세균 표면 운동성 분석의 준비, 이미징 및 정량화

이 절차의 전반적인 목표는 스웜(swarming)이라고 하는 박테리아 표면 운동성을 재현 가능한 표준 방식으로 시각화하고 정량화하는 것입니다. 이것은 먼저 표면 운동성 플레이트를 준비하고 경화함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 표면 운동성 분석 플레이트에 박테리아를 접종하고 통제된 환경에서 이러한 플레이트를 배양하는 것입니다.

다음으로, 플레이트 분석의 박테리아 성장 패턴을 실시간으로 이미지화합니다. 절차의 마지막 단계는 정량화를 위해 이미지를 처리하는 것입니다. 궁극적으로 이 절차는 표면 모달 박테리아에 대한 군집 확장률 또는 바이오 제품 밀도 분포와 같은 정량적 동적 정보를 생성하기 위해 표면 운동성 플레이트 분석 준비를 위한 표준화된 프로토콜을 제공합니다.

많은 그룹이 표면 운동성 분석을 수행합니다. 이 기술의 주요 장점은 불일치로 이어질 수 있는 여러 변수를 최소화하는 체계적인 프로토콜을 제공한다는 것입니다. 이 방법은 박테리아가 다양한 유형의 표면에 어떻게 서식하는지와 같은 박테리아 표면 운동성 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이 방법은 약간의 수정을 통해 슈도모나스 군집 운동성에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 다른 표면 모달 박테리아를 연구하는 데에도 적용할 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 프로토콜 또는 실험실 환경의 작은 변화가 스웜 분석 결과에 큰 영향을 미칠 수 있기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 대학원생인 Morgan입니다.

프로토콜을 시작하려면 200ml의 FAB에서 황산암모늄 군집 배지, 0.9g의 고귀한 한천 및 0.2g의 카이노산을 500ml 배지 병에 결합하여 농업 혼합물을 준비합니다. 교반 플레이트를 사용하여 미디어를 완전히 혼합하십시오. 다음으로, 빠른 환기 옵션을 사용하여 섭씨 121.1도로 설정된 오토클레이브에서 22분 동안 매체를 살균합니다.

살균 직후 미디어 병 뚜껑을 조여 물 증발을 방지하십시오. 매체를 자기 교반 플레이트에 놓고 활성 교반이 있는 주변 온도 환경에서 AED를 섭씨 50도로 냉각합니다. 나중에 실험 시점에서 한천을 사용하는 경우 활발한 교반 없이 섭씨 60도의 수조 또는 인큐베이터에서 15시간 동안 따뜻하게 유지할 수 있습니다.

매체가 2밀리리터의 필터 멸균 포도당에서 약 섭씨 50도에 도달하면 표준 멸균 기술을 사용하여 자기 교반 막대와 철저히 혼합하여 매체의 기포 형성을 방지합니다. 후드에서 멸균 혈청학 피펫을 사용하여 7.5ml의 edia를 개별 60mm 페트리 접시에 분취합니다. 더 큰 떼 표면적이 필요한 경우 25리터의 에디아를 100mm 페트리 접시로 분취합니다.

모든 접시를 쌓지 않은 상태로 두고 한천이 굳을 수 있는 수평 표면이 균일한지 확인하기 위해 과녁 수준으로 후드를 확인하십시오. 60mm 플레이트의 경우 접시 뚜껑을 옆으로 치우고 덮개가 없는 한천을 후드에서 30분 동안 경화시킵니다. 100mm 접시가 클수록 경화 시간이 더 길어집니다.

주어진 실험실의 습도, 공기 흐름 및 온도로 인해 박테리아의 최적 군집을 위해 경화 시간을 테스트해야 할 수 있습니다. 건조 후, APL은 원하는 성장기에 별도로 미리 성장된 세포를 즉시 접종해야 합니다. 먼저 새 LB 플레이트에서 분리된 박테리아 군체를 선택하고 6ml의 배양액에 접종합니다. 미디어.

수평 흔들기로 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 배양을 배양합니다. 다음날, 멸균 이쑤시개 또는 와이어 접종 바늘로 한천 표면을 찌르고 건조된 군집 한천 플레이트에 1-5마이크로리터의 하룻밤 배양을 접종하고, 박테리아 균주에 따라 군집 분석 플레이트를 섭씨 30도, 섭씨 37도로 설정된 온도로 설정된 인큐베이터로 옮기고, 또는 섭씨 42도. 과도한 수분이 한천이 아닌 플레이트 뚜껑에 응결되도록 플레이트를 뒤집고, 타임랩스 이미징 직전 2시간 또는 4시간 동안 균주 특정 온도에서 박테리아를 평형화합니다.

다음으로, 농업 표면의 박테리아가 장치의 반전된 카메라를 향해 아래를 향하도록 플레이트를 생체 내 이미징 장치로 옮깁니다. 모든 페트리 접시 뚜껑에 소량의 물을 채웁니다. 그런 다음 뒤집힌 AER 플레이트 위에 물가가 위를 향하도록 각 뚜껑을 놓습니다.

이미징 장치 내부에서 이미징 인클로저를 밀봉하여 일정한 습도 수준을 유지하고 이미징 장치의 이미징 설정을 조정하고 떼 활동의 타임 랩스 이미징을 시작합니다. 실시간 이미징 후 표면 운동성 실험에서 Image J와 같은 표준 이미지 분석을 사용하여 박테리아의 군집 역학을 분석할 수 있습니다. 접종 직전의 한천 수분 함량을 분석하는 것은 성공적인 스벌링 결과를 달성하는 데 중요합니다.

최적으로 AER 플레이트는 긴밀한 접종 지점을 촉진하고 박테리아 군집 활동을 향상시키는 반면, 건조된 플레이트는 수분 함량 외에도 표면 운동성을 억제하는 반면, 배지 첨가제의 유무는 박테리아 균주를 활용하여 발광 또는 형광 단백질을 발현함으로써 배양 온도의 함수로 박테리아의 군집 활동에 영향을 미칠 수 있습니다. 서로 다른 두 박테리아 종 간의 떼지어 경쟁하는 역학 관계를 타임랩스 비디오에 캡처할 수 있습니다. 또한, 박테리아 무리 내에서 지질을 촉진하는 지역 세포 밀도의 변화와 생합성 이동성 속도도 시간 경과 형광 현미경으로 확인하고 정량화할 수 있습니다.

이 절차를 따릅니다. 컨포칼 현미경 검사와 같은 다른 방법을 사용하여 개별 세포 행동에 대한 질문에 답하고 박테리아 표면 운동성에 대한 상세하고 미시적이며 미시적인 분석을 생성할 수 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 재현 가능한 표준 스웜 분석을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것이며, 표면 운동성 분석을 준비, 경화 및 접종하고 박테리아 성장 패턴에서 결과를 처리 및 분석하여 박테리아 표면 운동성에 대한 포괄적인 분석을 얻을 수 있습니다.