최적화 된 합성 표면을 간세포 표현형 사용 안정화

이 절차의 전반적인 목표는 줄기세포 유래 인간 간세포의 장기적으로 안정적인 배양을 보존하기 위해 폴리머 코팅 표면을 최적화하는 것입니다. 이것은 먼저 폴리우레탄 1 3 4 또는 PU 1 3 4를 합성하여 수행됩니다. 두 번째 단계는 PU 1 34를 용해시키는 데 적합한 용매를 선택하는 것입니다.

다음으로, 유리 커버 슬립의 PU 1 3 4를 사용한 스핀 코팅 공정이 최적화됩니다. 마지막 단계는 폴리머 P1 34 코팅 유리 커버 슬립의 멸균 절차를 최적화하여 궁극적으로 주사 전자 현미경, 원자력 현미경 및 약물 대사를 최적화하는 것입니다. 줄기세포 유래 간세포의 기능에 대한 PU 1 34 폴리머 코팅의 영향을 보여주기 위해 분석이 사용됩니다.

간세포가 있는 URI의 강력한 줄기세포를 유지하기 위해 배양에서 al Metrices를 사용하는 것과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 이러한 합성 물질이 목적에 맞게 미세 조정되고 품질이 보장된 표준에 따라 규모를 조정할 수 있다는 것입니다. 또한 배치 2 버스 일관성을 표시합니다. 이 기술의 의미는 세포 표현형을 보존하기 위해 합성 고분자의 표면을 최적화할 수 있는 방법의 예를 나타내기 때문에 간 질환 치료로 확장됩니다.

절차를 시연하는 사람은 이 절차를 시작하기 전에 제 실험실의 박사후 연구원인 Jeffrey Walton 박사입니다. 진공 오븐에서 48시간 동안 섭씨 40도에서 모노의 원 식스 헥산 다이얼 디 에틸렌 글리콜과 네오 펜타일 글리콜에 열처리를 적용합니다. 잔류 수분을 제거하려면 각 단량체 22 밀리몰과 dpic 산 55 밀리몰을 딘 스타크 장치에 연결되고 마그네틱 교반 막대가 장착된 두 개의 목이 있는 둥근 바닥 플라스크에 추가합니다.

그런 다음 전체 어셈블리를 진공 상태에서 가열하고 플라스크에 화학 물질을 추가하는 동안 수분 흡수를 피하기 위해 유리 제품을 섭씨 40도에서 6시간 동안 부드럽게 가열합니다. 오븐에서 어셈블리를 제거하고 시스템을 질소에 배치 한 후, 촉매 티타늄 4의 0.0055 몰을 첨가하지만 플라스크에 주사기로 산화물을 적가화합니다. 반응 혼합물을 섭씨 180도에서 24시간 동안 저어주어 딘 스타크 트랩에 잔류 수분을 수집합니다.

제품을 실온으로 식히십시오. 다음으로 3.2 밀리몰 또는 폴리올 P-H-N-G-A-G의 1 당량과 6.4 밀리 몰 또는 4 개의 4 개의 메틸 및 비스페놀 이소시아네이트의 2 개의 당량을 혼합합니다. 12 밀리리터의 무수 DML에서 딘 스타크 장치에 연결되고 마그네틱 스타 바가 장착 된 2 개의 목이 달린 둥근 바닥 플라스크.

질소 분위기 하에서 섭씨 70도에서 반응 혼합물을 교반합니다. 다음 0.8%의 마지막 농도에 주사기를 통해 촉매 티타늄 4 산화물을 적게로 추가하십시오.1 시간 후에, 공중 합체 제품을 주기 위하여 사슬 연장제 1 4 부탄 다이얼의 1개의 동등물을 추가하십시오. 온도를 섭씨 90도로 높이고 질소 분위기에서 24시간 동안 굶어 죽습니다.

반응 혼합물이 실온으로 호출되면 폴리우레탄 생성물의 침전이 관찰될 때까지 반응 혼합물에 dal ether를 적가시킵니다. 반응 혼합물을 원심분리기 튜브로 옮긴 후 용액을 5, 300회 G에서 5분 동안 원심분리합니다. 디캔팅 후, supinate는 용매가 증발할 때까지 실온에서 건조됩니다.

다음으로 200mg의 PU 1 34를 유리병에 넣습니다. 샘플을 클로로포름 또는 클로로포름과 톨루엔에서 2%의 최종 농도로 일대일 비율 또는 테트라 로란 또는 테트라 로란 안티 클로로 메탄의 조합으로 희석합니다. 일대일 비율로 용액이 균일해지고 침전물이 관찰되지 않을 때까지 분당 200회 동작의 속도로 셰이커를 사용하여 실온에서 20분 동안 용액을 격렬하게 흔듭니다.

완료되면 스핀 코터에 약 15mm 정사각형 유리 커버 슬립을 놓습니다. 피펫 스핀을 사용하여 커버 슬립에 PU 1-4 용액 50 마이크로 리터를 적용하고, 23 회 G.Then 공기 건조 커버 슬립을 23 회 G.Then 공기 건조 커버 슬립 실온에서 살균하기 전에 적어도 24 시간. 이 시점에서 감마는 실험실 라디에이터를 사용하여 12분 동안 10개의 회색 선을 적용하여 각 폴리머 코팅 커버 슬립에 방사선을 조사합니다.

또는 30와트 UV 전구를 사용하여 각 면에서 16분 동안 각 폴리머 코팅된 커버 슬립을 UV에 조사합니다. 완료되면 폴리머 코팅된 커버 슬립을 커버 슬립 크기에 따라 적절한 조직 배양 플레이트에 놓습니다. 해리 시약을 사용하여 인간 배아 줄기 세포주를 배양 및 분화한 후 분화 과정의 9일째에 PU 1 34 코팅된 커버 슬립에 재생하여 무혈청 배지 주사 전자 현미경이 있는 상태에서 세포

서로 다른 코팅된 유리 커버 슬립의 이미지는 톨루엔 또는 클로로포름으로 코팅된 코팅이 균일하지 않음을 보여주며, PE 1 34 침전으로 불균일한 코팅을 보여줍니다. 대조적으로, 사면체는 훨씬 더 균일 한 표면의 스핀 코팅을 허용했습니다. 또한, 다양한 고분자 코팅의 원자력 현미경 분석은 다른 용매에 비해 테트라 하이드로 퓨린에 용해 된 P 1 34의 거칠기가 40 % 감소하는 것을 보여 주며보다 균일 한 PU 1 34 코팅을 입증하는 생물학적 응용을 보여 주며 간 내배엽 분화가 유도되었으며 9 일째에는 세포와 같은 간아세포가 명백했으며 대부분의 세포가 사이토케라틴 19 알파 페타 단백질과 알파 세포 핵 인자를 발현하고 신진대사 기능의 척도로서의 낮은 수준의 알부민.

사이토크롬 P four 50 기능은 다른 폴리머 코팅 표면에 재도금한 지 4일 후에 평가되었습니다. tetra hydro fure mpu 1 3 4 코팅 된 표면에 재 도금 된 세포의 대사 활성이 2 배 증가하는 것이 관찰되었습니다. 이러한 결과는 인간 배아 줄기 세포 유래 간세포 대사 활성이 보다 균일한 P1 34 코팅면으로 개선됨을 보여줍니다.조영제 이미징은 UV 또는 감마 조사 후 큰 차이를 보이지 않았으며, 이는 주사 전자 현미경 분석에 의해 추가로 확인되었습니다.

감마선 방사선 PU 1 34 코팅 유리 커버 슬립에 재도금된 인간 배아 줄기세포 유래 간세포는 UV 방사선 PU 1 34 코팅 유리 커버 슬립에 재도금된 세포에 비해 CYP 3 a 활성이 3배 증가한 것으로 나타났습니다. 이러한 관찰은 감마선이 최적의 살균 기술임을 보여줍니다. 이 절차를 시도하는 동안 서로 다른 스핀 코팅 CLO 간의 코팅 균질성을 확인하는 것을 기억하는 것이 중요하며 화학 용제 기기로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있음을 잊지 마십시오.

이 절차를 수행하는 동안 항상 보안경 착용과 같은 적용을 받아야 합니다.