유동 세포 계측법을 사용하여 세포 외 소포의 분석을위한 기술

이 절차의 전반적인 목표는 두 가지 다른 방법으로 혈액 내 세포외 소포 순환을 분리하고 분석하는 것입니다. 개별 세포외 소포체 검출 방법. 혈소판 불량 혈장 또는 PPP는 먼저 혈액 샘플에서 분리됩니다.

그런 다음 PPP를 관심 형광 색소 접합 항체로 염색합니다. bead based detection method의 경우, 세포외 소포체를 beads로 배양한 다음 bead bound vesicle을 관련 fluorochrome conjugated antibodies로 염색합니다. 궁극적으로, 순환하는 세포외 소포체 함량은 유세포 분석에 의한 시료 분석을 통해 측정할 수 있습니다.

전자 현미경 또는 자기 비드 분리와 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 훨씬 빠르고 특정 하위 집단에 국한되지 않고 전체 세포 외 에스컬 집단을 평가할 수 있다는 것입니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 이 방법의 성공을 위해 입증된 기동 및 세포 분석기 설정 매개변수를 엄격하게 준수해야 하기 때문에 어려움을 겪을 것입니다.일상적인 변화를 최소화하면서 고품질 데이터를 생성하기 위해 Buffy coat와 적혈구에서 혈장을 분리하기 위해 전혈 샘플을 원심분리하는 것으로 시작합니다. 다음으로, 1.2 밀리리터의 혈장 상등액을 1.5 밀리리터 원심분리 튜브로 옮기고, 버피 코트와 적혈구를 포함하는 바닥층을 방해하지 않도록 주의한 다음 상등액을 다시 원심분리하여 혈소판과 큰 세포 조각을 제거합니다.

스핀이 끝나면 PPP 샘플의 마지막 200마이크로리터를 제외한 모든 샘플을 펠릿을 방해하지 않도록 주의하면서 조심스럽게 새 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 플라즈마를 위아래로 여러 번 혼합하고 각 시료 320마이크로리터를 96웰 플레이트의 맨 윗줄로 옮깁니다. 샘플을 염색하려면 3개의 패널 각각에 대한 관심 항체를 개별 영점 22마이크로미터, 원심 필터 튜브에 결합하고 고정된 각도의 단일 속도 원심분리기를 사용하여 항체를 스핀다운합니다.

모든 항체가 필터를 통과하면 그림과 같이 96웰 플레이트의 각 웰에 적절한 양의 혼합물을 첨가합니다. 다음으로, 멀티채널 피펫을 사용하여 PPP 샘플을 혼합한 다음 각 샘플 100마이크로리터를 2행의 항체로 옮깁니다. 그런 다음 샘플을 다시 혼합하고 팁을 변경한 다음 100마이크로리터의 샘플을 다음 두 줄의 항체 각각에 적절하게 옮깁니다.

실험을 위해. 웰당 220마이크로리터의 PBS에서 30분 후 플레이트를 섭씨 4도에서 배양하여 생물 안전 캐비닛 내부의 6열에서 8열까지 가열합니다. 그런 다음 너비 조절이 가능한 다중 채널 피펫을 사용하여 팁을 변경하지 않고 각 웰의 내용물을 해당 원심 필터 튜브로 옮깁니다.

세척 열 중 하나에서 200마이크로리터의 PBS를 사용하여 샘플을 방금 제거한 우물을 헹굽니다. 그런 다음 헹굼 용액을 PPP 샘플이 이전에 추가된 것과 동일한 필터로 옮기고 원심 필터를 닫습니다. 염색된 모든 PPP 샘플이 헹굼 용액과 함께 옮겨졌으면 고정 로터 원심분리기에서 샘플을 스핀다운합니다.

탈수 후 필터 위에 액체가 남아 있지 않은지 확인하십시오. 그런 다음 300마이크로리터의 PBS에 필터 상단을 다시 현탁시키고 즉각적인 유세포 분석을 위해 사전 라벨링된 튜브로 재현탁 내용물을 옮깁니다. 원심 필터를 사용하여 염색된 샘플을 세척하면 배경 마커 신호와 양성 마커 신호 간의 분리가 향상됩니다.

그러나 엑소좀을 포함한 일부 더 작은 세포외 소포체는 필터의 도어를 통해 손실될 수 있다는 점에 유의해야 합니다.샘플을 분석하려면 먼저 순방향 및 측면 산란 전압 매개변수를 로그 스케일로 설정하고 각 매개변수에 대해 세포 분석기에서 허용하는 가장 낮은 임계값을 선택합니다. 그런 다음 영점 22마이크로미터의 튜브를 실행하는 동안 필터링된 PBS는 이러한 전압을 대부분의 배경 소음을 제외하는 가장 높은 값으로 조정합니다. 다음으로, 1마이크로미터 이하의 비드 혼합물이 들어 있는 튜브를 실행하고 전방 바이사이드 산점도에서 비드 개체군 주위에 게이트를 그려 1마이크로미터 비드 아래의 모든 이벤트를 캡처합니다.

이제 cytometers 유속을 낮게 설정하고 비드를 사용하여 유세포 분석기의 유속 다이얼을 원하는 이벤트 속도로 조정합니다. 다음 PBS에서 묽게 된 무지개 형광성 입자의 관을 사용하여 5개의, 000의 사건을 취득해, 앞으로 산란 옆 뿌리개, 및 각 색깔 수로를 위한 가치의 비열한 강렬을 기록하. 모든 매개변수가 설정되면 각 샘플에 대한 첫 번째 판독이 완료된 후 각 샘플에 대한 첫 번째 판독이 완료된 후 각 샘플에 20마이크로리터의 10%MP 40을 혼합하고 동일한 시간 동안 튜브를 다시 판독하여 동일한 시간 동안 용해된 샘플에서 감지된 양성 이벤트를 뺄 수 있습니다.

비드 기반 캡처를 통해 세포외 소포체를 검출하려면 먼저 코팅되지 않은 6마이크로미터 폴리스티렌 비드를 RPMI 배지로 두 번 세척한 다음 동일한 2밀리리터로 Resus를 세척합니다. 다음으로, 400 마이크로리터의 매체에 있는 네거티브 제어 튜브에 각각 6, 000개의 비드를 추가하고, 200 마이크로리터의 PPP 또는 초원심분리기 세포외 소포체의 다른 모든 튜브와 200 마이크로리터의 배지에 추가합니다. 각 튜브의 최종 부피를 400마이크로리터로 조정합니다.

더 많은 미디어와 함께. 쉐이커에서 섭씨 4도에서 밤새 튜브를 배양합니다. 다음 날 아침, 2ml의 배지로 구슬을 씻습니다.

상층액을 흡인하고 400마이크로리터의 5% 소 혈청 알부민을 섭씨 4도의 쉐이커에 3시간 동안 저장하여 비특이적 결합을 차단합니다. 3시간 후, 비드를 2밀리리터의 배지로 세척하고 펠릿을 100마이크로리터의 새 배지에 다시 현탁시킵니다. 이제 항체를 여과하고 각 튜브에 적절한 양의 여과된 항체 칵테일을 첨가한 다음 섭씨 4도에서 30분 후에 다른 2밀리리터의 배지로 비드를 세척합니다.

이번에는 펠릿을 400마이크로리터의 배지에 재현탁시키고 유세포 분석으로 샘플을 즉시 분석하여 방금 시연한 바와 같이 전방 내부 산란 매개변수를 유세포 분석기에서 허용하는 가장 낮은 임계값으로 조정합니다. 마지막으로, singlet bead population을 gate하고 sample당 2000개의 events를 획득합니다. 개별 및 비드 기반 검출 방법 모두 이러한 점도표에서 볼 수 있듯이 PPP 샘플에서 세포외 소포의 존재를 검출하는 데 사용할 수 있습니다.개별 검출 분석의 경우, lysed control은 나열되지 않은 해당 샘플에 대한 게이트를 설정하는 데 사용됩니다.

대부분의 이벤트는 세포외 소포 게이트 내에 있어야 합니다. 예를 들어, 이 그림에서 이러한 이중 매개변수 플롯은 세포에 공존하는 것으로 알려진 두 개의 적혈구 마커인 마커 CD 1 0 8 A 및 CD 2 35 A의 검출을 보여주었습니다. 예상한 바와 같이, 세포외 소포체에서 발생하는 양성 이벤트의 절반 이상이 두 마커 모두에 대해 양성인 반면, 이러한 파라미터 플롯에서는 세포에 공존하지 않는 것으로 알려진 두 마커의 세포외 소포 발현이 비드 기반 검출 방법을 사용하여 뚜렷한 별도의 양성 집단을 나타냅니다.

양성 집단과 음성 집단 사이에는 분리가 존재하지 않으며 이중 양성 사분면에 이벤트가 나타나지만, 두 유형의 세포외 소포체가 단일 비드에 결합하기 때문에 일반적으로 동일한 세포 유형에서 발견되지 않습니다. 따라서 이 방법의 데이터는 음성 대조군 데이터와 중첩된 히스토그램을 사용하여 가장 잘 분석되며, 한 번 마스터된 대조군과 비교하여 비드 샘플에서 관찰된 마커 표현식의 명백한 변화가 있습니다. 이 기법은 개별 검출 방법으로 3-4시간 내에 3-4시간 내에 3개의 항체 패널로 12개의 혈액 샘플을 분석하는 데 사용할 수 있으며, 적절하게 수행되는 경우 비드 방법으로 1일 반

이 절차를 시도하는 동안 각 샘플의 처리에 일관성을 유지하고, 특히 여러 날에 걸쳐 여러 샘플을 실행할 때 각 실험을 시작할 때 세포분석기 유속과 형광 강도가 전날의 실험 설정과 일치하도록 올바르게 조정되었는지 확인하는 것이 중요합니다.