Name: 유동 세포 계측법을 사용하여 세포 외 소포의 분석을위한 기술 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: 학습하세요 혈액에서 세포 외 소포(EV)를 유동 세포 계측법으로 분석하는 개별 검출 및 비드 기반 방법. 이 기술은 신경과학 및 세포 생물학 연구에 활용됩니다.

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저자는 장비 설정 사이토 흐름에 그의 도움을 혈액 시스템 연구소에서 데일 Hirschkorn에게 감사의 말씀을 전합니다. NIH에 의해 지원되었다이 작품은 HL095470 및 U01의 HL072268과 국방부 계약 W81XWH-10-1-0023 및 W81XWH-2-0028을 부여합니다.

참고 : 다음 프로토콜은 인간의 복지에 대한 모든 제도적 국내 및 국제 지침에 따라 수행되고있다. 모든 인간의 주제 샘플은 기관 검토위원회 (IRB)가 승인 한 프로토콜에서와 주제의 동의와 시험 하였다. 1. 방법 A : 개별 탐지 방법 전기 자동차의 혈액 샘플 / 절연 1.1) 처리 <ol><li> 다음 2 단계 차등 원심 분리 프로토콜을 사용하여 ACD-솔루션 또는 다른 즉시 적절한 항 응고 및 프로세스 (30 분 이내 최대)의 1.5 ml에 포함 된 2 개의 10 ml의 유리 튜브에 기증자 / 환자의 혈액을 그립니다. 참고 :이 프로토콜은 그려진 혈액의 결합 ~ 17 ml의에서 약 10 ml의 혈소판 가난한 플라즈마 (PPP)의를 얻을 것입니다. 다소간 PPP가 필요한 경우, 혈액 수집 튜브의 수는 적절히 조절 될 수있다. </li><li> RT에서 10 분 동안 1,500 XG에서 원심 분리버피 코트와 적혈구에서 혈장을 분리합니다. 버피 코트와 붉은 세포를 포함하는 바닥 층을 방해하지 않도록주의, 1.5 ml의 원심 분리기 튜브에 플라즈마 상층 액의 1.2 분취 량을 전송합니다. </li><li> 혈소판 및 대 세포 단편을 제거하기 위해 RT에서 10 분 동안 13,000 XG 스핀. 조심스럽게 펠렛을 방해하지 않도록하고 새로운 튜브에 PPP를 추가하는 200 ㎕를 뒤에 남겨두고, PPP를 전송합니다. </li><li> 이 시점에서, 나중에 분석을 위해 최대 2 년 (개요도 1a를 참조)에 대한 -80 ° C에서 분석하거나 새로운 1.5 ml의 원심 분리기 튜브에 1.0 ml의 분량에 전송 및 저장 즉시 PPP를 사용합니다. </li><li> 정제 전기 자동차는 초 원심 분리기 튜브에 기능 실험, 전송 PPP 6 ml의 필요와 0.2 μm의 필터링 된 인산염 완충 생리 식염수 28 ㎖ (PBS)를 추가하는 경우. 스윙 버킷 로터가 장착 된 초 원심 분리기를 사용하여 실온에서 10 만 XG에 60 분 동안 회전. 기음 뜨는에 resuspend의 EV 펠1.5 ml의 미디어 보자. 참고 : 가장 높은 재현성, 혈액 샘플을 기증자 기증자로 일관하게 처리해야한다. EV 분리 방법에서의 변화는 상당히 상관 검출 전기차의 수 및 유형에 영향을 미칠 수있다. </li></ol> 1.2) 분석을위한 시료 준비 참고 :이 시점에서, 단계 3 패널 14 마커 12 샘플을 분석하기위한 높은 처리량 프로토콜을 설명합니다. 그러나, 다른 항체의 조합이 여기에 사용될 수있다; 프로토콜은 관심있는 사람들을 위해 제안 된 마커를 대체하여 다른 EV 개체군을 연구하기에 적합 할 수있다. <ol><li> 37 ° C에서 해동 (-80 ° C에 저장하는 경우) 냉장고에서 12 샘플을 제거합니다. </li><li> 피펫 내용을 위아래로 몇 번 혼합합니다. 각 샘플에서 320 μl를 제거하고 96 웰 플레이트의 맨 위 행에 추가합니다. 참고 : 폭 조절 멀티 웰 피펫이와 엉덩이에 걸쳐 많은 다른 단계에 매우 도움이된다네, 한 번에 여러 샘플을 분석 할 때 특히. </li></ol> 1.3) 염색 EV 샘플 <ol><li> 염색하기 전에 긍정적 인 신호를 발생할 수있는 집계를 제거하기 위해 모든 항체 (ABS)를 필터링 할 수 있습니다. <ol><li> Ab의 혼합물 모두는 필터를 통과 한 결합 항체는 2 분 동안 실온에서 고정 된 각도 단일 고속 원심 분리기 (~ 750 XG)를 사용하여 별도의 0.22 μm의 원심 필터 튜브와 원심 분리기 (3) 각 패널에 사용될 때까지 또는 어떠한 항체 액은 필터의 표면에 잔류하지 않는다. 스토어 구간 최대 2 주 동안 냉장고에 칵테일하지만 다시 필터를 사용하기 전에 각각의 시간. </li></ol></li><li> 잘 2 행의 각 여과 Ab의 혼합물의 적절한 금액을 추가 (예를 들면, 나는 각 Ab의 2 μL 묻 패널의 샘플은, 그래서 필터링 Ab의 칵테일 12 μL 총 2 행 잘 당 추가됩니다). 제안 된 판지도의 개요에 대해도 1b를 참조하십시오. 이 또한 반복이상의 패널이 실행되는 경우 아래의 행에의 (여기에 잘 사를 행하기 위해 패널 III 칵테일의 3, 11 μL /는 행 8 μL / 웰 패널 II 칵테일의 추가, 특정 패널 정보에 대한 자료 목록 참조). </li><li> 멀티 채널 피펫을 사용하여, 상하 1 행 PPP 샘플들을 혼합하고 혼합 2. 상하 행의 웰에 1 행의 웰에서 100 μl를 옮긴다. 30 분 동안 4 ° C에서 행 3, 4 품어의 행에 1에서 100 μl를 전송 변경 팁과 반복. </li></ol> 1.4) 세척 MV 샘플 <ol><li> 생물 안전 캐비닛에 96 웰 4 ° C 접시와 전송을 제거합니다. / 잘 행 6-8 PBS의 220 μl를 추가, 멀티 채널 피펫을 사용하여 (/ 린스 스테인드 PPP를 포함하는 우물을 세척에 사용되는). </li><li> 항체의 패널 (3), 12 × 3 = 36 필터 튜브와 함께, 샘플 (12)의 폭 조절이 다중 채널 피펫 (미리 라벨링하여 원심 필터 튜브로 각 웰의 내용물을 옮길 것이다) 필요. 동일한 팁 사용 세척 행에서 PBS 200㎕를 제거하고 PPP 방금 제거 된 대응하는 웰에 추가한다. </li><li> 우물을 씻어 PPP 이전에 추가 된에 동일한 필터로 세척 용액을 전송 아래로 섞는다. 원심 필터의 확대 꼭대기. 변경 팁. </li><li> 모든 스테인드 PPP 샘플을 원심 필터 그들의 린스 솔루션과 함께 전송 될 때까지 남아있는 스테인드 샘플이 과정을 반복합니다. </li><li> RT에서 3 분 동안 850 XG에 고정 된 회 전자 원심 분리기 스핀에​​ 원심 필터를 전송합니다. 참고 : 어떤 액체가 필터 꼭대기에 남아 있는지 확인합니다. 원심 분리 후, 필터는 눈에 보이는 유체 층 위에 남아 없습니다 함께 &quot;건조&quot;로 나타납니다. 가능성이 있지만, 특정 PPP 샘플은 필터를 통해 효과적으로 이동 원심 긴 시간을 필요로 할 수있다. </li><li> 원심 필터 튜브를 제거하고 생물 안전 캐비닛으로 돌아갑니다.멀티 채널 피펫을 사용하여 300 ㎕의 PBS에 필터의 상단을 재현 탁. 재현 탁 내용이 즉시 FCM 분석을위한 튜브를 표지가 미리 전송합니다. 주 : 샘플 간 변동을 피하기 위해 샘플 간의 일관성 피펫 플런저 함몰 힘과 수를 유지하는 것이 매우 중요하다. 이 이상적으로 최대 특정 볼륨 아래로 피펫하도록 프로그램 된 전자 피펫을 사용하여 수행해야합니다 (예를 들어, 280 μL), 각 샘플에 대한 시간 (예를 들어, 8 회)의 정확한 숫자. </li></ol> 1.5) 사이토 설치 <ol><li> FCM 소프트웨어를 엽니 다. , 설정 실험 (제조업체의 지침에 따라) 장비 설정 비즈를 사용하여 매일 계측기 교정 및 설치를 수행하기 전에. </li><li> EV 샘플 하나 이상의 항체로 염색 한 경우 다수의 형광체는 다음과 같이 보정 값을 계산 한번에 측정한다 : <ol><li> 이전으로 보상 구슬 2 방울을 추가표지 된 튜브 (각 Fluorochrome과 접합 된 항체 1 관)과 항체의 권장 금액을 추가합니다. 흠 보상 제어로 사용할 다른 튜브에 부정적인 보상 구슬 2 방울을 추가합니다. </li><li> 30 분 동안 4 ° C에서 품어 PBS 400 μL에 PBS와 resuspend에 씻어. </li><li> 기기에 포함되어있는 소프트웨어 흐름 cytometer를 사용하여 각 보상 튜브를 실행하고 5 년간의 로그 스케일에 약 10 4 각 피크를 배치 형광 전압을 조정합니다. 형광 피크가 다른 채널에 비해 자신의 형광 채널에서 가장 높은 (밝은)되어 있는지 확인하고 필요한 경우 다시 형광 매개 변수의 전압을 조정합니다. 각 개별적으로 염색 미리 튜브를 실행하고 튜브 당 최소 5,000 개의 이벤트를 포착 할 수 있습니다. </li><li> 다음 선택 &quot;실험&quot;탭을 선택 &quot;보상&quot;을 모든 샘플에 보정 값을 적용하는 &quot;계산 보상&quot;을 선택합니다. </li></ol></li><li&gt; 규모를 기록하고 각 세포 계수기 (FSC = 200 SSC = 200)에 의해 허용되는 가장 낮은 임계 값을 선택하려면 앞으로 분산 형 (FSC)와 측면 산란 (SSC) 전압 매개 변수를 설정합니다. </li><li> 0.22 μm의 필터 PBS의 관을 실행하는 동안, (즉, 단지 이벤트 레이트 5 이벤트 / 초를 상회하는 전압 임계치 아래) 배경 잡음의 대부분을 배제 최고 값 FSC 및 SSC 전압을 조정한다. </li><li> 필요한 경우 PBS에 희석 1.0 ㎛의 비드, - 다음으로, 0.2 ㎛의 함유 튜브를 실행. FCS SSC 대 플롯에서, [㎛ 0.2 내지 1.0 이벤트를 캡처하는 비드 인구 주위에 게이트를 그립니다. 또한, SSC-H의 히스토그램, 1.0 μm의 구슬보다 작은 모든 이벤트를 포함하는 게이트를 그립니다. </li><li> &quot;소호&quot;(약 8 ~ 12 μL / 분)에 계측기의 유량을 설정합니다. 구슬 튜브를 사용 (또는 구슬의 공지 농도를 함유하는 다른 튜브) 직전까지 사이토에 유량을 조절 다이얼NT 속도는 약 200 이벤트 / 초에 도달한다. 같은 유량으로 모든 샘플 튜브를 읽고 그 흐름 속도가 실행 사이의 일관성을 유지하기 위해 미래의 실험에서 동일한 비드 농도를 사용합니다. </li><li> PBS에 희석 무지개 입자의 형광 관을 실행. 5000 이벤트를 취득. FSC, SSC, 각 컬러 채널에 대한 평균 휘도 값을 기록한다. 그 형광 강도 실험 사이의 일관성을 유지하기 위해 미래의 실험에서 전압을 조정하기 위해이 값을 사용합니다. </li></ol> 1.6) 샘플 읽기 <ol><li> &quot;소호&quot;(약 8 ~ 12 μL / 분)에 계측기의 유량을 설정하고 정확하게 1 또는 2 분 동안 각각의 샘플을 실행합니다. </li><li> 먼저 읽은 후, NP-40 아래 각 샘플, 피펫 최대 10 %의 20 μl를 추가하고, 검출 긍정적 인 이벤트의 공제 할 수 있도록 같은 시간 (1 또는 2 분)에 대해 다시 읽어 동일한 기간 동안 분해 된 샘플. 참고 : 그것은 매우 꼬마 도깨비입니다샘플 피펫보다는 와류로 혼합되는 것이 ortant. 우리의 경험에 비추어 볼 때, 볼텍스 EV-흉내 긍정적 인 이벤트로 이어지는, 일부 항체의 자체 집계가 발생할 수 있습니다. </li><li> 일단 모든 샘플 수출이 별도의 파일로 모든 파일 .fcs FCM 분석 소프트웨어를 이용하여 추가 분석에 사용되는, 판독되었다. </li></ol> 1.7) 데이터 분석 <ol><li> FCM 분석 소프트웨어를 엽니 다. 새로운 실험 파일로 .fcs 파일을 모두 가져옵니다. </li><li> 구슬 전용 튜브를 엽니 다. SSC-A 플롯 대 FSC-A에서 0.2 μm의 1.0 μm의 사이에 크기가 모든 구슬을 문을 그립니다. 이 EV 게이트입니다. 드래그 모든 샘플에 추가 할 수 있습니다. </li><li> 부정적인 컨트롤을 용해 샘플을 사용하여, 사용 된 각각의 형광 채널에서 배경 형광의 가장자리에 문을 그립니다. 해당하는 각 비 용해 샘플의 EV 게이트에 형광 문을 끕니다. 참고 :이 시점에서 그것은 또한 듀얼 형광 이중 매개 변수 플롯을 검사하는 데 유용합니다. 로켓 모양마커는 관련이없는 세포 유형에 존재하는 것으로 알려진 경우 특히 이중 양성 사분면 응집 또는 다른 소포 흉내 낸 사건으로부터 아티팩트를 나타낼 수있다 (도 8 참조). </li><li> 각 형광 마커를 들어, 비 - 분해 된 샘플의 이벤트 수와 샘플의 용균 이벤트 수를 뺀다. 선택적 % 양의 값을 얻기 위해 비 용균 EV 게이트 내에 전기차의 총 개수로이 번호를 나눈다. </li></ol> 2. 방법 B : 비즈 방법 전기 자동차의 혈액 샘플 / 절연 2.1) 처리 <ol><li> (1.1 절) 방법에 설명 된 혈액 처리 방법을 참조하십시오. </li></ol> 2.2) 분석을위한 시료 준비 <ol><li> 원하는 경우, 엑소 좀과 마이크로 소포에 PPP 또는 ultracentrifuged 전기차를 분별. 0.22 μm의 원심 필터에 PPP 또는 ultracentrifuged 전기 자동차의 250 μl를 추가하고 750 X에서 고정 된 회 전자 원심 분리기 스핀에​​ 전송실온에서 2 분 동안 g. 참고 : 어떤 액체가 필터 꼭대기에 남아 있는지 확인합니다. 원심 분리 후, 필터는 눈에 보이는 유체 층 위에 남아 없습니다 함께 &quot;건조&quot;로 나타납니다. 가능성이 있지만, 특정 샘플은 유체가 필터를 통해 효과적으로 이동하기위한 원심 약간 긴 시간을 필요로 할 수있다. </li><li> 2 ㎖에 코팅 6 μm의 폴리스티렌 비즈 (예를 들어, 음의 ABC 구슬) RPMI 매체와 배, 그리고에 resuspend을 씻으십시오. 각 FACS 튜브에 6,​​000 구슬을 추가합니다. 음성 대조군 튜브에, 구슬 형 RPMI 매체의 400 μl를 추가. 다른 모든 튜브, PPP 또는 ultracentrifuged 전기 자동차 (또는 그 분획물) 200 μL와 RPMI 미디어 200 μl를 추가합니다. </li><li> 미디어 400 μl의 모든 튜브의 최종 볼륨을 조정하고, 진탕 기에서 4 ° C에서 밤새 품어. </li><li> 다음 날 아침, 미디어의 2 ml로 구슬을 씻는다. 뜨는을 대기음. </li><li> 4 ℃에서 3 시간 동안 미디어 (400 μL)에 5 % 소 혈청 알부민 (BSA)으로 차단# 176; 통에 C. </li><li> 미디어의 2 ml로 구슬을 씻으십시오. 배지 100 ㎕에 대기음에 resuspend 펠렛. </li></ol> 2.3) 염색 EV 샘플 <ol><li> 모든 항체를 필터링합니다. 방법에 사용 된 동일한 항체 패널을 사용하거나, 필요한 경우, 그만큼의 형광체들간에 호환성으로 항체의 상이한 조합을 생성한다. </li><li> 결합 된 항체는 모두 0.22 μm의 필터 원심 튜브에 단일 패널에 사용될 수있다. 2 분 동안 또는 혼합물 구간까지의 모든 각도 고정 된 단일 고속 원심 분리기를 사용하여 원심 분리 필터를 통과 한 어떠한 항체 액은 필터의 표면에 잔류하지 않는다. </li><li> 모든 튜브에 필터링 된 항체 칵테일의 적절한 볼륨을 추가하고 4 ℃에서 30 분 동안 품어. </li><li> 사이토 흐름에 미디어의 400 μL 미디어, 재현 탁 2 ml로 구슬을 세척하고 즉시 실행 (또는 같은 날 내에서). </li></ol> 2.4) 설치 및 샘플 읽기 사이토<ol><li> FCM 소프트웨어를 엽니 다. , 설정 실험 (제조업체의 지침에 따라) 장비 설정 비즈를 사용하여 매일 계측기 교정 및 설치를 수행하기 전에. </li><li> EV 샘플 하나 이상의 항체로 염색 한 경우 다수의 형광체는 다음과 같이 보정 값을 계산 한번에 측정한다 : <ol><li> 튜브를 표지가 미리 보상 구슬 2 방울 (각 Fluorochrome과 접합 된 항체 1 관)을 추가하고 항체의 권장 금액을 추가합니다. 흠 보상 제어로 사용할 다른 튜브에 부정적인 보상 구슬 2 방울을 추가합니다. 30 분 동안 4 ° C에서 품어 PBS 400 μL에 PBS와 resuspend에 씻어. </li><li> FCM 소프트웨어를 사용하여, 각각의 보상 튜브를 실행하고 5 년간의 로그 스케일에 약 10 4 각 피크를 배치 형광 전압을 조정합니다. 형광 피크가 다른 채널에 비해 자신의 형광 채널 (밝은) 가장 높은 있는지 확인하고필요한 경우 다시 형광 매개 변수의 전압을 조정합니다. 각 개별적으로 염색 미리 튜브를 실행하고 튜브 당 최소 5,000 개의 이벤트를 포착 할 수 있습니다. </li><li> 탭 선택 &quot;실험&quot;다음 &quot;보상&quot;을 선택한 후 &quot;계산 보상&quot;모든 샘플에 보정 값을 적용합니다. </li></ol></li><li> 규모를 기록하고 각 세포 계수기 (FSC = 200 SSC = 200)에 의해 허용되는 가장 낮은 임계 값을 선택할 수있는 FSC와 SSC 전압 매개 변수를 변경합니다. </li><li> 중항 비즈 인구에 실행 샘플, 게이트 및이 게이트에 2000 이벤트를 취득. 수출 .fcs 파일. </li><li> 파일을 .fcs 분석 FCM 분석 소프트웨어를 사용합니다. 중항 구슬에 문입니다. 각각의 형광 색소에 대한 기하 평균 형광 강도 (MFI)를 계산하고, 음성 대조군의 MFI 비교. </li></ol>

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<li>Shet, A. S., Aras, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sickle+blood+contains+tissue+factor-positive+microparticles+derived+from+endothelial+cells+and+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Sickle blood contains tissue factor-positive microparticles derived from endothelial cells and monocytes.</a> Blood. 102 (7), 2678-2683 (2003).</li>
<li>Connor, D. E., Exner, T., Ma, D. D. F., Joseph, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+majority+of+circulating+platelet-derived+microparticles+fail+to+bind+annexin+V%2C+lack+phospholipid-dependent+procoagulant+activity+and+demonstrate+greater+expression+of+glycoprotein+Ib%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">The majority of circulating platelet-derived microparticles fail to bind annexin V, lack phospholipid-dependent procoagulant activity and demonstrate greater expression of glycoprotein Ib.</a> Thrombosis and Haemostasis. 103 (5), 1044-1052 (2010).</li>
<li>Nolte-’t Hoen, E. N. M., van der Vlist, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+qualitative+flow+cytometric+analysis+of+nanosized+cell-derived+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%3A+Nanotechnology%2C+Biology%2C+And+Medicine%22%5BJournal%5D)">Quantitative and qualitative flow cytometric analysis of nanosized cell-derived membrane vesicles.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, And Medicine. 8 (5), 712-720 (2012).</li>
<li>Van der Vlist, E. J., Nolte-’t Hoen, E. N. M., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J. A., Wauben, M. H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+labeling+of+nano-sized+vesicles+released+by+cells+and+subsequent+quantitative+and+qualitative+analysis+by+high-resolution+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry.</a> Nature Protocols. 7 (7), 1311-1326 (2012).</li>
<li>Orozco, A. F., Lewis, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+circulating+microparticles+in+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A.+77+A%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of circulating microparticles in plasma.</a> Cytometry Part A. 77 A. 77A (6), 502-514 (2010).</li>
</ol>

저자는 공개 할 관심의 충돌이 없습니다.

격리, 치료 및 전기 자동차의 분석을위한 두 개의 서로 다른 프로토콜이 각각 검출 또는 비드 기반의 접근 방식을 사용하여, 발표되었다. 사용하기에 가장 적절한 방법을 선택하는 것은 간단하지 않다 항상 관심 개별 소집단뿐만 아니라 테스트되는 샘플의 이해를 요구한다. 가장 적절한 방법을 선택할 때 또한, 취득 사용 계측기의 감도가 고려되어야한다. 때때로 아니라, 방법의 조합은 혼자 어느 한 방법보다 샘플에 대한 자세한 정보를 제공, 사용하는 최상의 단일 프로토콜이 없습니다. 이상적으로는, 여러 다른 분리 및 검출 기술은 EV 특정 인구가 연구되고 성능에 대하여 고려 사이토 개별 고려한 맞춤형 프로토콜을 개발하기 위해서는 먼저 평가해야한다. 대안 격리 기술은 초 원심 분리, 자당 밀도 분획 화, 면역 자기 B를 포함EAD 분리, 크로마토 그래피, 및 친 화성 정제 (12), 다른 검출 방법은 주사 전자 현미경, 투과 전자 현미경, 원자력 현미경, 동적 광산란 및 웨스턴 블로 팅 (8)를 포함한...

세포 외 소포 (전기 자동차)는 세포 - 세포 통신에 매우 관여하고 생물학적 과정의 다양한 범위를 조절하는 데 도움이 체액에서 발견 된 작은, 막 유래 소포입니다. 유동 세포 계측법 (FCM)를 사용하여 전기 자동차의 분석은 그들의 작은 크기와 관심의 마커에 대한 긍정적 인 이산 인구의 부족으로 악명 어려웠다. 상당히 지난 10 년 동안 개선하면서 EV 분석하는 방법은, 여전히 진행중인 작품입니다. 안타깝게도 거기 아무도 전천후 프로토콜없고, 사용하는 가장 적절한 방법을 결정할 때 여러 측면이 고려되어야한다. 여러 가지 처리 전기 자동차에 대한 기술과 개인 검출 또는 비드 기반의 접근 방식을 사용하여 전기 자동차를 분석하는 두 가지 프로토콜은 여기에 표시됩니다. 합리적인 F에서 일반적 상업적 제제 검색된 항체 응집체를 제거에 도움이된다 여기 기재된 방법, 증가하는 신호 대 잡음비, 및 설정 게이트배경 형광 검출을 최소화 ashion. 제 2 프로토콜 캡처 작은 전기차와 엑소 좀을 검출하도록 비드 기반 방식을 사용하는 반면 제 1 프로토콜은 임상 샘플의 대용량 분석에 특히 적합 개별 검출 방법을 사용한다. 또한 미세 입자로 알려진 전기 자동차는 세포 - 세포 통신에 관여 생물학적 과정 (1)의 다양한 범위를 조절하는 데 도움이되는 체액에서 발견 된 작은, 막 유래 소포입니다. 4 - 다양 표면 마커 및 / 또는 생물학적 물질의 직접 전사 식을 통해, 전기차가 활성화 또는 세포 간 통신 (2)에서의 역할을 억제하거나 재생받는 세포의 기능을 변경할 수있다. 다른 종양 촉진 metasta에서, 광범위한 조건에 기여하는 것으로 도시되었지만 임상 혈소판 유래 전기차는 강력한 항 응고 활성을 5 것으로 알려진질병 (7)에 대한 보호에 동생 (6). 전기차는 크기와 (8)의 생성 메커니즘에 따라 엑소 좀과 같은 마이크로 소포 (조작량) 등을 세포 유래 소포 작은 범주로 분류 될 수있다. MVS가 100~1000를 클수록 동안 세포 유래 소포 개체군의 명칭이 지속적인 논쟁 -8,9- 화제가되고 있지만, 엑소 좀은 일반적으로 소형으로 세포막과 엔도 좀의 융합으로부터 유도 40~100 nm의 입자를 설명한다 나노 입자들은 세포막의 열 발산에 의해 형성되어있다. 여기서, 일반적인 용어 &quot;전기 자동차&quot;는 세포에 의해 세포 외 방출 생물학적 소체의 모든 유형을 참조하는 데 사용된다. 전혈에서 전기차의 분리 다단계 절차 및 다양한 처리 변수는 보관 온도와 기간 (11, 12), 항응고제 / 방부제를 사용하고 (13)를 포함하여 EV 콘텐츠에 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다원심 분리 방법 (14)을 사용했다. 이러한 변수의 표준화에 대한 요구가 혈전증 및 지혈 과학 적절한에 대한 표준화위원회 (ISTH SSC) 혈액 처리 및 EV 격리 절차 15, 16에 대한 국제 사회에 의해 추천되었다, 아직 최적의 프로토콜에 연구자간에 합의가 존재하지 않았다 (12)를 사용합니다. 대부분 미리 엄격하게 제어 변수 분석이 정확하고 재현성에 매우 중요한 데이터 있다는 것이 동의. 전기차를 분석하기 위하여, 연구자들은 22, 23, 20, 21 및 웨스턴 블롯 산란 투과 전자 현미경 (17), 주사 전자 현미경 (18,19), 원자력 현미경, 동적 광을 포함한, 다양한 방법을 이용했다. FCM은 많은 연구자 9,24에 대한 선택의 방법이지만 - 인해 높은 처리 능력을 26, FCM을 사용하여 전기 자동차의 분석은있다32 - 그들의 크기와 이산 긍정적 인 인구 27의 부족으로 어렵기로 악명이 높다. 세포의 분석에 비해 필요가 입자 당 항원의 적은 수로 인해 방출 1) 적은 형광의 전기 자동차 결과의 작은 크기와 후 얼룩 세척 2) 제한된 타당성, 배경 형광을 줄일 수 있습니다. 연구자들 사이 일반적인 문제는 면역 글로불린 집계 (27, 28) 및 항체 (29)의 자체 집계에서 발생하는 신호를 포함한다. 또한, 긴 처리 시간 및 현재 프로토콜 33,34 많은 의해 사용 긴 세척 / 분리 절차는 그들에게 높은 처리량 애플리케이션에 이상적 미만을, 적은 수의 샘플을 분석하기 위해 여러 날 동안의 투입을 요구한다. 일부 연구자들은 정확하게 혈중 알코올 농도를 평가하기위한 형광 물질 하나를 뺀 (FMO)과 항체 이소 타입 쓸모으로 전통적으로 사용 FCM 음성 대조군 렌더링, 모두 세척 단계를 지내다kground 형광 (30). 항체 집계 및 기타 비 소포, 언 바운드 항체를 제거하는 어려움과 식별 할 수있는 긍정적 인 인구의 부족에서 발생하는 신호 : 우리의 프로토콜은 전기 자동차의 적절한 FCM 분석을 방해 할 수있는 세 가지 일반적인 문제를 해결합니다. 여기에 기재된 기술은, 일반적으로 상업적 제제 검색된 항체 응집체를 제거하는 신호 대 잡음비를 증가시키고 배경 형광의 검출을 최소화 합리적인 방식으로 게이트를 설정을 지원한다. 두 개의 서로 다른 검출 방법들이 여기에 제시된다 : 제 2 프로토콜 캡처 작은 전기차와 엑소 좀을 검출하도록 비드 기반 방식을 사용하는 반면 제 1 프로토콜은, 임상 샘플의 대용량 분석에 특히 적합 개별 검출 방법을 사용한다.

<table><tbody><tr><td>LSR II 탁상용 유세포 분석기</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>3-laser (20 mW Coherent Sapphire 488 nm blue, 25 mW Coherent Vioflame 405 nm violet, and 17 mW JDS Uniphase HeNe 633 nm red)</td></tr><tr><td>FACS Diva software&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>PC 버전 6.0</td></tr><tr><td>FlowJo 소프트웨어&nbsp;</td><td>Treestar US</td><td></td><td>Mac 버전 9.6.1 또는 PC 버전 7.6.5</td></tr><tr><td>Sphero Rainbow 형광 입자</td><td>BD Biosciences</td><td>556298</td><td>형광 강도 일관성을 유지하기 위해 모든 채널 전압을 조정하는 데 사용됩니다&nbsp;</td></tr><tr><td>울트라 레인보우 형광 입자&nbsp;</td><td>Spherotech</td><td>URFP-10-5</td>는 <td>배치에서 배치로 EV 게이팅 일관성을 보장하기 위해 Megamix-Plus SSC 비드와 함께 사용됩니다</td></tr><tr><td>. Megmix-Plus SSC 비드</td><td>Biocytex</td><td>7803</td>은 <td>실행 간 일관성을 유지하기 위해 FSC 및 SSC&nbsp; 전압을 조정하는 데 사용됩니다. 또한 모든 실행에서 동일한 흐름률이 사용되는지 확인하기 위해 흐름률을 모니터링하고 다이얼을 조정하는 데 사용할 수 있습니다</td></tr>. <tr><td>AbC Anti-Mouse Bead Kit</td><td>Life Technologies</td><td>A-10344</td>는 <td>보상 제어에 사용되며 음의 AbC 구슬은 비즈 기반 방법에 사용됩니다.</td></tr><tr><td>Nonidet P-40 대안 (NP-40) (CAS 9016-45-9)</td><td>Santa Cruz&nbsp;</td><td>SC-281108</td><td>은 음성 대조군으로 사용하기 위해 초기 판독 후 샘플을 용해하기 위해서만 개별 검출 방법에 사용됩니다. 재고는 PBS에서 1:10으로 희석하여 최대 1개월 동안 냉장고에 보관할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>BD TruCOUNT 튜브</td><td>BD Biosciences</td><td>절대</td><td>EV 농도가 필요할 때 사용할</td>340334</tr><tr><td>Ultrafree-MC, GV 0.22 &micro; m 원심 필터 유닛</td><td>Millipore&nbsp;</td><td></td><td>UFC30GVNB 크기에 따라 EV를 염색 세척하고/또는 분획</td></tr>하는 데 사용됩니다. <tr><td>Vacutainer 유리 전혈관 ACD-A</td><td>BD Biosciences</td><td></td> 364606 <td></td></tr><tr><td>Facs 튜브 12x75 폴리스트렌</td><td>BD Biosciences</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 저장통 개별 포장&nbsp;</td><td>Phoenix</td><td>RR-50-1s</td><td></td></tr><tr><td>Green-Pak 피펫 팁 - 10 &마이크로; l</td><td>Rainin</td><td>GP-L10S</td><td></td></tr><tr><td>Green-Pak 피펫 팁 -200 &마이크로; 엘&nbsp;</td><td>Rainin</td><td>GP-L250S</td><td></td></tr><tr><td>Green -Pak 피펫 팁 - 1,000 & 마이크로; 엘&nbsp;</td><td>Rainin</td><td>GP-L1000S</td><td></td></tr><tr><td>안정 스택 L300 팁 사전 멸균 Rainin</td><td></td><td>SS-L300S</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Lite&nbsp;XLS 8 채널 LTS&nbsp; 조절 가능&nbsp; 스페이서&nbsp;</td><td>Rainin</td><td>LA8-300XLS</td><td></td></tr><tr><td>96웰 조직 배양 플레이트</td><td>E& K Scientific</td><td>EK-20180</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 배지(Hepes 제외)</td><td>UCSF 세포 배양</td><td>CCFAE001</td>시설 <td>비드 기반 검출 방법에 사용되는 배지</td></tr><tr><td>Dulbeccos PBS D-PBS, CaMg-free, 0.2 &micro; m 여과 UCSF</td><td>세포 배양 시설</td><td>CCFAL003</td><td></td></tr><tr><td>초원심분리기 튜브, Thinwall, Ultra-Clear</td><td>BECKMAN COULTER INC</td><td></td><td></td></tr> 344058 <tr><td>PANEL I</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD3 PerCP-Cy5.5</td><td>Biolegend</td><td>344808</td><td>2 &micro; l</td></tr><tr><td>CD14 APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>301820</td><td>2 &마이크로; l</td></tr><tr><td>CD16 V450</td><td>BD Biosciences</td><td>560474</td><td>2 &micro; l</td></tr><tr><td>CD28 FITC</td><td>biolegend</td><td>302906</td><td>2 &micro; l</td></tr><tr><td>CD152 APC</td><td>BD Biosciences</td><td>555855</td><td>2 &micro; l</td></tr><tr><td>CD19 A700</td><td>Biolegend</td><td>302226</td><td>2 &micro; l</td></tr><tr><td>PANEL II</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD41a PerCP-Cy5.5</td><td>BD Biosciences</td><td>340930</td><td>2 &micro; l</td></tr><tr><td>CD62L APC</td><td>바이오레전</td>드 <td>304810</td><td>2 &마이크로; l</td></tr><tr><td>CD108 PE&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>552830</td><td>2 &마이크로; l</td></tr><tr><td>CD235a FITC</td><td>바이오레전</td>드 <td>349104</td><td>2 &마이크로; l</td></tr><tr><td>패널 III</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD11b PE-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>301322</td><td>2 &micro; l</td></tr><tr><td>CD62p APC</td><td>Biolegend</td><td>304910</td><td>2 &마이크로; l</td></tr><tr><td>CD66b PE&nbsp;</td><td>바이오레전</td>드 <td>305106</td><td>2 &마이크로; l</td></tr><tr><td>CD15 FITC</td><td>엑알파</td><td>X1496M</td><td>5 &마이크로; l</td></tr><tr><td>CD9 PE</td><td>Biolegend</td><td>555372</td><td></td></tr><tr><td>CD63 APC</td><td>Biolegend</td><td>353008</td><td></td></tr><tr><td>APC-Cy7 Ms IgG2a, &kappa;</td><td>바이오레전드</td><td>400230</td><td></td></tr></tbody></table>

유동 세포 계측법을 사용하여 세포 외 소포의 분석을위한 기술

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

세포 외 소포 (전기 자동차)는 세포 - 세포 통신에 매우 관여하고 생물학적 과정의 다양한 범위를 조절하는 데 도움이 체액에서 발견 된 작은, 막 유래 소포입니다. 유동 세포 계측법 (FCM)를 사용하여 전기 자동차의 분석은 그들의 작은 크기와 관심의 마커에 대한 긍정적 인 이산 인구의 부족으로 악명 어려웠다. 상당히 지난 10 년 동안 개선하면서 EV 분석하는 방법은, 여전히 진행중인 작품입니다. 안타깝게도 거기 아무도 전천후 프로토콜없고, 사용하는 가장 적절한 방법을 결정할 때 여러 측면이 고려되어야한다. 여러 가지 처리 전기 자동차에 대한 기술과 개인 검출 또는 비드 기반의 접근 방식을 사용하여 전기 자동차를 분석하는 두 가지 프로토콜은 여기에 표시됩니다. 합리적인 F에서 일반적 상업적 제제 검색된 항체 응집체를 제거에 도움이된다 여기 기재된 방법, 증가하는 신호 대 잡음비, 및 설정 게이트배경 형광 검출을 최소화 ashion. 제 2 프로토콜 캡처 작은 전기차와 엑소 좀을 검출하도록 비드 기반 방식을 사용하는 반면 제 1 프로토콜은 임상 샘플의 대용량 분석에 특히 적합 개별 검출 방법을 사용한다.

<html> 도 1은 분리 및 비드 기반 방법 또는 개별 검출 방법 중 하나를 사용하여 전기차의 검출을위한 전반적인 프로세싱 방식을 설명. FCM 큰 전기차를 분석 잘 작동하지만 대부분의 세포 계측기 개별적으로 엑소 좀 같이 입자에게 작은을 검출 할 수없는 사용하여 전기 자동차의 개별 감지. 비드 - 기반 접근은 표 1에 요약 된 작은 전기 자동차는, 그러나,이 방법의 사용과 관련된 단점이있다 검출 될 수있다. 일반적으로, (또는 수 크로스 구배 분획 절차의 첨가없이) 초 원심 분리를 사용하여 전기차의 격리는 전기 자동차는 기능 분석에 필요한 경우 추천. 초 원심은 혈청 단백질 및 기능 실험 결과에 영향을 미칠 수있는 플라즈마에서 다른 수용성 오염 물질을 포함하여 불순물을 제거합니다. 그러나, 초 원심은 시간 소모와 EV의 양과 질 (12)을 변경할 수 있습니다. &quot;&gt; 두 검출법에 대한 예상 결과가 그림 2-3에<...

많은 다른 방법은 유동 세포 계측법 (FCM)를 사용하여 세포 외 소체 (전기 자동차)의 측정을 위해 존재한다. 사용하기에 가장 적절한 방법을 결정할 때 여러 측면이 고려되어야한다. 측정 전기 자동차에 대한 두 프로토콜은 개별 감지 또는 비드 기반의 접근 방식을 사용하여,되게됩니다.

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

본 절차의 전반적인 목표는 두 가지 서로 다른 방법을 통해 혈액 내 세포외 소포의 순환을 분리하고 분석하는 것입니다. 개별 세포외 소포 검출 방법의 경우, 먼저 혈액 샘플로부터 혈소판 감소 혈장(PPP)을 분리합니다.그 후 PPP를 관심 대상의 형광색소 결합 항체로 염색합니다. 비드 기반 검출법의 경우, 세포외 소포를 비드와 함께 배양한 다음, 비드에 결합된 소포를 해당 형광색소 결합 항체로 염색합니다. 최종적으로, 유세포 분석을 통해 샘플을 분석함으로써 순환 세포외 소포의 함량을 결정할 수 있습니다.전자 현미경이나 자성 비드 분리(magnetic bead separation)와 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 속도가 훨씬 빠르며, 특정 하위 집단에 국한되지 않고 전체 세포외 소포체(extracellular vesicle) 개체군을 평가할 수 있다는 점입니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 사용자는 어려움을 겪을 수 있는데, 이는 데이터의 품질을 높이고 일일 변동을 최소화하기 위해 시연된 조작법과 유세포 분석기(cytometer) 설정 매개변수를 엄격히 준수해야 하기 때문입니다. 먼저 전혈 샘플을 원심분리하여 혈장(plasma)을 버피코트(Buffy coat) 및 적혈구와 분리하십시오. 다음으로, 버피코트와 적혈구가 포함된 하층이 섞이지 않도록 주의하면서 혈장 상층액 1.2 mL를 1.5 mL 원심분리 튜브에 분주한 후, 다시 한번 원심분리하여 혈소판과 큰 세포 파편을 제거하십시오.원심분리가 끝나면 펠렛이 흐트러지지 않도록 주의하며 PPP 샘플의 마지막 200 µL를 제외한 모든 양을 새 튜브로 조심스럽게 옮깁니다. 그다음 혈장을 위아래로 여러 번 섞어주고, 각 샘플 320 µL를 96-웰 플레이트의 첫 번째 행에 옮깁니다. 샘플을 염색하려면, 세 가지 패널 각각에 필요한 항체들을 개별 0.22 µm 원심분리 필터 튜브에 넣고 고정각 단일 속도 원심분리기를 사용하여 항체를 여과합니다.모든 항체가 필터를 통과하면, 그림에 표시된 대로 혼합물의 적절한 양을 96-웰 플레이트의 각 웰에 추가합니다. 다음으로, 멀티채널 파이펫을 사용하여 PPP 샘플을 혼합한 후, 각 샘플 100 µL를 두 번째 행의 항체들에 옮깁니다. 그런 다음 샘플을 다시 혼합하고, 팁을 교체한 후 적절하게 다음 두 행의 각 항체에 샘플 100 µL를 옮깁니다.실험을 위해, 생물안전작업대 내에서 각 웰에 220 µL의 P

techniques-for-analysis-extracellular-vesicles-using-flow

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 비디오는 형광 표지 포획 항체-자기 나노입자 접합체를 사용하여 세포외 소포체의 면역 캡처를 보여줍니다. 이 프로세스에는 복잡한 형성, 형광 표지된 검출 항체를 사용한 염색, 자기 분리 및 항원 특성 분석을 위한 유세포 분석이 포함됩니다.

항원 특성 분석을 위한 세포외 소포체의 면역포획 및 유세포 분석(Immunocapture and flow cytometry of Extracellular Vesicles for Antigenic Characterization)

바이러스 또는 세포외 소포체는 표면 항원을 인식하는 항체에 결합된 15nm 자성 나노입자로 면역포획되었습니다. 포획된 비리온 또는 소포는 다른 표면 항원에 대한 형광 항체로 표지되었습니다. 그 결과로 생성된 복합체는 높은 자기장에서 분리되고 형광에 트리거된 기존 유세포 분석기로 분석되었습니다.

비리의 항원 스펙트럼과 세포 외 소포를 분석하는 Virometry 흐름

이 프로토콜에서 우리는 형광 기반 나노-추적 분석 하 여 인간의 전체 혈액에서 세포 외 vesicles의 신속한 격리 및 특정 마커의 특성화에 대 한 완벽 한 워크플로우를 설명합니다. 제시 결과 재현성의 높은 레벨을 표시 하 고 셀 문화 supernatants 조정 될 수 있습니다.

나노-추적 분석 인 혈에 있는 단일 Extracellular Vesicles의 빠른 형광 기반 특성

프로토콜 셀 문화 supernatants 함께 사용 하기 위해 작은 extracellular 소포 (EV)에 표면 epitopes를 감지 하도록 설계 된 재현 방법을 설명 합니다. 그것은 항 체를 표면 항 원 CD9, 인식 CD81 그리고 CD63, 함께 하는 비즈를 사용 하 여 특정 EV immunoprecipitation 활용. 메서드는 다운스트림 흐름 cytometry 분석에 최적화 되어 있습니다.

Extracellular 소포 세포 조절 미디어에서의 Cytometric 분석 흐름

최신 세대의 EV 특성화 도구는 여러 파라미터에 대한 단일 EV 분석이 동시에 가능합니다. 나노유세포분석은 표지 없이 45nm보다 큰 모든 생물학적 입자를 측정하고 다양한 형광 표지 기술로 아집단의 특정 특성을 식별합니다.

나노유세포분석을 통한 단일 세포외 소포 막횡단 단백질 특성 분석

이 프로토콜은 공기 분무 노즐의 크기, 시스 유체 압력, 샘플 흐름 압력, 전압, 이득 및 트리거링 임계값 매개변수를 최적화하여 작은 세포외 소포에 대한 신속하고 크기별 분리 방법을 제공합니다.

small extracellular vesicle의 High-throughput Isolation and Purification (고처리량 분리 및 정제를 위한 유세포 분석 분류 파라미터 최적화)

여기서는 형광 표지된 microRNA의 풍부함에 대한 체외 평가를 통해 microRNA 패키징의 역학을 연구하고 세포외 소포체(EV)로 내보낼 수 있는 간단한 프로토콜을 설명합니다.

유세포 분석을 사용하여 세포외 소포체로의 miRNA 방출 추적

여기에서는 인간 피험자의 눈물 및 타액과 같은 생물학적 액체에서 수집된 세포외 소포체(EV)의 특성화 방법을 보여줍니다. 이 방법에 사용된 스캐너는 샘플의 1μL에서 EV의 표현형, 크기 및 총 입자 수를 감지할 수 있습니다.

Characterizing Extracellular Vesicles from Biological Fluids(생물학적 유체로부터 세포외 소포체 특성화)

마우스 testis에서 높은 정화 가능한 meiotic 분수를 얻는 효과적인 방법은 형광 활성 세포 분류 (외과)와 세련된 세포 분리 프로토콜을 결합하는, 설명되어 있습니다. 이 방법은 DNA의 내용과 개별 meiotic 분수의 핵 밀도의 차이 활용합니다.

마우스 Meiotic 셀 유동세포계측법의 정제

면역 세포 기능과 확산을 모니터하기위한 셀 추적 염료의 성공적인 사용은 몇 가지 중요한 단계를 포함한다. 우리가 방법을 설명합니다 : 1) 막 염료를 갖춘 밝고 균일 재현 라벨 - ING 획득, 2) fluorochromes 및 데이터 수집 조건을 선택을하고, 3) 염료 희석에 따라 세포 증식을 수량화 할 수있는 모델을 선택.

셀 추적 염료를 사용하여 전지 부문 모니터링에 최적화 된 착색 및 확산 모델링 방법

학습하세요 혈액에서 세포 외 소포(EV)를 유동 세포 계측법으로 분석하는 개별 검출 및 비드 기반 방법. 이 기술은 신경과학 및 세포 생물학 연구에 활용됩니다.

유동 세포 계측법을 사용하여 세포 외 소포의 분석을위한 기술

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