인간 승모판에서 단백질 추출을위한 최적화 된 프로토콜

이 절차의 전반적인 목표는 단백질 분석에 적합한 인간 심장 승모판막에서 단백질을 효율적으로 추출하는 것입니다. 이 방법은 잠재적으로 심장 판막 질환 분야에서 병원성 메커니즘을 밝히는 데 도움이 될 수 있으며, 새로운 진단 및 예후 질환 마커를 식별하고 치료 표적을 식별할 수 있습니다. 이 프로토콜의 주요 장점은 많은 분석 응용 분야와 호환되는 효율적인 추출 워크플로우를 제공한다는 것입니다.

그 결과 심장 승모판 단백질체의 특성을 보다 철저하게 파악할 수 있었습니다. 또한 이 프로토콜은 인간 판막과 매우 유사하고 판막 기능 평가를 위한 실험 모델에 사용되는 돼지 승모판막과 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 실험 절차를 시연하는 것은 제 연구실의 기술자인 Stefania Ghilardi가 맡을 것입니다.

인간 승모판막을 준비하려면 4시간에서 12시간 동안 냉간 허혈 상태에서 이식한 심장부터 시작합니다. 클린룸에서 운송 가방에서 심장을 꺼내 멸균된 양동이에 넣습니다. 다음으로, 심장을 생물 안전 캐비닛으로 옮깁니다.

거기서 일회용 메스를 사용하여 정점에서 약 4cm 떨어진 좌심실 및 우심실 수준의 장축에 수직으로 자릅니다. 그런 다음 심장을 멸균 된 커튼에 놓습니다. 그런 다음 상행 대동맥과 폐동맥을 옆으로 이동하여 좌심방천장에 접근합니다.

좌측 심방지붕에서 집게와 곡괭이를 사용하여 좌측 귓바퀴 주위를 잘라 승모판막을 노출시킵니다. 승모판막은 좌심실에 완전히 포함되어 있습니다. 따라서 큰 승모판 책자와 작은 승모판 책자를 노출시키십시오.

전외측(anteerolateral and posteromedial)은 전방(anterior)과 후방(posterior area)의 경계선을 정의한다. 이제 가위와 외상이 없는 겸자로 승모판막을 둘러싸고 있는 좌심방과 심실 벽 두께를 절개합니다. 이 박리 중에 승모판 대동맥 판막의 연속성을 확인합니다.

다음으로, 후방 첨판과 경계를 이루는 commissures를 따라 절단하여 전방 승모판 첨판과 후방 승모판 첨판을 분리합니다. 절차가 완료되면 70% 이소프로필 알코올 용액과 6% 과산화수소 용액으로 캐비닛 테이블을 소독합니다. 이제 승모판막의 후엽을 식염수로 세척합니다.

그런 다음 밸브를 각각 평방 센티미터 미만의 작은 조각으로 자릅니다. 조각을 알루미늄 호일로 개별적으로 싸서 액체 질소로 얼립니다. 단백질 추출을 시작하려면 집게를 사용하여 액체 질소에서 샘플을 제거하고 즉시 드라이아이스에 놓습니다.

샘플을 해동시키지 마십시오. 다음으로, 액체 질소로 채워진 듀어 플라스크에 모르타르, 관련 절굿공이 및 샘플을 놓습니다. 액체 질소를 사용하여 샘플을 동결하고 분쇄기 시스템을 냉각시키는 것이 중요합니다.

이 단계는 생물학적 분해를 방지하고 효율적인 분말화를 가능하게 하지만 안전한 취급을 위해서는 기술 교육이 필요합니다. 급속 냉동되면 절구와 절굿공이를 드라이아이스가 들어 있는 폴리스티렌 상자에 넣습니다. 또한 드라이아이스 위에 주걱을 놓습니다.

다음으로, 호일에서 샘플을 제거하고 모르타르에 넣습니다. 그리고 그 위에 더 큰 유봉을 놓습니다. 드라이버를 사용하여 유봉을 회전시키고 샘플을 15-20회 분쇄합니다.

분쇄하는 동안 샘플을 식힌 주걱 끝과 혼합합니다. 큰 유봉을 사용한 후에는 더 작은 유봉으로 분쇄 과정을 반복하십시오. 미세한 분말을 얻는 것은 효율적인 단백질 추출에 매우 중요합니다.

이제 분말 샘플을 알려진 질량의 15밀리리터 원심분리기 튜브에 버립니다. 그런 다음 차가운 주걱을 사용하여 모르타르에 남아 있는 재료를 솔질합니다. 샘플이 든 튜브를 드라이아이스에 보관하고 샘플의 질량을 빠르게 측정합니다.

다음으로, 샘플을 유리 균질화 튜브에 덤프합니다. 그런 다음 샘플 10mg당 200마이크로리터의 요소 완충액을 추가합니다. 이 과정에서 튜브에 남아 있는 잔류물을 요소 완충액 분취액으로 헹궈내어 회수합니다.

이제 1, 500rpm에서 작동하는 전동 PFTE 유봉을 사용하여 샘플을 균질화합니다. 유봉을 샘플에 10회 비틀면서 천천히 누릅니다. 다음으로, 유리 피펫을 사용하여 점성이 있는 노란색 상등액을 깨끗한 1.7ml 원심분리 튜브로 옮깁니다.

이제 절반의 요소를 사용하여 나머지 샘플에 대해 균질화를 반복합니다. 상층액을 회수하여 이전 컬렉션과 결합합니다. 그런 다음 튜브를 튜브 회전기에 30분 동안 놓습니다.

30 분 후에, 차가운 분리기로 관을 적재하고 13, 30분 동안 000 G에 표본을 아래로 돌린다. 그런 다음 상층액을 회수합니다. 그리고 Bradford 단백질 분석을 사용하여 단백질 농도를 측정합니다.

규정된 프로토콜을 수행한 후, 몇 가지 추가 처리 후 다양한 방법을 사용하여 단백질 추출물을 연구했습니다. 총 422개의 단백질이 2차원 전기영동, 액상 등전 집속, 액체 크로마토그래피-질량 분석법 및 2D 액체 크로마토그래피-질량 분석법을 통해 승모판 조직에서 확인되었습니다. 422개의 단백질은 유전자 온톨로지 분석을 사용하여 분류되었습니다.

세포 외 영역에는 몇 가지 예상되는 단백질과 기타 세포 내 및 세포 표면 단백질이 포함되어 있습니다. 그 중 다수는 승모판막에서 처음으로 확인되었습니다. 이전에 승모판막에서 확인되지 않았던 4개의 단백질의 존재는 3개의 고유한 샘플에서 항체로 확인되었습니다.

단백질은 Septin-11, Four and a half LIM domain protein 1, Dermatoponin 및 alpha crystalline B입니다.이 비디오를 시청한 후에는 심장 승모판막에서 단백질을 추출하여 식별하고 정량화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 일단 마스터하면 이 프로토콜은 적절하게 수행되면 거의 2시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 단백질 무결성이 높은 단백질의 최대 수율을 얻으려면 이식 중에 샘플이 해동되지 않는 것이 중요합니다.