개발 체외 모델 시스템 에쿠스 caballus의 IgE
November 1st, 2014
현재 연구는 쥐 호염우기 백혈병 세포와 말 FcεRIα 유전자의 형질주입을 기반으로 하는 유전자 조작 분석 시스템의 개발 및 응용을 설명합니다. 형질주입된 세포는 IgE와 항원에 의해 알레르기 반응의 매개체 방출이 활성화될 수 있는 기능적 수용체를 발현합니다.
다음 실험의 전반적인 목표는 RAD Basophil 백혈병 세포에서 IgE 의존성 매개체 방출의 양을 측정하는 것입니다. 알레르기 증상은 히스타민과 같은 매개체의 방출로 인해 발생합니다. 자, 히스타민이 호염기구에 의해 방출되는 유일한 매개체가 비만 세포인 것은 아닙니다.
이 세포에 의해 방출되는 모든 매개체의 총합은 즉각적이고 지연된 과민성의 징후와 증상을 초래합니다. 이제 인간만 알레르기를 앓는 유기체가 아니며 개와 말도 고통을 겪습니다. 연구를 더욱 발전시키고 백신과 같은 알레르기 치료제를 찾기 위해서는 연구 치료에서 방출되는 매개체의 양을 정량화하기 위해 방출 분석이 필요합니다.
이것이 이 릴리스 분석의 이유입니다. RBL 매개자가 발표한 인체 시스템에 대한 분석은 1986년 Ian과 Hook에 의해 처음 개발 및 발표되었습니다. 나중에 DOC 시스템용으로 개발되었으며 지금은 말 시스템용으로 개발되었습니다.
변형은 관심 단백질을 변경하는 것만큼 간단합니다. 세포주 뉴스는 Rat Baso 백혈병 또는 RBL 2 H 3.1 세포주였으며, 말 높은 FNT ffc Serin R 하나의 수용체 알파 사슬을 밀리리터 당 500, 000 세포의 세포 밀도로 발현했습니다. 최종 농도인 밀리리터당 1나노그램에 관심 IgE 항체를 추가합니다.
혼합물 100마이크로리터를 96 토양 플레이트에 넣고 37도에서 16시간 동안 배양합니다. 이를 통해 세포는 웰 표면에 부착되고 항체는 수용체 세척제에 결합할 수 있습니다. 100마이크로리터의 따뜻한 37도로 나머지 결합되지 않은 항체와 죽은 세포를 포함하는 배지의 두 배가 완충액을 방출합니다.
마지막 세척의 완충액을 버리고 관심 농도에서 관심 항원 100마이크로리터로 교체합니다. 37도에서 20분 배양 후, 방출 매개체를 함유한 SUP 나틴 50마이크로리터를 새 웰로 옮기고 남은 상등액을 50마이크로리터의 트리톤 X 완충액으로 교체하여 세포에 공급하고 세포 내부에 남아 있는 매개체를 방출합니다. 50 마이크로 리터의 2 백만 몰 베타 hx.
많은 일 기질이 구연산염 완충액에 용해되었습니다. 37도에서 2시간 배양 후 각 웰에 150마이크로리터의 트리스 버퍼를 첨가하여 웰을 노란색으로 만듭니다. 16시간 후 405나노미터에서 색상 흡광도를 측정합니다.
Ian Buffer라고도 하는 방출 분석 버퍼를 37도에서 가열합니다. 또한 농도에서 방출 완충액에 있는 항원의 농도 구배를 준비합니다. 0, 0.1, 1, 10, 100, 1000 및 10, 000 밀리리터당 나노그램.
그런 다음 37도에서 데우십시오. 접시를 빠르게 튕겨 매체를 제거하고 우물 벽을 향해 100마이크로리터의 따뜻한 방출 완충액을 부드럽게 추가하여 우물을 씻습니다. 이는 온도 차이로 인한 세포 스트레스를 줄여 매개체를 조기에 방출하기 위함입니다.
접시는 두 번 씻어야 합니다. 최종 방출 완충액을 버리고 세척하고 100마이크로리터의 항원을 첨가하며, 음성 대조군의 경우 A행에서 항원 농도 0부터 시작하여 B행에서 G행으로, 마지막으로 Triton X 슬라이스, H행의 버퍼로 내려갑니다. 플레이트를 37도에서 20분 동안 배양합니다.
이것은 세포가 잠복기 후에 매개체를 방출하는 지점입니다. 각 웰에 있는 50마이크로리터의 액체를 해당 웰로 옮깁니다. 7열에서 12열까지 1-6번 위치에 남아 있는 액체를 완전히 추출하고 버리고 50마이크로리터의 Triton X 용해 완충액으로 교체합니다.
준비된 기질 50마이크로리터를 접시의 96개 웰 모두에 추가합니다. 37도에서 2시간 동안 배양합니다. 베타 H는 많은 일 기질을 4 개의 니트로 페놀로 대화합니다.
배양 기간이 끝나면 150 마이크로 리터의 트리스 버퍼를 첨가하여 4 개의 니트로 페놀을 노란색으로 바꾸어 반응을 중지하십시오. 405나노미터에서 판 분광 광도계를 사용하여 판을 읽습니다. 흡광도 데이터를 측정한 후, 웰 위치 A 1의 세포 내부에 있는 매개체의 총량을 곱하여 계산합니다.
위치 a 7 x 2에 해당하는 우물과 결과를 1의 값에 추가합니다. 이는 실험하는 동안 릴리스 매개자 이의신청 A를 포함하는 supinate를 새로운 우물 이의로 옮겼기 때문입니다. 7.
나머지 우물에 대해 계산을 반복합니다. 우물 반대에 있는 방출 매개자의 백분율을 계산하고, A 7 위치 값에 2를 곱하여 셀 내부의 계산된 총 매개자에서 A 7을 계산합니다. 다시 말하지만, 실험하는 동안 Reese 매개자를 포함하는 supernat이 있기 때문입니다.
우리가 그것을 새로운 것으로 옮겼을 때, 그 곱에 100을 곱하고 그 곱을 그 위치에 대한 셀 내부의 매개자의 해당 총 값으로 나눕니다. 이것은 팽창에 대한 방출 매개자의 백분율을 제공합니다. 각 행에 있는 6개의 팽창은 동일한 항원 평균 농도에 의해 도전을 받기 때문에 나머지 우물에 대해 계산을 반복합니다.
이러한 값을 계산하고 표준 편차를 계산하면 다음과 같이 그래프에 이러한 값이 표시됩니다. 그래프는 항원 농도가 증가함에 따라 밀리리터당 100나노그램으로 최고조에 달할 때까지 더 많은 매개체가 방출되고, 그 후 항원 농도가 증가함에 따라 매개체 방출이 감소함을 보여줍니다. 최종 실험 결과는 그래프 B에서 볼 수 있듯이 이러한 그래프와 같아야 합니다.연한 파란색의 대조군 방출 분석법에는 IgE 항체가 포함되어 있지 않으므로 항원 농도 증가에 따른 매개체 방출의 변화가 나타나지 않습니다.
이를 IgE 항체를 포함할 수 있는 진한 파란색의 실험 결과와 비교해 보십시오. 이는 항-IgE 백신의 안전성 시험이 진행되고 있는 사례입니다. 이 빨간색 그래프에서 볼 수 있듯이, 항-IgE 혈청은 세포 표면의 수용체를 교차 결합시켜 RBL 세포가 과립을 제거하도록 하는 반면, 보라색의 음성 대조군은 이 백신을 안전하지 않게 만듭니다.
이 분석법은 잠재적인 항알레르기 약물을 테스트할 때 매개체 방출 또는 그 지연을 측정할 수 있기 때문에 매우 유용하며, 항알레르기 항체를 테스트할 때 매개체 방출의 성공적인 차단 또는 실패를 결정할 수 있는 분석법과 같이 백신을 인간 개 또는 말 시스템에 맞게 조정할 수도 있습니다.
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개요
이 연구는 말의 Fc蔚RI伪 유전자로 형질전환된 쥐 기반구성 백혈병 세포를 이용한 유전자 공학 분석 시스템에 초점을 맞추고 있습니다. 이 시스템은 IgE와 항원에 반응하여 매개체 방출을 측정할 수 있어 알레르기 반응을 이해하는 데 중요합니다.
주요 연구 구성요소
과학 분야
- 면역학
- 알레르기 연구
- 세포 생물학
배경
- 알레르기 반응은 히스타민과 같은 물질의 방출에 의해 매개됩니다.
- 인간과 개, 말과 같은 동물 모두 알레르기로 고통을 받을 수 있습니다.
- 매개체 방출을 이해하는 것은 알레르기 치료를 개발하는 데 필수적입니다.
- 매개체를 정량화하기 위한 방출 분석은 연구에 필요합니다.
연구 목적
- IgE 의존적 매개체 방출을 측정하기 위한 신뢰할 수 있는 분석법을 개발합니다.
- 다양한 유기체에서 알레르기 반응에 대한 이해를 향상시킵니다.
- 백신을 포함한 잠재적 치료법의 개발을 촉진합니다.
사용된 방법
- 말의 Fc蔚RI伪 유전자로 쥐 기반구성 백혈병 세포를 형질전환합니다.
- IgE와 항원에 의한 수용체 활성화를 통해 매개체 방출을 유도합니다.
- 알레르기 반응을 평가하기 위해 방출된 매개체를 정량화합니다.
- 실험 분석을 위해 유전자 공학 세포주를 활용합니다.
주요 결과
- 형질전환된 세포는 기능적인 Fc蔚RI伪 수용체를 성공적으로 발현합니다.
- IgE와 항원 활성화는 측정 가능한 매개체 방출로 이어집니다.
- 이 분석법은 알레르기 반응을 연구하기 위한 플랫폼을 제공합니다.
- 결과는 알레르기 메커니즘에 대한 이해에 기여합니다.
결론
- 유전자 공학 분석법은 IgE 매개 반응을 연구하는 데 효과적입니다.
- 연구 결과는 향후 알레르기 치료 개발에 정보를 제공할 수 있습니다.
- 이 접근 방법은 다양한 종에서 알레르기 반응에 대한 연구를 향상시킬 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
This assay system enables quantitative assessment of IgE-dependent mediator release in an equine model, supporting target validation and mechanistic de-risking in allergy therapeutic development. By providing a reproducible platform to evaluate IgE-FcεRI interactions, it aids in preclinical screening of biologics such as anti-IgE vaccines or monoclonal antibodies. The model offers translational continuity across species, facilitating cross-species extrapolation of pharmacological profiles and safety assessments.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of equine IgE-FcεRI binding affinity and receptor functionality.
- Operational Value: Provides a standardized cell-based system for evaluating target engagement in allergic pathways.
- Predictive Value: Supports biological de-risking by confirming receptor-mediated signaling before in vivo studies.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Utilizes β-hexosaminidase release as a quantitative, scalable readout for mediator secretion.
- Reproducibility: Demonstrates consistent dose-dependent responses across antigen concentrations, supporting assay robustness.
- Platform Adaptability: Can be modified for human, canine, or equine systems, enabling cross-species assay reuse.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models physiological allergic responses observed in horses, which mirror human and canine hypersensitivity.
- Translational Continuity: Bridges in vitro findings to preclinical evaluation of therapeutic candidates.
- Risk-Adjusted Decisions: Informs go/no-go decisions based on mediator release profiles and safety signals.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical assessment, particularly for allergy-focused biologics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of IgE receptor interactions and pathway clarification in mast cell/basophil activation.
- Screening: Enables evaluation of therapeutic candidates (e.g., anti-IgE antibodies) for their ability to block or induce mediator release.
- Analytics: Generates quantitative mediator release data (e.g., peak at 36.68% ± 4.88% at 100 ng/mL antigen) for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects in vitro mechanism to preclinical safety and efficacy evaluation in animal models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for allergic disease model development across multiple species.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by confirming functional receptor expression and signaling.
- Operational Value: Delivers a standardized, quantitative assay with defined controls and measurable outputs.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early detection of biological activity or safety concerns.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of allergy therapeutics based on mechanistic de-risking data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mammalian cell culture, transfection, and immunological assay techniques.
- Dependent on fluorescence or colorimetric detection infrastructure (e.g., plate reader at 405 nm).
- Necessitates standardization of cell density, IgE sensitization, and antigen titration across laboratories.
- Requires adaptation of antigen concentrations and incubation times when applied to different species or models.
- Limited to in vitro mediator release and may not reflect full in vivo pathophysiological complexity.
