Name: 인간 승모판에서 단백질 추출을위한 최적화 된 프로토콜 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: 배우세요 인간 심장 승모판에서 단백질을 효율적으로 추출하는 방법을. 이 프로토콜은 프로테오믹스 분석을 통해 판막 질환의 병원성 메커니즘을 밝히고 새로운 진단 및 치료 표적을 식별하는 데 활용됩니다.

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이탈리아 보건부는이 연구를 지원했습니다 (RC 2013-BIO 15). 그녀는 훌륭한 기술 지원을 해주신 Barbara Micheli에게 감사드립니다.

이 프로토콜에서는 정상적인 심 초음파 검사의 매개 변수에도 불구하고 기술적 또는 기능적 이유로 기관 이식에서 제외 된 다기관 기증자로부터의 다기관 외과 (4 ~ 12 시간의 냉증 허혈 시간, 평균 6 ± 2 시간) 동안 인간의 심장을 수집합니다. 그들은 대동맥 및 폐동맥 판막의 은행 업무를 위해 Monzino Cardiologic Centre (Milan, Italy) 밀라노 심장 혈관 조직 은행으로 보내집니다. 승모판 후엽은 임상 목적으로 사용되지 않으므로 기증자의 친척으로부터 정보에 입각 한 동의를 얻은 후 대동맥 및 폐동맥 판막 분리시 수집됩니다. 이식 및 연구를위한 조직은 부모의 동의가 있어야 수집됩니다. 동의서에서 그들은 윤리적위원회의 지침에 따라 인간의 임상 적 사용 ( 즉, 미생물 학적, 기능적 및 혈청 학적 문제)에 적합하지 않은 경우에만 연구를위한 심장 조직의 사용을 허가합니다 (또는 사용하지 않음).몬 지노 심장 센터. 1. 승모판 준비 <ol><li> 장기 explantation (4 ~ 12 시간의 냉증 허혈 시간) 후 최대한 빨리 인간 승모판을 수확. </li><li> 클린 룸에서 차가운 (4 ° C) 용액 ( 즉, 염분 용액 또는 균형 잡힌 Eurocollins 또는 위스콘신)이 담긴 운반 백에서 심장을 제거합니다. 버킷에 넣고 밸브 준비를 위해 바이오 안전성 캐비닛 (biohazard vertical air flow, 클래스 A, GMP (Good Manufacturing Practices) 분류)에 넣으십시오. </li><li> 캐비닛에 멸균 일회용 드레이프에 심장을 놓습니다. 멸균 일회용 메스를 사용하여 정점에서 약 4cm 떨어진 좌우 심실의 레벨에서 심장을 주축에 수직으로 완전히 자릅니다. </li><li> 왼쪽 가슴 지붕을 표시하는 오름차순 대동맥과 폐동맥을 이동하십시오. </li><li> 멸균 된 오토 클레이브 가능한 포셉과 피크를 사용하여좌측 심방 루프는 승모판이 보이도록 만들고 위대한 승모 전단 (전방)과 작은 승모 전단 (후방)을 식별 할 수 있도록합니다. 참고 : 전 측방 및 후방 측방 판막은 전방 판막과 후방 경계의 경계를 정의합니다. </li><li> 무균 autoclavable 가위와 비 외상성 집게를 사용하여, 전체 승모판 주위의 좌심방과 심실 벽 두께를 해부 . </li><li> mitro-aortic valve continuity를 확인하십시오. 참고 : 좌심실에는 전체 승모판과 코드가 포함되어 있습니다. </li><li> 후부 승모판 판 전단에서 앞쪽 승모판 전단지를 분리하고, 심실 (삽입)과 함께 삽입을 따라 후부 전단지를 절단. </li><li> 생리 식염수에서 후방 전단지를 씻으십시오. 전단지를 작은 조각 (&lt;1cm 2 )으로 자른 다음 개별적으로 알루미늄 호일로 포장하십시오. 액화 질소로 그들을 고정하십시오. 주의 : 액체 질소를 사용할 때는 조직의 안전 절차를 따르십시오. <ol><li> 절차가 끝나면 70 % 이소 프로필 알콜 용액과 6 % 과산화수소 용액으로 캐비닛 테이블을 살균하십시오. </li></ol></li></ol> 2. 단백질 추출 <ol><li> 집게를 사용하여 액체 질소에 저장된 시료를 채취하고 즉시 알루미늄 호일에 싸서 드라이 아이스에 놓습니다. 시료를 옮길 때 시료를 녹이지 마십시오. </li><li> 분쇄하기 전에 분쇄기 시스템 ( 예 : CryoGrinder)의 도자기 / 지르코늄 모르타르와 유봉을 액체 질소가 들어있는 듀어 플라스크 (~ 500 mL)에 넣음으로써 시료와 함께 냉장하십시오. 주의 : 액체 질소를 사용할 때는 조직의 안전 절차를 따르십시오. </li><li> 박격포와 유봉을 드라이 아이스가 들어있는 폴리스티렌 상자에 넣으십시오. 알루미늄 호일에서 샘플을 꺼내어 박격포에 넣으십시오. </li><li> 갈아 입히기그는 유봉을 회전시키기 위해 스크루 드라이버를 사용하여 박격포에 대 한 큰 유봉을 샘플링한다. 연삭 과정 중에 샘플을 사전 냉각 된 주걱 끝과 섞는다. <ol><li> 작은 유봉으로 반복하십시오. </li></ol></li><li> 튜브를 뒤집어서 모르타르 위에 올려 놓고 시료를 튜브로 옮기려면 함께 뒤집어서 이전에 계량 한 튜브 ( 예 : 15 mL 원심 튜브)에 지상 샘플을 옮기십시오. 박격포에서 모든 재료를 회수하려면 사전 냉각 된 주걱을 사용하십시오. <ol><li> 샘플을 옮길 때 샘플이 녹지 않도록 샘플을 드라이 아이스에 보관하십시오. </li></ol></li><li> 샘플 순 중량을 계산하십시오. </li><li> 각 시료 다음에 박격포와 유봉을 깨끗이하고 고압 증기 멸균 또는 200 ° C에서 2 시간 가열하여 오염 제거하십시오. </li><li> 원심 분리기 튜브에서 분쇄 한 시료를 균질 기의 유리 튜브로 옮긴다. </li><li> 여과 된 요소 쇄석 추가유리 조직에 분말 조직 10mg 당 200uL의 우레아 완충액 (8M 우레아, 2M 티오 우레아, 4 % w / v CHAPS, 20mM 트리스 및 55mM 디티 오 트레이 톨)을 넣었다. 참고 : 원심 분리 관에 남아있는 잔유 가루 시료는 계산 된 부피의 우레아 완충액의 일부를 사용하여 회수 할 수 있습니다. </li><li> 붕규산 유리 몰탈과 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 (PTFE) 유봉이 장착 된 교반기를 사용하여 시료를 균질화하십시오. 비틀린 동작 (1,500 rpm)으로 샘플을 천천히 10 번 누르십시오. </li><li> 상층 액을 회수하고 깨끗한 1.7 mL 원심 분리 튜브로 옮긴다. 다시 신선한 우레아 완충액으로 나머지 시료를 추출하고 첫 번째 추출 중에 사용 된 부피의 절반을 더하십시오. </li><li> 2.10 단계를 반복하십시오. </li><li> 상등액을 회수하고 2.11 단계의 상등액과 합칩니다. 30 분 동안 튜브 rotator에 결합 된 뜨는을 놓으십시오. </li><li> 튜브를 13,000 xg 및 4 ° C에서 30 분간 원심 분리하십시오. </li><li> 상청액을제조자의 지시에 따라 Bradford 단백질 분석을 사용하여 단백질 농도를 측정한다. 샘플을 사용할 때까지 -80 ° C에 보관하십시오. </li></ol>

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이 프로토콜의 한 가지 중요한 단계는 액체 질소를 사용하여 시료를 동결시키고 그라인더 시스템을 냉각시키는 것입니다. 액체 질소를 사용하면 생물학적 분해를 방지하고 분말 파우더를 효율적으로 사용할 수 있지만 안전한 취급을위한 특수 교육이 필요합니다. 이 프로토콜에는 작은 시료를 표준 박격포와 유봉에서 복구하기가 어렵 기 때문에 시료 분쇄를위한 분쇄기 시스템이 있습니다. 이 경우 작은 샘플이 모르타르 표면에 미세한 분말로 퍼지기 때문에 수집이 어려워집니다. 또 다른 장점은 분쇄기가 모터 구동되어 재현성있는 방식으로 더 많은 샘플을 처리 할 수 ​​있고 피로를 추가하지 않아도된다는 것입니다. 분쇄기의 사용에 대한 하나의 한계는 박격포가 박격포에 효과적으로 눌려 지도록 작아야하는 시료 크기 (100mg 이하)입니다. 또한, 분쇄기 구성 요소는 세척을위한 사용 사이에서 실온으로 가온되어야합니다<html> 지. 결과적으로, 절차는 시간 소모적이며 많은 샘플이 매일 처리되는 경우 많은 세...

최근의 증거는 mRNA 합성 후 발생하는 많은 조절 기작의 역할에 대한 이해를 변화시켰다. 사실, 번역, post-transcriptional 및 proteolytic 프로세스는 단백질의 풍부와 기능을 조절할 수 있습니다. transcript level이 protein abundance의 주된 결정 인자라고 가정 할 때, mRNA 농도가 상응하는 단백질의 그것들에 대한 proxies라고 말하는 dogma는 부분적으로 수정되었다. transcript level은 단지 단백질의 양을 부분적으로 예측할 뿐이며, post-transcriptional events 세포 1 , 2 내의 단백질을 조절합니다. 또한, 단백질은 궁극적으로 세포의 기능을 지시하고 따라서 autocrine, paracrine 및 내분비 요인에 대한 응답으로 역동적 인 변화를 겪을 수있는 표현형을 지시합니다. 혈액 매개 매개체; 온도; 약물 치료; 질병이 생기다.ment. 따라서, 단백질 수준에 초점을 맞춘 표현 분석은 proteome을 특성화하고 질병 병인의 일부로 발생하는 중대한 변화를 밝혀내는 데 유용합니다 3 . 따라서 기존의 기술적 어려움에도 불구하고 건강과 질병 상태를 명확히하기 위해 프로테오믹스가 제시하는 기회는 엄청납니다. proteomics가 기여할 수있는 연구 분야 중 특히 유망한 분야 : 모든 수준 ( 즉, 전체 세포 또는 조직, 세포 내 구획 및 생물학적 유체)에서 단백질 발현의 변화 여부 확인; 질병의 진단 및 예후에 유용한 새로운 바이오 마커의 확인, 확인 및 확인; 약물 효과 및 독성 평가뿐만 아니라 치료 목적으로 사용될 수있는 새로운 단백질 표적의 확인 4 . 복잡성 포착프로테옴은 기술적 도전을 나타냅니다. 현재의 프로테오믹스 도구는 변경된 단백질 수준의 확인, 정량화 및 검증을 위해 대규모의 높은 처리량 분석을 수행 할 수있는 기회를 제공합니다. 또한, 가장 풍부한 단백질로 인한 간섭을 피하기위한 분획 화 및 농축 기술의 도입은 가장 풍부한 단백질을 포함시킴으로써 단백질 확인을 향상 시켰습니다. 마지막으로 proteomics는 단백질 기능의 중요한 조절 자로서 점차적으로 출현하는 번역 후 변형의 분석에 의해 보완되었다. 그러나 분석중인 생물 표본의 시료 준비 및 단백질 회수는 여전히 proteomic 워크 플로우의 제한 단계로 남아 있으며 가능한 함정 가능성을 높입니다. 사실, 최적화되어야하는 대부분의 분자 생물학 기술에서 첫 번째 단계는 조직 균질화이온 및 세포 용해, 특히 증폭 방법이 존재하지 않는 저농도 단백질의 분석에 유용합니다. 또한, 단백질의 화학적 특성은 자체 복구에 영향을 줄 수 있습니다. 예를 들어, 고도로 소수성 인 단백질의 분석은 isoelectric focusing 동안 쉽게 침전되기 때문에 매우 어렵습니다. 반면에 trans-membrane 단백질은 거의 용해되지 않습니다 (참고 문헌 5에서 검토). 또한, 조직 조성의 가변성은 보편적 인 추출 방법을 개발하는데 중요한 장벽이된다. 마지막으로, 거의 모든 임상 표본의 수량이 제한되어 있기 때문에 최소 샘플 양에서 최대 회수 및 재현성으로 단백질 준비를 할 수 있어야합니다. 이 작품은 proteomic 분석을위한 매우 도전 샘플을 나타내는 정상적인 인간의 심장 승모판에서 단백질 추출을위한 최적화 된 프로토콜을 설명합니다. 정상적인 승모판은좌심방과 심장 좌심실 사이에있는 렉스 구조 ( 그림 1 ). 심방에서 심실까지의 혈류를 조절하고 역류를 방지하며 전신에 적절한 수준의 산소 공급을 보장하여 적절한 심 박출량을 유지하는 데 중요한 역할을합니다. 그러나, 세포질이 적고 구성 요소가 거의없는 &quot;비활성&quot;조직으로 주로 간주됩니다 (주로 세포 외 기질에 있음). 이는 정상 상태에서 상주 판막 간질 세포 (VIC)가 낮은 단백질 생합성 률로 정지 상태를 나타 내기 때문입니다. 그러나 병리학 적 상태에서는 해면질 내의 VIC 수가 증가하고 단백질 합성이 다른 기능적 및 표현형 변화와 함께 활성화된다는 것이 입증되었습니다. 따라서, 최소한의 데이터를 사용할 수 있다는 것은 놀라운 일이 아닙니다.문헌은 병리학 승모판의 분석에 초점을 맞추고 있는데, 증가 된 수의 활성화 된 VIC가 확인 된 단백질의 상대적으로 많은 수를 설명 할 수있다. 결론적으로, 본 프로토콜은 승모판 막 단백질 성분의 연구를 통해 승모판 막 질환의 원인이되는 병원성 기전을 이해하는 데 도움이 될 수있다. 실제로, 근본적인 병리학 적 과정에 대한 더 깊은 이해는 혈류 역학적 인 고려 사항에 대한 현재의 적응증이있는 판막 질환의 임상 관리를 개선하는 데 도움이 될 수있다.

<table><tbody><tr><td>식염수 0.9</td><td></td><td></td><td>% NaCl</td></tr><tr><td>Eurocollins A</td><td>SALF</td><td>30874046</td><td>균형 장기의 수송 매체. 400mL의 유로콜린 A와 100mL의 유로콜린 B를 결합하여 균형 잡힌 배지인 유로콜린</td></tr><tr><td>유로콜린 B</td><td>SALF</td><td>30874022</td><td>균형 장기의 수송 매체를 얻습니다. 400mL의 Eurocollins A와 100mL Eurocollins B를 결합하여 균형 잡힌 배지 Eurocollins</td></tr><tr><td>Wisconsin</td><td>Bridge life</td><td>RM/N 4081</td><td>Balanced organ's transport medium</td></tr><tr><td>Biohazard vertical flow air</td><td>Burdinola</td><td></td><td>Class A GMP classification</td></tr><tr><td>Dewar Flask</td><td>Thermo Scientific</td><td>Nalgene 4150-1000</td><td></td></tr><tr><td>Cryogrinder system</td><td>OPS diagnostics</td><td>CG 08-01</td><td>모르타르, 유봉 및 스크루 드라이버가 포함 된 그라인더 시스템</td></tr><tr><td>스테인레스 스틸 집게</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>스테인레스 스틸 주걱</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>일회용 멸균 메스</td><td>Medisafe</td><td>MS-10</td><td></td></tr><tr><td>스테인레스 스틸 가위</td><td></td><td></td><td>오토 클레이브 가능</td></tr><tr><td>스테인레스 스틸 픽</td><td></td><td></td><td>오토 클레이브 가능</td></tr><tr><td>일회용 멸균 드레이프</td><td>Mon & Tex</td><td>3.307.08</td><td></td></tr><tr><td>이소프로필 알코올</td><td></td><td></td><td>70% 이소프로필 알코올</td></tr><tr><td>살균 용액 과산화</td><td></td><td></td>수소 <td>6% 과산화수소</td></tr><tr><td>마이크로피펫, 1mL, 팁</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>포함 15mL 원심분리기 튜브</td><td>VWR international</td><td>9278</td><td></td></tr><tr><td>1.7mL 원심분리기 튜브</td><td>VWR 국제</td><td>PIER90410</td><td></td></tr><tr><td>요소 버퍼</td><td></td><td></td><td>8 M 요소, 2 M 티오우레아, 4 % w/v CHAPS, 20 mM 트리즈마, 55 mM 디티오트레이톨</td></tr><tr><td>우레아 시</td><td>그마 알드리치</td><td>U6504-1KG</td><td>요소 버퍼</td></tr><tr><td>티오우레아</td><td>시그마 알드리치</td><td>T8656</td><td>요소 버퍼</td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>시그마 알드리치</td><td>C3023-5GR</td><td>요소 버퍼</td></tr><tr><td>에 사용Dithiotreitol</td><td>Sigma aldrich</td><td>D0632-5G</td><td>요소 버퍼</td></tr><tr><td>주사기에 사용 50 mL</td><td>PIC</td><td></td> 요소 버퍼 0.22 &micro<td>를 필터링하는 데 사용됩니다</td></tr><tr><td>. m 필터</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RB</td><td>요소 완충액</td></tr><tr><td>PFTE Pestle, 2mL</td><td>Kartell</td><td>6302</td><td>Potter-Elvehjem 균질화기</td></tr><tr><td>붕규산 유리 모르타르</td>의 일부 <td>Kartell</td><td>6102</td><td>Potter-Elvehjem 균질화기</td></tr><tr><td>교반기 VELP</td><td>scientifica</td><td>교반기 DLH</td><td>Potter-Elvehjem Bradford 단백질 분석에 의한 균질화에 사용</td></tr><tr><td></td><td>Bio-Rad 실험실</td><td>5000006</td><td></td></tr><tr><td>튜브 로테이터</td><td>Pbi International</td><td>F205</td><td></td></tr><tr><td>액체 질소</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>알루미늄 호일</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>아이스</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>폴리스티렌 상자</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>드라이 아이스</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>원심 분리기</td><td></td><td></td><td>13,000 x g 냉동고에서 1.7 mL 원심분리 튜브의 원심분리용</td></tr><tr><td>-80&deg; C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>정밀 균형</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>멸균 용 오토 클레이브</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>액체 질소</td><td></td><td></td><td></td>용 극저온</tr><tr><td>장갑</td><td></td><td></td><td></td></tr> 장갑 <tr><td>전문 강제 환기 및 자연 공기 대류 오븐</td><td></td><td></td><td>살균</td></tr><tr><td>프로테아제 억제제 칵테일</td><td>Sigma aldrich</td><td>P8340-5ML</td><td>100X 솔루션</td></tr><tr><td>ProteoExtract 단백질 침전 키트</td><td>Calbiochem</td><td>539180</td><td></td></tr><tr><td>RapiGest</td><td>Waters</td><td>186001861</td><td></td></tr><tr><td>Cytoscape</td><td>www.cytoscape.org</td><td>버전 2.7</td><td>유전자 온톨로지 분석을 위한 소프트웨어 플랫폼</td></tr><tr><td>BiNGO</td><td></td><td>http://apps.cytoscape.org/apps/bingo 버전 3.0.3</td><td>플러그인 유전자 온톨로지 분석용</td></tr><tr><td>AlphaB Crystallin/CRYAB 항체</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP1-97494</td> CryAB <td></td></tr><tr><td>Septin-11 항체</td>에 대한 마우스 단클론 항체 <td>Novus Biologicals</td><td>NBP1-83824</td><td>Septin-11</td></tr><tr><td>FHL1 항체</td>에 대한 토끼 다클론 항체 <td>Novus Biologicals</td><td>NBP-188745</td><td>FHL-1</td></tr><tr><td>Dermatopontin 항체</td>에 대한 토끼 다클론 항체<td>Novus Biologicals</td><td>NB110-68135</td><td>더마토폰틴에 대한 토끼 다클론 항체</td></tr><tr><td>염소 안티 마우스 IgG HRP</td><td>시그마 알드리치</td><td>A4416-0.5ML</td><td>면역 블로팅을 위한 2차 항체</td></tr><tr><td>염소 안티 토끼 IgG HRP</td><td>Bio-Rad 실험실</td><td>170-5046</td><td>면역 블로팅을 위한 2차 항체</td></tr></tbody></table>

인간 승모판에서 단백질 추출을위한 최적화 된 프로토콜

Optimized Protocol for the Extraction of Proteins from the Human Mitral Valve

세포 성 프로테옴의 분석은 복잡한 생물학적 시스템에 존재하는 단백질의 대규모 동정 및 정량화를 가능하게하는 기술의 개발로 인한 질병의 근원적 인 분자 기작을 밝히는데 도움이 될 수 있습니다. 단백질 학적 접근으로부터 얻은 지식은 잠재적으로 질병의 기초가되는 병원성 메커니즘에 대한 더 나은 이해, 새로운 진단 및 예후 질환 표지자의 확인 및 치료 목표의 희망을 가능하게한다. 그러나, 심장 승모판 막은 proteoglycan과 collagen-enriched extracellular matrix의 세포질이 낮기 때문에 proteomic analysis에서 매우 어려운 표본이됩니다. 이것은 전 지구적인 단백질 분석을 위해 단백질을 추출하는 것을 어렵게 만든다. 이 작품은 양적 proteomics 및 immunoblotting과 같은 후속 단백질 분석과 호환 프로토콜입니다. 이것은 데이터의 상관 관계를 허용 할 수있다.g 단백질 발현을 정량적 mRNA 발현 및 비 정량 면역 조직 화학적 분석에 대한 데이터로 비교 하였다. 사실, 이러한 접근법은 함께 수행 될 때 mRNA에서 번역 후 단백질 변형에 이르기까지 질병을 근본으로하는 분자 메커니즘에 대한보다 포괄적 인 이해로 이어질 것입니다. 따라서이 방법은 심장 판막 생리 병리학의 연구에 관심이있는 연구자들에게 적합 할 수있다.

요소 버퍼에서 단백질의 추출 및 용해는 등전두 초점 (2 차원 전기 영동 (2-DE) ) 및 액상 등전점 (IEF) 12 에 기반한 proteomic 방법과 직접 호환되며 Laemmli 버퍼 13 에서 희석 한 후 면역 블로 팅 프로 테아 제 억제제 칵테일을 함유하고있다. 겔이없는 질량 분석기 기반의 방법 ( 즉, 데이터 독립 질량 분광법 분석 (LC / MS E ) 및 2 차원 LC / MS E (2D-LC / MS E )에 결합 된 액체 크로마토 그래피 15 ) 기술 된 우레아 완충액에서, 우레아 및 티오 우레아를...

인간 승모판의 단백질 조성은 여전히 ​​부분적으로 알려지지 않았는데, 그 이유는 세포질이 낮아 단백질 생합성이 낮기 때문에 분석이 복잡하기 때문입니다. 이 연구는 승모판 프로테옴의 분석을 위해 단백질을 효율적으로 추출하기위한 프로토콜을 제공합니다.

Analysis of the cellular proteome can help to elucidate the molecular mechanisms underlying diseases due to the development of technologies that permit ...

이 절차의 전반적인 목표는 단백질체 분석에 적합하도록 인간 심장의 이첨판에서 단백질을 효율적으로 추출하는 것입니다. 이 방법은 심장 판막 질환 분야에서 병원성 기전을 밝히는 데 잠재적으로 기여할 수 있으며, 새로운 진단 및 예후 질환 마커와 더불어 치료 표적을 식별할 수 있게 합니다. 이 프로토콜의 주요 장점은 다양한 분석 응용 분야와 호환되는 효율적인 추출 워크플로우를 제공한다는 점입니다.그 결과로 심장 이첨판 프로테옴에 대한 더욱 포괄적인 특성 분석이 가능해졌습니다. 또한, 이 프로토콜은 인간의 판막과 매우 유사하여 판막 기능 평가를 위한 실험 모델로 사용되는 돼지 이첨판과 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다. 실험 절차의 시연은 저희 연구실의 테크니션인 Stefania Ghilardi가 진행하겠습니다.인간 승모판막을 준비하려면, 4~12시간 동안 냉허혈 상태에 있었던 적출 심장에서 시작하십시오. 클린룸에서 운반 백으로부터 심장을 꺼내 멸균된 버킷에 넣습니다. 그다음, 심장을 생물안전작업대(biosafety cabinet)로 옮깁니다.그곳에서 일회용 메스를 사용하여, 심첨부로부터 약 4cm 떨어진 좌우 심실 높이에서 장축에 수직으로 절단하십시오. 그런 다음 심장을 멸균 드레이프 위에 놓으십시오. 이어서 좌심방 천장을 노출시키기 위해 상행 대동맥과 폐동맥을 옆으로 밀어내십시오.좌심방 천장에서 포셉과 픽을 사용하여 좌심이 주변을 절개해 승모판을 노출시킵니다. 승모판은 완전히 좌심실 내에 포함되어 있습니다. 따라서 대승모판엽과 소승모판엽을 노출시킵니다.전외측 및 후내측 교합은 전방 및 후방 영역의 경계를 정의합니다. 이제 가위와 비외상성 포셉을 사용하여 좌심방과 승모판을 둘러싸고 있는 심실벽 두께를 박리하십시오. 이 박리 과정 중에 승모판-대동맥판 연속성을 확인하십시오.다음으로, 후엽을 둘러싸고 있는 교합선을 따라 절개하여 승모판 전엽을 후엽으로부터 분리합니다. 절차가 완료되면, 70% isopropyl alcohol 용액과 6% hydrogen peroxide 용액으로 캐비닛의 테이블을 소독합니다. 이제 승모판 후엽을 식염수로 세척합니다.그런 다음, 판막을 1cm² 미만의 작은 조각들로 자릅니다. 각 조각을 알루미늄 호일로 개별 포장한 후, 액체 질소로 급속 냉동합니다. 단백질 추출을 시작하려면, 핀셋을 사용하여 액체 질소에서 샘플을 꺼내 즉시 드라이아이스 위에 올립니다.시료가 녹지 않도록 주의하십시오. 다음으로, 액체 질소가 채워진 듀어 플라스크에 막자사발, 해당 막자, 그리고 시료를 넣습니다. 시료를 동결시키고 분쇄 시스템을 냉각하기 위해 액체 질소를 사용하는 것이 매우 중요합니다.이 단계는 생물학적 분해를 방지하고 효율적인 분쇄를 가능하게 하지만, 안전한 취급을 위해 기술적 교육이 필요합니다. 급속 냉동시킨 후, 막자와 유발을 드라이아이스가 들어 있는 폴리스티렌 박스에 넣으십시오. 또한, 스패튤라를 드라이아이스 위에 올려 두십시오.다음으로, 호일에서 샘플을 꺼내 막자사발에 넣습니다. 그리고 그 위에 더 큰 유발을 위치시킵니다. 드라이버를 사용하여 유발을 회전시키며 샘플을 15~20회 갈아줍니다.분쇄하는 동안 차갑게 식힌 스패튤라 끝으로 샘플을 섞어줍니다. 큰 절구공이를 사용한 후, 더 작은 절구공이로 분쇄 과정을 반복합니다. 미세한 분말을 얻는 것이 효율적인 단백질 추출을 위해 매우 중요합니다.이제 분말 시료를 질량을 알고 있는 15 millileter 원심분리 튜브에 넣습니다. 그다음 콜드 스파출라를 사용하여 남아 있는 물질을 막자사발에서 긁어 모아 넣습니다. 시료가 담긴 튜브를 드라이아이스 위에 두고 빠르게 시료의 질량을 측정합니다.다음으로, 샘플을 유리 균질기 튜브에 넣습니다. 그 다음, 샘플 10 mg당 200 µL의 요소 완충액을 추가합니다. 이때, 요소 완충액 분주액으로 튜브 내부에 남은 잔류물을 헹구어 회수하십시오.이제 1,500 rpm으로 작동하는 전동 PTFE 페스틀을 사용하여 샘플을 균질화합니다. 페스틀을 샘플 위로 천천히 누르며 회전시키는 동작을 10회 반복합니다. 다음으로, 유리 피펫을 사용하여 점성이 있는 노란색 상층액을 깨끗한 1.7 milliliter 원심분리 튜브로 옮깁니다.이제 urea의 양을 절반으로 줄여 남은 샘플에 대해 균질화를 반복합니다. 상층액을 회수하여 이전 수집분과 합칩니다. 그 다음, 튜브를 튜브 회전기에 놓고 30분 동안 회전시킵니다.30분 후, 튜브를 냉장 원심분리기에 넣고 13,000 G에서 30분 동안 원심분리합니다. 그 다음, 상층액을 회수합니다. 그리고 Bradford 단백질 정량법을 사용하여 단백질 농도를 측정합니다.규정된 프로토콜을 수행한 후, 몇 가지 추가 처리를 거쳐 다양한 방법으로 단백질 추출물을 분석하였습니다. 2차원 전기영동, 액상 등전점 전기영동, 액체 크로마토그래피-질량 분석 및 2D 액체 크로마토그래피-질량 분석을 통해 승모판 조직에서 총 422개의 단백질을 확인하였습니다. 이 422개의 단백질은 유전자 온톨로지(Gene Ontology) 분석을 통해 분류되었습니다.세포 외 영역에는 예상되었던 여러 단백질과 기타 세포 내 및 세포 표면 단백질이 포함되어 있었습니다. 이 중 상당수는 승모판에서 처음으로 확인되었습니다. 이전까지 승모판에서 확인되지 않았던 4가지 단백질의 존재가 3개의 고유 샘플에서 항체 분석을 통해 확인되었습니다.대상 단백질은 Septin-11, Four and a half LIM domains protein one, Dermatoponin 및 alpha crystalline B입니다. 이 영상을 시청한 후, 단백질의 확인 및 정량을 위해 심장 이첨판에서 단백질을 추출하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 숙련될 경우, 적절히 수행한다면 이 프로토콜은 거의 2시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때 높은 단백질 무결성을 유지하며 최대한의 단백질 수득률을 얻으려면, 모든 전송 과정 동안 샘플이 해동되지 않도록 하는 것이 매우 중요합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

어린 배아 마우스 판막의 단백질 발현 분석은 이용 가능한 조직의 한계로 인해 방해를 받았습니다. 이 원고는 웨스턴 블롯 분석을 위해 발달 중인 배아 마우스 판막 영역에서 단백질을 준비하기 위한 프로토콜을 제공합니다.

개발 배아 마우스 심장 밸브 지역에서 단백질 분리

우리는 LC-MS / MS 시스템을 사용 coregulatory 상호 작용 단백질의 정제 방법을 확립 하였다.

LC-MS / MS 분석을 이용하여 핵 공동 인자와 상호 작용 단백질의 높은 처리량 식별 단백질 제조 방법

여기, 우리는 Arabidopsis thaliana 엽초 엽 원형체에 적용된 상호 작용 캡처 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 생체 내 UV 가교 결합에 비판적으로 의존하며 생리 환경으로부터 식물 mRNA 결합 단백질의 분리 및 동정을 허용합니다.

식물 원형질에서 mRNA Interactome 캡처

미토 콘 드리 아 식물 세포의 단지 작은 백분율은, 그들은 연구의 범위에 대 한 정화 될 필요가 있다. 미토 콘 드리 아 균질, 매우 순화 된 미토 콘 드리 아 분수를 차동 및 밀도 그라데이션 원심 분리 뒤 다양 한 식물 기관에서에서 격리할 수 있습니다.

절연 및 호흡 측정의 미토 콘 드리 아 애기 thaliana 에서

미토 콘 드리 아 리보솜 그들의 세균 및 세포질에서 갈라 전문 있다. 여기 우리가 어떻게 mitoribosomes HEK 세포에서 그들의 기본 구획에서 얻어질 수 있다 보여줍니다. 방법은 정지 세포에서 미토 콘 드리 아의 절연 및 mitoribosomes의 결과 정화를 포함 한다.

HEK 세포에서 Mitoribosome의 신속한 격리

여기 선물이 polysome 끼얹는다 절연된 마우스 마음에 프로 파일링을 수행 하는 프로토콜. 우리 심장 관류, 프로 파일링, polysome polysome 분수 mRNAs, miRNAs, 및 polysome 프로테옴의 분석에 대 한 방법을 설명 합니다.

동적 Proteomic 그리고 미르 Langendorff 관류 후 절연 마우스 마음에서에서 Polysomes의 분석

이 프로토콜 자연 유기 물질과 다른 생태계에서 미생물 단백질의 완전 한 쌍 특성에 culminating 보완 분석 및 omics 기술에 대 한 단일 처리량을 설명 합니다. 이 이렇게 강력한 비교 대사 경로 및 변환을 설명 하는 온실 가스 생산 및 환경 변화에 대 한 응답을 예측에 대 한 중요 한 식별 수 있습니다.

복잡 한 자연 유기 물질 혼합물을 특성화에 대 한 단일 처리량 보완 고해상도 분석 기법

여기에서는 세제 및 Coomassie 청색에 대 한 노출을 최소화 하는 미토 콘 드리 아 슈퍼 복합체를 추출, 해결 및 식별 하는 프로토콜을 제시 합니다. 이 프로토콜은 분해능과 효소 활동의 보존 사이에 최적의 균형을 제공 하는 동시에 불안정 한 단백질-단백질 상호작용을 잃을 위험을 최소화 합니다.

미토 콘 드리 아 호흡기 사슬 슈퍼 복합체의 분리 및 분석을 위한 하이브리드 클리어/블루 천연 전기 영동

우리는 프로테옴 규모에서 단백질 발견 및 정량화와 호환되는 고품질 미토콘드리아 분리를 위한 2단계 프로토콜을 제시합니다. 우리의 프로토콜은 유전 공학을 필요로하지 않으므로 모든 일차 세포와 조직에서 미토콘드리아를 연구하는 데 적합합니다.

단백질 발견 및 정량 분석을 개선하기 위한 미토콘드리아의 2단계 태그 없는 분리

이 기사에서는 인간 플라즈마 유래 세포외 소포체(EV)의 분리, 특성화 및 정량화를 위한 방법론을 설명하고 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석법(LC-MS/MS)을 사용하여 EV 단백질체의 무표지 분석을 위한 워크플로우를 제시합니다.

심혈관 바이오마커 발견을 위한 혈장 유래 세포외 소포체의 분리, 특성화 및 단백질체 분석

미토콘드리아에 대한 생체 에너지 및 대사체 연구는 많은 질병에서 미토콘드리아의 다면적인 역할을 밝혀냈지만, 이러한 세포 소기관에 대한 분리 방법은 다양합니다. 여기에 자세히 설명된 방법은 여러 조직 소스에서 고품질 미토콘드리아를 정제할 수 있습니다. 품질은 호흡 조절 비율 및 고해상도 호흡 측정법으로 평가된 기타 지표에 의해 결정됩니다.

설치류 심장 조직으로부터 강력한 미토콘드리아 분리 

배우세요 인간 심장 승모판에서 단백질을 효율적으로 추출하는 방법을. 이 프로토콜은 프로테오믹스 분석을 통해 판막 질환의 병원성 메커니즘을 밝히고 새로운 진단 및 치료 표적을 식별하는 데 활용됩니다.

인간 승모판에서 단백질 추출을위한 최적화 된 프로토콜

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