WERKWIJZE Geïsoleerde

Het algemene doel van deze procedure is het opzetten van een consistent ex vivo longperfusiemodel bij ratten dat reproduceerbare resultaten oplevert. De eerste stap is de canulatie van de trachea en het starten van de mechanische ventilatie. Vervolgens worden de arteria pulmonalis en het linker atrium gecanuleerd.

De laatste stap is het verwijderen van het hart-longblok uit de borstholte en het plaatsen ervan in het circuit voor ex vivo longperfusie. Uiteindelijk worden druksensoren, weegcellen en een bloedgasanalyser gebruikt om de toestand van de long in real-time weer te geven door de pulmonale arteriële druk en andere parameters te meten. Ex vivo longperfusie is een opmerkelijke technologie die ons in staat heeft gesteld de donorpool voor longtransplantaties uit te breiden.

We verwachten dat we, door deze technologie als platform voor orgaanevaluatie in te zetten, de kwaliteit van de organen die voor transplantatie worden aangeboden en de algemene transplantatieuitkomsten kunnen verbeteren. Hier in het Copper-laboratorium hebben we de term 'het orgaan bewapenen' geïntroduceerd, wat staat voor het beoordelen, remodelleren of herstellen, en vervolgens het orgaan modificeren om de kwaliteit en daarmee de transplantatieuitkomsten te verbeteren. We hebben een robuust en reproduceerbaar klein-diermodel in ratten ontwikkeld voor ex vivo longperfusie.

In deze video demonstreren we de belangrijkste en cruciale stappen voor het ontwikkelen van dit ex vivo longperfusiemodel, dat vervolgens kan dienen als platform voor onderzoek naar perfusie en transplantatie. Begin met het opzetten van het EVLP-circuit en het circuleren van warm perfusaat door het systeem. Stel het warme waterbad, de warmtewisselaar en de kunstmatige thorax in op 37 °C.

Leid een gedeoxygeneerd oxygenatiegas via het gasfilter door de PERFUSE eight om te garanderen dat er ongeveer 6% opgeloste zuurstof aanwezig is voor het experiment. Sluit na het openen van het programma voor gegevensverwerving de druktransducer voor de arteria pulmonalis, de differentiële druktransducer voor de trachea, de differentiële druktransducer voor de respiratoire flow, de transducer voor het longgewicht en de transducer voor de pumpsnelheid aan op de analoog-naar-digitaal omzetterkast. Stel tot slot de operatietafel in en bereid alle operatieinstrumenten en benodigdheden voor die nodig zijn voor de procedure.

Nadat de sedatie via een teenknijptest is geverifieerd, wordt het geanestheseerde dier in rugligging op de operatietafel geplaatst. Start de gegevensregistratie met behulp van het programma voor gegevensverwerving. Wanneer u klaar bent, opent u de buikholte en injecteert u heparine in de vena cava inferior.

Volg de standaardprocedures om de trachea te canuleren en verbind de canule met een beademingscircuit. Zet de mechanische ventilator aan om de longen mechanisch te beademmen. Trek vervolgens de borstholte open om de longen bloot te leggen, waarbij u er zorg voor draagt deze niet aan te raken.

Verwijder de thymus en verschuif de abdominale inhoud naar één zijde om ofwel de vena cava inferior of de vena mesenterica bloot te leggen. Plaats na euthanasie een zijden hechtdraad achter de arteria pulmonalis en de aorta. Ter voorbereiding op het vastzetten van de canule in de arteria pulmonalis wordt een incisie van twee tot drie millimeter gemaakt op het voorvlak van de uitstroombaan van het rechterventrikel, waarna de canule in de arteria pulmonalis الرئيسية wordt ingevoerd.

Zet vast met een zijden hechtdraad, verwijder stolsels uit de pulmonale vasculatuur door ongeveer 15 milliliters van een elektrolytenoplossing met een laag kaliumgehalte via de arteria pulmonalis en uit via de apex van het hart te perfunderen. Plaats vervolgens een zijden hechtdraad achter het hart en rond de ventrikels. Om de mitralisklep te dilateren en de canulatie te vergemakkelijken, steekt u een kleine chirurgische pincet via de apex door de mitralisklep in het linker atrium.

Wanneer u er klaar voor bent, brengt u een canule via de mitralisklep vanuit de apex in het linker atrium in. Zet de canule van het linker atrium vast met de zijden hechtdraad. Sluit vervolgens de canule van de longslagader aan op het EVLP-circuit.

Zorg ervoor dat de instroomleiding vanuit het circuit is geprimed met perfuse eight. Om te voorkomen dat er lucht in het hart en de longen terechtkomt, schakelt u de hoofdperistaltische pomp in en stelt u deze in op een lage snelheid. Hierdoor kan perfuse eight door de longslagader en via de linker ventrikel de borstholte in stromen.

Houd de druk in de longslagader in de gaten om er zeker van te zijn dat deze niet plotseling stijgt, wat zou kunnen duiden op een blokkade of een onjuiste canulatie. Zet de peristaltische pomp uit wanneer u klaar bent. Sluit de canule van de longslagader aan op het circuit voor ex vivo longperfusie.

Sluit de canule van het linker atrium pas aan op het circuit nadat het hart-longblok uit het lichaam is verwijderd. Verwijder het hart-longblok door de slokdarm met een hemostaat af te klemmen en eronder door te snijden, zodat de slokdarm kan worden gebruikt om de cardiopulmonale structuren stomp op te tillen; dissekeer het omringende weefsel weg en snijd de aorta descendens en de hulpvaten door om het hart-longblok vrij te maken terwijl u dit via de slokdarm optilt. Transecteer de trachea om het hart-longblok volledig vrij te maken en plaats het op de aangewezen locatie in het EVLP-circuit.

Sluit vervolgens de canule van het linker atrium aan op de uitstroomlijn en start de peristaltische pomp. Om ventilatiedata te registreren en de druk te bewaken, verwijdert u snel de ventilatielijn van de bovenzijde van het EVLP-apparaat en bevestigt u de behuizing met de druksensoren. Plaats daarna de ventilatielijn opnieuw boven op het EVLP-apparaat.

Zorg ervoor dat de luchtbelvangst voldoende is gevuld met perfuse eight. Om te voorkomen dat er tijdens de eerste 15 minuten luchtbellen in de longen terechtkomen, moeten de ventilatie- en perfusie-instellingen langzaam worden gewijzigd naar de gewenste experimentele waarden. Verhoog tijdens deze initiële opstartfase ook de perfusiedebiet en de druk naar de gewenste waarden.

Het wordt aanbevolen om de ventilator zo te programmeren dat er intermitterende zijwaartse beademingen worden gegenereerd om de afvoer van vloeistof uit de longruimte te vergemakkelijken en het ontstaan van oedeem te vertragen. Definieer tijd nul als het moment waarop de beademingsparameters zijn ingesteld op een tidal volume van 4 ml/kg positief. End-expiratoire druk op 2 cm.

De H2O- en perfusieparameters bevinden zich op de verwachte niveaus en blijven constant. Indien gewenst, neem acht monsters via de monsterpoort, bevries deze direct in vloeibare stikstof en noteer het tijdstip waarop de monsters zijn afgenomen. Wanneer het experiment is voltooid, isoleer dan de benodigde anatomische delen voor verzameling en bevries deze direct in vloeibare stikstof of plaats ze in een fixeeroplossing voor verdere studies.

Het longgewicht van mannelijke Sprague-Dawley-ratten veranderde na de eerste 10 minuten niet significant gedurende 60 minuten ex vivo longperfusie. Er was ook geen verandering in de pulmonale arteriële druk. Op soortgelijke wijze werd de pulmonale vasculaire weerstand niet beïnvloed gedurende de duur van de studie.

Na één uur ventilatie met hoge teugvolumes en een hoge PEEP waren de concentraties pro-inflammatoire cytokinen verhoogd in de PERFUSE-groep, terwijl de concentraties anti-inflammatoire cytokinen ongewijzigd bleven. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in de belangrijkste stappen die nodig zijn om een ex vivo longperfusiemodel voor kleine dieren in ratten in uw laboratorium op te zetten.