개발 배아 마우스 심장 밸브 지역에서 단백질 분리
2014년 9월 23일
어린 배아 마우스 판막의 단백질 발현 분석은 이용 가능한 조직의 한계로 인해 방해를 받았습니다. 이 원고는 웨스턴 블롯 분석을 위해 발달 중인 배아 마우스 판막 영역에서 단백질을 준비하기 위한 프로토콜을 제공합니다.
이 절차의 전반적인 목표는 배아 심장 판막에서 단백질을 분리하고 추출하는 것입니다. 이것은 먼저 임신한 쥐에서 배아를 분리함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계에서는 배아에서 심장을 절개한 다음 마지막 단계에서 심장 판막을 수집합니다.
조직을 용해시키고 생성된 단백질 샘플을 후속 분석을 위해 준비합니다. 궁극적으로 웨스턴 BLO 분석은 단백질 발현 수준을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 이 방법의 시각적 시연은 발달 중인 심장의 작고 조밀한 모양 때문에 해부 단계를 배우기 어렵기 때문에 매우 중요합니다.
원하는 배아 발달 당일에 70% 에탄올을 사용하여 임산부의 복부를 살균합니다. 그런 다음 하복부의 피부와 근육을 들어 올려 내부 장기에서 멀리 떨어뜨리고 하복부를 절개하여 자궁 뿔에 접근할 수 있도록 합니다. 다음으로 집게로 자궁 경부를 잡고 끝까지 조심스럽게 자릅니다.
그런 다음 자궁 뿔을 들어 올려 뿔을 제자리에 유지하는 결합 조직을 절단하고 자궁 뿔과 요실의 접합부를 절단하여 제거를 완료합니다. 절개된 자궁 뿔을 차가운 0.1 어금니 트리스 완충액이 들어 있는 페트리 접시에 넣고 필요에 따라 헹굽니다. 그런 다음 자궁 뿔을 자릅니다.
배아 자루가 드러나도록 세로로 벌립니다. 배아를 노출시키려면, 태반과 배아의 접합부에 있는 배아 자루를 절단하고, 배꼽 혈관을 잘라 배아를 빼낸다. 절개된 배아를 차가운 0.1 어금니 트리스 완충액이 있는 두 번째 페트리 접시에 넣고, 해부되지 않은 나머지 배아와 함께 첫 번째 페트리 접시를 다음 배아 해부까지 얼음에 되돌려 놓습니다.
참수 후 배아를 등에 눕히고 흉벽을 흉곽 측면을 따라 절뚝거리기 위해 수직으로 절단하고 횡격막 위로 수평으로 자릅니다. 심장을 시각화하려면 흉벽을 엽니다. 그런 다음 집게를 큰 혈관을 따라 높이 들고 심장을 들어 올리고 아래의 혈관을 잘라냅니다.
다음으로, 집게 위를 잘라 심장을 빼냅니다. 폐혈관이 절단되지 않은 상태로 남아 있는 경우, 본원에 기술된 배아 단계에서 계속하기 전에 심장과 함께 폐를 제거하고, 폐동맥은 약간 불투명합니다. 동맥을 확인한 후 판막 수준 이상으로 절개하여 제거하십시오.
이제 ECD 심실 심근을 피하고 폐 판막 바로 아래를 자르고 관심 영역에서 과도한 트리스 버퍼를 제거합니다. 폐동맥과 같이 2마이크로리터의 용해 완충액이 들어 있는 einor 튜브에 판막을 삽입하기 전에 대동맥이 약간 불투명하게 보일 것입니다. 식별 후 대동맥 판막 바로 아래를 절단합니다.
다시 말하지만, 섬유주화된 심실 심근을 피해야 합니다. 여분의 삼중 용액을 제거한 다음 밸브를 용해, 완충액 및 폐동맥 조직이 포함된 einor 튜브로 옮깁니다. 모든 조직을 채취한 후 즉시 샘플을 섭씨 영하 80도까지 놓습니다.
단백질 적출을 위해 사용하고, 얼음에 모은 조직을 녹이고, 그 후에 13, 4 섭씨 온도에 100 Gs에 1 분 동안 표본을 펠릿으로 만듭니다. 결과 샘플의 부피를 확인하고 용해 버퍼를 사용하여 총 부피를 최대 40마이크로리터까지 가져옵니다. 그런 다음 5mm 스테인리스강 비드를 추가하여 제조업체의 지침에 따라 50Hz에서 2-4분 동안 lyr의 샘플을 파괴하고 균질화합니다.
균질화 후 튜브를 잠시 회전시키고 샘플을 새 튜브로 옮겨 추가 실험 분석을 위해 불용성 파편을 남깁니다. 이 제제 기술을 사용하여 E 13.5 배아의 단일 대동맥 판막 영역에서 인산화된 smad 1 5 8을 검출할 수 있습니다. 예를 들어, 단일 판막 영역에서 분리된 단백질만으로도 풀링된 판막 영역의 수에 비례하여 신호 강도가 증가하는 희미한 p smad 대역을 감지하기에 충분합니다.
중요한 것은 p smad 베타 액틴 비율이 사용 가능한 단백질 수준이 낮기 때문에 다양한 샘플 크기에서 명확하게 일정하게 유지되며, 동일한 블롯을 벗겨내고 총 smad에 대해 다시 프로브할 수 없다는 것입니다. 그러나 total smad one과 beta actin을 보여주는 별도의 블롯은 동일한 발현 패턴을 나타냅니다. 이러한 판막 영역에는 우심실의 샘플인 심실 심근 마커와 함께 이 준비 기술을 사용하여 심실 심근을 오염시키는 것이 거의 전혀 없으며, NP는 대동맥 판막 영역에서 검출되지 않는 반면, 이 마커는 심실에서 쉽게 검출됩니다.
또한, 심실 심근 마커인 미오신 경쇄 2 V도 심실 샘플에서 쉽게 검출할 수 있지만 대동맥 판막 영역에서는 거의 검출되지 않아 이 박리의 정확성을 강조합니다. QPCR 또는 RN AIC와 같은 다른 mes는 다른 발달 단계에서 어떤 다운스트림 유전자가 영향을 받는지와 같은 추가 질문에 답하기 위해 수행할 수 있습니다.
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개요
이 기사는 생쥐의 배아 심장 판막에서 단백질을 분리하고 추출하는 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 제한된 조직 가용성으로 인한 단백질 발현 분석의 어려움에 대응합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 발달 생물학
- 심혈관 연구
배경
- 배아 조직에서의 단백질 발현 분석은 종종 샘플 크기에 의해 제한됩니다.
- 심장 판막에서의 단백질 수준을 이해하는 것은 발달 연구에 매우 중요합니다.
- 웨스턴 블롯 분석은 단백질 발현을 평가하는 일반적인 기술입니다.
- 배아 심장과 같은 작은 조직의 해부는 기술적으로 어려울 수 있습니다.
연구 목적
- 배아 생쥐 심장 판막에서 단백질 추출에 대한 상세한 프로토콜을 제공합니다.
- 단백질 발현 수준 연구를 위한 웨스턴 블롯 분석을 용이하게 합니다.
- 제한된 샘플에서의 단백질 분석의 재현성과 정확성을 향상시킵니다.
사용된 방법
- 임신한 생쥐에서 배아를 분리합니다.
- 배아에서 심장을 해부합니다.
- 단백질 추출을 위한 심장 판막을 수집합니다.
- 분석을 위한 단백질 샘플을 준비하기 위해 조직을 용해합니다.
주요 결과
- 배아 심장 판막에서의 단백질 추출에 성공했습니다.
- 웨스턴 블롯 분석에 적합한 샘플을 준비했습니다.
- 효과적인 학습을 위한 해부 기술을 시연했습니다.
- 발달 중인 심장 조직에서의 단백질 발현 수준을 평가했습니다.
결론
- 이 프로토콜은 배아 심장 판막에서의 단백질 발현 연구를 효과적으로 가능하게 합니다.
- 해부 기술을 마스터하는 데 시각적 보조가 필수적입니다.
- 이 방법은 심장 발달 및 관련 분야의 연구를 발전시킬 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Protein isolation from limited embryonic tissue enables detection of signaling pathway activation in early developmental models. This approach supports target validation by providing semi-quantitative data on phosphorylated proteins from pooled microdissected valve regions. The method addresses a key bottleneck in preclinical research where sample scarcity hinders mechanistic de-risking of cardiovascular targets.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses in cardiac valve development through detection of phosphorylated signaling proteins like pSmad1/5/8.
- Operational Value: Provides a reproducible workflow for protein extraction from four E13.5 mouse aortic valve regions, each yielding ~1 µg protein.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by allowing semi-quantitative assessment of pathway activation in disease-relevant embryonic systems.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological samples for downstream western blot analysis, enabling reliable compound evaluation in phenotypic screening.
- Operational Value: Standardizes lysis and homogenization protocols using Tris-based buffer with protease inhibitors and SDS-sample buffer for denaturation.
- Scalability: Enables platform reuse across developmental timepoints by pooling tissue to overcome low protein yield limitations.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase protein expression data to preclinical validation through consistent pSmad/β-actin ratios across sample sizes.
- Mechanistic De-risking: Reduces ambiguity in target engagement by confirming ventricular myocardium exclusion via absence of MYL2V and ANP markers in valve regions.
- Predictive Confidence: Enables risk-adjusted advancement decisions by linking protein expression patterns to developmental stages using internal controls.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification by providing mechanistic readouts from disease-relevant embryonic systems.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through detection of phosphorylated signaling proteins in valve tissue.
- Screening: Delivers assay-ready samples with standardized protein extraction, enabling reproducible western blot outputs for compound screening.
- Analytics: Generates quantitative dependent variable measurements via chemiluminescent signal intensity proportional to protein pool size, supporting comparative condition analysis.
- Translational Research: Maintains continuity from embryonic discovery to preclinical models by preserving pathway-specific expression patterns detectable in separate blots for total Smad and β-actin.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable capability for protein isolation across embryonic cardiovascular studies, reducing redundant protocol development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by enabling detection of low-abundance phosphorylated proteins from microdissected tissues.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through defined lysis volumes, bead-based homogenization, and consistent sample preparation for western blot.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in early cardiovascular target assessment.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization by providing semi-quantitative pathway activation data from embryonic valve regions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microdissection of embryonic cardiac structures to isolate valve regions without ventricular myocardium contamination.
- Dependent on instrumentation for homogenization (lyser with stainless steel beads) and centrifugation at 13,100 × g for sample clarification.
- Necessitates cross-team standardization of lysis buffer volumes (40 µL final volume) and protease inhibitor use to ensure sample consistency.
- Involves adaptation considerations when applying the protocol to other embryonic tissues or developmental stages beyond E13.5 aortic valve regions.
- Includes practical limitations such as inability to quantify total protein via spectrophotometry due to low yield, requiring reliance on semi-quantitative western blot analysis.
