배아 마우스 마음에 면역 형광을 이용하여 심근 개발 분석

이 실험 절차의 전반적인 목표는 발달 중인 마우스 배아 심장의 근섬유 및 심근세포 성숙도를 평가하는 것입니다. 이를 위해 먼저 절단 배지 내에서 배아 심장의 방향을 잡고 동결시킵니다. 그 다음, 적절한 방향으로 심장을 저온 절편 제작(cryosectioning)합니다.

그 후 심장 절편에 대해 관심 단백질의 면역형광 표지를 진행합니다. 마지막으로, 면역 염색된 심장 절편의 공초점 현미경 관찰을 수행합니다. 최종적으로, MyFi 및 기타 심근세포 구조의 발달을 보여주기 위해 2차원 및 3차원 이미지 분석이 사용됩니다.

이 방법은 돌연변이와 심장 유전자가 MyFi 조립 및 중간판(intercalated discs)과 같은 특정 구조의 형성에 어떠한 영향을 미치는지와 같이, 심장 발달 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 배아 심장을 급속 냉동하려면, 흄 후드 내에서 3.5cm 페트리 접시에 최적 절단 온도(optimal cutting temperature) 또는 OCT 배지를 채웁니다. 액체 질소에서 2-메틸부탄을 냉각합니다.

텍스트 프로토콜에 따라 마우스 배아 심장을 분리한 후, 심장을 OCT에 넣고 몇 초 동안 평형을 맞춘 다음 OCT가 들어 있는 7 mm 몰드로 옮깁니다. 심장의 내벽이 몰드 바닥을 향하도록 배치하십시오. 몰드를 액체 질소로 냉각된 2-메틸부탄에 조심스럽게 넣습니다.

OCT가 완전히 하얗게 굳을 때까지 2-methyl butane 액체가 OCT 또는 얼어붙은 심장에 닿지 않도록 주의합니다. 그 다음, 몰드를 드라이아이스가 들어 있는 얼음 바구니로 옮깁니다. 모든 심장이 얼면, cryo 몰드를 알루미늄 호일로 감싸고 cryosectioning 준비가 될 때까지 -80 °C에서 보관합니다.

배아 심장을 고정하려면 PBS에 희석된 4% PFA를 사용하여 12웰 포일 배양 플레이트의 각 웰을 채웁니다. 텍스트 프로토콜에 따라 배아 심장을 적출한 후, 각 심장을 PFA가 담긴 웰에 넣고 4°C에서 하룻밤 동안 고정합니다. 심장을 동결 보호하기 위해 플라스틱 전이 피펫을 사용하여 각 심장을 PBS에 희석된 15% Sucrose 1.5 mL가 들어 있는 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고, 심장이 튜브 바닥으로 가라앉을 때까지 4°C에서 부드럽게 흔들어 줍니다. 이후 각 심장을 PBS에 희석된 30% sucrose로 옮기고, 심장이 튜브 바닥으로 가라앉을 때까지 4°C에서 부드럽게 흔들어 줍니다.

이 비디오의 앞부분에서 보여준 대로 OCT에 배아를 동결합니다. 크라이오 몰드를 크라이오스탯 챔버에 넣고 영하 17 °C로 맞춘 후, 크라이오 몰드를 뒤집고 가벼운 압력을 가해 몰드에서 심장 블록을 밀어냅니다. 성형된 조직 블록의 상단에 심장의 전벽이 오도록 방향을 맞춥니다.

척(chuck) 위에 OCT를 크게 한 방울 떨어뜨리고, 심장 블록을 OCT 방울 위에 고정합니다. 이때 심장의 전벽이 척에서 가장 멀어지도록 방향을 유지하십시오. 심장이 척 위에 얼어붙을 때까지 기다립니다.

척과 심장 블록이 장착된 상태로 크라이오스탯(cryostat) 오브젝트 홀더에 올립니다. 블레이드의 각도가 시료 대비 3~5도가 되도록 조정합니다. 양전하 코팅으로 전처리된 현미경 슬라이드에 10 µm 두께의 절편을 수집합니다.

면역형광 염색을 위해 샘플을 -80 °C에서 보관하기 전 완전히 건조시키십시오. 절편에서 OCT를 고정하거나 제거한 후, PBS에 희석한 1x 블로킹 버퍼를 사용하여 부드럽게 흔들어 주며 45분 동안 블로킹합니다. 마우스에서 생성된 1차 항체를 사용하는 경우, PBS 0.1% tween 20에 1:100으로 희석한 donkey 또는 goat anti mouse IgG H plus L 단가 FAB 단편을 첨가하고 실온에서 부드럽게 흔들어 주며 45분 동안 배양하십시오.

1배 블로킹 버퍼에 희석한 1차 항체를 첨가하고, 실온에서 2시간 동안 또는 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 배양 후, 1배 XPBS를 사용하여 절편을 10분씩 3회 세척합니다. 실온에서 블로킹 버퍼에 1:500으로 희석한 접합 2차 항체를 시료에 첨가하고, 빛이 차단된 상태로 2시간 동안 배양합니다.

실온에서, 차광 상태로 XPBS를 사용하여 절편을 10분 동안 3회 세척합니다. 슬라이드의 양 끝에 마운팅 용액을 두 방울씩 떨어뜨려 항퇴색제(anti fade medium)로 마운팅하고 커버 슬립으로 덮습니다. 매니큐어를 사용하여 커버 슬립을 밀봉합니다.

이미징 준비가 될 때까지 4 °C에서 차광하여 보관하십시오. 4x 대물렌즈와 레이저 형광을 사용하여 샘플과 관심 영역을 찾습니다. 맵으로 사용할 이미지를 캡처하십시오.

고배율로 이미징할 때, 슬라이드 스테이지를 최소한으로 조정하며 슬라이드를 제거합니다. 그런 다음 60 x 오일 침수 렌즈로 교체합니다.

대물렌즈에 오일을 소량 떨어뜨리고 슬라이드를 다시 슬라이드 스테이지 위에 놓습니다. 그다음, 샘플을 다시 찾아 각 채널에 대해 원하는 수준으로 레이저 출력, 노출 시간 및 비닝(binning)을 설정합니다. 텍스트 프로토콜의 지침에 따라 최적의 설정값이 결정되면, 해당 샘플 설정을 실험 내의 모든 조직 절편에 동일하게 적용합니다.

강도 히스토그램을 사용하여 분석에 사용할 각 채널의 최적 강도 범위를 확인하십시오. 적절한 레이저 채널을 선택하여 획득 함수를 통해 Z-stack을 생성하십시오. 그런 다음 Z-stack의 상한 및 하한 범위를 설정하십시오.

소프트웨어에서 제공하는 광학 슬라이스 두께 값의 절반에 해당하는 Zack 스텝 크기를 선택하십시오. 실행(run)을 클릭하여 Fiji 또는 그에 준하는 이미지 분석 프로그램을 사용하여 이미지를 수집하십시오. 사용자 정의 색상 모드 옵션을 사용하여 Zack 파일을 열고, 각 채널을 별도의 창으로 분리하십시오.

이미지 풀다운 메뉴에서 밝기/대비 조정 도구를 열고, 각 채널 내에서 최적의 히스토그램 강도 범위를 설정하십시오. 이전에 결정한 대로, 분석 중인 모든 Zacks에 이 채널 범위들을 적용하십시오. 그다음 이미지 색상 풀다운 메뉴에서 개별 채널들을 하나의 합성 이미지로 병합하십시오.

Image Stacks Z 프로젝트 메뉴를 사용하여 합성 이미지로부터 평면화된 Z 스택(flattened Z stack)을 생성합니다. 이 이미지는 3D 이미지보다 훨씬 밝게 나타나므로, 과포화가 되지 않도록 대조군 샘플의 히스토그램 강도 범위를 조절하고 동일한 설정을 실험군 평면화 Z 스택에 적용합니다. 3D 이미지를 생성하려면 먼저 Image Stacks 3D 프로젝트 메뉴를 선택합니다. 회전축으로 X축 또는 Y축 중 하나를 선택합니다.

슬라이스 간격을 Z 스택 스텝 크기와 동일한 마이크론 수로 설정하십시오. 원하는 총 회전량을 선택하고 회전 각도 증분값을 1로 설정하십시오. 그런 다음 플러그인 풀다운 메뉴에서 ImageJ 3D 뷰어를 여십시오.

생성된 합성 이미지의 표시 형식을 volume으로 선택하고 리샘플링 계수를 1 또는 2로 설정하십시오. 이 수치들은 급속 동결 및 아세톤 고정된 심장에서 서로 다른 단백질의 공동 염색에 대한 전형적인 결과를 보여줍니다. S alpha actinin 항체는 Z disc와 interated disc를 높은 특이성과 최소한의 배경 신호로 재현성 있게 표지했습니다. 부착 연접 단백질 beta-catenin 항체는 심근세포와 비심근세포 모두의 막에 결합했으며, E 16.5의 추정 interated disc에서 SFA actinin과의 공국소화가 나타났습니다. 배아 심장에서의 beta one Integrin 면역형광 염색은 특히 까다롭지만, 본 연구의 beta one integrin 염색에서는 SFA Actinin이 표지한 Z disc와 동일한 주기성을 가진 신호가 나타났으며, 이는 E 16.5에서 형성되는 초기 costumers를 반영하는 것일 수 있습니다.

E 12.5 단계에서, SFA actinin 및 tropo myosin 염색 패턴은 외부 치밀층(compact zone)의 성숙한 근원섬유와 일치하는 소주심근세포(trabecular cardiomyocytes) 내의 규칙적인 주기성을 보여주었습니다. SFA actinin은 선형보다는 점상(punctate) 형태였으며, tropo myosin 신호는 선형보다는 확산된 형태였습니다. E 12.5 심장의 NCA 부착성 염색 및 소주심근세포는 강한 SFA actinin 염색 부위와 공국소화(co localized)되었으며, 이는 개재판(intercalated discs)을 나타내는 것으로 보입니다. 여기에는 life act RFP Ruby 형질전환 마우스의 PFA 고정 E 12.5 배아 심장에서 SFA actinin과 filamentous actin을 표지한 모습이 나와 있습니다. SFA actin의 신호 대 잡음비는 급속 냉동 심장 절편에 비해 감소하였습니다.

3차원 이미지 재구성을 통해 심근세포 내의 MyFi가 서로 대략 평행하게 배열되어 있음을 확인하였으나, 개별 심근세포들은 서로 다른 각도로 지향되어 있음을 알 수 있었습니다. 이 영상을 시청한 후, 귀하는 배아 심장의 적절한 방향 설정 및 동결 절편 제작 방법뿐만 아니라, 마우스 심장 발달 과정 중 MyFi 및 심근세포 성숙도를 평가하기 위한 면역 염색, 공초점 현미경 관찰 및 이미지 분석 수행 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다.