호흡기 유체의 Equid 헤르페스 바이러스-2 진단에 대한 정량적 PCR 방법의 개발 및 검증

qPCR 방법의 전반적인 목적은 말의 생물학적 시료 내 equine herpesvirus-2의 바이러스 양을 평가하는 것입니다. 이 방법은 말 호흡기 질환의 진단 분야에서 핵심적인 질문에 답하고, 임상의를 위한 새로운 해석 보조 도구에 대한 정량적 데이터를 제공하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 민감도가 높고 특이적이며 신속한 방법이라는 점입니다.

또 다른 장점은 국제 표준화 위원회의 프랑스 대표 기관인 AFNOR 표준 NF U47-600에 따라 개발되었다는 점입니다. 절차 시연은 저희 유닛의 신진 연구원인 Erika Hue가 맡겠습니다. 호흡기 액체 생물학적 시료에서 핵산을 추출하려면, 흄 후드 아래에서 생물학적 시료 140 µL를 용해액 560 µL에 첨가한 후 실온에서 10분 동안 배양하십시오.

시료에 ethanol 560 µL를 추가하고, 전체 용액 중 630 µL를 실리카 컬럼에 넣은 후 원심분리합니다. 남은 630 µL를 다시 실리카 컬럼에 넣고 원심분리합니다. 시료를 컬럼에 모두 처리한 후, 세척 완충액 AW1과 AW2를 각각 500 µL씩 사용하여 컬럼을 두 번 세척합니다.

그런 다음 컬럼에서 핵산을 용출시키기 위해 상온의 elution 버퍼 또는 AVE 버퍼 50 µL를 첨가합니다. 캡을 닫고 상온에서 1분 동안 배양합니다. 이후 6,000 ×g에서 1분 동안 원심분리합니다.

DNA를 증폭시키기 위해, 텍스트 프로토콜에 따라 프라이머와 프로브를 적정시킨 후, PCR 마스터 믹스 12.5 µL, 20 µM 정방향 및 역방향 프라이머, 10 µM 프로브를 넣고 22.5 µL가 될 때까지 초순수를 적절히 추가하여 각 반응당 22.5 µL의 반응 혼합물을 준비합니다. 오염을 방지하기 위해 PCR 반응 혼합물은 항상 지정된 구역에서 준비하십시오. 96웰 플레이트의 각 반응 웰에 적절한 반응 혼합물 22.5 µL를 분주합니다.

추출 및 PCR에 대한 음성 대조군을 포함하여 시약에 원치 않는 DNA가 오염되지 않았는지 확인하십시오. 다음으로 샘플, 추출 음성 대조군, PCR 음성 대조군 또는 양성 대조군 샘플 2.5 µL를 각각 해당 반응 웰에 첨가합니다. 그런 다음 접착식 플레이트 씰을 사용하여 플레이트를 덮습니다.

그런 다음 6,000 gs에서 10초 동안 원심분리합니다. 플레이트를 실시간 PCR 시스템에 넣습니다. 그런 다음 여기에 표시된 분석 레이아웃 템플릿과 PCR 프로그램 설정을 선택하고 실행을 시작합니다.

실시간 PCR 시스템에서 스프레드시트로 원시 데이터를 전송한 후, 각 샘플의 임계 사이클(threshold cycle)을 얻기 위해 증폭 플롯의 임계값을 베이스라인 위쪽이자 지수 성장 영역 내로 설정하십시오. 각 포인트 표준 세트를 표준 곡선으로 플로팅하여 선형성을 확인하십시오. 그런 다음 표준 곡선을 기반으로 서로 다른 샘플의 카피 수를 계산하십시오.

qRT-PCR 결과의 검출 한계를 결정하기 위해, 6개의 튜브에 초순수 90 µL씩 분주합니다. 완충 구역을 대상으로 하는 플라스미드의 10배 단계 희석액 6개를 준비하려면, 먼저 플라스미드 작업 희석액 10 µL를 초순수 90 µL가 들어 있는 튜브로 옮깁니다. 튜브를 짧게 볼텍싱하고 원심 분리합니다.

그런 다음 튜브에서 10 µL를 다음 물 튜브로 옮깁니다. 볼텍싱과 원심분리를 거친 후, 모든 물 튜브에 플라스미드가 들어갈 때까지 이 이동 과정을 반복합니다. 이 비디오의 앞부분에서 설명한 대로 10배 단계 희석된 6개의 샘플에서 DNA를 증폭시킨 후, 양성 신호가 나타나는 마지막 희석 단계이자 검출되지 않는 첫 번째 희석 단계인 감소 구역(abatement zone)을 결정합니다.

6단계의 2배 연속 희석액을 준비하려면, 6개의 튜브에 초순수 25 µL씩 분주하십시오. 10배 희석 시리즈에서 양성 신호를 나타낸 마지막 플라스미드 희석액 튜브에서 25 µL를 취해 첫 번째 물 튜브로 옮깁니다. 볼텍싱과 원심분리를 수행한 후, 방금 시연한 것과 동일한 방식으로 나머지 5단계의 희석액을 준비하십시오.

이 비디오의 앞부분에서 설명한 대로 2배 연속 희석액의 DNA를 증폭하십시오. 세 번의 독립적인 실험에서 DNA 증폭을 완료한 후, 각 플라스미드 농도 수준에 대해 24개의 반복 시료 중 양성 반복 시료의 수를 계산하십시오. 24개의 반복 시료 중 23개의 양성 반복 시료가 검출되는 수준인 95% 신뢰 수준의 LOD 또는 LOD 95% PCR을 결정하십시오.

본 방법의 검출한계(LOD)를 결정하기 위해, 양성 신호를 나타낸 10배 희석액의 마지막 농도보다 4배 더 농축된 플라스미드 작업 희석액 25 µL를 시작으로 5단계의 2배 연속 희석액을 준비합니다. 증폭 단계에 사용되는 플라스미드는 오염을 방지하기 위해 지정된 구역에서 준비된 플라스미드 작업 희석액을 사용합니다. 이는 매우 중요한 단계입니다.

플라스미드의 각 희석액에서 5 µL를 취해, 음성 대조 시료 135 µL가 들어 있는 4개의 튜브에 각각 옮겨 5가지 양성 표준물질에 대한 4개씩의 반복 시료를 준비합니다. 5가지 양성 표준물질의 반복 시료 4개에 대해 추출을 수행하고, 이 영상의 앞부분에서 설명한 증폭 과정을 진행합니다. 각 플라스미드 농도 수준별로 8개의 반복 시료 중 양성으로 나타난 반복 시료의 수를 계산합니다.

마지막으로, 8회 반복 실험 중 8회 모두 양성으로 나타나는 최하위 농도인 검출한계(LOD)를 결정합니다. 이 영상에서 설명하는 정량적 RT-PCR 방법은 호흡기 액체 내의 equid herpesvirus-2를 검출하고 정량화합니다. 본 실험에서는 10배 단계 희석을 수행하여 희석 배수 10⁻⁹에서 10⁻¹⁰ 사이의 감소 구역(abatement zone)을 추정하였습니다.

LOD PCR 값은 감쇄 구역 내의 새로운 2배 연속 희석을 통해 결정되었습니다. 선형 범위와 LOQ PCR을 결정하기 위해, LOD PCR 값인 2.6과 샘플 2.5 µL당 260,000 copies 사이에서 10배 연속 희석을 6단계로 수행하여 범위를 설정하였으며, 이때 LOD PCR 값을 시작점으로 사용하였습니다. LOQ PCR은 선형 범위 내에서 가장 낮은 농도를 의미합니다.

전체 방법의 특성 분석은 호흡기 시료로부터의 DNA 추출부터 표적의 증폭 및 정량에 이르기까지 qRT-PCR 데이터를 얻는 데 필요한 모든 단계의 검증을 의미합니다. qRT-PCR 전체 분석 방법의 정량적 성능은 이 그래프에 나타낸 정확도 프로파일을 통해 평가 및 검증되었습니다. 호흡기 질환이 있는 말의 비강 스왑 시료 172개에 대한 EHV2 바이러스 게놈 부하량이 여기와 같이 정량화되었습니다.

어린 말에서 바이러스 게놈 부하가 더 높게 나타났으며, 최대 1.9 × 10¹¹ copies/mL의 부하가 검출되었습니다. 이 기술을 숙달하면 증폭 단계당 2시간 이내에 완료할 수 있으며, 적절하게 수행할 경우 전체 검증 단계를 4주 이내에 마칠 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때는 특히 플라스미드 용액을 다룰 때 오염 위험을 피하는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오.

본 절차 이후에는 게놈 식별과 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 시퀀싱과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 DNA의 추출 및 증폭 방법과 PCR 산물을 특성화하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 병원체와 같은 생물학적 샘플을 다루는 작업은 매우 위험할 수 있다는 점을 잊지 마십시오.

본 절차를 수행하는 동안에는 항상 후드 내에서 작업하고 적절한 생물 안전 등급 구역을 이용하는 등의 예방 조치를 취해야 합니다.