인간 승모판에서 단백질 추출을위한 최적화 된 프로토콜

이 절차의 전반적인 목표는 단백질체 분석에 적합하도록 인간 심장의 이첨판에서 단백질을 효율적으로 추출하는 것입니다. 이 방법은 심장 판막 질환 분야에서 병원성 기전을 밝히는 데 잠재적으로 기여할 수 있으며, 새로운 진단 및 예후 질환 마커와 더불어 치료 표적을 식별할 수 있게 합니다. 이 프로토콜의 주요 장점은 다양한 분석 응용 분야와 호환되는 효율적인 추출 워크플로우를 제공한다는 점입니다.

그 결과로 심장 이첨판 프로테옴에 대한 더욱 포괄적인 특성 분석이 가능해졌습니다. 또한, 이 프로토콜은 인간의 판막과 매우 유사하여 판막 기능 평가를 위한 실험 모델로 사용되는 돼지 이첨판과 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다. 실험 절차의 시연은 저희 연구실의 테크니션인 Stefania Ghilardi가 진행하겠습니다.

인간 승모판막을 준비하려면, 4~12시간 동안 냉허혈 상태에 있었던 적출 심장에서 시작하십시오. 클린룸에서 운반 백으로부터 심장을 꺼내 멸균된 버킷에 넣습니다. 그다음, 심장을 생물안전작업대(biosafety cabinet)로 옮깁니다.

그곳에서 일회용 메스를 사용하여, 심첨부로부터 약 4cm 떨어진 좌우 심실 높이에서 장축에 수직으로 절단하십시오. 그런 다음 심장을 멸균 드레이프 위에 놓으십시오. 이어서 좌심방 천장을 노출시키기 위해 상행 대동맥과 폐동맥을 옆으로 밀어내십시오.

좌심방 천장에서 포셉과 픽을 사용하여 좌심이 주변을 절개해 승모판을 노출시킵니다. 승모판은 완전히 좌심실 내에 포함되어 있습니다. 따라서 대승모판엽과 소승모판엽을 노출시킵니다.

전외측 및 후내측 교합은 전방 및 후방 영역의 경계를 정의합니다. 이제 가위와 비외상성 포셉을 사용하여 좌심방과 승모판을 둘러싸고 있는 심실벽 두께를 박리하십시오. 이 박리 과정 중에 승모판-대동맥판 연속성을 확인하십시오.

다음으로, 후엽을 둘러싸고 있는 교합선을 따라 절개하여 승모판 전엽을 후엽으로부터 분리합니다. 절차가 완료되면, 70% isopropyl alcohol 용액과 6% hydrogen peroxide 용액으로 캐비닛의 테이블을 소독합니다. 이제 승모판 후엽을 식염수로 세척합니다.

그런 다음, 판막을 1cm² 미만의 작은 조각들로 자릅니다. 각 조각을 알루미늄 호일로 개별 포장한 후, 액체 질소로 급속 냉동합니다. 단백질 추출을 시작하려면, 핀셋을 사용하여 액체 질소에서 샘플을 꺼내 즉시 드라이아이스 위에 올립니다.

시료가 녹지 않도록 주의하십시오. 다음으로, 액체 질소가 채워진 듀어 플라스크에 막자사발, 해당 막자, 그리고 시료를 넣습니다. 시료를 동결시키고 분쇄 시스템을 냉각하기 위해 액체 질소를 사용하는 것이 매우 중요합니다.

이 단계는 생물학적 분해를 방지하고 효율적인 분쇄를 가능하게 하지만, 안전한 취급을 위해 기술적 교육이 필요합니다. 급속 냉동시킨 후, 막자와 유발을 드라이아이스가 들어 있는 폴리스티렌 박스에 넣으십시오. 또한, 스패튤라를 드라이아이스 위에 올려 두십시오.

다음으로, 호일에서 샘플을 꺼내 막자사발에 넣습니다. 그리고 그 위에 더 큰 유발을 위치시킵니다. 드라이버를 사용하여 유발을 회전시키며 샘플을 15~20회 갈아줍니다.

분쇄하는 동안 차갑게 식힌 스패튤라 끝으로 샘플을 섞어줍니다. 큰 절구공이를 사용한 후, 더 작은 절구공이로 분쇄 과정을 반복합니다. 미세한 분말을 얻는 것이 효율적인 단백질 추출을 위해 매우 중요합니다.

이제 분말 시료를 질량을 알고 있는 15 millileter 원심분리 튜브에 넣습니다. 그다음 콜드 스파출라를 사용하여 남아 있는 물질을 막자사발에서 긁어 모아 넣습니다. 시료가 담긴 튜브를 드라이아이스 위에 두고 빠르게 시료의 질량을 측정합니다.

다음으로, 샘플을 유리 균질기 튜브에 넣습니다. 그 다음, 샘플 10 mg당 200 µL의 요소 완충액을 추가합니다. 이때, 요소 완충액 분주액으로 튜브 내부에 남은 잔류물을 헹구어 회수하십시오.

이제 1,500 rpm으로 작동하는 전동 PTFE 페스틀을 사용하여 샘플을 균질화합니다. 페스틀을 샘플 위로 천천히 누르며 회전시키는 동작을 10회 반복합니다. 다음으로, 유리 피펫을 사용하여 점성이 있는 노란색 상층액을 깨끗한 1.7 milliliter 원심분리 튜브로 옮깁니다.

이제 urea의 양을 절반으로 줄여 남은 샘플에 대해 균질화를 반복합니다. 상층액을 회수하여 이전 수집분과 합칩니다. 그 다음, 튜브를 튜브 회전기에 놓고 30분 동안 회전시킵니다.

30분 후, 튜브를 냉장 원심분리기에 넣고 13,000 G에서 30분 동안 원심분리합니다. 그 다음, 상층액을 회수합니다. 그리고 Bradford 단백질 정량법을 사용하여 단백질 농도를 측정합니다.

규정된 프로토콜을 수행한 후, 몇 가지 추가 처리를 거쳐 다양한 방법으로 단백질 추출물을 분석하였습니다. 2차원 전기영동, 액상 등전점 전기영동, 액체 크로마토그래피-질량 분석 및 2D 액체 크로마토그래피-질량 분석을 통해 승모판 조직에서 총 422개의 단백질을 확인하였습니다. 이 422개의 단백질은 유전자 온톨로지(Gene Ontology) 분석을 통해 분류되었습니다.

세포 외 영역에는 예상되었던 여러 단백질과 기타 세포 내 및 세포 표면 단백질이 포함되어 있었습니다. 이 중 상당수는 승모판에서 처음으로 확인되었습니다. 이전까지 승모판에서 확인되지 않았던 4가지 단백질의 존재가 3개의 고유 샘플에서 항체 분석을 통해 확인되었습니다.

대상 단백질은 Septin-11, Four and a half LIM domains protein one, Dermatoponin 및 alpha crystalline B입니다. 이 영상을 시청한 후, 단백질의 확인 및 정량을 위해 심장 이첨판에서 단백질을 추출하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 숙련될 경우, 적절히 수행한다면 이 프로토콜은 거의 2시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때 높은 단백질 무결성을 유지하며 최대한의 단백질 수득률을 얻으려면, 모든 전송 과정 동안 샘플이 해동되지 않도록 하는 것이 매우 중요합니다.