정의된 분화 시스템을 사용하여 만능 줄기 세포에서 간 선조 사양

이 프로토콜은 기초 및 임상 연구를 위해 간 생물학을 연구하기 위한 재현 가능한 도구를 제공하는 줄기세포 유래 간 분화 시스템을 제공합니다. 표준화되고 따르기 쉬운 프로토콜과 기성품 배양 시약을 결합함으로써 이 시스템은 간 전구 세포와 간세포와 같은 세포를 대규모로 생산할 수 있습니다. 라미닌-531이 함유된 10cm 접시에 인간 만능 세포를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 유지하고, 접시당 10ml의 줄기세포 유지 배지를 매일 공급합니다.

라미닌 521 플레이트를 준비하려면 해동된 라미닌 521을 칼슘 및 마그네슘과 함께 얼음처럼 차가운 DPBS에서 최종 농도인 밀리리터당 8마이크로그램으로 희석합니다. 24웰 플레이트의 각 웰에 250마이크로리터의 라미닌 용액을 추가하거나 96웰 플레이트의 각 웰에 50마이크로리터를 추가합니다. 플레이트를 좌우로 부드럽게 흔들어 웰을 고르게 코팅한 다음 반투명 플렉시블 필름으로 플레이트를 밀봉하고 밤새 섭씨 4도에서 보관합니다.

세포 파종 당일, 세포 배양 인큐베이터에서 사전 코팅된 플레이트를 30-60분 동안 따뜻하게 합니다. laminin 521 용액을 흡인하고 각 웰에 10마이크로몰 ROCK 억제제가 보충된 줄기세포 유지 배지를 추가한 다음 플레이트를 인큐베이터로 되돌립니다. 세포 수 유창성이 70-80%에 도달하면 배양 접시에서 사용한 배지를 흡인하고 실온에서 칼슘이나 마그네슘이 없는 5ml의 DPBS로 각 배양 접시를 세척합니다.

배양 접시에서 DPBS 세척제를 흡인한 다음 접시에 5ml의 효소가 없는 해리 시약을 추가하고 세포가 접시에서 눈에 띄게 분리될 때까지 섭씨 37도에서 8-10분 동안 플레이트를 배양합니다. 세포 스크레이퍼를 사용하여 배양 접시에서 세포를 부드럽게 분리한 다음 5ml 혈청학적 피펫으로 각 웰의 내용물을 위아래로 피펫팅하여 단일 세포 현탁액을 생성합니다. 각 세포주에 대해 모든 유지보수 웰의 세포를 멸균 50ml 튜브로 풀링합니다.

비워진 각 배양 접시를 5ml의 줄기 세포 유지 배지로 세척하고 고인 세포가 있는 해당 튜브에 세척액을 추가합니다. 풀링된 각 샘플에 대해 3개의 생존 가능한 세포 계수를 수행합니다. 풀링된 샘플을 250 x g에서 5분 동안 원심분리합니다.

그런 다음 상등액을 흡인하고 10 micromolar ROCK 억제제 Y27632를 보충한 줄기세포 유지 배지로 1-3ml의 실온에서 세포를 재현탁합니다. 원하는 시딩 밀도를 달성하는 데 필요한 세포 수를 계산한 후 세포를 적절한 농도로 재현탁하고 사전 코팅된 플레이트에 분배합니다. 웰당 총 부피는 24웰 플레이트의 경우 1밀리리터, 96웰 플레이트의 경우 0.1밀리리터여야 합니다.

균일한 세포 분산을 보장하기 위해 플레이트를 좌우로, 앞뒤로 부드럽게 흔들고 파종된 플레이트를 인큐베이터에 넣고 앞뒤로 좌우로 흔듭니다. 텍스트 원고에 기술된 바와 같이 결정적인 내배엽 유도 및 후속 간 전구 세포 사양 분화를 위한 배지를 준비합니다. 분화 첫날, 웰에서 사용한 배지를 제거하고 1단계 배지 배지로 교체합니다.

2일, 3일, 4일째에 사용한 배지를 제거하고 1단계 배지 2를 각 웰에 공급합니다. 5일차에는 최종 내배엽 분화 분석을 위한 웰을 고정합니다. 나머지 웰의 경우 사용한 배지를 제거하고 각 웰에 stem diff hepatic progenitor 배지를 공급합니다.

10일차에는 간전구세포 분화 분석을 위해 세포를 채취하거나 세포 분화와 같은 추가 간세포를 진행합니다. 간전구세포 분화 배양을 특성화하기 위해 면역염색을 사용하여 5일째에 최종 내배엽 특이적 마커의 발현을 검출하고 10일째에 간전구세포 특이적 마커의 발현을 검출하고 HNF4 알파 양성 세포의 비율을 정량화합니다. 10일째에는 ELISA를 통해 알파 태아 단백질과 알부민 분비도 측정합니다.

이 프로토콜은 인간 배아 줄기 세포와 인간 유도 만능 줄기 세포 모두에서 간 전구 세포를 구별하는 데 사용되었습니다. 분화 프로토콜의 5일차에 Sox 17 발현을 통해 최종 내배엽 사양을 평가했습니다. 두 세포주 모두에서 Sox 17은 H9 및 P106에 대해 각각 80 및 87.8%의 Sox 17 양성 세포로 높게 발현되었습니다.

10일째에 간 전구 세포는 조약돌과 같은 형태를 보였습니다. 또한, HNF4 알파, AFP, 알부민 및 사이토케라틴 19 발현에 대해 간전구세포 사양을 평가하였다. 두 간 전구 배양 모두 HNF4 알파, AFP 및 CK 19와 같은 태아 간 마커를 발현했습니다.

알파태아단백 분비는 두 세포주 모두에서 10일째에 검출되었으나 ELISA에서는 알부민 분비가 검출되지 않았다. 세포 수 변동성 및 간 전구 세포 분화 효율은 HNF4 알파 발현을 정량화하여 평가했습니다. 10일째에 간전구세포는 H9 및 P106에 대해 웰당 각각 95% 및 97% 이상의 HNF4 알파 양성 세포로 행 간에 유의미한 변동성을 보이지 않았습니다.

분화가 시작되기 전에 균일한 세포 분포는 간 전구 세포의 균질한 집단을 보장하는 데 중요합니다. 이를 달성하려면 플레이트를 좌우로, 앞뒤로 부드럽게 흔들어 세포가 균일하게 분산되도록 하십시오. 이 프로토콜에 의해 생성된 간전구세포는 다른 분석을 위해 간세포 유사 세포로 추가로 분화될 수 있으며, 질병 모델링 또는 약물 스크리닝을 위한 재현 가능하고 표준화된 도구를 제공합니다.