배아 마우스 마음에 면역 형광을 이용하여 심근 개발 분석

이 절차의 전반적인 목표는 발달 중인 배아 마우스 심장에서 근엽 및 심근세포 성숙을 평가하는 것입니다. 이것은 먼저 절단 매체에서 배아 심장의 방향을 잡고 동결함으로써 이루어집니다. 다음으로, 심장을 적절한 방향으로 동결 절편합니다.

그런 다음 심장 절편은 관심 단백질의 면역 형광 표지를 거칩니다. 마지막으로, 면역 염색 심장 절편에 대한 컨포칼 현미경 검사가 수행됩니다. 궁극적으로 2차원 및 3차원 이미지 분석을 사용하여 MyFi 및 기타 심근 세포 구조의 발달을 보여줍니다.

이 방법은 돌연변이 및 심장 유전자가 MyFi 조립에 미치는 영향, interated disc 및 costumers와 같은 특정 구조의 출현과 같은 심장 발달 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 배아 심장을 스냅, 동결하려면 최적의 절단 온도 또는 OCT 매체를 사용하여 화학 후드에 3.5cm 페트리 접시를 채웁니다. 시원하다. 액체 질소에 있는 2개의 메틸 부탄.

텍스트 프로토콜에 따라 마우스 배아 심장을 분리한 후, 심장을 OCT에 넣고 몇 초 동안 평형을 유지한 후 OCT가 들어 있는 7mm 주형으로 옮깁니다. 심장의 내벽을 주형의 바닥으로 향하게 합니다. 곰팡이를 액체 질소로 냉각된 두 개의 메틸 부탄에 부드럽게 놓습니다.

두 개의 메틸 부탄 액체가 OCT에 닿지 않도록 주의하거나 OCT가 흰색이 될 때까지 심장이 얼지 않도록 합니다. 그런 다음 드라이 아이스가 들어 있는 얼음 양동이에 금형을 옮깁니다. 모든 심장이 얼어붙은 후 극저온 주형을 호일로 싸서 냉동 절편이 준비될 때까지 섭씨 80도의 음의

배아 심장을 고정하려면 PBS에서 4%PFA를 사용하여 12개의 호일 배양 플레이트의 웰을 채웁니다. 텍스트 프로토콜에 따라 배아 심장을 해부한 후, 각 심장을 PFA 우물에 넣고 하룻밤 동안 섭씨 4도에서 고정합니다.플라스틱 이송 피펫을 사용하여 심장을 보호하기 위해 PBS에 1.5ml의 15% 설탕이 들어 있는 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브로 각 심장을 옮기고 심장이 튜브 바닥으로 가라앉을 때까지 섭씨 4도에서 부드럽게 교반합니다. PBS에서 각 심장을 30% 자당으로 옮기고 심장이 튜브 바닥으로 가라앉을 때까지 섭씨 4도에서 부드럽게 저어줍니다.

이 비디오의 앞부분에서 설명한 것처럼 OCT에서 배아를 동결합니다. 극저온 조절기 챔버에 극저온 조절기를 삽입하고 섭씨 영하 17도에 도달한 후 극저온 조절기를 뒤집고 부드러운 압력을 사용하여 금형에서 심장 블록을 배출합니다. 심장의 전벽을 성형 조직 블록의 상단으로 향하게 합니다.

척에 OCT를 크게 한 방울 떨어뜨리고 OCT 드롭에 심장 블록을 장착합니다. 심장의 전벽이 척에서 가장 멀리 오도록 방향을 유지합니다. 심장이 척에 얼어붙도록 하십시오.

척과 장착된 심장 블록을 저온 유지 장치 홀더에 로드합니다. 블레이드의 각도가 샘플에 대해 3도에서 5도가 되도록 조정합니다. 양전하를 띤 코팅으로 전처리된 현미경 슬라이드에 10마이크로미터 절편을 수집합니다.

면역 형광을 수행하기 위해 섭씨 영하 80도에서 보관하기 전에 샘플을 완전히 건조시킵니다. 절편에서 OCT를 고정 및/또는 제거한 후 PBS에 희석된 하나의 x 블로킹 버퍼를 사용하여 부드러운 흔들기로 45분 동안 차단합니다. mouse에서 생성된 1차 항체를 사용하는 경우, PBS 0.1%tween 20에 1:100으로 1:1 희석한 당나귀 또는 염소 anti mouse IgG H plus L monovalent FAB fragment를 첨가하고 실온에서 45분 동안 부드럽게 흔들어 배양합니다.

1차 항체 또는 1개의 x 차단 완충액에 희석된 항체를 추가하고 실온에서 2시간 또는 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양합니다. 배양 후 XPBS 1개를 사용하여 10분 동안 절편을 세 번 세척합니다. 실온에서 addor conjugated secondary antibody를 1-500으로 희석하여 샘플에 대한 완충액을 차단하고 2시간 동안 빛으로부터 보호하여 배양합니다.

실온에서 하나의 XPBS를 사용하여 빛으로부터 보호된 실온에서 10분 동안 섹션을 세 번 세척합니다. 슬라이드의 양쪽 끝에 두 방울의 매체를 떨어뜨려 페이드 방지 매체에 슬라이드를 장착하고 커버 슬립을 사용하여 덮습니다. 매니큐어를 사용하여 커버 슬립을 밀봉하십시오.

섭씨 4도에서 보관하고 이미지를 촬영할 준비가 될 때까지 빛으로부터 보호합니다. four x objective와 laser fluorescence를 사용하여 샘플과 관심 영역을 찾습니다. 지도로 사용할 이미지를 캡처합니다.

고배율로 촬영할 때. 슬라이드를 제거하여 슬라이드 스테이지를 최소한으로 조정합니다. 그런 다음 60x 오일 이멀젼 대물렌즈로 변경합니다.

대물렌즈에 작은 기름 한 방울을 놓고 슬라이드를 슬라이드 s로 교체합니다.tage. 그런 다음 샘플을 다시 찾아 레이저 출력 노출 시간과 비닝을 각 채널에 대해 원하는 수준으로 설정합니다. 텍스트 프로토콜의 지침에 따라 최적 설정이 결정되면 실험 내의 모든 조직 절편에 대한 샘플 설정을 사용합니다.

강도 히스토그램을 사용하여 분석에 사용될 각 채널의 최적 강도 범위를 기록하십시오. 적절한 레이저 채널을 선택하여 획득 기능을 사용하여 Zack을 생성합니다. 그런 다음 Z 스택의 상한과 하한을 선택합니다.

소프트웨어에서 제공하는 광학 슬라이스 두께 값의 절반인 Zack 스텝 크기를 선택합니다. 실행을 클릭하여 피지 또는 이미지 분석을 위한 유사한 프로그램을 사용하여 이미지를 수집합니다. 사용자 지정 색상 모드 옵션을 사용하여 Zack 파일을 열고 채널을 별도의 창으로 분할합니다.

이미지 풀다운 메뉴에서 밝기 대비 조정 도구를 열고 각 채널 내에서 최적의 히스토그램 강도 범위를 설정합니다. 이전에 결정한 대로 이러한 채널 범위를 분석 중인 모든 Zack에 적용합니다. 그런 다음 이미지 색상에서 풀다운 메뉴를 선택하고 개별 채널을 단일 복합 이미지로 병합합니다.

이미지 스택 Z 프로젝트 메뉴를 사용하여 합성 이미지에서 편평화된 Z 스택을 만듭니다. 이 이미지는 3D 이미지보다 훨씬 더 밝으므로 과포화를 방지하기 위해 컨트롤 샘플의 히스토그램 강도 범위를 조정하고 실험적인 평면화된 Zack에 동일한 설정을 적용합니다. 3D 이미지를 생성하려면 먼저 이미지 스택 3D 프로젝트 메뉴를 선택합니다. 회전의 X축 또는 Y축을 선택합니다.

슬라이스 간격을 Z 스택 스텝 크기와 동일한 미크론 수로 설정합니다. 원하는 총 회전을 선택하고 회전 각도 증분을 1로 설정합니다. 그런 다음 플러그인 풀다운 메뉴에서 이미지 J 3D 뷰어를 엽니다.

복합 이미지 생성 디스플레이를 볼륨으로 선택하고 리샘플링 계수를 1 또는 2로 설정합니다. 이 그림은 스냅 냉동, 아세톤 고정 심장, 재현성 있게 표지된 Z 디스크로 표시된 S 알파 액티닌에 대한 항체 및 높은 특이성과 최소한의 배경을 가진 삽입 디스크에서 서로 다른 단백질의 cos 염색에 대한 일반적인 결과를 보여줍니다. 부착 접합 단백질 베타 카테닌에 대한 항체는 심근 세포와 비 심근 세포 모두의 막에 결합하고 SFA 액티닌과의 공동 국소화가 E 16.5 베타 1 인테그린 면역 형광에서 추정되는 interated discs에서 발생 배아 심장에서 특히 도전적이지만, 이러한 연구에서 베타 one integrin 염색은 SFA Actinin 표지 Z 디스크와 동일한 주기성을 가진 신호를 밝혔습니다. 아마도 E 16.5에서 형성된 초기 의상을 반영하는 것일 수 있습니다.

E 12.5에서, SFA 액티닌 및 트로포 마이신 염색 패턴은 외곽 콤팩트 영역의 성숙한 근섬유와 일치하는 섬유주 심근세포에서 규칙적인 주기성을 보였고, SFA 액티닌은 선형보다 반점이 더 많았으며, 트로포 미오신 신호는 선형이 아닌 확산성이었고, E 12.5 심장에서 섬유주 심근세포는 강렬한 SFA 악티닌 염색 영역과 함께 국한되어 있었고, 이는 삽입된 디스크를 나타낼 수 있습니다. 여기에 표시된 것은 생명 행위 RFP 루비 형질전환 마우스의 SFA 액티닌 및 필라멘트 액톤에 대해 표시된 PFA 고정 E 12.5 배아 심장입니다. 잡음 비율에 대한 SFA 액틴 신호는 스냅 동결 심장 절편에 비해 감소했습니다.

3차원 이미지 재구성을 통해 심근세포 내의 MyFi는 서로 대략 평행하지만 개별 심근세포는 서로에 대해 다양한 각도로 향하는 것으로 나타났습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 배아 심장의 올바른 방향과 냉동 절편 방법을 잘 이해하게 될 뿐만 아니라 면역 염색, 컨포칼 현미경 검사 및 이미지 분석을 수행하여 마우스 심장 발달 중 MyFi 및 심근세포 성숙을 평가하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 인정하다.