Name: 호흡기 유체의 Equid 헤르페스 바이러스-2 진단에 대한 정량적 PCR 방법의 개발 및 검증 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: 학습하세요 말 호흡기 유체에서 Equid 헤르페스 바이러스-2를 정량적 PCR로 검출하는 방법을. 이 기술은 수의학 진단에서 바이러스 부하를 정확히 측정하여 임상 의사결정을 지원합니다.

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저자는 기술 지원에 대해 Sophie Castagnet과 Nadia Doubli-Bounoua에게 감사의 뜻을 전합니다. 이 작업은 칼바도스 총회(General Council of Calvados)와 바스-노르망디 지역(Basse-Normandie) 지역과 프랑스 정부의 합의(CPER 2007-2013; 프로젝트 R25 p3)의 재정적 지원을 받았다. 저자는 AFNOR 그룹의 전문가, 특히 Jean-Philippe Buffereau와 Eric Dubois에게 감사를 표하고 싶습니다.

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<li>Mullis, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+enzymatic+amplification+of+DNA+in+vitro%3A+the+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.Symp.Quant.Biol%22%5BJournal%5D)">Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction.</a> Cold Spring Harb.Symp.Quant.Biol. 51 (1), 263-273 (1986).</li>
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<li>Association Francaise de Normalisation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22NFU+47-600-2.+Animal+health+analysis+methods-PCR-Part+2%3A+Requirements+and+recommendations+for+the+development+and+the+validation+of+veterinary+PCR%22">NFU 47-600-2. Animal health analysis methods-PCR-Part 2: Requirements and recommendations for the development and the validation of veterinary PCR</a>. , (2015).</li>
<li>ISO. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22EN+ISO-CEI+17025.+General+requirements+for+the+competence+of+testing+and+calibration+laboratories%22">EN ISO-CEI 17025. General requirements for the competence of testing and calibration laboratories</a>. , (2005).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Manual+of+Diagnostic+Tests+and+Vaccines+for+Terrestrial+Animals+2010.+Chapter1.1.1.4%2F+5.+Principles+and+Methods+of+Validation+of+Diagnostic+Assay+for+Infectious+Diseases%22">Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals 2010. Chapter1.1.1.4/ 5. Principles and Methods of Validation of Diagnostic Assay for Infectious Diseases</a>. , This thoroughly revised chapter replaces Chapter 1.1.4 Principles of validation of diagnostic assays for infectious diseases and Chapter 1.1.5 Validation and quality control of polymerase chain reaction methods used for the diagnosis of infectious diseases from the sixth edition of the OIE Terrestrial Manual (2009).</li>
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<li>Blanchard, P., Regnault, J., Schurr, F., Dubois, E., Ribiere, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-laboratory+validation+of+chronic+bee+paralysis+virus+quantitation+using+an+accredited+standardised+real-time+quantitative+RT-PCR+method%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol.Methods%22%5BJournal%5D)">Intra-laboratory validation of chronic bee paralysis virus quantitation using an accredited standardised real-time quantitative RT-PCR method.</a> J Virol.Methods. 180 (1-2), 26-31 (2012).</li>
</ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.

2000 년대 이래, 실시간 PCR은 실험실 증가 금 표준 기술 (세포 배양 및 세균 배양 방법)을 대체하고있다. 기술의 구현은 비교적 간단합니다. 그러나 실험 방법의 검증은 정확하고 반복 가능하고 신뢰할 수있는 데이터를 확인하기 위해 분자 검출 및 병원균의 정량 필수적이다. 추출 공정은 생체 물질의 손실의 주요 원천이기 때문에, 하나의 프로토콜과 다른 정량의 오차의 메인 소스로 간주 될 수있다. 이와 같이, 주로 문헌에보고 QRT-PCR 동안 DNA 플라스미드의 표준 곡선의 생성은 바이러스 게놈로드를 나타내는하지만 추출 단계를 고려하지 않는다. AFNOR 규범 NF U47-600-2에서 전체 방법 유효성 검사 프로세스에 대한 드 노보 전략에 대한 설명은이 지역에서 상당한 진전을 나타냅니다. 도시 된 바와 같이EHV-2 마리에서이 논문은, 또는 꿀벌 21에서 다른 사람에 의해,이 개발 단계 전체 방법의 PCR의 특성 및 특성과 검증 단계 사이의 명확한 차별화를 필요로한다. 이 흥미로운 접근 한 제한은 프로토콜의 변화가 매우 비용이 많이 드는 될 수 있습니다 전체 프로세스를 재 검증 할 의무가 발생할 것입니다. 이 제한은 또한 정량의 범위는 바이러스 (예를 들면, 호흡기 유체, 기관, 혈액 또는 소변) 추출되는 소스에 의존한다는 사실에 의해 강조되었다. 사실, 각 행렬은 물리 화학적 특성이 상이한 특이성을 제시하고 독립적 QRT-PCR에 의한 바이러스 검출과 정량에 사용되는 각각의 상이한 행렬을 정의하는 것이 중요하다. 따라서, 각각의 생물학적 샘플의 바이러스 게놈 부하보다 정확하게 추출에서 정량화 할 수있다. 특성화는 계정 열 순환기의 모드로합니다EL 및 이전에 잘 특성화 방법의 사용 (예를 들면, 본 문서에 기재된 EHV-2 qPCR의 방법) 상위 기관 또는 다른 실험실 기계의 새로운 유형을 필요로 할 때, 하나는 그 기기의 성능을 확인한다. 모든 테스트 실험실로 가져에 대한 qPCR에 분석의 성능의 확인은 필수 조건이다. 이는 일반적으로 공지 된 특성을 갖는 기준 샘플을 분석함으로써 달성된다. 이러한 검사는 필수 및 qPCR에 (LOD, LOQ 효율)의 성능 및 전체 방법 (LOD, LOQ)의 안정성을 확인하기 위해 NF 47-600-1 AFNOR 규범 요청에 따라 의무적으로 간주된다. 뿐만 아니라 개발 단계에서 특성화되지만 연구 또는 진단 목적으로 사용될 수도 때 위험 요인 식별 잘 프로토콜의 표준화를 위해 조절 될 수있다. 특히 우려 적절한 직원 교육, 우수한 인력, 소모품의 품질 관리입니다사용 및 저장, 분석에 포함 된 과학 장비의 성능에 영향을 미칠 수있는 즉각적인 환경 조건 및 계량 조건의 인식 제어 할 수 있습니다. 실험실 간 비교를위한 기준 샘플의 사용은 또한 불확실성을 제어 할 수 있도록 할 수 있습니다. 이러한 방식으로, 실험실간에 데이터의 비교를 용이하게 할 수있다. 실제로, 간 실험실 숙련도 시험 평가 방법의 재현성을 확인하는 것이 필수적이다. 분석 된 생물학적 매트릭스의 국제 단위 (IU)로 표현되는 바이러스 게놈로드 결과 (IU는 : 유체 또는 사본 복사 / ㎖ 조직에 대한 / g)을 다른 실험실 사이의 결과를 비교하기 위해 사용하기 쉽다. 정량 한계 이상의 모든 결과는 비 정량 양성 결과로 간주된다 카피 / ㎖ 및 LOD와 LOQ 사이의 결과로서 표현된다. 이러한 방식으로 게놈 quantificational 데이터를 표시하면 사전 처리에 더 정확하게 부합분석의 (게놈의 증폭). 사실상, 세포 배양 실험에서 TCID (50)에 의해 바이러스 하중 식 (중간 조직 배양 감염 량) 세포 및 바이러스 균주의 특성에 따라 달라집니다. 각 변형 라인은 최초의 세포 병변 효과가 명백하기 전에 독특한 감염 역학 및 EHV-2와 같은 일부 바이러스는 몇 일이 걸릴 수 있습니다 보유하고있다. 결론적으로, QRT-PCR의 특성이 새로운 방법은 실험실 간의 데이터 표현과 해석의 조화를 촉진해야한다. 이 질환 상태를 선언하는 대신 단지 병원균의 존재 또는 부재에 대한 컷오프 값의 설정 등 향후 QRT-PCR 잠재적 새로운 애플리케이션에 매우 유용 할 것이다.

Equid 헤르페스 바이러스-2 (EHV-2)와 같은 콧물, 인두염 및 부어 림프절 1-3으로 잠재적 인 임상 증상과 함께 호흡 증후군에 참여하고있다. 이 바이러스는 또한 말 산업 2에 대한 중요하고 부정적인 경제적 영향이 발생할 수 있습니다 말의 가난한 성능과 관련된 것으로 의심된다. 지금까지 감마 EHV 대한 금 표준 (γ-EHV) 검출은 세포 배양 방법이었다. 이 절차의 첫 번째 불편 EHV-2와 다른 사이의 차별이없는했다 γ-EHV의 (예를 들어, EHV-5). 두 번째 불편 4,5 명단 12 28 일에서 소요되는 세포 변성 과정의 느린 개발했다. 검증 정규화 정량적 실시간 중합 효소 연쇄 반응의 개발 (QRT-PCR)이 방법은 빠르게 EHV-2 EHV- 구별하는 바이러스를 검출하는 데 도움이 될 것(5) 바이러스 게놈로드 및 정량 비율로 질환 덕분 사이의 관계를 연구. 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)을 멀리 스가 (6)에 의해 1986 년에 처음으로 기재된 생물학적 진단 (사람, 환경, 수의학) 분야의 대부분의 새로운 금 표준이 되려고 하였다. 특이도, 민감도 및 신속성 : 병원체의 게놈의 일부의 증폭에 기초하여이 방법은 많은 장점을 제공한다. 또한, 앰플 리콘의 오염의 위험이 QRT-PCR의 출현 및 품질 보증 7 때문에 물러. 그럼에도 불구하고, 새로운 금 표준 PCR 법 등의 인식은 개선 된 성능 데이터뿐만 아니라, 시간 경과에 따른 성능 저하없이 전체 방법의 개발 및 검증 단계의 제어의 데모 이상 필요로. 검출에 사용되는 제 분자 도구는 EHV-2 시간 C 있었다중첩 PCR과 onsuming과 관련 비특이적 증폭 서열 8로 하였다. 헤르페스 바이러스의 표적 유전자는 디옥시리보 핵산 (DNA) 중합 효소와 DNA 포장 (9)이었다. 그러나,이 중첩 PCR 증폭에 의한 오염의 위험을 제공한다. 그 후, 통상의 PCR 시험은 최근 실시간 PCR 특성 EHV-2 (10)의 정량화에 대해 기재되었다. 2009 년 2에서 검토 인터루킨 10와 같은 유전자 또는 당 단백질 B 유전자를 증폭하도록 설계되지만 데이터를 사용할 수 없었다되었습니다 추출 공정을 포함한 전체에있어서의 유효성에 관한. 이 프로토콜에서 개발 및 검증 절차, 협회 프랑세즈 드 정상화에 따라 말의 호흡 유체의 EHV-2 DNA의 검출과 정량 정량적 PCR 방법에 대해 (AFNOR) 표준 NF U47-600 3,11,12 설명되어 있습니다 프랑스 대표의은이다국제 표준화위원회. 이 표준은 NF EN ISO / CEI 17025 2005 년 13 및 OIE (동물 건강을위한 세계기구)에 따르면, (11, 12)은 &quot;동물 건강 분석 방법 수의학 PCR의 구현, 개발 및 검증을위한 요구 사항 및 권장 사항&quot;의 자세한 사항 . QRT-PCR 분석의 (a)의 개발, (b) 형 QRT-PCR 분석의 특성 전체의 (c)의 특성 : 권장 2010 14 EHV-2 QRT-PCR 검증 프로토콜은 세 부분으로 된 절차를 포함 (PCR 분석으로 생물학적 시료로부터 핵산을 추출)에서 분석 방법. 검출 (LOD)의 한계 및 정량 한계 (LOQ) 다음 QRT-PCR 분석의 전체 분석 방법의 특성은이 한계의 정의를 포함한다. LOD의 95 %는 PCR 모든 CA의 95 %에서 발견 될 수 단위 부피당 핵산 사본의 최저 수를 나타낸다에스. 정량 한계는 95 % PCR 고려 불확실성을 가지고 판단 할 수 핵산 사본의 최저 량을 나타낸다. 이 QRT-PCR 방법은 정확한 탐지 및 호흡기 유체의 EHV-2의 신속한 정량화 할 수 있습니다. 또한, 상기 방법은 다른 새로운 QRT-PCR 분석법의 개발을위한 표준화 된 절차와 같은 일반적인 템플릿을 위해 다른 실험실에서 적용될 수있다.

<table><tbody><tr><td>AB-1900 자연 색상 ABgene 96 웰 플레이트&nbsp;</td><td>Dutsher</td><td>16924</td><td></td></tr><tr><td>접착 필름 qPCR Absolute&nbsp;</td><td>Dutsher</td><td>16629</td><td>qRT-PCR 실행 전에 플레이트를 밀봉하는 데 사용되는 접착 필름</td></tr><tr><td>0.5ml 마이크로튜브, 스커트, 캡</td><td>Dutsher</td><td>039258</td><td></td></tr><tr><td>에탄올 98%</td><td>Sodipro</td><td>SAF322941000</td><td></td></tr><tr><td>프라이머</td><td>Eurofins</td><td>맞춤 주문</td><td></td></tr><tr><td>프로브</td><td>Life Technologies</td><td>맞춤 주문</td><td></td></tr><tr><td>플라스미드</td><td>Eurofins</td><td>맞춤 주문</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp&nbsp; RNA 바이러스 미니 키트 (포함: QIAamp Mini 컬럼, AVL&nbsp; 완충액,&nbsp; AW1 버퍼, AW2 버퍼, AVE 버퍼, 수집 튜브)&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>52906</td><td>AVL 버퍼: 72°C에서 5분 예열; </td></tr><tr><td>Sanger 방법에 의한 C 염기서열분석</td><td>Eurofins</td><td>맞춤 주문</td><td></td></tr><tr><td>Taqman Universal PCR Master Mix</td><td>Life Technologies</td><td>4364340</td><td></td></tr><tr><td>Tris-EDTA 완충 용액</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-296653A</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000c 분광 광도계</td><td>Thermoscientific</td><td>ND-2000C</td><td></td></tr><tr><td>StepOnePlus Real-Time PCR systems</td><td>Life Technologies</td><td>4376600</td><td>예열 15분&nbsp;</td></tr></tbody></table>

호흡기 유체의 equid 헤르페스 바이러스-2 진단에 대한 정량적 pcr 방법의 개발 및 검증

Development and Validation of a Quantitative PCR Method for Equid Herpesvirus-2 Diagnostics in Respiratory Fluids

이 프로토콜은 NF U47-600 규범에 따라 말 호흡기에서 EHV-2의 검출 및 정량화를 위한 정량적 RT-PCR 방법을 설명합니다. 개발 및 첫 번째 검증 단계 후, AFNOR 규범에 따라 두 가지 뚜렷한 특성화 단계, 즉 (a) qRT-PCR 분석법 단독의 특성화 및 (b) 전체 분석 방법의 특성화를 수행했습니다. 전체 분석 방법의 검증에는 핵산 추출과 최종 PCR 분석 사이의 모든 단계에 대한 묘사가 포함되었습니다. 
바이러스 유전체 부하의 정확한 측정을 위해 qRT-PCR에 의한 바이러스 검출에는 전체 방법의 검증이 매우 중요합니다. 추출 단계는 생물학적 물질 손실의 주요 원인이기 때문에 한 프로토콜과 다른 프로토콜 간의 정량화 오류의 주요 원인으로 간주될 수 있습니다. 이러한 이유로 AFNOR 표준 NF-U-47-600은 추출 단계 전에 플라스미드 희석 범위를 포함할 것을 권장합니다. 또한 정량화의 한계는 바이러스가 추출되는 출처에 따라 다릅니다. 국제 단위(IU)로 표시되는 바이러스 게놈 부하 결과는 서로 다른 실험실 간의 결과를 비교하기 위해 사용하기가 더 쉽습니다. 
qRT-PCR의 이 새로운 특성화 방법은 실험실 간의 데이터 표시 및 해석의 조화를 촉진해야 합니다.

전술 한 바와 같이 정량적 RT-PCR 방법은, 감지 및 호흡기 체액 equid 헤르페스 -2-을 정량화하기 위해 구현되었다.도 1은 AFNOR 규범 NF에 따른 정량적 RT-PCR 법의 개발 및 검증을위한 개략적 플로 차트를 도시 U47-600. 프라이머 및 프로브의 특이성은 PCR의 단계별 개발 과정에서 확인되었다. 전용 EHV-2 균주는이 시스템에서 증폭 하였다. 이어서, QRT-PCR의 성능을 특징으로 할 수 있었다. 첫째, 6 10 배 연속 희석 저감 영역 (그림 2)를 설정하기 위해 수행 된 LOD PCR을 추정합니다. 이 예에서, 6 10 배 희석액의 LOD PCR을 추정 (26000 0.26 복사 / 2.5 μL 샘플 사이) 10-5 및 10-10 사이에 이루어졌다. 저감 존 리터(2.6 및 0.26 복사 / 2.5 μL 샘플 사이) 10-9 10 -10 희석 사이 이거 야. 이 경우의 LOD PCR 값을 결정하기 위해, 플라스미드를 6 개의 배 희석액이 경감 영역에서 5.2 0.16 복사 / 2.5 μL 샘플 사이에 이루어졌다. LOD PCR 값은 2.6 복사 / 2.5 μL 샘플이었다. 선형성 범위와 LOQ PCR을 결정하기 위해, LOD PCR 값은 2.6 (LOD PCR) 및 26 카피 / 2.5 μL 샘플 사이 6 10 배 희석액의 범위를 시작하는 데 사용 하였다. (3)는 EHV2위한 선형 회귀를 도시한다 한 실험에서 QRT-PCR. 선형 회귀 (도 4)의 성능은 표 3에 기재된 계산하여 4 번씩 검증된다. 계산의 기준에 따라 선형성 범위를 정의하기 위해 수행되는 절대 편차 나 나 브로UE는 플라스미드 부하의 어떤 수준 난을, 10을 기록 ≤0.25. 이 경우, 직선 2.6 내지 26 카피 / 2.5 μL 샘플을 배치 범위. PCR 정량 한계는 선형 범위의 낮은 농도이다 (즉, 260 카피 / 이때 2.5 μL 샘플). U는 LIN 범위 2.6-260,000 복사 / DNA 2.5 μL, 0.12 로그 (10)로 측정되었다. QRT-PCR (그림 1, 노란색)의 개발 (그림 1, 파란색) 및 특성화 후, AFNOR NF U47-600 규범은 QRT-PCR (그림 1, 오렌지)에 대한 DNA 추출에서 전체 분석 방법의 특성을 권장합니다. (정확도 프로필 표 4에 기재된 바와 같이 진단 민감도와 특이도. 계산 된 전체 QRT-PCR 분석법의 정량 성과를 평가하고, 검증 <strong&gt; 그림 5). 최첨단 분자 기술을 사용하여이 프로토콜은, 우리가 감지하고 호흡기 질환 및 / 또는 감염의 임상 적 의심과 말에서 얻은 172 비강 면봉 샘플에서 EHV-2 바이러스 게놈로드를 정량화 할 수 있었다. EHV-2 분야 (생물) 샘플에서의 발생률이 인구의 50 % (172분의 86)을했다. 정량적 분석은 EHV-2 바이러스 게놈로드는 젊은 말에서 유의하게 높았다 및 바이러스 게놈로드의 재분할 나이 (그림 6) 감소 것을 보여 주었다. 본 연구에서는 가장 높은 EHV-2 바이러스 게놈로드 (1.9 × 10 (11) 복사 / ml)를 자마에 (그림 6) 검출되었다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53672/53672fig1.jpg" /> 그림 1 : 개발 (파란색)에 대한 워크 플로우 차트, 정량적 RT-PCR의 특성AFNOR 규범 NF U47-600-2에 따라 (노란색)과 QRT-PCR (오렌지)에 대한 DNA 추출에서 전체 분석 방법의 특성. 워크 플로우 차트 개발을위한 여러 단계를 다시 시작, 정량적 RT의 특성 - PCR 및 QRT-PCR로 DNA 추출에서 전체 분석 방법의 특성. 각 단계의 경우, 워크 플로우 차트가 필요한 실행의 수를 나타냅니다, 희석 수행하고 필요한 분석가의 수를 할 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53672/53672fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53672/53672fig2.jpg" /> 그림 2 : 플라스미드의 6 10 배 연속 희석을 얻을 실시간 PCR 곡선 대표 결과 저감 영역의 결정. 저감 영역을 추정하기 위해, 6 10 배 시리얼희석 10-5 사이 (26,000 복사본 / 2.5 μL 샘플) 및 (10) -10 (0.26 복사 / 2.5 μL 샘플을) 만들어집니다. 저감 영역은 10 -9의 희석 사이 (2.6 복사 / 2.5 μL 샘플) 및 (10) -10 (0.26 복사 / 2.5 μL 샘플)에있다. 이 경우, 플라스미드의 6 두 배 연속 희석은 5.2 및 0.16 복사 / 2.5 μL 샘플 사이의 LOD 95 % PCR을 결정하기 위해이 감소 영역에서 이루어졌다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53672/53672fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/53672/53672fig3.jpg" /> 도 3. EHV2 QRT-PCR을위한 선형 회귀 정량 시험의 선형성이 특정 범위 내에 존재하는 타겟 용액의 농도에 비례하는 결과를 생성 할 수있는 능력이다. 이것은 의해 모델링 될 수있다선형 회귀 계기 응답 (사이클 임계 값 또는 코네티컷)와 대상의 양의 로그 사이 (Y = 도끼 + B) (목표 복사 / 2.5 μL 샘플의 수). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53672/53672fig3large.jpg" target="_blank">여기를 클릭하십시오이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다 .</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/53672/53672fig4.jpg" /> 그림 4 :. EHV-2 qPCR에의 선형 회귀의 성능 평균 바이어스 (측정 된 플라스미드 양 사이의 평균 차이를 나타냅니다 <img alt="fig4-1" src="/files/ftp_upload/53672/fig4-1.jpg" /> ) 각 플라스미드 수준에 대한 이론적 인 플라스미드 양 (X &#39;내가). 수직 막대는 식에 의한 선형성 불확도 (U LINi)를 나타냅니다 <img alt="fig4-2" src="/files/ftp_upload/53672/fig4-2.jpg" /> SD&#39;i는 표준 편차 오는 곳<html> f를 측정 플라스미드 양. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53672/53672fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/53672/53672fig5.jpg" /> 도 5 :. EHV-2 QRT-PCR 방법의 검증 결과에 기초하여 정밀도 정보 녹색 선 (원) 데이터의 진위 (계통 오차 또는 바이어스)를 나타낸다. 수용 한계는 실험실 (점선)에 의해 ± 0.75 로그 (10)에 정의되어 있습니다. 하부 및 상부 정확도 한계 신뢰성 데이터 (레드 라인)의 두 배 표준 편차 ± 평균 바이어스 각 플라스미드 부하 수준을 측정 하였다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53672/53672fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 1 &quot;&gt; <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/53672/53672fig6.jpg" /> 그림 6 :. EHV-2 시대에 따른 바이러스 게놈로드의 정량 EHV-2 비강 면봉 샘플에서 검출의 바이러스 게놈로드 분포는 서로 다른 연령 그룹에 대한 표현된다. 수평 라인은 표준 편차 (m = 개월) 내에서 중간 값을 나타냅니다. * 뉴먼 - Keuls 사후 테스트 (P &lt;0.05)와 ANOVA에 의해 크게 다른. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53672/53672fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 표적 유전자 </td><td colspan="3"> 프라이머, 프로브 및 plasmide 서열 (5&#39;-3 &#39;) </td><td> 염기 위치 </td><td> 제품 크기 (뉴클레오티드) </td><td colspan="2"><strong&gt; 열 사이클링 조건 </td><td> 참조 </td></tr><tr><td rowspan="4"> EHV2 GB (HQ247755.1) </td><td colspan="3"> 정 : GTGGCCAGCGGGGTGTTC </td><td> 2,113에서 2,130 사이 </td><td rowspan="4"> (78) </td><td> 95 ° C 5 분 </td><td></td><td rowspan="4"> (11) </td></tr><tr><td colspan="3"> 역 : CCCCCAAAGGGATTYTTGAA을 </td><td> 2,189에서 2,170 사이 </td><td> 95 ° C 15 초 </td><td rowspan="2"> 45주기 </td></tr><tr><td colspan="3"> 프로브 : FAM-CCCTCTTTGGGAGCATAGTCTCGGGG-MGB </td><td> 2,132에서 2,157 사이 </td><td> 60 ℃ 1 분 </td></tr><tr><td colspan="3"> 플라스미드 : ACCTGGGCACCATAGGCAAGGTGGTGGTCA ATGTGGCCAGCGGGGTGTTCTCCCTCTTTG GGAGCATAGTCTCGGGGGTGATAAGCTTTTT CAAAAATCCCTTTGGGGGCATGCTGCTCATA GTCCTCATCATAGCCGGGGTAGTGGTGGTG TACCTGTTTATGACCAGGTCCAGGAGCATAT ACTCTGCCCCCATTAGAATGCTCTACCCCGG GGTGGAGAGGGCGGCCCAGGAGCCGGGCG CGCACCCGGTGTCAGAAGACCAAATCAGGA ACATCCTGATGGGAATGCACCAATTTCAG </td><td> 2081에서 2381 사이 </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> 표 1 :.이 프로토콜에 사용되는 프라이머, 프로브 및 긍정적 인 합성 DNA 컨트롤 시퀀스 플라스미드의 순서 (양의 합성 DNA)의 위치를 EHV2gB 시퀀스 (HQ247755.1)의 2081에서 2381 사이 뉴클레오티드에 해당합니다. 이 프로토콜에서 사용되는 프라이머 및 프로브의 설계는 특정 소프트웨어를 이용하여 수득 하였다. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2"> 병원체 </td><td rowspan="2"> 참조 (원점) </td><td rowspan="2"> 균주의 수 </td><td> 결과 </td></tr><tr><td> EHV-2 </td></tr><tr><td rowspan="2"> EHV-2 </td><td> VR701 (ATCC) </td><td row스팬 = &quot;2&quot;&gt; 20 </td><td rowspan="2"> 양 </td></tr><tr><td> 20 샘플 (FDL 컬렉션) </td></tr><tr><td rowspan="2"> EHV-5 </td><td> KD05 (GERC) </td><td rowspan="2"> (20) </td><td rowspan="2"> 부정 </td></tr><tr><td> 20 샘플 (FDL 컬렉션) </td></tr><tr><td rowspan="2"> EHV-3 </td><td> VR352 (ATCC) </td><td rowspan="2"> 이 </td><td rowspan="2"> 부정 </td></tr><tr><td> T934 WSV (GERC) </td></tr><tr><td rowspan="2"> EHV-1 </td><td> 켄터키 변형 켄터키 A (ATCC) </td><td rowspan="2"> 삼 </td><td rowspan="2"> 부정 </td></tr><tr><td> 이 샘플 (FDL 컬렉션) </td></tr><tr><td> EHV-4 </td><td> VR2230 (ATCC) </td><td> 1 </td><td> 부정 </td></tr><tr><td> 나귀 헤르페스 바이러스 AHV5 </td><td> FDL 컬렉션 </td><td> 1 </td><td> 부정 </td></tr><tr><td rowspan="2"> 말인플루엔자 바이러스 </td><td> A / 말 / Jouars / / 2006 4 (H3N8) </td><td rowspan="2"> 1 </td><td rowspan="2"> 부정 </td></tr><tr><td> (기탁 번호 JX091752) </td></tr><tr><td> 말 동맥염 바이러스 </td><td> VR796 (ATCC) </td><td> 이 </td><td> 부정 </td></tr><tr><td> 로도 코커스 동등 </td><td> FDL 컬렉션 </td><td> 1 </td><td> 부정 </td></tr><tr><td> 연쇄상 구균 동등의 subsp. Zooepidemicus </td><td> FDL 컬렉션 </td><td> 1 </td><td> 부정 </td></tr><tr><td> 연쇄상 구균 동등의 subsp. 동등 </td><td> FDL 컬렉션 </td><td> 1 </td><td> 부정 </td></tr><tr><td> Coxiella burnetii의 </td><td> ADI-142-100 (Adiagene) </td><td> 1 </td><td> 부정 </td></tr><tr><td> 한 Chlamydophila 보르 투스 </td><td> ADI-211-50 (Adiagene) </td><td> 1 </td><td> 부정 </td></tr><tr><td> 클레 브시 엘라의 PNEUmoniae </td><td> FDL 컬렉션 </td><td> 1 </td><td> 부정 </td></tr></tbody></table> 표 2 : EHV-2 QRT-PCR의 분석 특이성. <img alt="표 3" src="/files/ftp_upload/53672/53672table3.jpg" /> 표 3 : (NF U47-600-2 12에서 적응) 바이어스 및 선형성 불확실성의 계산. 각 시험을 위해, 선형 회귀의 성과 (Y = AX는 + b) Y가 얻어지는 사이클 임계 값 테이블을 이용하여 검증 A는 기울기가 얻어진다. X는 플라스미드 레벨이고, B는 절편 나 플라스미드 인 레벨 (I, K는 레벨 1에서 변한다) t에서 K 사용한 플라스미드 레벨의 수이다 (예를 들면, K = 6그의 테이블), j는 (j는 I 시험 1에서 다름) 재판이다는, 나는이 테이블의 예를 들어 I = 4) (3, 6 시험 사이를 포함, 임상 시험의 수 X I는 각각 추정 된 플라스미드 양이다. 나는 수준을 플라스미드. x는 내가 수준을 플라스미드 각각에 대한 전 = 10 로그 (X I) &#39;내가 방정식 X 얻어진 이론적 인 플라스미드 양이다&#39;. 각 J 시험 동안, 사이클 임계 값은 각 I 얻어 플라스미드 레벨은 선형 회귀로 계산된다 y를 난, J는 J의 X I, J + ㄴ J를 =. <img alt="표 3-1" src="/files/ftp_upload/53672/table3-1.jpg" /> 시험 J 동안 측정 된 플라스미드 양이다. 바이어스 전 </<html> 서브&gt; 측정 된 플라스미드 수량 및 각 시험에 대한 이론적 인 플라스미드 수량과 각 플라스미드 수준 사이에 관찰 된 차이입니다. <img alt="table3-2" src="/files/ftp_upload/53672/table3-2.jpg" /> 평균 값은 <img alt="table3-3" src="/files/ftp_upload/53672/table3-3.jpg" /> 각하여 내가 수준을 플라스미드, SD는 &#39;내가 측정 량의 표준 편차 <img alt="table3-4" src="/files/ftp_upload/53672/table3-4.jpg" /> 각각의 난에 대한 플라스미드 수준 바이어스 평균은 바이어스 난의 평균이며, U LINi 내가 SD&#39;i 계산 수준을 플라스미드와 편견을 의미 각각에 대해 결정된 선형성 불확실성이다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53672/53672table3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 1 &quot;FO : 유지-together.within 페이지 =&quot;1 &quot;FO : 유지 -에 - next.within 페이지 =&quot;항상 &quot;&gt; <tbody><tr><td></td><td></td><td colspan="2"> 샘플의 실제 상태 </td></tr><tr><td></td><td></td><td> 양 </td><td> 부정 </td></tr><tr><td rowspan="3"> 결과는 모든 방법을 얻을 </td><td> 양 </td><td> RP (실제 양) </td><td> FP (위양성) </td></tr><tr><td> 부정 </td><td> FN (위음성) </td><td> RN (실제 음) </td></tr><tr><td> 합계 </td><td> RP + FN </td><td> FP + RN </td></tr><tr><td></td><td></td><td> 자체 = RP / (RP + FN) </td><td> SP = RN / (RN + FP) </td></tr></tbody></table> 표 4. 전체 진단 방법의 민감도의 계산 (SE)와 특이도 (SP)는 슈 테이블은 confid을 계산 하였다NF U47-600-2에 기재된 전체적인 방법의 민감도 및 특이도는 95 %에서 런스 인터벌.

여기에서는 말의 호흡기액에서 EHV-2 DNA의 검출 및 정량화에 사용되는 정량적 PCR 방법의 개발 및 검증을 위한 프로토콜을 제시합니다. EHV-2 qRT-PCR 검증 프로토콜에는 개발, qRT-PCR 분석 단독의 특성화 및 전체 분석 방법의 특성화의 세 부분으로 구성된 절차가 포함됩니다.

호흡기 유체의 Equid 헤르페스 바이러스-2 진단에 대한 정량적 PCR 방법의 개발 및 검증

The protocol describes a quantitative RT-PCR method for the detection and quantification of EHV-2 in equine respiratory fluids according to the NF U47-600 ...

qPCR 방법의 전반적인 목적은 말의 생물학적 시료 내 equine herpesvirus-2의 바이러스 양을 평가하는 것입니다. 이 방법은 말 호흡기 질환의 진단 분야에서 핵심적인 질문에 답하고, 임상의를 위한 새로운 해석 보조 도구에 대한 정량적 데이터를 제공하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 민감도가 높고 특이적이며 신속한 방법이라는 점입니다.또 다른 장점은 국제 표준화 위원회의 프랑스 대표 기관인 AFNOR 표준 NF U47-600에 따라 개발되었다는 점입니다. 절차 시연은 저희 유닛의 신진 연구원인 Erika Hue가 맡겠습니다. 호흡기 액체 생물학적 시료에서 핵산을 추출하려면, 흄 후드 아래에서 생물학적 시료 140 µL를 용해액 560 µL에 첨가한 후 실온에서 10분 동안 배양하십시오.시료에 ethanol 560 µL를 추가하고, 전체 용액 중 630 µL를 실리카 컬럼에 넣은 후 원심분리합니다. 남은 630 µL를 다시 실리카 컬럼에 넣고 원심분리합니다. 시료를 컬럼에 모두 처리한 후, 세척 완충액 AW1과 AW2를 각각 500 µL씩 사용하여 컬럼을 두 번 세척합니다.그런 다음 컬럼에서 핵산을 용출시키기 위해 상온의 elution 버퍼 또는 AVE 버퍼 50 µL를 첨가합니다. 캡을 닫고 상온에서 1분 동안 배양합니다. 이후 6,000 ×g에서 1분 동안 원심분리합니다.DNA를 증폭시키기 위해, 텍스트 프로토콜에 따라 프라이머와 프로브를 적정시킨 후, PCR 마스터 믹스 12.5 µL, 20 µM 정방향 및 역방향 프라이머, 10 µM 프로브를 넣고 22.5 µL가 될 때까지 초순수를 적절히 추가하여 각 반응당 22.5 µL의 반응 혼합물을 준비합니다. 오염을 방지하기 위해 PCR 반응 혼합물은 항상 지정된 구역에서 준비하십시오. 96웰 플레이트의 각 반응 웰에 적절한 반응 혼합물 22.5 µL를 분주합니다.추출 및 PCR에 대한 음성 대조군을 포함하여 시약에 원치 않는 DNA가 오염되지 않았는지 확인하십시오. 다음으로 샘플, 추출 음성 대조군, PCR 음성 대조군 또는 양성 대조군 샘플 2.5 µL를 각각 해당 반응 웰에 첨가합니다. 그런 다음 접착식 플레이트 씰을 사용하여 플레이트를 덮습니다.그런 다음 6,000 gs에서 10초 동안 원심분리합니다. 플레이트를 실시간 PCR 시스템에 넣습니다. 그런 다음 여기에 표시된 분석 레이아웃 템플릿과 PCR 프로그램 설정을 선택하고 실행을 시작합니다.실시간 PCR 시스템에서 스프레드시트로 원시 데이터를 전송한 후, 각 샘플의 임계 사이클(threshold cycle)을 얻기 위해 증폭 플롯의 임계값을 베이스라인 위쪽이자 지수 성장 영역 내로 설정하십시오. 각 포인트 표준 세트를 표준 곡선으로 플로팅하여 선형성을 확인하십시오. 그런 다음 표준 곡선을 기반으로 서로 다른 샘플의 카피 수를 계산하십시오.qRT-PCR 결과의 검출 한계를 결정하기 위해, 6개의 튜브에 초순수 90 µL씩 분주합니다. 완충 구역을 대상으로 하는 플라스미드의 10배 단계 희석액 6개를 준비하려면, 먼저 플라스미드 작업 희석액 10 µL를 초순수 90 µL가 들어 있는 튜브로 옮깁니다. 튜브를 짧게 볼텍싱하고 원심 분리합니다.그런 다음 튜브에서 10 µL를 다음 물 튜브로 옮깁니다. 볼텍싱과 원심분리를 거친 후, 모든 물 튜브에 플라스미드가 들어갈 때까지 이 이동 과정을 반복합니다. 이 비디오의 앞부분에서 설명한 대로 10배 단계 희석된 6개의 샘플에서 DNA를 증폭시킨 후, 양성 신호가 나타나는 마지막 희석 단계이자 검출되지 않는 첫 번째 희석 단계인 감소 구역(abatement zone)을 결정합니다.6단계의 2배 연속 희석액을 준비하려면, 6개의 튜브에 초순수 25 µL씩 분주하십시오. 10배 희석 시리즈에서 양성 신호를 나타낸 마지막 플라스미드 희석액 튜브에서 25 µL를 취해 첫 번째 물 튜브로 옮깁니다. 볼텍싱과 원심분리를 수행한 후, 방금 시연한 것과 동일한 방식으로 나머지 5단계의 희석액을 준비하십시오.이 비디오의 앞부분에서 설명한 대로 2배 연속 희석액의 DNA를 증폭하십시오. 세 번의 독립적인 실험에서 DNA 증폭을 완료한 후, 각 플라스미드 농도 수준에 대해 24개의 반복 시료 중 양성 반복 시료의 수를 계산하십시오. 24개의 반복 시료 중 23개의 양성 반복 시료가 검출되는 수준인 95% 신뢰 수준의 LOD 또는 LOD 95% PCR을 결정하십시오.본 방법의 검출한계(LOD)를 결정하기 위해, 양성 신호를 나타낸 10배 희석액의 마지막 농도보다 4배 더 농축된 플라스미드 작업 희석액 25 µL를 시작으로 5단계의 2배 연속 희석액을 준비합니다. 증폭 단계에 사용되는 플라스미드는 오염을 방지하기 위해 지정된 구역에서 준비된 플라스미드 작업 희석액을 사용합니다. 이는 매우 중요한 단계입니다.플라스미드의 각 희석액에서 5 µL를 취해, 음성 대조 시료 135 µL가 들어 있는 4개의 튜브에 각각 옮겨 5가지 양성 표준물질에 대한 4개씩의 반복 시료를 준비합니다. 5가지 양성 표준물질의 반복 시료 4개에 대해 추출을 수행하고, 이 영상의 앞부분에서 설명한 증폭 과정을 진행합니다. 각 플라스미드 농도 수준별로 8개의 반복 시료 중 양성으로 나타난 반복 시료의 수를 계산합니다.마지막으로, 8회 반복 실험 중 8회 모두 양성으로 나타나는 최하위 농도인 검출한계(LOD)를 결정합니다. 이 영상에서 설명하는 정량적 RT-PCR 방법은 호흡기 액체 내의 equid herpesvirus-2를 검출하고 정량화합니다. 본 실험에서는 10배 단계 희석을 수행하여 희석 배수 10⁻⁹에서 10⁻¹⁰ 사이의 감소 구역(abatement zone)을 추정하였습니다.LOD PCR 값은 감쇄 구역 내의 새로운 2배 연속 희석을 통해 결정되었습니다. 선형 범위와 LOQ PCR을 결정하기 위해, LOD PCR 값인 2.6과 샘플 2.5 µL당 260,000 copies 사이에서 10배 연속 희석을 6단계로 수행하여 범위를 설정하였으며, 이때 LOD PCR 값을 시작점으로 사용하였습니다. LOQ PCR은 선형 범위 내에서 가장 낮은 농도를 의미합니다.전체 방법의 특성 분석은 호흡기 시료로부터의 DNA 추출부터 표적의 증폭 및 정량에 이르기까지 qRT-PCR 데이터를 얻는 데 필요한 모든 단계의 검증을 의미합니다. qRT-PCR 전체 분석 방법의 정량적 성능은 이 그래프에 나타낸 정확도 프로파일을 통해 평가 및 검증되었습니다. 호흡기 질환이 있는 말의 비강 스왑 시료 172개에 대한 EHV2 바이러스 게놈 부하량이 여기와 같이 정량화되었습니다.어린 말에서 바이러스 게놈 부하가 더 높게 나타났으며, 최대 1.9 × 10¹¹ copies/mL의 부하가 검출되었습니다. 이 기술을 숙달하면 증폭 단계당 2시간 이내에 완료할 수 있으며, 적절하게 수행할 경우 전체 검증 단계를 4주 이내에 마칠 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때는 특히 플라스미드 용액을 다룰 때 오염 위험을 피하는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오.본 절차 이후에는 게놈 식별과 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 시퀀싱과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 DNA의 추출 및 증폭 방법과 PCR 산물을 특성화하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 병원체와 같은 생물학적 샘플을 다루는 작업은 매우 위험할 수 있다는 점을 잊지 마십시오.본 절차를 수행하는 동안에는 항상 후드 내에서 작업하고 적절한 생물 안전 등급 구역을 이용하는 등의 예방 조치를 취해야 합니다.

development-validation-quantitative-pcr-method-for-equid-herpesvirus

Research

연구

JoVE Journal

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나노 크기의 PCR에 의한 DNA 및 RNA 기반 병원균 높은 처리량 테스트는 syndromic 개와 말 호흡기 PCR 패널을 사용하여 설명한다.

나노 PCR에 의한 동물 표본의 호흡기 병원체의 높은 처리량 검출

높은 처리량,이 연구에 설명 합니다 호흡 syncytial 바이러스 (RSV)에 대 한 특정 중화 항 체 titer를 확인 하려면 이미징 기반 마이크로 중화 분석 결과. 이 분석 결과 형식은 다른 샘플 형식에 대해 테스트 되었습니다.

향상 된 높은 처리량 호흡 Syncytial 바이러스 (RSV) 마이크로 중화 분석 결과

우리를 생성 하는 방법을 설명 하 고 RSVs에 대 한 호흡 syncytial 바이러스 (RSVs)와 최적화 된 패 분석 결과 수정 유전자 증폭. 우리는 두 재조합 바이러스는 각각 RSV 복제의 정량화를 허용 하 고 라이브 RSV 포함 몸과 포함 시체 관련 된과 립 역동성의 분석을 생성 하 여이 프로토콜을 설명 합니다.

생성, 증폭 및 재조합 호흡 Syncytial 바이러스의 적정

중첩 된 범-리스 사 바이러스는 역 전사 중 합 효소 연쇄 반응을 특이 적으로 알려진 모든 리즈 사 바이러스를 검출 하기 위해 개발 되었다. 다른 동물 종의 광견병 뇌 샘플을 이용한 검증은이 방법이 금 표준 형광 항 체 시험에 상응 하는 민감도 및 특이성을 가지 며, 일상적인 광견병 진단을 위해 사용 될 수 있음을 보여주었다.

Lyssaviruses 검출을 위한 보편적 중첩 역방향 전사 중 합 효소 연쇄 반응의 평가

우리는 뇌 생검 샘플링에서 최종 해석에 이르기까지 신속한 면역 크로마토그래피 진단 테스트 (RIDT)를 사용하여 필드 조건하에서 동물 광견병의 사후 진단을위한 완전한 프로토콜을 제시합니다. 우리는 또한 분자 분석 및 바이러스 성 지노티핑을 위한 장치를 사용하여 추가 응용을 설명합니다.

추가 분자 응용을 가진 자원 제한 적인 설정을 위한 필드 사후 광견병 급속한 면역학로토그래피 진단 시험

여기에서 우리는 유전자 치료 벡터의 임상 개발을 지원하기 위해 액적 디지털 중합효소 연쇄 반응에 의한 인간 눈물에서 아데노 관련 바이러스 벡터의 규정 준수 검출에 대한 우수 실험실 관행의 개발 및 검증을 위한 프로토콜을 제시합니다.

눈물의 바이오셰딩 연구에서 아데노 관련 바이러스 벡터의 검출을 위한 검증 가능한 액적 디지털 중합효소 연쇄 반응 분석

학습하세요 말 호흡기 유체에서 Equid 헤르페스 바이러스-2를 정량적 PCR로 검출하는 방법을. 이 기술은 수의학 진단에서 바이러스 부하를 정확히 측정하여 임상 의사결정을 지원합니다.

호흡기 유체의 Equid 헤르페스 바이러스-2 진단에 대한 정량적 PCR 방법의 개발 및 검증

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