부 높은 범위 깊이 효과적으로 작동 하려면 필요 합니다. 대신, 바코드 그룹은 클러스터 된 철에 의해 분류학 범주화 방법27 알고리즘 읽기의 큰 세트에 적용 될 수 있도록 수 있습니다. SiC-seq 워크플로의 상대적으로 낮은 전반적인 barcoding 효율성 또한 입력된 샘플의 가용성 낮은 경우에서 과제를 선물 수 있습니다. SiC-seq 포아송 분포 바코드 캡슐화 단계에 의존, 따라서 세포의 약 10% 분자 바코드를 받을 마지막 라이브러리 준비 단계 중에 증폭 됩니다. 이것은 다른 microdroplet 기반 바코드 제도10, 소중한 셀 샘플을 사용 하는 사용자가 시퀀싱에 대 한 적절 한 라이브러리 수익률을 달성 하는 어려움이 있을 수 있습니다. 고 마지막에 PCR 사이클의 수를 늘려야 할 수 있습니다. 증폭 단계입니다. 미세 전문 기술 사용자를 위한 또 다른 잠재적인 솔루션 디지털 PCR 단계, 따라서 전체 바코드 효율 가져온 후 긍정적인 바코드 방울을 정렬 하는 > 8528.
SiC-seq 기술에 대 한 잠재적인 미래 방향을 새로운 임상 연구는 단일 셀에 대 한 방법을 포장 하는 포유류 세포와 함께 사용 하기 위해 워크플로 적응 이다. 예를 들어, 단일 암 중 복사 번호 유사의 분석 5 월 세포 암 병 리2에서 성분의 역할에 대 한 우리의 이해를 더. 또는 관심29 의 DNA 시퀀스를 풍부 하 게 조사 하는 기존의 방법 SiC-seq를 통합 모집단의 대상으로 단일 셀 시퀀싱 또는 셀의 희귀 한 변종 사용할 것. 환경 샘플, 알려진된 신진 대사 통로 내에서 유전자는 대상 고 소설 게놈 제도 식별 하는 유전자를 이웃과 함께 콘텐츠 분석 될 수 있습니다. 인간의 호스트 환경 내에서 낮은 titer 병원 성 박테리아 샘플 격리 될 수 있습니다 및 더 많은 검사를 단일 세포 수준에서 밀접 하 게 시퀀싱 독성의 genotypic 그들의 기원.

게놈은 세포 id 및 기능, 전체 유기 체를 포함 하는 청사진의 잠재력을 코딩 있습니다. 게놈 수준에서 세포 생물학의 이해는 다른 유형의 세포 인구에서 관찰 된 phenotypic 다양성을 설명할 수 있다. 이 이종 생물 학적 시스템에서 이며 인류 건강 및 질병에 대 한 광범위 한 의미를 갖는다. 예를 들어 종양 세포 중 유전자 복사 번호 유사 진화 및 암1,2의 확산에 연결 됩니다. 세균 감염, pathogenicity 제도 게놈의 작은 분수에 수평으로 옮겨질 수 있다 하 고 항생제 내성 박테리아3,4의 확산으로 이어질. 단일 셀 수준에서 유전자를 공부 하 고 있는 주요 과제의 DNA, 세포의 수천을 분석할 필요가 genotypes의 전체 다양성을 낮은 수량입니다. 이러한 이유로 실험 처리량에서 제한 단일 셀 연구, 가장 풍부한 셀 쪽으로 결과 바이어 싱의 효과 방해 했습니다. 단일 셀 격리 기법5,6, 광학 핀셋7, 대량 젤8, 및9 마이크로 임베디드 정렬 흐름 등은 시퀀싱;에 대 한 셀의 수백 처리할 수 그러나, 이것은 대부분 샘플의 극히를 일부에 나타냅니다. 실질적으로 더 높은 처리량을 가진 단일 셀 게놈 시퀀싱 하는 방법을 더 깊이 그리고 더 완전 한 세포 인구, 따라서 elucidating genotypic 다양성이 지역이 사회 내에서 역할의 프로 파일링 수 있습니다.
드롭릿 마이크로 셀과 picoliter 스케일 원자로의 수백만에서 생물학 시 약의 높은 처리량 조작 수 있습니다. 날짜 하려면, microdroplet 기술 이질적인 조직10,,1112, 셀 중 차동 식 패턴을 공부 하는 데 사용 되었습니다 깊이 긴 분자13,14 시퀀스 ,15및 단일 셀16행위 chromatin immunoprecipitation 시퀀싱 (칩 seq) 분석. 실제로, microdroplets 높은 처리량, compartmentalized 작업, 그들을 단일 셀 유전체학에 의무가 응용 프로그램 만들기 수 있다. 그러나이 기술 개발 과제가 그것의 자신의 독특한 기술, 있습니다. 셀 lysed 해야 합니다 정화, 고 균일 하 게 샘플 세포 인구를 최소한의 바이어스 증폭. 또한, polyadenylated 포유류 세포에 있는 mRNA 사본는 달리 아무 유사한 분자 모티브 대상 핵 산의 캡처를 촉진 하기 위하여 게놈에서. 이러한 이유로, 단일 셀 게놈 시퀀싱 microdroplet 플랫폼에서 구현 하기 어려운 되었습니다.
이 작품에서는, 우리는 단일 실험17셀의 수천 수만의 게놈을 시퀀싱 할 수 이전에 보고 된 단일 셀 미세 접근의 상세한 프로토콜을 제공 합니다. 이 기술로, SiC-seq 라는 세균 세포 미크론 규모 hydrogels에 개별적으로 lysed, tagmented, 그리고 독특한 oligonucleotide 바코드를 통해 세포의 게놈 DNA에 접합 되는 포함 하는 microdroplet와 합병 한 단일 중복 확장 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR). hydrogels는 높은 분자 무게 genomic DNA sterically 쌌 다, 세제 및 액세스 하 여 DNA barcoding18전에 정화 용균성 효소와 같은 작은 분자를 허용 하는 절연된 컨테이너 역할을 합니다. 이 프로토콜 처리 > 결과 바코드 라이브러리 시퀀싱에 대 한 준비에 시간의 문제에 50000 단일 셀. 시퀀싱, 따라 읽기는 셀룰러 인덱스와 각 데이터 집합의 읽기, 수백만의 구성의 결과로 그들의 단일 셀 바코드 순서 대로 역다중화.

<table><tbody><tr><td>3" 실리콘 웨이퍼, P형, 버진 테스트 등급</td><td>대학 웨이퍼</td><td>447</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 3025 포토레지스트</td><td>Microchem</td><td>17030192</td><td></td></tr><tr><td>스핀 코팅기</td><td>특수 코팅 시스템</td><td>G3P-8</td><td></td></tr><tr><td>포토마스크</td><td>CadArt Servcies</td><td>(맞춤형)</td><td>마스크 설계는 보충 파일 참조</td></tr><tr><td>PGMEA 개발자</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>484431</tr><tr><td>이소프로판올</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>109827</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 실리콘 엘라스토머 키트</td><td>Krayden</td><td>4019862</td><td></td></tr><tr><td>탈기 챔버</td><td>Bel-Art</td><td>42025</td><td></td></tr><tr><td>0.75mm 생검 펀치</td><td>World Precision Instruments</td><td>504529</td><td></td></tr><tr><td>유리 현미경 슬라이드(75mm x 50mm)</td><td>Corning</td><td>294775X50</td><td></td></tr><tr><td>Aquapel (소수성 유리 처리)</td><td>Pittsburgh Glass Works</td><td>47100</td><td></td></tr><tr><td>PE-2 폴리에틸렌 튜빙</td><td>Scientific Commodities</td><td>B31695-PE/2</td><td></td></tr><tr><td>1 mL 주사기</td><td>BD</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>27 게이지 바늘</td><td>BD</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>주사기 펌프</td><td>New Era 펌프 시스템</td><td>NE-501</td><td></td></tr><tr><td>Novec HFE-7500 불소 오일( HFE)</td><td>3M</td><td>98-0212-2928-5</td><td></td></tr><tr><td>FC-40 플루오르화 오일</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9755</td><td></td></tr><tr><td>PEG-PFPE 계면활성제</td><td>Ran Biotechnologies</td><td>008-FluoroSurfactant</td><td></td></tr><tr><td>Space heater</td><td>Lasko&nbsp;</td><td>CD09250&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>아가로스, 저겔화 온도</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>a9414</td><td></td></tr><tr><td>TE (10X)</td><td>Rockland</td><td>mb-007</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1X, pH 7.4</td><td>E& K Scientific Products</td><td>EK-65083</td><td></td></tr><tr><td>OptiPrep (밀도 구배 매체)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>d1556</td><td></td></tr><tr><td>1H,1H,2H-Perfluoro-1-Octanol (PFO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>370533</td><td></td></tr><tr><td>Span 80 (sorbitane monooleate)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>s6760</td><td></td></tr><tr><td>Hexane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>139386</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20 (polysorbate 20)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>p2287</td><td></td></tr><tr><td>Lysozyme Type IV</td><td>MP Biomedicals</td><td>195303</td><td></td></tr><tr><td>Mutanolysin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9901</td><td></td></tr><tr><td>Zymolyase (효모 용해 효소)</td><td>Zymo Research</td><td>e1004</td><td></td></tr><tr><td>Lysostaphin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L7386</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl, pH 7.5, 1M</td><td>Invitrogen</td><td>15567-027</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Teknova</td><td>d9750</td><td></td></tr><tr><td>리튬 도데실 설페이</td><td>트 Sigma-Aldrich</td><td>L9781</td><td></td></tr><tr><td>단백질 분해 효소 K</td><td>New England Biosciences</td><td>P8107S</td><td></td></tr><tr><td>에탄올, 200 증거 (100 %)</td><td>Koptec</td><td>V1001</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green I(핵산 염색)</td><td>Invitrogen</td><td>S7563</td><td></td></tr><tr><td>PEG 6k</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81260</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100(옥틸페놀 에톡실레이트)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>t8787</td><td></td></tr><tr><td>Nextera DNA Library Prep Kit</td><td>Illumina</td><td>FC-121-1030</td><td></td></tr><tr><td>Phusion Hot Start Flex Master Mix(High-fidelity Hot Start Master Mix)</td><td>New England Biosciences</td><td>m05365</td><td></td></tr><tr><td>플래티넘 멀티플렉스 PCR 마스터 믹스(Taq 마스터 믹스)</td><td>Applied Biosystems</td><td>4464263</td><td></td></tr><tr><td>Warmstart 2.0 Bst 중합효소(등온 중합효소)</td><td>New England Biosciences</td> Nextera XT 키트의 <td>m0538m</td><td></td></tr><tr><td>NT 버퍼(중화 버퍼)</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1024</td><td></td></tr><tr><td>냉음극 형광 인버터</td><td>(맞춤형)(맞춤형)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DC 전원 공급 장치</td><td>Mastech</td><td>HY1503D</td><td></td></tr><tr><td>Zerostat 3 정전기 방지 건</td><td>Milty</td><td>5036694022153</td><td></td></tr><tr><td>3D 프린팅 원심분리기 주사기 홀더</td><td>(맞춤형)(</td><td>맞춤형)</td><td>3D 프린팅 파일에 대한 보충 파일 참조</td></tr><tr><td>Zymo DNA Clean & 집중 장치-5</td><td>자이모 연구</td><td>D4003</td><td></td></tr></tbody></table>

단일 셀 게놈 시퀀싱 초고 처리량 미세 플랫폼

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

시퀀싱 기술 생물 학적 시스템에서 세포질이 성분의 역할의 진화 이해에 대 한 응답에서 단일 셀 해상도로 대량에서 패러다임의 변화를 받은. 그러나, 큰 인구의 단일 셀 시퀀싱 게놈 시퀀싱에 대 한 처리에 제한에 의해 방해 되어 있다. 이 종이에 우리는 방법 분리, 증폭, 드롭릿 마이크로 사용 하 여 단일 셀 게놈 시퀀싱 (SiC-seq) 및 바코드 단일 세포의 게놈 설명 합니다. 미세 합병 효율적으로 쌍 각 게놈 독특한 단일 셀 oligonucleotide 바코드와 함께 하는 동안 microgels에 셀 캡슐화 compartmentalized 정화와 DNA의 tagmentation 수 있도록 > 50000 단일 셀 시퀀싱 할 당 실행 합니다. 시퀀싱 데이터는 역다중화 바코드를 생성 하는 단 세포에서 발생 하는 읽기의 그룹에 의해. 단일 셀 시퀀싱의 높은 처리량과 낮은 바이어스 방법으로 SiC-seq는 광범위 한 게놈 연구를 대상으로 다양 한 세포 인구 수 있게 된다.

SiC seq 실험 워크플로 포함 3 PDMS 미세 장치는 소프트 리소 그래피 프로시저 (그림 1)를 사용 하 여 조작 합니다. 공동 흐름 dropmaker (그림 3A)는 독특한 단일 셀 식별자 genomic DNA를 라벨에 대 한 디지털 바코드 방울의 25 µ m를 생성 합니다. PCR 증폭 (표 2, 뇌관 바)에 대 한 핸들을가지고 있는 15 bp 타락 한 시퀀스 바코드 oligonucleotides에 의하여 이루어져 있다. 바코드 단일 분자 캡슐화를 달성 하기 위해 femtomolar 농도를 희석 하 고 모든 방울을 받을 0 또는 1 바코드 fragment(s). 더블-좌초 바코드 amplicons의 많은 복사본을 저조한 방울 바코드를 포함 하는 증폭 된다. 핵 산 얼룩 성공적인 증폭을 확인 하 고 바코드 조각 (그림 4B)의 캡슐화 속도 측정 하는 데 사용 됩니다. microgels 공동 세균성 세포 현 탁 액 및 동일한 유량 (그림 2A)에서 녹은 agarose 젤을 흐르는 의해 생성 됩니다. agarose는 공동 흐름 dropmaking 프로세스는 효과적으로 2의 요인에 의해 수성 솔루션을 dilutes으로 두 번 원하는 최종 농도에서 준비 된다. 로 agarose 냉각, 그것은 25 µ m 직경 microgel는 작은 물방울의 구형 볼륨 점령으로 굳은 것 이다.
일련의 세척 및 세포 단계 정화 microgels (그림 2B)에 높은 분자 무게 genomic DNA. 속보는 유화 액, 후 수성 세척 추적 밖으로 다운스트림 효소 치료를 억제할 수 있는 유기 용 제 희석 큰 볼륨에서 수행 됩니다. 씻어 microgels 셀 캡슐화 속도 (그림 4A) 확인을 현미경으로 관찰 된다. 광범위 한 용균성 활동 효소 칵테일 박테리아와19진 핵 미생물 세포 벽을 소화 microgel 서 스 펜 션에 추가 됩니다. 세제 성분을 K와 두 번째 치료 단백질을 저하 하 고 세포 파편을 solubilizes.
순화 된 DNA의 Tagmentation microgels18사이 작은 tagmented DNA 파편의 확산에서 발생 하는 잠재적인 상호 오염을 피하기 위해 방울에서 수행 됩니다. 드롭릿 캡슐화 장치 (그림 3B) 동시에 또한 "태그" 그것은 사전 로드 된 oligonucleotide20동안 이중 가닥 DNA를 조각 버퍼 및 tagmentation 효소와 함께 각 microgel compartmentalizes. microgels 가까운 포장 입자, 캡슐화 요금 1 microgel 모든 드롭 몇 남자21 (그림 4C)에 대 한 접근 달성으로 작은 물방울에 로드 됩니다.
미세 워크플로 (그림 2C)의 마지막 단계에서 장치 바코드 1 방울, 1 microgel-포함 된 드롭 및 제어 2 단계 과정에서 증폭 혼합 결합 하는 이중 합병 작업을 수행 합니다. 첫째, PCR 시 약을 포함 하는 작은 물방울 쌍 이며 노란색 (그림 5)에 표시 된 지역에서 바코드 드롭과 병합 합니다. 미세 채널에서 바닷물 전극 높은 전기 분야 그라데이션 방울 합병 트리거를 생성 합니다. 비슷한 방식으로, 첫 번째 병합 된 물방울 microgel 물방울와 결합 이며 빨간색으로 표시 된 지역에서 두 번째 시간을 병합. 방울 수집 되 고 열 순환 단일 중첩 확장 (SOE) PCR 칩. 바코드와 tagmented genomic DNA의 겹치는 보완 끝 퓨전만 제대로 바코드 구문 지 수 증폭을 허용합니다.
시퀀싱 데이터는 먼저 읽기 품질에 의해 필터링 하 고 그들의 15-bp 단일 셀 바코드 순서 대로 읽기를 그룹화 하 여 구문 분석. 유효 바코드 그룹, 그것은 읽기;의 최소 수 있어야 이 임계 처리 분석 시퀀싱 데이터의 유용한 금액에 포함 된 셀을 제한 하 고 데이터 집합에서 PCR 돌연변이 바코드 "고아"를 제거 합니다. 이 샘플을 실행, 최소 그룹 당 7.5 kbps 설정 됩니다 (150의 50 읽기 혈압 각). 그룹 크기를 비교 하는 바코드의 히스토그램 유효한 바코드 그룹의 중요 한 부분 (그림 6A) 임계값 크기 보다 큰 표시 합니다.
제어 실험 미생물 커뮤니티 구성 알려져 있다, 순도 관계 되는 풍부 통계 SiC seq 실행의 품질을 평가 하 데 사용 됩니다. 여기, 3 그람 음성 박테리아, 5 그람 양성 박테리아 및 효 모 2의 구성 된 합성 10 셀 커뮤니티 분석 이다. 주어진된 바코드 그룹의 순도 읽기 읽기 그룹에서의 총 수로 나눈 그룹에 가장 일반적인 게놈에 수로 정의 됩니다. 바코드 그룹의 대부분 순도 0.95 (그림 6B) 보다 더 큰 있다. 세포 유형의 관계 되는 풍부는 원시 읽기를 계산 하 여 고 어디 그룹에 해당 하는 셀 형식을에 할당의 회원 읽기 (그림 6 c)의 합의 바코드 그룹을 계산 하 여 계산 됩니다. 읽기 및 바코드 그룹의 풍부는 대략 동등한 비율, 특정 종 어울리지 않게 작거나 큰 바코드 그룹에 포함 되지 않은 그런 세포 인구를 샘플링 되는 나타내는에 추적 합니다. 플로팅 단일 종에서 모든 바코드 그룹의 집계 범위 전체 게놈 몇몇 또는 강하 영역 (그림 7)에 걸쳐 높은 범위를 나타냅니다. 범위의 균일 정규화 된 범위 값, 평균을 중심으로 대부분의 값의 주파수 분배로 확인할 수 있습니다 (그림 7, 삽입).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57598/57598fig1.jpg"> 그림 1 : 사진 평판에 의해 미세 소자의 제조. (A) 마스터 금형 단일 기능 높이 스핀 코팅의 실리콘 웨이퍼에 감광 제 수-8 층에 의해 조작. 포토 레지스트는 다음 photolithographic 마스크와 UV 빛, 가교 노출된 수-8 꽃무늬. 마지막으로, uncrosslinked SU-8 개발자 욕조에 녹입니다. 결과 형 완전 한 미세 장치를 생산 하는 유리 슬라이드에 접착 되는 PDMS를 캐스팅 하는 데 사용 됩니다. (B) 더블 레이어 장치 제조 마찬가지로 스핀 코팅 및 노출 단계 시작. 이러한 단계는 다음 2 층 장치를 만드는 반복 됩니다. <a href="/files/ftp_upload/57598/57598fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57598/57598fig2.jpg"> 그림 2: 의 SiC seq 워크플로 개요. (A) A 미생물 현 탁 액은 microgels에 있는 단일 셀을 캡슐화 하는 dropmaker 장치에 녹은 agarose와 공동 흐른. (B)는 microgels 세균성 게놈 DNA를 정화 세척의 시리즈를 받게 됩니다. 용균성 효소 그람 양성 박테리아와 효 모의 세포 벽을 소화 하 고 세제 solubilizes 세포질 파편. microgels 경우 다시 상호 오염을 줄이기 위해 tagmentation에 대 한 작은 물방울으로 캡슐화 됩니다. (C) 미세 합병, 결합 한 디지털 PCR 바코드 tagmented microgel 게놈 그리고 비율로 증폭 믹스 &gt; 1 kHz. 오프 칩 SOE-PCR tagmented 게놈에 독특한 단일 셀 바코드를 결합 하 고 선택적으로 증폭 하 고 완전히 바코드 구문. <a href="/files/ftp_upload/57598/57598fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57598/57598fig3.jpg"> 그림 3: Dropmaking 및 microgel 다시 캡슐화에 대 한 미세 장치. (A)이이 패널 공동 흐름 dropmaker (기능 높이의 25 µ m)를 보여줍니다. 셀 및 녹은 agarose 25 µ m x 25 µ m 접합점에서 25 µ m 방울을 생산 하기 위해 동일한 흐름 속도에서 장치에 소개 된다. 디지털 바코드 dropmaking 셀 입구 연결 및 PCR 혼합은 agarose 입구에 도입. (B)이이 패널 microgel 다시 캡슐화 장치 (기능 높이의 25 µ m)를 보여 줍니다. microgels 25 µ m x 30 µ m 교차점에서 다시 캡슐화 하기 전에 tagmentation 믹스의 볼륨을 유지 하는 그들의 가까운 포장 주문 깔때기 모양의 입구에 흐름. <a href="/files/ftp_upload/57598/57598fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57598/57598fig4.jpg"> 그림 4 : 작은 물방울 및 microgels의 현미경 사진. (A)이이 패널 표시 효소 세포 전에 25 µ m microgels 세척 합니다. 박테리아는 붙일 캡슐화 속도의 정량화에 대 한 스테인드. 푸아송 로드 통계 지시 10에 1 방울의 속도로 캡슐화 또는 다중 캡슐화 이벤트의 빈도 최소화 하기 위해 적은 셀 이어야 합니다. (B)이이 패널은 25 µ m 디지털 바코드 작은 물방울 핵 산 얼룩으로 대우의 형광 현미경 이미지를 보여 줍니다. 방울 증폭된 바코드 파편을 포함 하는 강한 형광 신호를 생성 합니다. (C)이이 패널 microgels 다시 50 µ m에서에서 캡슐화를 보여줍니다. microgels의 가까운 패킹 캡슐화 요금 몇 남자와 드롭 당 1 젤을 접근 수 있습니다. <a href="/files/ftp_upload/57598/57598fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57598/57598fig5.jpg"> 그림 5 : 단일 셀 게놈 바코드에 대 한 미세 이중 합병 장치. 2 단계 합병 작업 쌍 높은 처리량에서 tagmented 유전자와 바코드 방울. PCR 혼합의 물방울은 처음 생성 하 고 바닷물 전극을 사용 하 여 노란색으로 표시 된 지역에서 바코드 드롭릿와 합병. 다음으로 microgel를 포함 하는 작은 물방울 소개 이며 빨간색으로 표시 된 지역에서 두 번째 시간을 병합. 오일 후미 reinjected 방울 사이의 간격의 정확한 제어를 위한 수 있습니다. 바코드 reinjection 챔버와 스페이서 석유 파란색에서 음영 짧은 25 µ m 계층에 배치 됩니다. 다른 모든 장치 기능 전체 높이의 45 µ m로 두꺼운 층에 속한다. <a href="/files/ftp_upload/57598/57598fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57598/57598fig6.jpg"> 그림 6 : 10 셀 합성 미생물 지역 사회에 대 한 바코드 그룹 메트릭. (A)이이 패널 그룹 크기는 바코드의 분포를 보여줍니다. 주어진된 크기의 그룹 수가 그룹 크기가 증가 함에 따라 기 하 급수적으로 감소합니다. 그룹 당 7.5 kbps의 최소 임계값 제한 충분 한 양의 정보를 가진 그룹을 분석 하 고 PCR 돌연변이 시퀀스 "고아"를 제거 합니다. (B)이이 패널에서 그룹 순도 바코드의 분포를 보여줍니다. 대부분 (&gt; 90%)은 매우 높은 순도의 그룹의 (&gt; 95%). (C)이이 패널 읽기 및 바코드 그룹 수준에서 계산 하는 10 종의 관계 되는 풍부를 보여준다. 계산 방법 2 바코드 그룹 크기 종에 걸쳐 일관성 있는 지를 나타내는 비슷한 결과 생산. <a href="/files/ftp_upload/57598/57598fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57598/57598fig7.jpg"> 그림 7 : 집계의 게놈 범위 새 균의 subtilis 바코드 그룹. B. subtilis 박테리아를 모든 바코드 그룹에서 읽기 (N = 9,398)는 풀링된 및 집계에서 분석. 원형 범위 지도 SiC seq 읽기 없이 관찰 강하 지역의 범위 균일성을 보여 줍니다. 파선 둘레는 평균 범위를 나타냅니다 (5.55 x). 상대 범위 주파수의 인세트 히스토그램 표시 기초의 대량 게놈 넓은 평균 근처 깊이에서 커버는 점선으로 표시. <a href="/files/ftp_upload/57598/57598fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>장치</td>
			<td>1 층 높이 (µ m)</td>
			<td>1 레이어 회전 속도 (rpm)</td>
			<td>2 층 높이 (µ m)</td>
			<td>2 레이어 회전 속도 (rpm)</td>
		</tr>
<tr>
<td>공동 흐름 dropmaker</td>
			<td>25</td>
			<td>4000</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
<tr>
<td>젤 재 encapsulator</td>
			<td>25</td>
			<td>4000</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
<tr>
<td>이중 합병</td>
			<td>25</td>
			<td>4000</td>
			<td>20</td>
			<td>5000</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 미세 장치 제조 매개 변수. 이 표에서 감광 스핀 코팅에 대 한 그들의 필요한 속도와 SiC seq 워크플로 (3025 SU-8에 대 한 제조업체의 사양에 따라)에 사용 되는 미세 장치 목록을 보여줍니다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>레이블</td>
			<td colspan="5">시퀀스 (5' &gt; 3')</td>
		</tr>
<tr>
<td>바</td>
			<td colspan="5">GCAGCTGGCGTAATAGCGAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGNNNNNNNNNNNNNNNTAAGCCAGCCCCGACACT</td>
		</tr>
<tr>
<td>DNA_BAR</td>
			<td colspan="5">CTGTCTCTTATACACATCTCCGAGCCCACGAGACGTGTCGGGGCTGGCTTA</td>
		</tr>
<tr>
<td>P7_BAR</td>
			<td colspan="5">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCAGCTGGCGTAATAGCG</td>
		</tr>
<tr>
<td>P5_DNA</td>
			<td colspan="5">AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCGTCGGCAGCGTC</td>
		</tr>
<tr>
<td>I7_READ</td>
			<td colspan="5">GCCCACGAGACGTGTCGGGGCTGGCTTA</td>
		</tr>
</tbody></table>표 2: 뇌관 시퀀스.
보충 파일 1: <a href="/files/ftp_upload/57598/Suppl_File_1-SiC-seq_device_masks.dwg" target="_blank">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보조 파일 2: <a href="/files/ftp_upload/57598/Suppl_File_2-centrifuge_syringe_holder_1mL.dwg" target="_blank">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

단일 셀 시퀀싱 생물 학적 시스템, genotypic이 보여 하지만 현재 기술 커뮤니티 구성 및 기능의 깊은 프로 파일링에 필요한 처리량 부족. 여기, 우리는 미세 워크플로 시퀀싱에 대 한 설명 > 다양 한에서 50000 단일 셀 게놈 세포 인구.

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...

이 실험의 전반적인 목표는 일련의 미세유체 장치를 사용하여 수만 개의 단일 세포에서 바코드가 있는 게놈 염기서열 분석 데이터를 생성하는 것입니다. 이 방법은 비교할 수 없는 단일 세포 염기서열분석 처리량을 달성합니다. 당사는 미세유체역학(microfluidics)을 사용하여 세포를 개별적으로 캡슐화, 용해 및 바코드화하여 염기서열분석 연구에서 기존의 충격으로 인해 손실되는 기본 게놈 이질성을 보존합니다.이 기술의 주요 장점은 처리량이 높고 수만 개의 셀에서 단일 셀 데이터를 생성할 수 있다는 것입니다. 이 시연에서는 미생물을 대상으로 작업하지만, 워크플로우는 미세유체 장치 치수를 약간 수정하여 다양한 세포 유형에 사용하도록 조정할 수 있습니다. 프로토콜을 시작하려면 1X Tris-EDTA 또는 TE 완충액에서 부피당 3%중량의 저용융 온도 아가로스 1ml를 준비합니다.주사기가 장전될 때까지 아가로스 용액을 섭씨 90도의 열 블록에 보관하십시오. 1ml의 인산염 완충 식염수(PBS)에 세포를 재현탁시키고 세포를 회전시킵니다. 상등액을 흡인하고 PBS에서 17% 부피 대 부피 밀도 구배 매체의 1밀리리터에 세포 펠릿을 재현탁하고 주사기가 로딩될 때까지 세포를 얼음 위에 유지합니다.다음으로, 3밀리리터 주사기에 중량당 2%의 PFPE-PEG 계면활성제가 함유된 불소화 오일(HFE)을 로드합니다. 27게이지 바늘로 끼우고 주사기 펌프에 넣습니다. 세포 현탁액과 용융된 아가로스를 27게이지 바늘이 맞는 1밀리리터 주사기에 넣고 주사기 펌프에 넣습니다.그런 다음 실내 히터를 높게 설정하고 가열 표면을 주사기에서 10cm 떨어진 곳에 배치합니다. 주사기에서 측정한 온도가 약 섭씨 80도인지 확인하십시오. 튜브를 장치에 삽입하기 전에 펌프를 프라이밍하여 라인에서 공기를 제거하십시오.폴리에틸렌 또는 PE 튜브 조각을 사용하여 주사기 바늘을 미세유체 장치 입구에 연결합니다. 튜브 조각을 콘센트에 연결하고 자유 끝을 15ml 수집 튜브에 넣습니다. 드랍메이킹 후 수집 튜브를 섭씨 4도에서 30분 동안 놓아 아가로스가 완전히 겔화되도록 합니다.20게이지 바늘이 장착된 3ml 주사기를 사용하여 수집 튜브에서 오일의 아래쪽 층을 제거하고 아가로스 방울의 최상층을 방해하지 않도록 주의합니다. HFE에서 부피 PFO당 10%부피 1밀리리터를 추가하여 계면활성제 층에서 아가로스 방울을 끊습니다. 용액을 1분 동안 위아래로 피펫팅하여 에멀젼을 철저히 코팅하며, 에멀젼은 균질하고 덩어리가 없어야 합니다.원뿔형 튜브를 2, 000 회 g에서 1 분 동안 회전시켜 아가로스 마이크로겔을 수집합니다. PFO/HFE 상등액을 흡인하고 마이크로겔이 이제 계면활성제 층에서 벗어나 투명한지 확인합니다. 마이크로겔을 세척한 후 10마이크로리터의 겔 분취액을 1X 핵산 염색으로 염색하여 현미경으로 400X 배율로 마이크로겔의 세포 캡슐화를 확인합니다.co-flow dropmaker 장치의 셀 입구를 작은 납 땜납 조각으로 막습니다. 튜브를 장치에 삽입하기 전에 펌프를 프라이밍하여 라인에서 공기를 제거하십시오. 튜브 조각을 콘센트에 연결하고 자유 끝을 0.2ml PCR 튜브에 넣습니다.드롭메이킹을 위해 화면의 유속을 사용합니다. 각 튜브에 약 50마이크로리터의 방울이 있는 PCR 튜브에 방울을 수집합니다. 드롭메이킹 후 겔 로딩 피펫 팁을 사용하여 에멀젼에서 HFE 오일의 하부층을 조심스럽게 제거하고 중량당 5% 중량의 PFPE-PEG 계면활성제를 함유한 FC-40 불소화 오일로 교체합니다.그런 다음 열 주기를 프로그래밍합니다. 튜브를 장치에 삽입하기 전에 펌프를 프라이밍하여 라인에서 공기를 제거하십시오. PE 튜빙 조각을 사용하여 HFE, 태그 부착 혼합물 및 마이크로겔이 포함된 주사기를 미세유체 장치 주입구에 연결합니다.튜브 조각을 콘센트에 연결하고 플런저를 1밀리리터 선으로 당겨 빈 1밀리리터 주사기에 자유 끝을 놓습니다. 다음으로, 400X 배율에서 광학 현미경으로 마이크로겔 캡슐화 속도를 확인합니다. 태그멘테이션 에멀젼이 들어있는 주사기를 바늘로 끼우고 섭씨 55도의 열 블록이나 오븐에서 1시간 동안 똑바로 세워 배양하여 게놈 DNA를 단편화합니다.FC-40 오일 분획을 HFE 2%중량 당 중량 PFPE-PEG로 교체하여 합병을 위한 바코드 방울을 준비합니다. 방울을 1ml 주사기에 조심스럽게 옮기고 바늘로 끼운 다음 주사기 펌프에 넣습니다. 배양 및 태그가 부착된 마이크로겔 액적 주사기를 주사기 펌프에 로드합니다.다음으로, PE 튜브 조각을 사용하여 3개의 염화나트륨 주사기를 2개의 전극 입구와 단일 해자 입구에 연결합니다. 튜브를 장치에 삽입하기 전에 펌프를 프라이밍하여 라인에서 공기를 제거하십시오. PE 튜빙 조각을 사용하여 펌프에 장착된 3개의 HFE 주사기를 2개의 스페이서 오일 주입구와 적하 오일 주입구에 연결합니다.그런 다음 튜브를 주사기 바늘에 연결하기 전에 정전기 방지 건으로 모든 액적 재주입 튜브를 쏘십시오. PCR 혼합 주사기, 마이크로겔 드롭 주사기 및 바코드 드롭 주사기를 PE 튜브를 사용하여 해당 주둥이에 연결합니다. 전극 주사기의 바늘을 앨리게이터 클립을 사용하여 냉음극 형광 인버터에 연결합니다.인버터의 DC 전원 공급 장치를 2볼트로 설정합니다. 권장 유속으로 이중 병합 장치를 실행합니다. 각 튜브에 약 50마이크로리터의 에멀젼이 있는 PCR 튜브에 방울을 수집합니다.열 사이클링 전에 겔 로딩 피펫 팁을 사용하여 에멀젼에서 HFE 오일의 하부층을 조심스럽게 제거하고 중량당 5% 중량의 PFPE-PEG 계면활성제를 함유한 FC-40 불소화 오일로 교체합니다. 그런 다음 주기를 프로그래밍합니다. 열 사이클 방울에서 DNA를 회수하려면 방울을 마이크로 원심분리기 튜브에 모으고 20마이크로리터의 PFO를 사용하여 에멀젼을 분해합니다.10초 동안 소용돌이치며 섞입니다. 튜브를 돌립니다. 피펫을 사용하여 튜브에서 상부 수성층을 조심스럽게 제거하고 새 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다.오일 상을 버리십시오. 그런 다음 마지막으로 라이브러리 준비, 염기서열분석 및 분석 단계를 진행합니다. 그룹 크기 대비 바코드 개수의 히스토그램은 유효한 바코드 그룹의 상당 부분이 그룹 임계값 크기당 7.5킬로베이스 쌍 바로 위에 있음을 보여주며, 이는 PCR 돌연변이 고아 바이러스를 제외합니다.3개의 gram 음성 박테리아, 5개의 gram 양성 박테리아 및 2개의 효모로 구성된 합성 10개 세포 군집의 세포 유형의 상대적 풍부도는 raw read와 barcode group을 계산하여 계산되었습니다. 모든 바코드 그룹에서 B.subtilis 판독값의 원형 커버리지 맵은 관찰 가능한 드롭아웃 영역이 없는 SiC-seq 판독의 균일성을 보여주며, 평균 커버리지는 5.55X입니다. 커버리지의 균일성은 정규화된 커버리지 값의 빈도 분포로 검증되었습니다.이 절차를 시도하는 동안 10방울당 약 1개의 바코드 또는 셀의 캡슐화 속도를 유지하는 것이 중요합니다. 이는 단일 셀 데이터를 복잡하게 만들 수 있는 이중 캡슐화 이벤트의 가능성을 제한합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 단일 세포 염기서열분석 데이터를 생성하는 데 사용되는 미세유체 장치를 설정하고 작동하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.이 기술을 숙달하면 8시간 또는 4시간씩 하루 2회 실행할 수 있습니다.

an-ultrahigh-throughput-microfluidic-platform-for-single-cell-genome

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

여기 샘플 제한된 양의 작업 특히, microRNA (miRNA) 표현 수준에 대해 비용과 시간 효율 높은 처리량 검사 도구로 microfluidic 플랫폼와 함께 최적화된 멀티 플렉스 반전 transcriptase 정량 PCR (qRT - PCR) 프로토콜을 설명합니다.

높은 처리량 MicroRNA의 프로파일 : 최적 멀티 플렉스 플루 동적 ArrayTM의 IFCs에 Nanoliter의 규모 qRT - PCR

우리는 단백질 배열의 표현을위한 마이크로 유체 접근 방식을 제시한다. 이 장치는 마이크로 기계 밸브에 의해 제어 반응 챔버의 수천으로 구성되어 있습니다. 마이크로 유체 장치는 microarray 인쇄 유전자 도서관에 결합되어 있습니다. 이러한 유전자 그런 다음 베꼈 및 실험 사용할 준비가 단백질 배열의 결과로, 칩에 번역되어 있습니다.

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우리는 마이크로 스케일 세포 자극 실험에 자동 세포 배양 및 심문 플랫폼을 개발했습니다. 플랫폼은 양성 세포의 작은 인구를 자극 분자 분석을위한 해물을 복구하는 간단한 다목적 및 정밀한 컨트롤을 제공합니다. 플랫폼은 물론 귀중한 세포 및 / 또는 시약을 사용하는 연구에 적합합니다.

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순환 종양 세포(CTC)는 암 진행 및 전이 연구에 매우 중요합니다. 이 기사에서는 CTC 농축 및 단일 CTC 시퀀싱을 위한 고처리량 통합 프로토콜을 제시하여 포획 효율성과 CTC 순도를 개선하는 동시에 오염 및 시퀀싱 비용을 줄여 정밀 종양학 연구 및 임상 응용을 발전시킵니다.

미세유체공학 기반 고처리량 순환 종양 세포 분류 및 단일 세포 시퀀싱 기술

학습하세요 단일 세포 게놈 시퀀싱을 위한 초고처리량 미세유체 플랫폼을 활용한 방법입니다. 이 기술은 수만 개의 세포를 개별적으로 캡슐화하고 바코딩하여 게놈 이질성을 보존합니다.

단일 셀 게놈 시퀀싱 초고 처리량 미세 플랫폼

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