호흡기 유체의 Equid 헤르페스 바이러스-2 진단에 대한 정량적 PCR 방법의 개발 및 검증

qPCR 방법의 전반적인 목표는 말의 생물학적 샘플에서 말 헤르페스 바이러스-2의 바이러스 부하를 평가하는 것입니다. 이 방법은 말의 호흡기 질환 진단 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며, 실무자를 위한 새로운 해석 보조 도구에 대한 정량적 데이터에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 민감하고 구체적이며 빠른 방법이라는 것입니다.

또 다른 장점은 국제 정상화 위원회의 프랑스 대표인 AFNOR 규범 NF U47-600에 따른 개발입니다. 이 절차를 시연하는 사람은 우리 병동의 젊은 연구원인 Erika Hue입니다. 호흡액의 생물학적 샘플에서 핵산을 추출하려면 흄 후드 아래에서 560마이크로리터의 용해 용액에 140마이크로리터의 생물학적 샘플을 첨가하고 실온에서 10분 동안 배양하는 것으로 시작합니다.

샘플에 560마이크로리터의 에탄올을 추가하고 총 용액 630마이크로리터를 실리카 컬럼과 원심분리기에 적용합니다. 나머지 630마이크로리터를 실리카 컬럼에 적용하고 다시 원심분리합니다. 샘플을 컬럼에 적용한 후 세척 버퍼 AW1 및 AW2를 각각 500마이크로리터씩 사용하여 컬럼을 두 번 세척합니다.

그런 다음 컬럼에서 핵산을 용리시키기 위해 50마이크로리터의 실온 용출액 또는 AVE 완충액을 추가합니다. 뚜껑을 닫고 실온에서 1분 동안 배양합니다. 다음 6, 1 분 동안 000 gs에 분리기.

DNA를 증폭하기 위해 텍스트 프로토콜에 따라 프라이머와 프로브를 적정한 후 PCR 마스터 믹스 12.5마이크로리터, 정방향 및 역방향 프라이머 20마이크로몰, 프로브 10마이크로몰, 22.5마이크로리터에 도달하기에 필요한 충분한 초순수를 추가하여 각 반응에 대해 22.5마이크로리터의 반응 혼합물을 준비합니다. 오염을 방지하려면 항상 특정 영역에서 PCR 반응 혼합물을 준비하십시오. 22.5 마이크로리터의 적절한 반응 혼합물을 96 웰 플레이트의 각 반응 웰에 분취합니다.

추출 및 PCR에 대한 음성 대조군을 포함하여 시약이 원치 않는 DNA로 오염되지 않도록 합니다. 다음으로 2.5마이크로리터의 샘플, 추출 음성 대조군, PCR 음성 대조군 또는 양성 대조군 샘플을 해당 반응 웰에 추가합니다. 그런 다음 접착 플레이트 씰을 사용하여 플레이트를 덮습니다.

그리고 6, 10 초 동안 000 gs에 분리기. 플레이트를 Real-Time PCR 시스템에 놓습니다. 그런 다음 분석 레이아웃에 대한 템플릿과 여기에 표시된 PCR 프로그램 설정을 선택하고 실행을 시작합니다.

Real-Time PCR 시스템에서 스프레드시트로 원시 데이터를 전송한 후, 기준선 위와 지수 성장 영역 내에서 증폭 플롯의 임계값을 설정하여 각 샘플에 대한 임계값 주기를 구합니다. 선형성을 얻기 위해 각 점 표준 세트를 표준 곡선으로 플롯합니다. 그런 다음 표준 곡선을 기준으로 다른 샘플에 대한 복제 수를 계산합니다.

qRT-PCR 결과의 검출 한계를 확인하려면 90마이크로리터의 초순수를 6개의 튜브에 분배합니다. 저감 영역을 표적으로 하는 플라스미드의 10배 연속 희석액 6개를 준비하려면 먼저 플라스미드 작업 희석액에서 90마이크로리터의 초순수가 함유된 튜브로 10마이크로리터를 옮기는 것으로 시작합니다. 튜브를 간단히 와류로 분리하고 원심분리합니다.

그런 다음 튜브에서 다음 물 튜브로 10마이크로리터를 옮깁니다. 볼텍싱(vortexing)과 원심분리(centrifuning) 후, 모든 물 튜브가 플라스미드를 받을 때까지 전달을 반복합니다. 이 비디오의 앞부분에서 설명한 바와 같이 6개의 10배 연속 희석액에서 DNA를 증폭한 후 양성 신호를 생성하는 플라스미드의 마지막 희석인 저감 구역과 검출 없이 첫 번째 희석을 결정합니다.

6개의 2중 연속 희석액을 준비하려면 25마이크로리터의 초순수를 6개의 튜브에 분배합니다. 10 배 희석에서 긍정적 인 신호를 준 플라스미드의 마지막 희석에서 튜브에서 첫 번째 물 튜브로 25 마이크로 리터를 옮깁니다. 방금 시연된 바와 같이 나머지 5개의 희석액을 준비하기 전에 와류와 원심분리기를 사용합니다.

이 비디오의 앞부분에서 설명한 대로 2중 연속 희석에서 DNA를 증폭합니다. 3개의 독립적인 임상시험에서 DNA를 증폭한 후, 각 플라스미드 농도 수준에 대해 24번의 반복 중 양성 반복 횟수를 계산합니다. 95%의 신뢰도로 LOD 또는 LOD 95% PCR로 LOD를 결정하며, 이는 24번의 반복 실험 중 23번의 양성 반복을 검출하는 수준입니다.

방법의 LOD를 결정하기 위해 양수 신호를 제공한 10배 희석에서 마지막 농도보다 4배 더 농축된 25마이크로리터의 플라스미드 작업 희석으로 시작하여 5개의 2배 연속 희석을 준비합니다. 증폭 단계에 사용되는 플라스미드는 오염을 방지하기 위해 특정 영역에서 준비된 플라스미드 작업 희석액에서 나옵니다. 이는 매우 중요한 단계입니다.

플라스미드의 각 희석액에서 5마이크로리터를 135마이크로리터의 음성 자원 물질이 있는 4개의 튜브로 옮겨 5개의 양성 표준물질의 4개의 복제를 얻습니다. 5개의 양성 표준물질에 대해 4개의 반복실험을 추출하고 이 비디오의 앞부분에서 설명한 대로 증폭 절차를 수행합니다. 각 수준의 플라스미드 농도에 대해 8번의 반복 중 양성 복제의 수를 계산합니다.

마지막으로, 8번의 반복 실험 중 8번의 반복이 양수인 마지막 수준인 LOD 방법을 결정합니다. 이 비디오에 설명된 정량적 RT-PCR 방법은 호흡기액에서 equid herpesvirus-2를 검출하고 정량화합니다. 이 실험에서는 희석 10에서 음의 9번째 및 10에서 음의 10번째 사이에 있는 저감 영역을 추정하기 위해 10배 연속 희석이 이루어졌습니다.

LOD PCR 값은 저감 구역에서 새로운 2배 연속 희석으로 측정되었습니다. 선형성 범위 및 LOQ PCR를 결정하기 위하여 LOD PCR 값은 2.6, LOD PCR 값 및 2.5 마이크로리터 표본 당 260, 000의 사본 사이 6개의 10배 일련 희석의 범위를 시작하기 위하여 이용되었다. LOQ PCR은 선형성 범위에서 가장 낮은 농도입니다.

전체 방법의 특성화는 호흡기 샘플에서 DNA를 추출하는 것부터 표적의 증폭 및 정량화에 이르기까지 qRT-PCR 데이터를 얻는 데 필요한 모든 단계를 검증하는 것입니다. qRT-PCR 전체 분석 방법의 정량적 성능은 이 그래프에 표시된 정확도 프로필로 평가 및 검증되었습니다. EHV2 바이러스 게놈은 호흡기 질환이 있는 말의 비강 면봉 샘플 172개에 포함되어 있으며, 여기에 표시된 대로 정량화

바이러스 게놈 부하(genetic genome load)는 어린 말에서 더 높았으며, 가장 높은 부하(load d of the radio)는 1.9 곱하기 10에서 밀리리터당 11번째 복제로 검출되었습니다. 이 기법을 마스터하면 증폭 단계당 2시간 이내에 완료할 수 있으며, 제대로 수행되면 총 검증 단계를 4주 이내에 수행할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안, 특히 플라스미드 용액으로 작업할 때 오염 위험을 피해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.

이 절차에 따라 게놈 식별과 같은 추가 질문에 답하기 위해 염기서열분석과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 이 영상을 본 후에 당신은 DNA의 적출 그리고 확대를 실행하는 방법과 그들의 PCR 예비를 성격을 나타내기 위하여 방법의 좋은 이해가 있어야 한다. 병원체와 같은 생물학적 샘플로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있다는 것을 잊지 마십시오.

후드 작업 및 조정된 보안 수준 영역과 같은 몇 가지 예방 조치는 이 절차를 수행하는 동안 항상 수행해야 합니다.