최적화 된 합성 표면을 간세포 표현형 사용 안정화

이 절차의 전체적인 목표는 줄기세포 유래 인간 간세포의 장기적이고 안정적인 배양을 유지하도록 폴리머 코팅 표면을 최적화하는 것입니다. 이는 먼저 polyurethane 1 3 4 또는 PU 1 3 4를 합성함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 PU 1 34를 용해시키기 위한 적절한 용매를 선택하는 것입니다.

다음으로, 유리 커버슬립 상의 PU 1 3 4 스핀 코팅 공정을 최적화합니다. 마지막 단계는 폴리머 P 1 34가 코팅된 유리 커버슬립의 멸균 절차를 최적화하는 것입니다. 최종적으로 주사 전자 현미경, 원자 힘 현미경 및 약물 대사 분석을 사용하여 줄기세포 유래 간세포의 기능에 있어 PU 1 34 폴리머 코팅의 영향을 확인합니다.

간세포를 포함하는 URI 강력 줄기세포의 배양 시 기존의 매트릭스 사용법과 같은 방법들에 비해 이 기술이 가지는 주요 장점은, 이러한 합성 재료들을 목적에 맞게 정밀하게 조정할 수 있으며 품질 보증 표준에 따라 대량 생산이 가능하다는 점입니다. 또한, 이들은 배치 간 일관성을 나타냅니다. 이 기술의 시사점은 합성 폴리머의 표면을 최적화하여 세포 표현형을 보존하는 방법을 제시한다는 점에서 간 질환 치료로 확장될 수 있습니다.

본 절차는 저희 연구실의 박사후 연구원인 Dr. Jeffrey Walton이 시연하겠습니다. 이 절차를 시작하기 전에, 모노메르인 1,6-hexane diol, diethylene glycol 및 neopentyl glycol을 진공 오븐에서 40 °C로 48시간 동안 열처리하십시오. 잔류 수분을 제거하기 위해, 각 모노메르 22 mmol과 adipic acid 55 mmol을 Dean-Stark 장치가 연결되고 마그네틱 바가 포함된 2구 라운드 바닥 플라스크에 넣으십시오.

이후 전체 장치를 진공 상태로 두고, 플라스크에 화학 물질을 첨가하는 동안 수분이 흡수되는 것을 방지하기 위해 유리 기구를 40 °C에서 6시간 동안 완만하게 가열합니다. 장치를 오븐에서 꺼내 시스템을 질소 분위기로 전환한 후, 시린지를 사용하여 촉매인 titanium four, but oxide 0.0055 moles를 플라스크에 한 방울씩 첨가합니다. 반응 혼합물을 180 °C에서 24시간 동안 교반하며, dean stark trap에서 잔류 수분을 수집합니다.

생성물을 실온까지 냉각시키십시오. 그다음, Dean-Stark 장치가 연결되고 마그네틱 바가 들어있는 2구 라운드 바닥 플라스크에 무수 DMF 12 mL와 함께 폴리올 P-H-N-G-A-G 3.2 millimole(1당량) 및 4,4'-methylene bis(phenyl isocyanate) 6.4 millimole(2당량)을 혼합하십시오.

질소 분위기 하에 반응 혼합물을 70 °C에서 교반합니다. 그런 다음 시린지를 사용하여 촉매인 titanium four oxide를 최종 농도가 0.8%가 되도록 한 방울씩 첨가합니다. 1시간 후, 공중합체 생성물을 얻기 위해 체인 연장제인 one four butane dial 1당량을 첨가합니다. 온도를 90 °C로 높이고 질소 분위기 하에서 24시간 동안 반응시킵니다.

반응 혼합물이 실온으로 냉각되면, 폴리우레탄 생성물의 침전이 관찰될 때까지 반응 혼합물에 디에틸 에테르를 한 방울씩 첨가합니다. 반응 혼합물을 원심분리 튜브로 옮긴 후, 5,300 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 따라낸 후, 용매가 증발할 때까지 실온에서 건조합니다.

다음으로 PU 1 34 200 mg을 유리 병에 정밀하게 측정하여 넣습니다. 시료를 클로로포름, 또는 클로로포름과 톨루엔의 1:1 혼합액, 또는 테트라하이드로푸란, 또는 테트라하이드로푸란과 클로로메탄의 1:1 혼합액을 사용하여 최종 농도가 2%가 되도록 희석합니다. 용액이 균질해지고 침전물이 관찰되지 않을 때까지 쉐이커를 사용하여 실온에서 200 rpm의 속도로 20분 동안 격렬하게 흔들어 섞어줍니다.

완료되면 약 15 mm 크기의 정사각형 유리 커버 슬립을 스핀 코터에 놓습니다. 피펫을 사용하여 PU 1~4 용액 50 µL를 커버 슬립에 도포합니다. 각 커버 슬립을 23 ×g에서 7초 동안 스핀 코팅합니다. 그 다음, 멸균 전 실온에서 최소 24시간 동안 커버 슬립을 공기 건조시킵니다. 이 시점에서 실험실 방사선 조사기를 사용하여 각 폴리머 코팅 커버 슬립에 10 Gy의 선량을 12분 동안 감마선 조사합니다.

또는, 30W UV 전구를 사용하여 폴리머가 코팅된 각 커버슬립의 양면을 각각 16분 동안 UV 조사합니다. 완료되면 커버슬립 크기에 맞는 적절한 조직 배양 플레이트에 폴리머 코팅 커버슬립을 배치합니다. 해리제를 사용하여 분리된 인간 배아줄기세포주 세포를 배양 및 분화시킨 후, 분화 과정 9일 차에 무혈청 배지 조건에서 PU 1 34 코팅 커버슬립 위에 다시 도말하여 주사전자현미경으로 관찰합니다.

다양한 코팅 처리된 유리 커버슬립의 이미지를 통해 톨루엔 또는 클로로포름을 이용한 코팅은 균일하지 않았으며, PE 1 34 침전으로 인해 불균일한 코팅이 형성되었음을 확인할 수 있었습니다. 반면, 테트라하이드로푸란은 훨씬 더 균일한 표면의 스핀 코팅을 가능하게 했습니다. 또한, 다양한 폴리머 코팅에 대한 원자간력 현미경 분석 결과, 다른 용매와 비교하여 테트라하이드로푸란에 용해된 P 1 34의 거칠기가 40% 감소하여 더욱 균일한 PU 1 34 코팅이 형성되었음을 보여주었습니다. 생물학적 응용을 위해 간 내배엽 분화를 유도한 결과, 9일째에 간모세포 유사 세포가 나타났으며, 대다수의 세포가 cytokeratin 19, alpha feta protein, hepatocyte nuclear factor for alpha를 발현하고 대사 기능의 척도인 albumin은 낮은 수준으로 발현하였습니다.

폴리머로 코팅된 서로 다른 표면에 재배양한 지 4일 후에 Cytochrome P450 기능을 평가하였습니다. tetra hydro fure mpu 1 3 4 코팅 표면에 재배양된 세포에서 대사 활동이 2배 증가한 것이 관찰되었습니다. 이러한 결과는 인간 배아줄기세포 유래 간세포의 대사 활동이 더 균일한 P 1 34 코팅면에서 향상됨을 보여줍니다. 대비 영상 분석 결과 UV 또는 감마선 조사 후에도 거시적인 차이는 나타나지 않았으며, 이는 주사 전자 현미경 분석을 통해 추가로 확인되었습니다.

감마선 조사된 PU 1 34 코팅 유리 커버슬립에 재배양한 인간 배아줄기세포 유래 간세포는 UV 조사된 PU 1 34 코팅 유리 커버슬립에 재배양한 세포보다 CYP 3A 활성이 3배 더 높게 나타났습니다. 이러한 관찰 결과는 감마선 조사가 최적의 멸균 기술임을 입증합니다. 이 절차를 수행할 때, 서로 다른 스핀 코팅 CLO 간의 코팅 균질성을 확인하는 것이 중요하며, 화학 용매 기구를 다루는 작업은 매우 위험할 수 있다는 점을 잊지 마십시오.

이 절차를 수행하는 동안에는 항상 보호 안경 착용과 같은 안전 조치를 취해야 합니다.