인간 배아 줄기 세포 인구에서 Hepatocyte 같은 전지의 강력한 생성

다음 실험의 전반적인 목표는 체외에서 인간 간 생물학을 연구하기 위해 균일한 수준의 인간 간세포를 생산하는 것입니다. 이는 인간 배아 줄기 세포 또는 인간 배아줄기세포를 최종 배배엽으로 유도함으로써 시작되며, A와 WIN A.As T에서 활성화되는 생리학적 자극을 사용하여 두 번째 단계인 최종 배배엽은 두 번째 단계에서 매우 효율적으로 간 내배엽으로 유도됩니다. 다음으로, 인간 배아줄기 유래 간 내배엽을 체외에서 성숙시켜 기능성 인간 간세포를 생성합니다.

PCR 웨스턴 블로팅(Western blotting), 면역형광, 엘리자(Eliza's) 및 약물 대사(drug metabolism)의 결과는 이 방법이 약 90%의 효율로 인간 배아줄기세포에서 간세포를 유도한다는 것을 나타냅니다.이 기술을 사용하면 이론적으로 상당한 수준의 인간 간 기능을 나타내는 1차 인간 간세포의 무진장 공급을 생성할 수 있습니다. 미래에는 약물 독성을 정확하게 예측하고 인간의 간을 지원하는 데 도움이 될 것입니다. 비결은 태양의 분화와 인간 세포의 핵 밀도를 높이는 것입니다.

이 방법의 시각적 시연은 코어 세포 밀도가 균질한 세포 집단을 생성하는 데 필수적이기 때문에 매우 중요합니다. 우리는 이 기술을 성공적으로 수행할 수 있도록 전 세계 4개 현장에서 15명 이상의 개인을 교육했습니다. 인간 배아 줄기세포 배양으로 시작하여 염기성 FGF가 보충된 마우스 배아 섬유아세포 조건화된 배지 ORM cm이 있는 마트리겔 코팅된 플레이트에서 증식합니다.

간 분화 이전에 유지된 인간 배아줄기세포를 주의 깊게 특성화하는 것이 중요합니다. 예를 들어, 이러한 세포는 인간의 배아줄기세포 형태를 나타냅니다. 또한 만능 줄기 세포 마커인 OCT 4 및 nano를 positive control H seven human ESC line과 유사한 수준으로 발현합니다.

또한, 인간 ESC는 SS EEA 4에 양성입니다. 인간 E ESC가 30-60% co-fluency에 도달하면 ME CM을 새로 준비된 분화 배지로 교체합니다. 간 분화를 시작하려면 3일 동안 24시간마다 배지를 교체해야 합니다.

3일 후, 세포는 내배엽 표현형으로 분화하기 시작하면서 삼각형 모양을 띠게 됩니다. 매체를 SR DMSO 구분으로 전환합니다. 4-5일 동안 배지 배양.

48시간마다 매체를 교체합니다. 이 5일의 기간이 지나면 세포는 간 세포의 특징인 다각형 모양을 취하기 시작합니다. 인간 배아줄기세포세포와 간내배엽의 분화는 9일째까지 일련의 심오한 형태학적 변화에 반영됩니다.

더욱이, 9일 동안 옥타 포의 발현은 점차 감소한다. 대조적으로, FP와 알부민의 간 전사체는 7일째부터 증가합니다. 세포를 성숙시키고 48시간마다 새로운 배지로 9일 동안 최종 배지에서 간 표현형을 유지하여 계속합니다.

마지막으로, 위상차 현미경으로 배양된 세포를 모니터링하여 뾰족한 삼각형 모양에서 다각형 모양을 나타내는 특징적인 간 형태로의 점진적인 형태학적 변화를 확인하여 간 내배엽 기능 분석을 정량적으로 평가합니다. 사이토크롬 P four 50 효소 활성, 특히 SIP 3 A 4 또는 SIP 1 A 2의 경우. 첫 번째 배양 17일째.

인간 ESC 유래 간 내배엽 세포는 특정 기질이 삼중 반응을 수행합니다. 조직 배양 배지를 음성 대조군 배양물로 사용하여 섭씨 37도에서 5시간 동안 배양하는 것을 잊지 마십시오. 상층액을 수집하고 제조업체의 지침에 자세히 설명된 대로 기초 효소 활성의 상대적 수준을 측정합니다.

이제 각 샘플에 대해 A-B-C-A-S에 의해 결정된 단백질 밀리그램당 효소 활성을 계산합니다. 이 간 내배엽의 체외 성숙 방법에 의해 파생된 일반적인 배양물의 면역 염색. 3개의 인간 간 마커, 알부민, FP 및 ein의 균일한 발현을 입증합니다.

이 비디오를 시청한 후에는 인간 및 학습 줄기 세포를 간세포와 효율적으로 구별하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 일단 숙달되면, 이 기술은 100만 개의 세포당 약 2분 30초의 약정으로 매일 수행할 수 있습니다. 분화 과정에서 매일 형태학적 변화를 확인하는 것은 매우 중요합니다.