Name: 최적화 된 합성 표면을 간세포 표현형 사용 안정화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: 학습하세요 폴리우레탄 합성 및 스핀 코팅을 활용한 간세포 배양 표면 최적화 기법을. 이 방법은 줄기세포 유래 간세포의 장기 안정적 배양을 가능하게 합니다.

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PHNGAD (폴리 [1,6-hexanodiol / 네오 펜틸 글리콜 / 디 (에틸렌 글리콜) -alt - 아 디프 산] 디올)의 1 합성 <img alt="반응식 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51723/51723scheme1.jpg" width="500" /> 반응식 1 : PHNAGD의 합성 PHNAGD의 합성의 도식 표현.. PHNAGD는 1,6-Hexanodiol의 반응, 디 에틸렌 글리콜, n​​eoppentyl 글리콜 및 아 디프 산을 제조 하였다. PHNAGD, 폴리 [1,6-hexanodiol / 네오 펜틸 글리콜 / 디 (에틸렌 글리콜) -alt - 아 디프 산] 디올. <ol><li> 잔류 물을 제거하기 위해 진공 오븐에서 48 시간 동안 40 ° C에서 단량체 1,6 - 헥산 디올, 디 (에틸렌 글리콜) 및 네오 펜틸 글리콜로 열처리를 적용. 진공 상태에서 RT까지 차가운 할 수 있습니다. </li><li> 딘 - 스탁 장치에 교반 막대가 장착되고 연결의 2 구 둥근 바닥 플라스크에 각각의 단량체 및 아 디프 산 (55 밀리몰)의 22 밀리몰 추가. </li><li> 진공 상태에서 전체 어셈블리를 놓고 부드럽게 GLA를 가열플라스크에 화학 물질의 첨가 중에 흡습을 방지하기 위해 6 시간 동안 40 ° C의,시 ssware. </li><li> 드롭에 의해 촉매 티타늄 (IV) 부톡 사이드 0.0055 몰을 드롭 주사기를 통해 추가합니다. </li><li> 24 시간 동안 N 2 분위기에서 180 ° C에서 반응 혼합물을 교반하고, 딘 - 스타크 트랩에서 잔류 물을 수집한다. 제품이 RT로 냉각시킵니다. </li></ol> PU134의 2 합성 <img alt="계획이" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51723/51723scheme2.jpg" width="500" /> 반응식 2 : PU134의 합성 PU134가 4,4 메틸렌 비스 (페닐 이소시아네이트) 2.0 당량과 PHNGAD 1.0 당량의 반응에 의해 제조 된 폴리 우레탄 (134)의 합성 도식 표현, 1.0을 첨가 하였다. 1,4 - 부탄디올 사슬 연장 제의 당량. <ol><li> (4) 2 당량과 폴리올 PHNGAD 1 당량 (Mn이 1,800 ~ DA, 3.2 밀리몰)을 혼합무수 N에서 &#39;4 메틸렌 비스 (페닐 이소시아네이트) (6.4 밀리몰), N 디메틸 포름 아미드 (12 mL)을 첨가 하였다. </li><li> N 2 분위기 하에서 70 ° C에서 반응 혼합물을 저어. </li><li> , 주사기를 통해 추가 촉매 티타늄 드롭 들러 (IV) 부톡 사이드 (0.8 중량 %). </li><li> 1 시간 후, 사슬 연장 1,4 - 부탄디올 (3.2 밀리몰)의 1 당량을 추가한다. 90 ° C의 온도를 높이고 N 2 분위기 하에서 24 시간 동안 교반한다. </li><li> 반응에 이어, 침전이 일어날 때까지 반응 용액에 적가 하였다 (도 사용될 수 헥산 또는 물), 디 에틸 에테르를 첨가하여 침전에 의해 폴리 우레탄을 모은다. </li><li> 5 분 동안 5,300 XG에 용액을 원심 분리기. </li><li> 뜨는을 가만히 따르다 용매가 증발 할 때까지 진공 오븐에서 40 ° C에서 떨어져 건조. 주 : 위해 반응의 최종 생성물은 분자량 분포에 관한 정확한 파라미터를 갖고 있는지 확인하기 위해, 기능적 GROU중합체 및 융점 및 유리 전이 온도의 PS는 다양한 분석 기술 및 방법은, 겔 투과 크로마토 그래피 또는 피트 르 분광법으로 사용될 수있다. </li></ol> PU134 솔루션의 3 준비 <ol><li> 유리 병에 PU134의 200 mg의 무게를 측정한다. </li><li> 클로로포름, 1 클로로포름과 톨루엔의 조합 : 용매의 수가 2 %의 최종 농도로 희석 한 PU134 비율, 테트라 히드로 푸란과 조합 한 테트라 히드로 푸란과의 dicloromethane : 1 비율. 참고 : 오른쪽 용매의 선거 사용할 수있는 폴리머에 따라 달라집니다. 다른 용매는 중합체의 용해에 영향을 미칠 수있는 다른 비등점을 갖는다. </li><li> 용액을 균질하게하고 침전물이 관찰되지 않을 때까지, 200 MOT / 분의 속도로 진탕을 사용하여 RT에서 20 분 동안 격렬히 흔들어 용액. </li></ol> PU134 유리 슬라이드의 4 코팅 <ol><li> 알자 배치스핀 코터에 ND 15mm이 커버 슬립. </li><li> 피펫을 사용하여 각 PU134 용액 50 μl를 적용합니다. 비율에 비례하는 양 표면을 유지해야 커버 슬립 크기에 따라 PU134 용액의 양을 조정한다. </li><li> 23의 X g에서 7 초 동안 각 coverslip에 스핀. </li><li> 멸균하기 전에 최소 24 시간 동안 실온에서 공기 건조 커버 슬립. </li></ol> 커버 슬립의 5 조사 <ol><li> 12 분 동안 실험실 조사 장치를 사용하여 회색의 열 용량을 적용하여 중합체 코팅 된 커버 슬립을 감마 - 조사한다. </li><li> 16 분 각 팀의 30 W, UV 전구를 사용하여 폴리머 코팅 된 커버 슬립을 조사 자외선. </li><li> 슬라이드 크기에 따라 적합한 조직 배양 접시에 고분자 코팅 된 커버 슬립을 놓습니다. </li></ol> 6 주사 전자 현미경 <ol><li> 압력이 5 × 10-1 밀리바의 분위기에서 200 초간 스퍼터링에 의해 금 코트 폴리머 커버 슬립. </li><li> microg 캡처이차 전자 촬상 모드에서의 20 kV의 가속 전압에서 주 사형 전자 현미경을 사용하여 코팅 된 커버 슬립의 중합체 raphs. </li></ol> 7 원자 힘 현미경 관찰 <ol><li> 중합체 표면의 20 × 20 ​​μm 인 영역을 스캔. </li><li> 1.32 Hz에서에서 1.60 Hz로 스캔 속도를 설정합니다. </li><li> 스캔 한 지역에서 512 X 512 픽셀의 해상도를 설정합니다. </li><li> 루트 평균 화상 데이터 플레인에서 찍은 높이 편차의 평균을 이용하여 코팅의 제곱 (RMS 또는 자승)를 계산 의미로 표현 : <img fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/51723/51723eq1.jpg" width="123" /> 여기서 닫아 현재 Z 값이며, N은 주어진 지역 내 점의 수이다. </li><li> 이용한 화상의 7.5 편차를 계산하거나, 표면 평균 거칠기 (라) <img fo:content-width="1.5in" src="/files/ftp_upload/51723/51723eq2.jpg" width="154" /> 어디 Z (X)는 t을 설명하는 기능입니다그 높이 (Z) 및 평가 길이 &quot;L&quot;을 통해 샘플의 위치 (X)의 관점에서 분석 프로파일 표면. RA가 중심면에 대하여 표면의 평균 값을 나타낸다. </li></ol> 8 세포 배양 및 분화 <ol><li> 농경 건초 및 17에 기재된 바와 같이 인간 배아 줄기 세포주 (hESC의) H9 차별화. </li><li> 해리 시약을 이용하여 세포를 분리하고 (18,19)에 대해 설명 Szkolnicka으로 무 혈청 배지의 존재하에 분화 과정의 일 9시 PU134 코팅 슬라이드 위에 그들을 replate. 주 : 효소 적 세포 해리의 사용은 물리적 셀 박리하는 것이 바람직하다. </li></ol> 9 사이토 크롬 P450 기능 분석 <ol><li> 제조업체의 지침에 따라 CYP3A 활동을 측정한다. </li><li> 세포없이 hESC의 파생 일 13 일 19에서 간세포, 미디어를 품어 - 음성 대조군으로, 적절한 SUBSTR로37 ° C에서 5 시간 동안 먹었다. </li><li> , 셀 및 미디어에서 상층 액을 수집 제조업체의 지침에 따라 분석을 수행한다. </li><li> 표면적 (cm 2) ~ CYP 활성 및 정규화의 상대적인 수준을 측정한다. </li></ol> (10) 면역 염색 <ol><li> 워시 hESC의 1 분 동안 PBS로 간세포를 유도, 두 번 반복합니다. </li><li> 10 분 동안 -20 ° C에 차가운 얼음 백퍼센트 세포를 해결하기 위해 메탄올, 장소를 추가합니다. </li><li> 5 분 동안 PBS로 세포를 씻으 두 번 반복합니다. </li><li> PBS / T (0.1 % 트윈) RT에서 1 시간 / 10 % BSA와 함께 세포를 배양한다. </li><li> PBST 솔루션을 기음과 PBS / T (0.1 % 트윈) / 1 % BSA에 희석 적절한 일차 항체를 추가, 부드러운 교반 O / N로 4 ° C에서 배양한다. </li><li> 5 분 동안 PBS / T (0.1 % 트윈) / 1 % BSA와 세포를 세척하고 세 번 반복합니다. </li><li> , PBS / T (0.1 % 트윈) / 1 % BSA에 적합한 항체를 희석하여 세포에 추가하고 교반과 함께 1 시간 동안 RT에서 어두운 곳에서 배양. </li><li> 5 분 동안 PBS로 세포를 세척하고 세 번 반복합니다. </li><li> 각 웰에 기포의 수를 줄이기 위해 부드럽게 커버 슬립을 추가 (1000 DAPI 일을 포함) MOWIOL 488를 추가합니다. 스토어는 어둠 속에서 4 ° C에서 세포를 고정. 적절한 필터 및 형광 램프 현미경을 사용하여 염색 관찰한다. 최적화 된 일차 및 이차 항체는 표 1에 나열되어 있습니다. </li></ol>

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</ol>

DCH는 CSO, FibromEd 제품 유한 회사의 이사, 설립자 FibromEd 제품 유한 회사 MB와 JPI의 주주 아르 설립자 주주입니다

줄기 세포로부터 간세포를 생성하는 데 사용되는 현재의 방법의 대부분은 동물 유래의 미정 행렬에 의존한다. 이러한 기판은 어플리케이션에 상당한 장벽을 나타내는 세포의 기능과 안정성에 영향을 미치는, 비싸고 매우 가변적 일 수있다. 따라서, 우리는 줄기 세포 유래 간세포의 문화를 지원하는 합성 물질에 대한 화면을 수행 하였다. 우리가 식별 한 견고한 간세포 분화 방식과 조합 PHNGAD, MDI 및 증량제, 그 중합에 의해 형성된 단순 우레탄 (PU134)는, 간세포 표현형을 안정화 및 마트 리겔 (15)와 비교했을 때 세포의 기능을 향상시킨다. 같은 비트로 넥틴 (22), 라미닌 (521) 23 또는 매트 리겔 등 일반적으로 배양에 사용되는 생물학적 매트릭스를, 기존의 분화 줄기 세포의 처리, 단기간의 유지 보수를 위해 효과적이다. 대조적으로, PU134 코팅 표면 hepatocy위한 우수한 기질을 제공테 문화. 또한,...

생물학적 물질은 널리 능성 줄기 세포의 한 유지 및 분화에 사용되어왔다. 가능하지만, 이러한 생물학적 기질은 종종 정의되지 않은 구성 요소의 무수가 포함되어 있습니다. 마트 리겔은 줄기 세포 배양 및 분화를위한 일반적으로 사용되는 기판이다. 불행하게도, 그 변수 조성물은 세포 표현형 및 기능에 영향을 미친다. 대안 이상의 정의 된 생물학적 매트릭스들의 다양한 2-7을 사용되었지만, 그들의 동물성 또는 나쁨 확장 그들에게 산업 제조에 부적합한 후보를 만든다. 따라서, 줄기 세포 연구의 주요 목표는 정의 된 구성과 신뢰할 수있는 성능으로 합성 대안의 식별이다. 정의되지 않은 세포 배양 기판의 한계를 극복하기위한 시도에서, 화학, 생물학 학제 간의 협력은 세포 표현형을 지원하는 능력과 합성 물질을 확인했다. 신디etic 기판은, 비용 효율적인 확장 성, 그리고 생체 내 환경을 흉내 낸, 복잡한 3 차원 구조로 제조 될 수있다. 이러한 특성으로 인해, 합성 기판은 널리 다양한 유형의 세포의 분화 8-10을 지원하고 구동하기 위해 사용되어왔다. 고급 및 높은 처리량 분석 대형 도서관에서 합성 물질의 신속한 심사를 촉진하고, 생물 의학 연구 및 개발 11-13에서 다양한 응용 프로그램과의 유연한 특성을 가진 새로운 물질을 전달했다. 높은 처리량, 고분자 마이크로 어레이 검사 기술을 활용, 우리는 빠른 속도로 인간의 줄기 세포 유래 간세포의 유지 보수에 적합한 간단한 폴리 우레탄 (PU134)를 확인했다. 이 중합체는 간세포 분화와 기능 14-16와 관련하여 동물 유래의 기재에 우수한 것으로 밝혀졌다. 우리는 이후 효과를 액세스하는 도포 조건, 지형 및 살균 처리를 최적화 한간세포 기능 및 수명을 안정화 중합체 성능. 이 세포 기반의 모델링 및 재생 의학 응용 프로그램에 대한 간세포 생물학의 기초를 이해 관련하여 중요한 의미를 갖는다. 여기에 설명 된 기술은 합성 중합체의 표면이 세포 표현형을 유지하도록 최적화 될 수있는 방법의 예를 나타낸다. 우리는 효율적인 무 혈청 간세포 분화 프로토콜이 기술의 조합이 체외 모델링 및 재생 의료에 사용하기위한 간세포의 생산 확장을 제공하는 잠재력을 가지고 있다고 믿는다.

<table><tbody><tr><td colspan="4">폴리머 PU134 코팅 커버슬립의 합성, 준비, 코팅 및 특성화</td></tr><tr><td></td><td>Shaker Edmun B&uuml; hler</td><td>KS-15</td><td></td></tr><tr><td>조사기</td><td>CIS Biointernational</td><td>IBL 637&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>스핀 코터</td><td>특수 코팅 시스템</td><td>P-6708</td><td></td></tr><tr><td>주사 전자 현미경&nbsp;</td><td>Philips</td><td>XL30CPSEM</td><td></td></tr><tr><td>원자력 현미경</td><td>DimensionV Nanoscope, VEECO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>p4-GLO CYP3A4</td><td>Promega</td><td>V8902</td><td></td></tr><tr><td>UV 전구</td><td>ESCO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoScope 분석 소프트웨어</td><td>VEECO</td><td></td><td>버전 1.20</td></tr><tr><td>형광 현미경</td><td>Olympus</td><td></td><td>TH45200 Volocity 4 소프트웨어 사용</td></tr><tr><td>조직 배양 플레이트</td><td>Corning, UK&nbsp;</td><td>3527</td><td></td></tr><tr><td>유리 슬라이드</td><td>과학 실험실 용품</td><td>MIC3308</td><td></td></tr><tr><td>디에틸렌 글리콜</td><td>시그마&ndash; Aldrich</td><td>93171</td><td></td></tr><tr><td>1,6-헥산디올</td><td>시그마&ndash; Aldrich</td><td>240117</td><td></td></tr><tr><td>Neopentyl 글리콜</td><td>Sigma&ndash; Aldrich</td><td>408255</td><td></td></tr><tr><td>Adipic acid</td><td>Sigma&ndash; Aldrich</td><td>9582</td><td></td></tr><tr><td>무수 N,N-Dimethylformamide</td><td>Sigma&ndash; Aldrich</td><td>227056</td><td></td></tr><tr><td>Diethyl 에테르</td><td>Sigma&ndash; 알드리치</td><td>676845</td><td></td></tr><tr><td>티타늄(IV) 부톡사이드&nbsp;</td><td>시그마&ndash; 알드리치</td><td>244112</td><td></td></tr><tr><td>1,4-부탄디올&nbsp;</td><td>시그마&ndash; Aldrich</td><td>493732</td><td></td></tr><tr><td>진공 오븐</td><td>Thermoscientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4,4'-Methylenebis(phenyl isocyanate)</td><td>Sigma&ndash; Aldrich</td><td>101688</td><td></td></tr><tr><td>Tetrahydrofurane</td><td>시그마&ndash; Aldrich</td><td>401757</td><td></td></tr><tr><td>스퍼터 코팅기</td><td>Bal-Tec SCD 050</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Inmunostaining</td></tr><tr><td>Phosphate buffer saline (-MgCl2, -CaCl2)</td><td>Gibco</td><td>10010031</td><td>실온에서</td></tr><tr><td>보관 PBST, PBS는 0.1% TWEEN 20&nbsp;</td><td>&nbsp; 과학 실험실 용품 회사</td><td>EC607&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>메탄올</td><td>&nbsp; Scientific Laboratory Supplies Ltd</td><td>CHE5010</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Sigma-Aldrich, UK</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>MOWIOL 488</td><td>DAPI Calbiochem</td><td>475904</td><td>제조업체 지침에 따라 Tris HCl 및 글리세롤로 구성</td></tr>됨<td colspan="4">세포 배양 및 기능 분석CYP3A 활성 pGLO 키트 Promega V8902 <tr></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hepatozyme</td><td>Gibco</td><td>17705021</td><td></td></tr><tr><td>TryLE express</td><td>Life Technologies</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/12604013">12604013</a></td><td></td></tr></tbody></table>

최적화 된 합성 표면을 간세포 표현형 사용 안정화

Stabilizing Hepatocellular Phenotype Using Optimized Synthetic Surfaces

현재 세포 생물학의 주요 한계 중 하나는 분화된 세포 표현형을 유지하는 것입니다. 생물학적 매트릭스는 일반적으로 일차 및 만능 줄기 세포 유래 간세포를 배양하고 유지하는 데 사용됩니다. 생물학적 매트릭스는 유용하지만, 간세포의 단기적인 배양을 허용하여 광범위한 적용을 제한합니다. 우리는 합성 고분자 코팅을 사용하여 한계를 극복하려고 시도했습니다. 폴리머는 가장 광범위한 종류의 생체 재료 중 하나이며 광범위한 기계적, 물리적 및 화학적 특성을 가지고 있어 목적에 맞게 미세 조정할 수 있습니다. 중요한 것은 이러한 재료를 품질 보증 표준으로 확장할 수 있고 배치 간 일관성을 표시할 수 있다는 것입니다. 이는 제약 테스트 산업 또는 세포 기반 치료에서 높은 처리량 스크리닝을 위해 세포를 확장해야 하는 경우 필수적입니다. 폴리우레탄(PU)은 세포 배양에서 가능성을 보여준 재료 그룹 중 하나입니다. 안정적인 표현형을 나타내는 인간 간세포의 장기 배양을 위해 폴리우레탄 코팅 표면을 최적화하는 최근의 진행 상황이 제시되고 논의됩니다.

고분자 용매 중합체 코팅 표면의 지형에 영향 폴리 우레탄 (134)은 단독으로 또는 톨루엔 또는 테트라 하이드로 퓨란 또는 디클로로 메탄과 유리 슬라이드가 다양한 제형으로 스핀 코팅과 조합하여, 클로로포름에 용해시켰다. 주사 전자 현미경 (SEM) 및 원자력 현미경 (AFM)을 (도 1) 중합체 코팅의 물리적 성질을 특성화하기 위해 사용되었다. 톨루엔, 클로로포름을 사용하여 얻은 코팅은 PU134 침전 (그림 1A)와 고르지 코팅을 보여 균일하지 않았다. 대조적으로, 테트라 히드로 푸란은 훨씬 균일 한 표면 (도 1a)의 스핀 코팅을 허용 적합한 용매이었다. 표면 토포 그래피는 제곱 (RMS)와 평균 거칠기 지수 (Ra)를 의미하는 루트를 이용하여 AFM으로 측정되었다. PU134는 테트라 히드로 푸란에 용해 토륨 비교 조도의 40 % 감소를 나타냈다전자 ...

이 문서는 장기적 폴리머 코팅 된 표면을 개발에 초점을 맞출 것이다, 줄기 세포의 안정적인 문화는 인간의 간세포를 산출했다.

Currently, one of the major limitations in cell biology is maintaining differentiated cell phenotype. Biological matrices are commonly used for culturing ...

이 절차의 전체적인 목표는 줄기세포 유래 인간 간세포의 장기적이고 안정적인 배양을 유지하도록 폴리머 코팅 표면을 최적화하는 것입니다. 이는 먼저 polyurethane 1 3 4 또는 PU 1 3 4를 합성함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 PU 1 34를 용해시키기 위한 적절한 용매를 선택하는 것입니다.다음으로, 유리 커버슬립 상의 PU 1 3 4 스핀 코팅 공정을 최적화합니다. 마지막 단계는 폴리머 P 1 34가 코팅된 유리 커버슬립의 멸균 절차를 최적화하는 것입니다. 최종적으로 주사 전자 현미경, 원자 힘 현미경 및 약물 대사 분석을 사용하여 줄기세포 유래 간세포의 기능에 있어 PU 1 34 폴리머 코팅의 영향을 확인합니다.간세포를 포함하는 URI 강력 줄기세포의 배양 시 기존의 매트릭스 사용법과 같은 방법들에 비해 이 기술이 가지는 주요 장점은, 이러한 합성 재료들을 목적에 맞게 정밀하게 조정할 수 있으며 품질 보증 표준에 따라 대량 생산이 가능하다는 점입니다. 또한, 이들은 배치 간 일관성을 나타냅니다. 이 기술의 시사점은 합성 폴리머의 표면을 최적화하여 세포 표현형을 보존하는 방법을 제시한다는 점에서 간 질환 치료로 확장될 수 있습니다.본 절차는 저희 연구실의 박사후 연구원인 Dr. Jeffrey Walton이 시연하겠습니다. 이 절차를 시작하기 전에, 모노메르인 1,6-hexane diol, diethylene glycol 및 neopentyl glycol을 진공 오븐에서 40 °C로 48시간 동안 열처리하십시오. 잔류 수분을 제거하기 위해, 각 모노메르 22 mmol과 adipic acid 55 mmol을 Dean-Stark 장치가 연결되고 마그네틱 바가 포함된 2구 라운드 바닥 플라스크에 넣으십시오.이후 전체 장치를 진공 상태로 두고, 플라스크에 화학 물질을 첨가하는 동안 수분이 흡수되는 것을 방지하기 위해 유리 기구를 40 °C에서 6시간 동안 완만하게 가열합니다. 장치를 오븐에서 꺼내 시스템을 질소 분위기로 전환한 후, 시린지를 사용하여 촉매인 titanium four, but oxide 0.0055 moles를 플라스크에 한 방울씩 첨가합니다. 반응 혼합물을 180 °C에서 24시간 동안 교반하며, dean stark trap에서 잔류 수분을 수집합니다.생성물을 실온까지 냉각시키십시오. 그다음, Dean-Stark 장치가 연결되고 마그네틱 바가 들어있는 2구 라운드 바닥 플라스크에 무수 DMF 12 mL와 함께 폴리올 P-H-N-G-A-G 3.2 millimole(1당량) 및 4,4'-methylene bis(phenyl isocyanate) 6.4 millimole(2당량)을 혼합하십시오.질소 분위기 하에 반응 혼합물을 70 °C에서 교반합니다. 그런 다음 시린지를 사용하여 촉매인 titanium four oxide를 최종 농도가 0.8%가 되도록 한 방울씩 첨가합니다. 1시간 후, 공중합체 생성물을 얻기 위해 체인 연장제인 one four butane dial 1당량을 첨가합니다. 온도를 90 °C로 높이고 질소 분위기 하에서 24시간 동안 반응시킵니다.반응 혼합물이 실온으로 냉각되면, 폴리우레탄 생성물의 침전이 관찰될 때까지 반응 혼합물에 디에틸 에테르를 한 방울씩 첨가합니다. 반응 혼합물을 원심분리 튜브로 옮긴 후, 5,300 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 따라낸 후, 용매가 증발할 때까지 실온에서 건조합니다.다음으로 PU 1 34 200 mg을 유리 병에 정밀하게 측정하여 넣습니다. 시료를 클로로포름, 또는 클로로포름과 톨루엔의 1:1 혼합액, 또는 테트라하이드로푸란, 또는 테트라하이드로푸란과 클로로메탄의 1:1 혼합액을 사용하여 최종 농도가 2%가 되도록 희석합니다. 용액이 균질해지고 침전물이 관찰되지 않을 때까지 쉐이커를 사용하여 실온에서 200 rpm의 속도로 20분 동안 격렬하게 흔들어 섞어줍니다.완료되면 약 15 mm 크기의 정사각형 유리 커버 슬립을 스핀 코터에 놓습니다. 피펫을 사용하여 PU 1~4 용액 50 µL를 커버 슬립에 도포합니다. 각 커버 슬립을 23 ×g에서 7초 동안 스핀 코팅합니다. 그 다음, 멸균 전 실온에서 최소 24시간 동안 커버 슬립을 공기 건조시킵니다. 이 시점에서 실험실 방사선 조사기를 사용하여 각 폴리머 코팅 커버 슬립에 10 Gy의 선량을 12분 동안 감마선 조사합니다.또는, 30W UV 전구를 사용하여 폴리머가 코팅된 각 커버슬립의 양면을 각각 16분 동안 UV 조사합니다. 완료되면 커버슬립 크기에 맞는 적절한 조직 배양 플레이트에 폴리머 코팅 커버슬립을 배치합니다. 해리제를 사용하여 분리된 인간 배아줄기세포주 세포를 배양 및 분화시킨 후, 분화 과정 9일 차에 무혈청 배지 조건에서 PU 1 34 코팅 커버슬립 위에 다시 도말하여 주사전자현미경으로 관찰합니다.다양한 코팅 처리된 유리 커버슬립의 이미지를 통해 톨루엔 또는 클로로포름을 이용한 코팅은 균일하지 않았으며, PE 1 34 침전으로 인해 불균일한 코팅이 형성되었음을 확인할 수 있었습니다. 반면, 테트라하이드로푸란은 훨씬 더 균일한 표면의 스핀 코팅을 가능하게 했습니다. 또한, 다양한 폴리머 코팅에 대한 원자간력 현미경 분석 결과, 다른 용매와 비교하여 테트라하이드로푸란에 용해된 P 1 34의 거칠기가 40% 감소하여 더욱 균일한 PU 1 34 코팅이 형성되었음을 보여주었습니다. 생물학적 응용을 위해 간 내배엽 분화를 유도한 결과, 9일째에 간모세포 유사 세포가 나타났으며, 대다수의 세포가 cytokeratin 19, alpha feta protein, hepatocyte nuclear factor for alpha를 발현하고 대사 기능의 척도인 albumin은 낮은 수준으로 발현하였습니다.폴리머로 코팅된 서로 다른 표면에 재배양한 지 4일 후에 Cytochrome P450 기능을 평가하였습니다. tetra hydro fure mpu 1 3 4 코팅 표면에 재배양된 세포에서 대사 활동이 2배 증가한 것이 관찰되었습니다. 이러한 결과는 인간 배아줄기세포 유래 간세포의 대사 활동이 더 균일한 P 1 34 코팅면에서 향상됨을 보여줍니다. 대비 영상 분석 결과 UV 또는 감마선 조사 후에도 거시적인 차이는 나타나지 않았으며, 이는 주사 전자 현미경 분석을 통해 추가로 확인되었습니다.감마선 조사된 PU 1 34 코팅 유리 커버슬립에 재배양한 인간 배아줄기세포 유래 간세포는 UV 조사된 PU 1 34 코팅 유리 커버슬립에 재배양한 세포보다 CYP 3A 활성이 3배 더 높게 나타났습니다. 이러한 관찰 결과는 감마선 조사가 최적의 멸균 기술임을 입증합니다. 이 절차를 수행할 때, 서로 다른 스핀 코팅 CLO 간의 코팅 균질성을 확인하는 것이 중요하며, 화학 용매 기구를 다루는 작업은 매우 위험할 수 있다는 점을 잊지 마십시오.이 절차를 수행하는 동안에는 항상 보호 안경 착용과 같은 안전 조치를 취해야 합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Chemistry

화학

이 문서는 인간의 배아 줄기 세포 집단에서 인간 간장 endoderm의 생성에 초점을 맞출 것이다.

인간 배아 줄기 세포 인구에서 Hepatocyte 같은 전지의 강력한 생성

동일한 공여자로부터 인간 간세포와 비실질 간 세포를 분리하는 기술에 대해 설명합니다. 다양한 간 세포 유형은 기능적 간 모델 및 조직 공학의 기초를 구축합니다. 이 새로운 방법은 높은 수율과 생존력으로 간 세포를 분리하는 것을 목표로 합니다.

차 인간 간세포의 분리 및 비 실질 간 세포의 주요 집단 대응을위한 프로토콜

여기에 제시된 방법은 다 능성 줄기 세포로부터 인간 간세포 - 유사 세포를 생성하기 위해 확장 및 우수 제조 기준 (GMP) 레디 분화 시스템을 설명한다. 이것은 기초 및 응용 연구 인간 간 인간 간세포 - 유사 세포를 생성하기위한 비용 효과적이고 표준화 된 시스템으로서 작용한다.

정의 및 간세포와 같은 세포의 확장 성 생성 인간 다 능성 줄기 세포에서

여기에 제시 된 프로토콜 간 질환의 치료에 대 한 작은 분자를 식별 하기 위한 플랫폼을 설명 합니다. 단계별 설명 Ipsc 96 잘 접시에서 hepatocyte 특성을 가진 세포로 분화 하 고 작은 분자에 대 한 잠재적인 치료 활동 화면 셀을 사용 하는 방법을 자세히 제시 합니다.

약물 발견에 대 한 만능 줄기 세포 유래 Hepatocyte 같은 세포를 유도 하는 인간을 사용 하 여

이 프로토콜에는 hepatocyte 같은 셀 96 잘 접시 형태로 인간의 pluripotent 줄기 세포에서 생산 하는 반자동된 접근 방식을 설명 합니다. 이 프로세스는 신속 하 고 비용 효율적인, 품질의 생산 기초 및 응용 연구를 인간의 hepatocyte 같은 셀 배치를 안심 수 있도록 합니다.

만능 줄기 세포에서 세포 처럼 Hepatocyte의 반자동된 생산

이 프로토콜은 정의된 배양 시스템 및 세포 자가 조립을 사용하여 인간 다능성 줄기 세포로부터 간구를 생성하는 접근법을 기술한다. 이 프로토콜은 다수의 세포주에서 재현가능하고 비용 효율적이며 생체 의학 적용을 위한 안정적인 인간 간구의 생산을 허용합니다.

다능성 줄기 세포에서 3차원 인간 간구의 혈청 무료 생산

이 문서의 목표는 만능 줄기 세포로부터 인간 간 선구분화를 유도하는 표준화된 접근법을 제공하는 것입니다. 즉시 사용 가능한 미디어 제형이 있는 이 절차의 개발은 사용자에게 생체 의학 연구 및 번역을 위한 인간 간 세포를 생성하는 촉진 시스템을 제공합니다.

정의된 분화 시스템을 사용하여 만능 줄기 세포에서 간 선조 사양

마우스 간세포로부터 장기 전 시험관 3D 오르간구배기 시스템이 구축되었다. 이러한 오르가노이드는 shRNA/ectopic 구조, siRNA 경질 및 CRISPR-Cas9 엔지니어링의 렌티바이러스 감염에 의해 통과되고 유전적으로 조작될 수 있다.

뮤린 헤파토세포 오르가노이드의 설립 및 유전적 조작

만능 줄기 세포에서 유래한 간세포는 미토콘드리아 및 활성 백혈구 세포 접착 분자(ALCAM, CD166이라고도 함) 염색을 사용하여 세포 분류를 통해 정제할 수 있습니다.

인간 유도 만능 줄기 세포에서 유래한 간세포를 정제하기 위한 세포 분류에 살아있는 미토콘드리아 염색 적용

최근의 기술 발전으로 약물 대사 및 독성 응용 분야를 위한 체외 플랫폼의 대규모 생산이 가능해졌습니다. 모든 인간 2D+ 간계(TV2D+)는 기존의 2차원 배양 방법을 사용하여 생리학적으로 관련된 결과를 제공합니다. 이 프로토콜은 시스템의 설정, 유지 관리 및 적용에서 최종 사용자를 지원합니다.

약물 개발 응용 분야를 위한 모든 인간 간 배양 시스템

학습하세요 폴리우레탄 합성 및 스핀 코팅을 활용한 간세포 배양 표면 최적화 기법을. 이 방법은 줄기세포 유래 간세포의 장기 안정적 배양을 가능하게 합니다.

최적화 된 합성 표면을 간세포 표현형 사용 안정화

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