유동 세포 계측법을 사용하여 세포 외 소포의 분석을위한 기술

본 절차의 전반적인 목표는 두 가지 서로 다른 방법을 통해 혈액 내 세포외 소포의 순환을 분리하고 분석하는 것입니다. 개별 세포외 소포 검출 방법의 경우, 먼저 혈액 샘플로부터 혈소판 감소 혈장(PPP)을 분리합니다.

그 후 PPP를 관심 대상의 형광색소 결합 항체로 염색합니다. 비드 기반 검출법의 경우, 세포외 소포를 비드와 함께 배양한 다음, 비드에 결합된 소포를 해당 형광색소 결합 항체로 염색합니다. 최종적으로, 유세포 분석을 통해 샘플을 분석함으로써 순환 세포외 소포의 함량을 결정할 수 있습니다.

전자 현미경이나 자성 비드 분리(magnetic bead separation)와 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 속도가 훨씬 빠르며, 특정 하위 집단에 국한되지 않고 전체 세포외 소포체(extracellular vesicle) 개체군을 평가할 수 있다는 점입니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 사용자는 어려움을 겪을 수 있는데, 이는 데이터의 품질을 높이고 일일 변동을 최소화하기 위해 시연된 조작법과 유세포 분석기(cytometer) 설정 매개변수를 엄격히 준수해야 하기 때문입니다. 먼저 전혈 샘플을 원심분리하여 혈장(plasma)을 버피코트(Buffy coat) 및 적혈구와 분리하십시오. 다음으로, 버피코트와 적혈구가 포함된 하층이 섞이지 않도록 주의하면서 혈장 상층액 1.2 mL를 1.5 mL 원심분리 튜브에 분주한 후, 다시 한번 원심분리하여 혈소판과 큰 세포 파편을 제거하십시오.

원심분리가 끝나면 펠렛이 흐트러지지 않도록 주의하며 PPP 샘플의 마지막 200 µL를 제외한 모든 양을 새 튜브로 조심스럽게 옮깁니다. 그다음 혈장을 위아래로 여러 번 섞어주고, 각 샘플 320 µL를 96-웰 플레이트의 첫 번째 행에 옮깁니다. 샘플을 염색하려면, 세 가지 패널 각각에 필요한 항체들을 개별 0.22 µm 원심분리 필터 튜브에 넣고 고정각 단일 속도 원심분리기를 사용하여 항체를 여과합니다.

모든 항체가 필터를 통과하면, 그림에 표시된 대로 혼합물의 적절한 양을 96-웰 플레이트의 각 웰에 추가합니다. 다음으로, 멀티채널 파이펫을 사용하여 PPP 샘플을 혼합한 후, 각 샘플 100 µL를 두 번째 행의 항체들에 옮깁니다. 그런 다음 샘플을 다시 혼합하고, 팁을 교체한 후 적절하게 다음 두 행의 각 항체에 샘플 100 µL를 옮깁니다.

실험을 위해, 생물안전작업대 내에서 각 웰에 220 µL의 PBS를 넣고 6행부터 8행까지 30분 동안 22 °C에서 배양한 후, 플레이트를 4 °C에서 배양하십시오. 그 다음, 팁을 교체하지 않고 간격 조절이 가능한 멀티채널 피펫을 사용하여 각 웰의 내용물을 해당 원심분리 필터 튜브로 옮기십시오.

세척 행 중 하나에서 PBS 200 µL를 사용하여 방금 샘플을 제거한 웰을 헹굽니다. 그다음 헹굼 용액을 이전에 PPP 샘플을 추가했던 동일한 필터로 옮기고 원심분리 필터를 닫습니다. 염색된 모든 PPP 샘플이 헹굼 용액과 함께 옮겨지면, 고정 로터 원심분리기로 샘플을 원심분리합니다.

원심 분리 후, 필터 상단에 액체가 남아 있지 않은지 확인하십시오. 그런 다음 필터 상단을 300 µL의 PBS에 재현탁하고, 재현탁된 내용물을 미리 라벨링된 튜브로 옮겨 즉시 유세포 분석을 수행합니다. 원심 분리 필터를 사용하여 염색된 시료를 세척하면 배경 신호와 양성 마커 신호 사이의 분리능이 향상됩니다.

하지만 엑소좀을 포함한 일부 작은 세포외 소포체는 필터의 기공을 통해 손실될 수 있다는 점에 유의해야 합니다. 샘플을 분석하려면, 먼저 전방 산란광(forward scatter)과 측방 산란광(side scatter) 전압 파라미터를 로그 스케일로 설정하고, 각 파라미터에 대해 사이토미터에서 허용하는 가장 낮은 임계값을 선택하십시오. 그런 다음 0.22 µm 필터로 여과한 PBS 튜브를 실행하면서, 배경 소음의 대부분을 배제할 수 있는 가장 높은 전압 값으로 조정하십시오. 이어서 1 µm 이하의 비드 혼합물이 포함된 튜브를 실행하고, 전방 산란광 대 측방 산란광 도표에서 비드 군집 주위에 게이트를 그려 1 µm 비드 이하의 모든 이벤트를 포착하십시오.

이제 유세포 분석기의 유속을 낮게 설정하고, 비즈를 사용하여 유세포 분석기의 유속 다이얼을 원하는 이벤트 속도로 조정하십시오. 그런 다음 PBS에 희석된 레인보우 형광 입자가 담긴 튜브를 사용하여 5,000개 이벤트를 획득하며, 전방 산란광(forward scatter), 측방 산란광(side scatter) 및 각 색상 채널의 평균 강도 값을 기록합니다. 모든 파라미터 설정이 완료되면, 각 샘플을 정확히 1분 또는 2분 동안 분석하십시오. 각 튜브의 1차 측정이 완료된 후, 각 샘플에 10% MP 40 20 µL를 혼합하고, 동일한 시간 동안 튜브를 다시 측정하여 동일한 기간 동안 용해된 샘플에서 검출된 양성 이벤트를 차감할 수 있도록 합니다.

비드 기반 캡처를 통해 세포외 소포를 검출하려면, 먼저 코팅되지 않은 6 µm 폴리스티렌 비드를 RPMI 배지로 2회 세척한 후, 동일한 배지 2 mL에 재현탁하십시오. 다음으로, 새로운 팍스 튜브(fax tube) 각각에 비드 6,000개를 넣습니다. 음성 대조군 튜브에는 배지 400 µL를 넣고, 나머지 모든 튜브에는 PPP 200 µL 또는 적절하게 초원심분리한 세포외 소포 200 µL와 배지 200 µL를 넣습니다. 각 튜브의 최종 부피를 400 µL로 조정하십시오.

배지를 더 추가합니다. 튜브를 4 °C의 쉐이커에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날 아침, 2 mL의 배지로 비드를 세척합니다.

상층액을 흡입하고 400 µL의 5% bovine serum albumin으로 비특이적 결합을 차단한 후, 4 °C의 쉐이커에서 3시간 동안 반응시킵니다. 3시간 후, 비드를 2 mL의 배지로 두 번 더 세척하고 펠릿을 100 µL의 신선한 배지에 재현탁합니다. 이제 항체를 필터링하고 각 튜브에 적절한 부피의 필터링된 항체 칵테일을 추가한 다음, 4 °C에서 30분 후에 비드를 다시 2 mL의 배지로 세척합니다.

이번에는 펠렛을 400 µL의 배지에 재현탁하고, 방금 시연한 대로 유세포 분석기의 허용 최저 임계값으로 전방 및 측방 산란 파라미터를 조정하여 즉시 샘플을 분석합니다. 마지막으로, 싱글렛 비드 집단에 게이트를 설정하고 샘플당 2000개의 이벤트를 수집합니다. 이 점 도표에서 보는 바와 같이, 개별 검출 방법과 비드 기반 검출 방법 모두 PPP 샘플 내 엑소좀의 존재를 확인하는 데 사용할 수 있습니다. 개별 검출 분석의 경우, 용해된 대조군을 사용하여 해당 미등록 샘플의 게이트를 설정합니다.

대부분의 이벤트는 세포외 소포 게이트(extracellular vesicle gate) 내에 위치해야 합니다. 예를 들어, 이 그림의 이변수 플롯(bi-parameter plot)에서는 세포상에 공존하는 것으로 알려진 두 가지 적혈구 마커인 CD 1 0 8 A와 CD 2 35 A의 검출 결과가 나타나 있습니다. 예상대로 세포외 소포의 양성 이벤트 중 절반 이상이 두 마커 모두에 대해 양성을 보인 반면, 세포상에 공존하지 않는 것으로 알려진 두 마커의 세포외 소포 발현은 비드 기반 검출법을 통해 서로 뚜렷하게 구분되는 양성 집단을 나타냅니다.

양성 집단과 음성 집단 사이의 분리가 일어나지 않으며, 두 종류의 세포 외 소포가 단일 비드에 모두 결합하기 때문에 보통 동일한 세포 유형에서 발견되지 않음에도 불구하고 이중 양성 사분면에 이벤트가 나타납니다. 따라서 이 방법으로 얻은 데이터는 음성 대조군 데이터와 겹쳐진 히스토그램을 사용하여 분석하는 것이 가장 좋으며, 숙련된 경우 대조군과 비교하여 비드 처리된 샘플에서 마커 발현의 뚜렷한 이동을 관찰할 수 있습니다. 이 기술을 적절히 수행하면 개별 검출법으로는 3~4시간 만에, 비드법으로는 1.5일 만에 세 가지 항체 패널을 사용하여 12개의 혈액 샘플을 분석할 수 있습니다.

이 절차를 수행할 때, 각 시료의 처리 과정을 일관되게 유지하는 것이 중요하며, 특히 여러 날에 걸쳐 다수의 시료를 분석하는 경우, 매 실험 시작 시 사이토미터의 유속과 형광 강도가 전날의 실험 설정과 일치하도록 정확하게 조정되었는지 확인해야 합니다.