Name: 셀 추적 염료를 사용하여 전지 부문 모니터링에 최적화 된 착색 및 확산 모델링 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 22 min 49 s
Description: 배우세요 면역세포 분열 정량화를 위한 세포 추적 염료 사용법과 플로우 사이토메트리 분석 기법. 이 방법은 복잡한 세포 집단 내 증식 반응을 정확하게 측정하여 면역학 연구에 활용됩니다.

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브루스 Bagwell (진실성 소프트웨어 하우스), Nadège Bercovici (IDM), Lizanne Breslin (Zynaxis 세포 과학 PTI 연구) : 저자는 특히 년 동안 이러한 방법의 개발에 자신의 기술 및 지적 공헌에 대한 다음 개인을 감사드립니다 브라이언 그레이 (PTI 연구), 월 피셔 (다트머스 의과 대학), 앨리스 Givan (다트머스 의과 대학), 베시 Ohlsson - 빌헬름 (SciGro 주식회사), 그리고 마리아 Waugh (다트머스 의과 대학). 또한 그림 2에 표시된 데이터를 생성 연간 연구 방법의 과정과 유동 세포 계측법의 응용에서 2006 년 Bowdoin 클래스를 감사드립니다. 유동 세포 계측법은 NIH 공유 악기 프로그램에서 장비 교부금의 일부에 설립 된 로즈웰 파크 암 연구소의 유동 세포 계측법 연구소에서 수행하고, 국가의 핵심 권한 부여 (5 P30 CA016056-29)의 지원을받는되었다암 로스웰 파크 암 연구소로, 그리고라고 Abramson 암 센터의 유동 세포 계측법 및 NIH 공유 악기 프로그램에서 장비 교부금의 일부에 설립 된 펜실베니아 대학의 셀 정렬 자원 연구소의 연구원, 그리고 NIH # 2P30에서 지원을받는 국립 암 연구소에서 CA016520. 도 3 및도 5에 도시 된 작품은 PTI 연구, 주식회사에게 수여 바이오 메디컬 이미징 및 생물의 국립 연구소 (NIBIB)에서 SBIR 보조금 EB00228에 의해 부분적으로 지원되었다

1. PKH26 셀 추적 염료와 일반 막 라벨링 (Ref. 25, 그림 1) <ol><li> 1.9 - 단계 1.1 무균 기술을 사용합니다. 혈소판 오염을 최소화하기 위해 최종 300 XG 스핀의 추가와 함께 실험실의 표준 방법을 사용하여 ~ 10 7 사람 말초 혈 mononuclear 세포 또는 림프구를 (hPBMC, hPBL) 준비합니다. 2 단계에서 사용하기 위해 500 μl 나누어지는을 (5x10 6 셀) 예약, 10 얼음에 HBSS 1%의 BSA와 장소에서 7 / ML에서 세포를 Resuspend. </li><li> 12 X 75mm 원뿔 폴리 프로필렌 관 장소 5x10 6 셀 (500 μl). 3.5 ML의 HBSS에 한 번 씻으십시오. 조심스럽게 잔류 유체의 더 이상 15-25보다 μl를두고 있지만, 세포를 제거 할 수 없습니다를 돌보는 표면에 뜨는을 대기음. 단계 1.4에서 2 배 세포 현탁액을 준비하려면이 튜브를 사용하십시오. </li><li> 단계 1.2에서 세척 셀 동안 12 X 75mm 원뿔 폴리 프로필렌 튜브에 희석제 C 라벨 차량의 0.5 ML을 (PKH26GL 키트에서) 추가 할 수 있습니다. 사립이 튜브를 사용하여단계 1.5에서 2 배 PKH26 솔루션입니다. </li><li> 단계 1.2에서 한물 세포 펠렛에 희석제 C 라벨 차량의 0.5 ML를 추가하고 단일 세포 현탁액 (2 배 세포)를 얻기 위해 3-4 회를 기음과 분배. 세포 생존과 복구를 줄일 수 있습니다 거품 형성과 혼합 과도한를 피하십시오. </li><li> 즉시 단계 1.4에서 2 배 세포 현탁액을 준비 후, 단계 1.3과 소용돌이에 준비 희석제 C 관에 에탄올에 1.0 MM PKH26 염색 가공 (PKH26GL 키트에서) 2.0 μl를 추가하여 2 배 (4 μM) 염료 솔루션을 준비 균일하게 분산. </li><li> 즉시 단계 1.5에서 2 배 염료 솔루션을 준비 후, 신속하게 배 염료 솔루션에 단계 1.4에서 2 배 세포 현탁액을 피펫 동시에 기음 완전히 염료에 세포를 분산하기 위해 3-4 회를 분배하지 않습니다.에 직접 1.0 밀리미터 염료를 추가 세포, 배 염료로 2 배 세포를 부어, 또는 vortexing하면서 염료를 배에 배 셀을 추가 할 수 있습니다. 착색 거의 즉시이기 때문에, 이러한 방법은 적은 얻을 수권장하는 방법보다 균일 한 농도 (그림 2). </li><li> 1 분 후, 열 inactivated 혈청 또는 셀 멤브레인에 염료 이해를 중지 할 수 HBSS 5퍼센트의 BSA의 1.0 ML를 추가합니다. 충분한 단백질을 사용하지 않으면 세척 단계에서 세포를 가지고 펠릿 수와 다른 세포의 의도 라벨을 일으킬는 실험에서 제시 염료 집계의 형성을 위험. 10% 열 inactivated 혈청 (CM) 또는 HBSS 1퍼센트 BSA와 매체가 정지 시약으로 사용되는 경우, 15 ML 원뿔 폴리 프로필렌 튜브에 얼룩 수행과 모든 흡착을 확보하기 위해 정지 시약 최소한 5.0 ML를 추가합니다 비법 염료. </li><li> 5 분의 라벨 세포를 원심 분리기 @ ~ 400 X g. 세포를 제거하지 않고 표면에 뜨는을 자세히 대기음. 잘 recentrifugation 전에 펠렛을 분산, CM 또는 HBSS 1%의 BSA 4 ML로 두 번 펠렛을 씻으십시오. 튜브 벽에 adsorbed 염료의 carryover를 최소화하고 세정 효율을 최대화하기 위해 Fi 접속 설비를 한 후 새로운 폴리 프로필렌 튜브에 세포를 전송첫 resuspension. 참고 : 적절하게 스테인드 세포 펠렛의 독특한 핑크 가미을 전시합니다. </li><li> 1.0 ML HBSS 하나의 %의 BSA에 씻은 세포 펠렛을 Resuspend. , 셀을 계산 셀 복구를 결정, 10 7 / ML의 최종 농도를 제공 볼륨을 조정할 수 있습니다. 주의 흡인으로, 세포 복구 ≥ 85%해야합니다. 세포 복구가 &lt;70% 경우, 더 진행하기 전에 원인을 결정한다. 2 단계에서 사용하기위한 얼음에 150 μl 나누어지는 (1.5x10 6 셀) 및 장소를 철회 할 수 있습니다. </li></ol> 2. 악기 및 분석 설정 컨트롤의 작성 (표 1) <ol><li> 1, 3, 4, 5, 7 다섯 1.8 ML Eppendorf 튜브의 각 단계에 1.1에서 저장 한 세포 현탁액에서 흠없는 세포의 나누어지는 50 μl (5x10 5). 2, 6, 8 : PKH26 POS의 세 관의 각 단계에 1.9 세포 나누어지는 50 μl (5x10 5). </li><li> 튜브 1-8로, 10 μl IgG 블록 (시약의 표를 참조 100 μg / IgG의 관을)를 추가그리고 주위 온도 (20-25 ° C)에서 10 분에 품다. </li><li> 포화 튜브 4, 5, 7 표 1에 나와있는 항체의 양 (이거 야), 그리고 8 추가 30 주위 온도에서 분, 빛으로부터 보호의 모든 샘플을 (튜브 1-8) 품다. </li><li> 모든 샘플에 HBSS 1%의 BSA의 1.5 ML를 추가 펠릿 원심 분리 (5 분 @ 400 XG)와주의 염원과 함께 HBSS 1퍼센트 BSA의 1.5 ML로 한 번 씻어하여 셀은 셀 손실을 방지합니다. </li><li> HBSS 1퍼센트의 BSA 500 μl 각 샘플을 Resuspend. 귀하의 cytometer에 분석 할 시료에 필요한 경우, 12 X 75mm 둥근 바닥 튜브로 전송할 수 있습니다. 표 1에 표시된대로 튜브 3, 6, 7, 8-100 μg / ML 7 AAD 작동 주식 매일 (시약의 표 참조) 10 μl를 추가합니다. 흐름 cytometer 설정 및 착색 확인 (3 단계)에서 사용하기 전에 30 분을 위해 얼음을 품다. </li></ol> 3. 흐름 Cytometer 설치 및 착색 확인 <ol><li> 있는지 확인 흐름 cytome적이 매일 품질 관리를위한 실험실의 설립 절차를 사용하여 제대로 작동합니다. 그 신호를 확인하는 것은 쉽게 사용할 수 있도록 각각의 스펙트럼 창에 감지하고, 검출기 응답이 확산 모니터링 14에 사용되는 창에서 강도를 신호에 비례 것을. 할 수 있습니다 </li><li> 선형 디스플레이 비늘을 사용하여 FSC 대 튜브 1 SSC 데이터를 수집. 림프구 인구가 점 음모의 왼쪽 하단 사분면에 속하는 각 검출기의 증폭 이러한 조정, 각 매개 변수에 오프 규모 없으며, 임계 값으로 인해 중단되지 않습니다. 3.7 - 3.3 단계의 모든 샘플 ungated FSC 대 SSC 데이터를 수집합니다. </li><li> 모든 4 형광 검출기에 대한 컬러 보상 및 로그 디스플레이 비늘을 사용하지, 튜브 1 데이터를 수집. / 더 셀 첫 번째 채널에 몇 축적되지과 규모에 흠없는 림프구의 autofluorescence을 배치 각 검출기의 높은 전압 (HV)를 조정합니다. 각 히스토그램에 대한 분석 경계를 설정흠없는 셀의 밝은 2 %에 해당. </li><li> 단계 3.2 3.3 년에 설립 어떤 색 보상 및 HV 설정을 사용하지, FSC, SSC와 모든 4 형광 감지기에서 신호를 수집, 튜브 2 데이터를 수집. PKH26 형광을 모니터링하는 데 사용되는 검출기를 들어, 마지막으로 채널에 몇 / 아니오 세포로, 모든 PKH26 POS 세포는 3 -4 번째 시대에서 하나의 대칭 정상으로 규모에 표시되는지 확인합니다. 거기에 여러 봉우리가 또는 최고 모양이 왜곡되는 경우, 최소화 및 혼합 기술 (그림 2) 솔트 세심한주의와 함께 1 단계를 반복합니다. 필요한 경우, 염료 농도를 조정합니다. </li><li> 단계 3.3 년에 설립 된 설정을 사용 FSC, SSC와 모든 4 형광 감지기에서 신호를 수집 관 3 데이터를 수집. 7 AAD의 형광을 모니터링하는 데 사용되는 검출기를 들어, 7 AAD POS 세포 (비 가능한 세포가 잘 해결 즉, 단계 3.3 년에 설립 된 2 %의 경계 위에 떨어질 있는지 확인가능한 7 AAD 제외 세포에서). </li><li> 단계 3.3 년에 설립 된 설정을 사용 FSC, SSC와 모든 4 형광 감지기에서 신호를 수집 관 4 데이터를 수집. CD8 POS 세포가 잘 흠없는 세포 (즉, FITC 검출기에 대한 단계 3.3 년에 설립 된 2 %의 경계 위의 가을)에서 해결되었는지 확인합니다. 튜브 5 반복하고 CD8 POS 세포가 잘 흠없는 세포 (예를 들면 가을 APC 감지기를위한 단계 3.3 년에 설립 된 2 %의 경계 위)에서 해결되어 있는지 확인합니다. </li><li> 단계 3.3 년에 설립 된 사용 설정, FSC, SSC와 모든 4 형광 감지기에서 신호를 수집 튜브 6, 7, 8에 대한 데이터를 수집. </li><li> 튜브 1-5와 다른 세 fluorochromes를 모니터링하는 데 사용되는 감지기의 각 fluorochrome에 대한 행렬을 겹치는 색​​상을 설정하려면 색상 보정 소프트웨어를 수집 목록 모드 파일을 사용합니다. 샘플 6 목록 모드 파일에이 행렬을 적용하고 확인이 PKH26 연구소의 존재eling는 7 AAD POS 세포를 감지 할 수있는 기능을 변경하지 않습니다. </li><li> ) 3 잘 해결 subpopulations합니다 (3 번 CD 제외의 CD4 제외, 3 번 CD POS CD4 제외하고 3 번 CD POS CD4 POS) FITC 대에서 확인할 수 있습니다 : 색상 샘플 7 목록 모드 파일에 단계 3.8에서 행렬을 중복 확인 ​​신청 APC 점 플롯, 그리고 반에는 3 번 CD-FITC 및 안티 CD4-APC의 b)는 존재는 7 AAD POS 세포를 감지 할 수있는 기능을 변경하지 않습니다. 반에는 3 번 CD-FITC의 존재가 PKH26 검출기에서 수집 데이터에 대한 상위 2 %의 경계를 변경하는 경우, 필요에 따라 경계를 재조정. </li><li> 단계 3.8의 샘플 8 목록 모드 파일에 색 중복 행렬을 적용합니다. PKH26 라벨의 존재 단계 3.3에서 autofluorescence 컨트롤을 사용하는 세트에서 FITC, 7 AAD 또는 APC 감지기에 대한 2 %의 경계를 변경하는 경우, 표 1의 관 7을 사용 필요에 따라 경계 (이거 야)를 재조정하고 확인 그게 아직 disting 할 수 있습니다uish에는 3 번 CD POS CD4 POS, 3 번 CD POS CD4 제외하고, 3 번 CD 제외의 CD4 제외 전지는 조정 된 경계 (이거 야)를 사용하여. </li></ol> 4. 염료 희석하여 전지 부문 모니터링을위한 확산 모델 선택 <ol><li> 당신의 cytometer에 채널과 로그 수십 년의 수에 따라 달라집니다 세대 사이의 간격을 결정합니다. 디지털 기기를 들어,이 값은 일반적으로 4 ~ 5 년은 디지털 신호 프로세서에서 용기의 수에 의해 결정됩니다. 아날로그 악기에서 수십 년의 수는 거의 전체 숫자입니다 위치를 정확하게 모델링은 실험적으로 결정되는 수십 년의 정확한 숫자가 필요합니다. 이 작업을 수행하려면 제조업체 할당 상대적 농도로 보정 된 형광 구슬의 혼합물의 데이터는 실험에 사용 된 동일한 검출기 높은 전압 설정에서 획득됩니다. 구슬 봉우리의 위치는 정수의 관점에서 로그 눈금의 교정이 가능로그 10 년마다 ensity 범위. 특히, 이것은 제조업체 할당 된 값의 로그에 대해 각 구슬 유형에 대한 채널 번호를 음모에 의해 이루어집니다. 비드 데이터 값에 대한 최적 직선의 기울기는 채널 당 상대 강도 단위의 수를 제공합니다. 채널의 수를 곱한 값,이 값은 다음 강도의 두 배 감소 (즉, 딸이 생성 간격)에 해당하는 채널의 수는 14으로 계산 할 수있는 전체 규모에 대한 로그 수십 년의 수, 될 것입니다. </li><li> 세대 간의 고정 된 간격을 사용하거나 간격이 떠 허용할지 여부를 결정합니다. 표준 (고정) 설정은 각 세대의 위치를 지정하는 단계 4.5에서 결정된 세대 간격 값을 사용하며, 히스토그램이 뚜렷한 봉우리가 부족하면 일반적으로 사용됩니다. 플로트 설정은 각 세대 피크의 위치는 히스토그램 모양에 의해 결정 할 수 있습니다 언제 distinguishabl 일반적으로 사용됩니다전자 세대 봉우리가 분명 있습니다. </li><li> 모든 세대 또는 부동 너비를 고정 피크 폭을 사용할지 여부를 결정합니다. 고정 폭은 모든 세대를 모델로 unstimulated 컨트롤 샘플의 SD는 계산 사용하여 샘​​플 구별 세대 봉우리가 부족하면 일반적으로 선택됩니다. 부동 폭이 프로그램은 독립적으로 각 세대의 SD을 변경할 수 있으며 가장 구별 세대 봉우리과 함께 사용됩니다. </li><li> 확산 분석 모듈 (여기 ModFit LT 버전 3.3)이 포함 된 프로그램을 실행을 클릭합니다. (예를 들어, 표 1 관 8로 counterstained PKH26 POS 세포의 자극을 96 시간 문화) 분석하도록 설정 데이터를 자극 PKH26 POS 파일을로드합니다. </li><li> 이 경우 가능한에 출입을 금지 PKH26 (42분의 585) (7 AAD 제외)에는 3 번 CD POS 림프구와 작은 파편 및 대형 집계 (그림 3)을 제외 FSC 대 SSC에, 분석에 대한 매개 변수를 선택합니다. 정의에이 지역은 폭발는 일반적으로 발견되는 높은 기대 분산 지역을 포함하고 3 번 CD 표현이 자극을 문화 속에서 변조 될 수 있습니다에주의해야합니다. </li><li> 확산 마법사를 사용하여 새 확산 모델을 만듭니다. 개방형 데이터 파일 (시작 탭)을 사용하여 unstimulated PKH26 POS 제어 파일을로드하고 나눌 세포에 해당하는 부모의 분포에서 피크 채널의 위치를 정의합니다. </li><li> 부모 피크 위치와 폭 (표준 편차)에 대한 값을 지정하고 unstimulated PKH26 POS 컨트롤에 대한 파일을 분석합니다. 고정 피크 폭 (SD)가 필요하다면, 잠금 SD를 선택합니다. </li><li> PKH26 제외 제어 (예를 들어, PKH26 제외 세포의 96 시간 문화 표 1 관 7로 counterstained)을로드합니다. PKH26 제외 컨트롤 위의 dimmest 세대를위한 정상 채널을 설정하여 세대의 수를 조정합니다. 이것은 뉴를 결정모델이 정확하게 넣을 수 딸 세대의 mber하고 일반적으로 6-9 세대입니다. </li><li> 자극 샘플에 대한 데이터 파일을 (예를 들어, 표 1 관 8과 같은 counterstained PKH26 POS 세포의 자극을 96 시간 문화) 열고 단계 4.7에 정의 된 부모 피크 위치와 SD의 영역은 변경되지 않습니다되었는지 확인합니다. 고정 세대 간격이 필요하다면, 표준 모델 옵션을 선택하고, 그렇지 않으면 떠 옵션을 선택합니다. </li><li> 단계 4.9에 정의 된 동일한 모델을 사용하여 데이터 집합에있는 각 실험 파일을 분석합니다. 모두 시각 및 감소 치 광장 (RCS) 값에 의해 정의 된 부모 피크 위치에 사소한 조정에 가장 적합한 맞춤을 위해 필요할 수 있습니다. </li><li> 데이터 집합의 각 실험 파일에 대한 최적으로 인해 원하는 확산 통계를 기록합니다. 가능한 통계의 포괄적 인 설명을 보려면 참조를 참조하십시오. 22. </li></ol>

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</ol>

K. 험프리, JD Tario, 주니어 PK 월레스 생활 기술 주식회사와 BD Biosciences의 평가를 위해 사전 상업 셀 추적 시약을 받았습니다. AD는 Bantly와 JS 무어 평가 시약을 추적 사전 상업 셀을받은 염료를 추적 다양한 CellVue 전지의 사전 상업적 특성에 대한 PTI 연구, 주식회사의 생명 기술의 주식회사와 기금. K. Muirhead는 (Phanos 기술 주식회사에 컨설팅 서비스를 제공합니다 (PKH 및 CellVue 염료의 소유자)와 시그마 - 알드리치 및 분자 타겟팅 기술 주식회사에 대한 백업 기술 지원을 제공합니다 SciGro 주식회사에 의해 고용되어 이들의 유통 염료). 이 기사에 생산 및 무료 액세스 시그마 - 알드리치의 후원을받습니다.

여기에 설명 된 방법은 대부분 안정적으로 막 염료에게 13,16,18를 사용하여 hPBMC 라벨링와 막이나 단백질 염료 2,11,13,16을 사용하여 림프구 집합의 phenotyping과 확산 추적을위한 최적의 결과를 제공하기 위해 결합 된 실험실에서 발견 한 아르 18. 도 1 및도 2에 도시 된 바와 같이, 밝은 균일 한 라벨이 가장 쉽게 physiologic 소금의 존재를 제한하고 혼합 기법을 사용하여 달성된다 염료의 동일한 농도에 대한 모든 세포의 급속한, 균일 한 노출의 결과가. 막 염료로 착색은 지질 이중층에 파티션으로 발생하기 때문에, 무료 염료 농도를 변경 다른 변수는 라벨의 효율성에 영향을 미칠 수 있습니다. 예를 들어, 이전 희석제 C의 resuspension에 소금을 덜 효율적으로 유실에 둥근 바닥 폴리스티렌 튜브 결과에 라벨 있으며, 특히, 튜브 벽에 흡착 색깔을 사용하기 때문에 감소 무료 염료 농도낮은 염료 농도에서. 두 요인은 원추형 바닥 폴리 프로필렌 튜브를 (도 3, 4 및 사용 라벨이 완료되면보다 폭 넓은 착색 분포를 제공하는 경향이 게시되지 않은 결과). 최적화 된 착색 절차를 사용하는 경우에도 샘플 연령과 유형도 최대 폭에 영향을 미칠 수 있습니다. 예를 들어, 24 시간 이전의 혈액 샘플이나 TRIMA pheresis 필터 범위로부터 격리 림프구에 대한 CVS 반면 14~20%에서 갓 그려 혈액 범위 (그림 3, 참조. 13되지 않은 결과)에서 분리 PKH26 POS의 림프구에 대한 CVS 25-30에서 % (그림 4 참조. 18). 균일 및 비 가능한 세포 분석에서 제외 모두 구별의 딸 봉우리가 차례로 관측 데이터 (그림 5와 6에 맞게 확산 모델의 선택에 영향을 미치는 염료 희석 프로필에서 분명 여부에 영향을 될 수있는 범위를 더럽히는 것 </strong&gt;). ModFit (진실성 소프트웨어 하우스, Topsham, ME)이 같은 확산 지수와 전구체 주파수 (도 3, 5, 6, 표 3)과 같은 통계를 생성하는 데 사용되는 소프트웨어의 한 예로서 여기에 사용되지만, 다른 소프트웨어 패키지는 모듈 분석이 포함 확산 데이터입니다. 이 포함 FCSExpress (드 노보 소프트웨어, 로스 앤젤레스, CA)과 FlowJo (트리 스타 주식회사, 애쉬 랜드, OR). 이러한 프로그램은 모두 반복적 위치, 높이와 순차 딸이 세대를 대표하는 가우스 피크의 SD (또는 폭)을 변경하여 원시 데이터에 가장 적합한를 찾을 비선형 최소 제곱 분석을 사용합니다. Proliferative 지수 (PI) 및 전구체 주파수 (PF)는 확산의 범위에 가장 일반적으로 사용되는 조치입니다. 로 ModFit에 의해 정의 된 PI는 thymidine의 호응을 분석의 &#39;자극 지수&#39;와 유사한 분석의 과정 동안 세포 수의 증가,을 측정하기위한 한 방법입니다. PF는 초기 populat에 ​​세포의 일부를 반환proliferating하여 자극에 반응 이온. 용어는 소프트웨어 패키지 (예를 들어, FlowJo 및 ModFit는 &quot;확산 지수 &#39;을 뜻합니다에 대해 서로 다른 정의와 계산을 사용하여) 22 중 다소 차이가 있기 때문에 기사를 읽을 때주의 그러나, 권장합니다. 단백질 염료를 사용할 때 막 염료와 라벨링과 확산 분석을 보시려면 여기를 논의 중요한 문제도 발생하고 있습니다. 예를 들어, 혼합 기술에 대한 세심한주의도 CFSE (그림 6) 2-4,13,18,24를 사용하면 균일 한 분포와 구별 딸이 봉우리를 얻기 위해, 죽은 / 죽어 세포의 배제와 함께 준수해야합니다. phenotyping 및 생존 능력 평가를위한 fluorochromes의 적절한 선택은 특히 같은 CFSE 2-4,11,13,16,18와 같은 눈에 보이는 발광 단백질 염료와 함께 과도한 스펙트럼 중복 및 항체 양성 세포를 인식 할 수 없다는를 방지하는 것도 중요합니다 </sup&gt;. 추적 염료의 농도를 줄이면 인접 스펙트럼 채널에 보상 문제를 감소하지만, 딸 세포의 농도가 autofluorescence과 중복을 시작하기 전에도 모니터링 할 수 있습니다 셀 부문의 수를 제한합니다. 또는, 그러한까지 붉은 색 발광 CellVue의 피 (시그마 - 알드리치, 세인트 루이스, MO) 또는 보라색 발광 CellTrace 누나 (생명 기술, 그랜드 아일랜드, NY)와 같은 새로운 셀 추적 염료의 보상 문제 (그림 6)을 줄일 수 있습니다 사용합니다. 막 염료는 일반적으로 덜 독성 11,26을 전시하는 경향이 있지만 마지막으로,이 염료 중 클래스와 오버 레이블 셀 수 있습니다. 그것은 사용 추적 염료의 농도가 추적 할 수있는 세포의 기능 (그림 6) 3,13,16,18를 변경되지 않았는지 확인하는 것이 그러므로 필요가 있습니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약이나 장비 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 상업적으로 구입 </td></tr><tr><td> 7 Aminoactinomycin D </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> A9400 </td><td></td></tr><tr><td> 소 혈청 알부민 (BSA) </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> A4503 </td><td></td></tr><tr><td> 태아 소 혈청 (FBS) </td><td> 애틀랜타 체액 </td><td> S11150 </td><td></td></tr><tr><td> 행크스 균형 소금 솔루션 (HBSS) </td><td> 생명 기술 </td><td> 14175-079 </td><td> 페놀 붉은없이 칼슘, 마그네슘 무료, </td></tr><tr><td> 인간 IgG Cohn 분수 II 및 III 글로블린 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> G-4386 </td><td></td></tr><tr><td> 마우스 반 인간 3 번 CD-FITC </td><td> BD Biosciences </td><td> 349201 </td><td> 실험실 적정에 의해 결정으로 포화 농도 </td></tr><tr><td> 마우스 반 인간 CD4-APC </td><td> BD Biosciences </td><td> 340672 </td><td> 실험실 적정에 의해 결정으로 포화 농도 </td></tr><tr><td> 마우스 반 인간 CD4-PECy7 </td><td> BD Biosciences </td><td> 348799 </td><td> 실험실 적정에 의해 결정으로 포화 농도 </td></tr><tr><td> 마우스 반 인간 CD8-FITC </td><td> BD Biosciences </td><td> 347313 </td><td> 실험실 적정에 의해 결정으로 포화 농도 </td></tr><tr><td> 마우스 반 인간 CD8-APC </td><td> Caltag (생명 기술) </td><td> MHCD0805 </td><td> 실험실 적정에 의해 결정으로 포화 농도 </td></tr><tr><td> 마우스 반 인간 CD19-APC </td><td> Caltag (생명 기술) </td><td> MHCD1905 </td><tD 실험실 적정에 의해 결정됩니다&gt; 포화 농도 </td></tr><tr><td> 마우스 반 인간 CD25-APC </td><td> BD Biosciences </td><td> 340938 </td><td> 실험실 적정에 의해 결정으로 포화 농도 </td></tr><tr><td> 마우스 반 인간 CD127-PE </td><td> BD Biosciences </td><td> 557938 </td><td> 실험실 적정에 의해 결정으로 포화 농도 </td></tr><tr><td> 마우스 반 인간 3 번 CD </td><td> eBiosciences </td><td> 16-0037-85 </td><td> 1.0 MG / ML, azide 무료 </td></tr><tr><td> 마우스 반 인간 CD28 </td><td> eBiosciences </td><td> 16-0289-85 </td><td> 1.0 MG / ML, azide 무료 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Gibco </td><td> 21300-058 </td><td></td></tr><tr><td> EtOH 10-3M PKH26 및 희석제 C를 포함하는 PKH26 붉은 형광 세포 링커 키트 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> PKH26GL - 1KT 또는 MINI26 - 1KT </td><td> 1 단계 절차도 적용PKH67을 포함하는 키트 또는 기타 CellVue 염료에 </td></tr><tr><td> EtOH 및 희석제 C에서 10 3M CellVue의 피를 포함하는 CellVue 피까지 붉은 형광 세포 링커 키트 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> MINCLARET - 1KT 또는 MIDCLA​​RET - 1KT </td><td></td></tr><tr><td> 5 - (및-6) carboxyfluorescein의 diacetate, succinimidyl 에스테르 (CFDA-SE) </td><td> Invitrogen (생명 기술) </td><td> C34554 </td><td> 비 형광, 형성 할 막 esterases으로 흘리고 형광 아미노 반응 carboxyfluorescein succinimidyl 에스테르 (CFSE) </td></tr><tr><td> 죽었 / LIVE 고칠 수 있었던 </td><td> Invitrogen (생명 기술) </td><td> L34955 </td><td></td></tr><tr><td> 멸균 12 원뿔형 X 75mm 폴리 프로필렌 튜브 및 모자 </td><td> VWR </td><td> 60818-102 </td><td> 더 나은 막 염료 착색 효율을 (; 표면에 뜨는 흡인하는 동안 더 적은 세포의 손실을 감소 염료 흡착) 제공 </td></tr><tr><td> 12 X 75mm rounD 바닥 폴리스티렌 튜브 </td><td> Becton 디킨슨 </td><td> 21008-936 </td><td></td></tr><tr><td> 흐름 cytometer </td><td> Bioscience BD </td><td> FACSCalibur LSRFortessa </td><td> 그리고 APC 예, FITC, PKH26, 7-AAD (. 그들 각각 520 nm의, 567 nm의, 그리고 655 nm의, 예 : 488 nm의)를 감지 할 수있는 어떠한 cytometer. 633-640 나노 미터, 그들을. 660 nm의) </td></tr><tr><td> 흐름 cytometer </td><td> Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 날 </td><td> LSRII 청록색 </td><td> 그리고 APC 예, FITC, PKH26, 7-AAD (. 그들 각각 520 nm의, 567 nm의, 그리고 655 nm의, 예 : 488 nm의)를 감지 할 수있는 어떠한 cytometer. 633-640 나노 미터, 그들을. 660 nm의) </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 연구소는 준비 </td></tr><tr><td> 7 Aminoactinomycin D, 농축 가공 </td><td> NA </td><td> NA </td><td> PBS 1 MG / ML. -20 ° C.에서 aliquots 및 저장소에 고정 </td></tr><tr><td> 7 Aminoactinomycin D, wor왕 주식 </td><td> NA </td><td> NA </td><td> 100 μg / PBS에 ML은, 1 MG / ML 냉동 가공에서 매일 준비합니다. </td></tr><tr><td> IgG 블록 </td><td> NA </td><td> NA </td><td> HBSS + 10 MG / ML 인간 IgG Cohn 분수 II 및 III 글로블린 + 10 MG / ML BSA. </td></tr></tbody></table>

셀 추적 염료를 사용하여 전지 부문 모니터링에 최적화 된 착색 및 확산 모델링 방법

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

형광 셀 추적 염료는, 흐름 및 이미지 세포 계측법과 결합, 체외 ​​및 생체의 여러 세포 유형의 상호 작용과 운명을 공부하는 강력한 도구입니다. 1-5 등 염료를 사용하여 출판물의 수천의 일부가 그대로가 있지만 가장 일반적으로 발생 셀 추적 응용 프로그램의 모니터링을 포함 : <ol><li> 줄기 및 전구 세포 정지, 확산 및 / 또는 차별화 6-8 </li><li> 항원 기반 멤브레인 전송 구 및 / 또는 전구체 세포 증식 3,4,10-18 및 </li><li> 면역 규정 및 효과기 세포 기능 1,18-21. </li></ol> 상업적으로 이용 가능한 세포 추적 염료는 화학 및 형광 속성에 다양하지만, 셀 라벨 자신의 메커니즘에 따라 두 클래스 중 하나에 대다수의 가을. &quot;막 염료는&quot;높은 lipophilic 염료는 t이며, PKH26에 의해 typified셀 멤브레인 1,2,11에 안정적으로하지만 비 covalently 모자 파티션. &quot;단백질 염료는&quot;CFSE에 의해 typified, 세포 단백질 4,16,18과 안정적인 공유 결합 채권을 형성 아미노 반응 염료 있습니다. 각 클래스는 자신의 장점과 한계를 가지고있다. 성공적인 사용의 핵심은, 특히 여러 염료가 다른 세포 유형을 추적하는 데 사용되는 여러 가지 빛깔의 연구에 각 클래스 2-4,16,18,24의 최적 사용을 가능하게하는 중요한 문제를 이해하는 것이 있습니다. 프로토콜 셀 추적 염료를 사용하는 경우 가난한 또는 가변 결과의 세 가지 일반적인 원인을 강조 여기에 포함되어 있습니다. 이는 다음과 같습니다 <ol><li> 밝고 균일 재현 라벨을 달성하기 실패했습니다. 이 모든 세포 추적 연구를위한 필요 출발점이 될 것입니다하지만 단백질 염료 또는 항체와 같은 평형 구속력이 시약을 사용할 때보다 막 염료를 사용하여 다른 변수에주의가 필요합니다. </li><li> 차선 fluorochrome 조합차 / 또는 실패는 중요한 보상 컨트롤을 포함 할 수 있습니다. 염료 형광을 추적하면 일반적으로 10 2 - 항체 형광보다 10 3 배 더 밝아. 이 추적 염료의 존재가 사용하는 다른 프로브를 감지 할 수있는 능력을 손상하지 않습니다 있는지 확인하는 것이 중요합니다. </li><li> 최대 모델링 소프트웨어과 잘 맞는지를 얻기 위해 실패했습니다. 이러한 소프트웨어는 전구체 주파수 또는 기타 통계에 따라 서로 다른 집단이나 자극에 걸쳐 proliferative 응답 양적 비교를 할 수 있습니다. 적합한 구하기 그러나,의 염료 희석 프로필을 왜곡 할 수 세포를 죽음과 관찰 염료 희석 프로파일의 특성과 모델을 근간 가정의 일치 / 죽었어. 제외가 필요합니다 </li></ol> 여기에 주어진 예는 세포 증식을 모니터링 막 및 / 또는 단백질 염료를 사용하는 경우이 변수가 결과에 영향을 미칠 수 방법을 보여줍니다.

면역 세포 기능과 확산을 모니터하기위한 셀 추적 염료의 성공적인 사용은 몇 가지 중요한 단계를 포함한다. 우리가 방법을 설명합니다 : 1) 막 염료를 갖춘 밝고 균일 재현 라벨 - ING 획득, 2) fluorochromes 및 데이터 수집 조건을 선택을하고, 3) 염료 희석에 따라 세포 증식을 수량화 할 수있는 모델을 선택.

형광 세포 추적 염료는 유세포 분석 및 이미지 사이토메트리와 결합하여 ...의 상호작용과 운명을 연구할 수 있는 강력한 도구입니다.

이 방법의 전반적인 목표는 세포 추적 염료를 사용하여 복잡한 세포군 내의 서로 다른 면역 세포 하위 집합에 대한 세포 분열 정도를 직접 정량화하는 것입니다. 이는 먼저 세포 단백질에 안정적으로 결합하거나 세포막에 비공유적으로 삽입되는 것으로 알려진 형광 염료로 모세포 집합을 라벨링하여 자극에 반응하는 염료 라벨링 세포를 추적함으로써 달성됩니다. 형광 항체로 염색하고 다매개변수 유세포 분석기를 사용하여 분석하면 자극된 관심 면역 세포 유형 간의 차별적 반응을 검출할 수 있습니다. 이때 추적 염료로 염색되지 않은 대조군은 자가 형광과 구별할 수 있는 딸세포의 최저 형광 강도를 설정하는 데 사용되며, 추적 염료로 라벨링되었으나 자극되지 않은 대조군은 분열되지 않은 세포가 검출되는 형광 강도를 설정하는 데 사용됩니다. 일반적으로 자극을 주면 반응하여 증식하는 세포들이 점진적으로 어두워지므로 광범위한 강도 범위가 나타나지만, 무반응 세포들은 그렇지 않습니다.최종적으로, 피크 모델링 소프트웨어를 사용하여 서로 다른 세대에 있는 세포의 상대적 빈도를 추정하면, 증식 지수나 전구세포 빈도와 같은 지표를 통해 서로 다른 집단 또는 자극에 따른 증식 반응을 정량적으로 비교할 수 있습니다. 트리튬성 티미딘 통합이나 KI 67 발현과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, DI 희석이 세포 분할에 대한 직접적인 측정치를 제공하며 이를 면역 표현형 분석 및 사이토카인 생성과 같은 다른 유세포 분석 측정법과 결합할 수 있다는 점입니다. 세포의 염료 흡수가 매우 빠르게 일어나므로 막 염료 염색 방법의 시각적 시연이 도움이 됩니다.결과적으로, 밝고 균일한 염색 결과를 얻기 위해서는 숙련된 기술이 핵심입니다. 인간 말초혈액 단핵세포를 분리한 후, 혈소판 오염을 최소화하기 위해 상온에서 300 ×g로 5분 동안 원심분리하십시오. 그런 다음 펠릿을 1% BSA가 포함된 HBSS에 10⁷ cells/mL 농도로 재부유시킨 후 얼음에 보관하십시오.500 µL의 aliquot를 제거하여 보관한 후, 또 다른 500 µL의 세포 aliquot를 12 x 75 mm 원추형 폴리프로필렌 튜브로 옮깁니다. 3.5 mL의 HBSS를 첨가하고 실온에서 400 ×g로 5분 동안 원심분리합니다. 세척하는 동안, PKH 26 GL 키트의 diluent C labeling vehicle 0.5 mL를 또 다른 12 x 75 mm 원추형 폴리프로필렌 튜브에 넣습니다. 잔류액이 15 ~ 25 µL 이하가 되도록 상층액을 조심스럽게 흡입하여 제거하되, 세포가 제거되지 않도록 주의합니다. 다음으로, 세포 펠릿에 diluent C labeling vehicle 0.5 mL를 첨가하고, 용액을 여러 번 흡입 및 분사하여 단일 세포 현탁액을 얻습니다.이제 희석액 C가 담긴 튜브에 PKH 26 2 µL를 첨가하여 2 X XD 스톡을 준비합니다. 그 다음 즉시 세포 현탁액을 갓 준비한 2 X PKH 26 염색액에 피펫으로 옮기고, 세포가 염색액 전체에 균일하게 분산되도록 혼합물을 동시에 흡입하고 분사하는 과정을 여러 번 반복합니다. 1분 후, 세포막으로의 염색약 흡수를 중단시키기 위해 열 불활성화 혈청 1 mL를 첨가합니다. 세포를 원심 분리한 후, 펠렛이 제거되지 않도록 주의하여 상층액을 흡입하여 제거합니다.그런 다음 10% 열불활성화 혈청이 포함된 완전 배지 4 mL에 펠렛을 분산시키고, 세포 현탁액을 새로운 폴리프로필렌 튜브로 옮깁니다. HBSS 및 1% BSA로 세포를 두 번 세척합니다. 적절하게 염색된 세포는 펠렛에서 뚜렷한 분홍색 색조를 나타냅니다. 세포 펠렛을 HBSS 및 1% BSA 1 mL에 다시 현탁한 후, 세포 수를 측정하고 최종 농도가 10⁷ cells/mL가 되도록 부피를 조절합니다. 표에 설명된 유세포 분석 프로토콜에 따라 세포를 염색한 후, 처음 5개의 튜브를 사용하여 전방 산란(forward scatter) 및 측방 산란(side scatter) 파라미터와 4개 형광 검출기 모두의 신호를 설정합니다.특히 2번 튜브의 PKH 26 형광을 모니터링하는 데 사용되는 검출기의 경우, PKH 26으로 염색된 모든 세포가 세 번째에서 네 번째 decade의 단일 대칭 피크로 나타나며 마지막 채널에는 세포가 거의 없거나 전혀 없는지 확인하십시오. 다음으로, 컬러 보정 소프트웨어와 1번에서 5번 튜브까지 수집한 리스트 모드 파일을 사용하여, 다른 세 가지 형광색소를 모니터링하는 데 사용되는 검출기들의 각 형광체에 대한 컬러 오버랩 매트릭스를 설정하십시오.그런 다음 이 행렬을 샘플 6의 리스트 모드 파일에 적용하십시오. PKH 26 라벨링의 존재가 7-AAD 양성 세포를 검출하는 능력에 영향을 주지 않는지 확인하기 위함입니다. 이제 방금 설정한 색상 중첩 행렬을 튜브 7의 리스트 모드 파일에 적용하십시오.FE 대 PC 플롯에서 CD3 양성 CD4 음성 및 CD3 양성 CD4 양성 집단을 확인하십시오. anti-CD3, FE 및 anti-CD4 APC의 존재가 7-AAD 양성 세포를 검출하는 능력에 영향을 주지 않는지 확인하십시오. 마지막으로, tube 7의 색상 중첩 행렬(color overlap matrix)을 tube 8의 리스트 모드 파일(list mode File)에 적용하십시오.이제 증식 분석 모듈이 포함된 프로그램을 엽니다. 분석할 데이터 세트에서 자극된 PKH 26 염색 파일을 불러옵니다. 다음으로, 이번 분석을 위한 파라미터를 선택합니다. 여기서는 생존 가능한 7-AAD 음성, CD3 양성 림프구로 게이팅된 PKH 26과, 작은 파편 및 큰 응집물을 제외하기 위한 forward scatter 대 side scatter를 선택합니다.이 구역들을 정의할 때, 일반적으로 blast가 발견되는 높은 전방 산란(forward scatter) 영역이 포함되도록 주의하십시오. 다음으로, 증식 분석 마법사(proliferation wizard)를 엽니다. 시작 탭을 클릭하여 데이터 파일을 열고, 자극을 주지 않은 PKH 26 양성 대조군을 로드하십시오.분열되지 않은 세포에 해당하는 부모 피크(parental peak)의 위치를 정의하십시오. 부모 피크의 위치와 너비 값을 기록하며 파일을 분석하십시오. 고정된 피크 너비가 필요한 경우, lock SD를 체크하고 PKH 26 음성 대조군을 로드한 후, PKH 26 음성 세포보다 높은 피크 채널을 설정하여 dimus 딸 세대의 세대 수를 조정하십시오.이는 딸 세대 수를 설정합니다. 완료 시 모델을 정확하게 피팅할 수 있습니다. 자극된 PKH 26 양성 파일을 다시 불러오십시오.구분 가능한 세대별 피크가 뚜렷하게 나타나면, 모델 옵션에서 floating 설정을 선택하십시오. 로그 십진수가 정확히 4.0이 아닌 경우, 본문에서 설명한 대로 세대 간 간격을 조정하십시오. 이제 자극된 샘플을 분석하여 부모 피크 위치에 해당하는 영역이 변함없이 유지되는지 확인하십시오.마지막으로, 데이터 세트 내의 각 실험 파일에 대해 'analyze'를 선택하여 적용합니다. 방금 생성한 모델을 통해 각 실험 파일의 최적 적합(best fit) 결과로 도출된 원하는 증식 지표를 기록합니다. 이 첫 번째 데이터 시리즈는 혼합 기술이 PKH 26 형광 분포에 미치는 영향을 보여줍니다.배양된 U 9 37 골수성 세포를 앞서 설명한 방법을 사용하여 세포 추적 염료로 염색하였으며, 첫 번째 히스토그램은 염색되지 않은 대조군 데이터를 보여줍니다. 사이토미터 설정은 이러한 세포의 자가형광이 첫 번째 디케이드(decade)에 위치하도록 조정하여, 첫 번째 채널에 축적되는 세포가 없거나 매우 적게 나타나도록 하였습니다. 두 번째 히스토그램은 PKH 26 염색이 잘 이루어졌음을 보여줍니다.2x 세포와 2x 염료를 빠르게 혼합했을 때, 형광 분포는 밝고 균일하며 대칭적이었으나, 이전 히스토그램에 사용된 기기 설정에서는 범위를 벗어난 세포가 나타나지 않았습니다. 반면, 즉시 혼합하지 않고 2x 세포를 2x 염료에 추가했을 때는 더 불균일한 형광 분포가 관찰되었습니다. 이렇게 희미하게 염색된 소수의 하위 집단은 본 실험의 최종 히스토그램에서 이후 시점에 나타날 경우 딸세포로 잘못 해석될 수 있습니다. 또한, 3 µL의 고농도 에탄올 염료 스톡을 0.5 mL의 2x 세포 현탁액에 실수로 직접 추가했을 때도 불충분한 혼합이 발생하여, 매우 희미하고 오른쪽으로 치우친 형광 강도 분포를 보였습니다.여기 PKH 20로 염색된 인간 말초혈액 단핵세포를 자극제인 Anti CD three 및 IL two 시약의 처리 여부에 따라 배양한 증식 실험의 전형적인 결과가 제시되어 있습니다. 96시간의 배양 후, 세포를 수확하여 anti CD three FE, anti CD 19 A PC 및 seven A a d로 대조 염색하였습니다.두 가지 서로 다른 게이팅 전략을 비교하였습니다. 첫 번째 게이팅 전략에서는, CD3 대 7-AAD의 점 도표(dot plot)를 사용하였습니다. 살아있는 7-AAD 음성 CD3 양성 T 세포를 선택하기 위해 7-AAD가 사용되었습니다. 그 후, 블라스팅 림프구(blasting lymphocytes)는 포함하면서 커다란 응집체는 제외하기 위해 전방 산란광(forward scatter) 및 측방 산란광(side scatter) 영역을 사용하여 게이팅하였습니다.염색되지 않은 대조군의 R1+R2 게이트 이벤트는 회색 히스토그램으로 표시되며, PKH 26으로 염색되었으나 자극되지 않은 세포는 파란색으로 표시됩니다. 자극되지 않은 대조군에서 생존해 있으나 분열하지 않은 T 세포가 밝고 대칭적이며 균질하게 염색된 것에 주목하십시오. 이 데이터는 이전 그림과 동일한 방식으로 게이팅되었으나, 이번 경우에는 세포를 anti-CD3와 IL-2로 자극했습니다. R1+R2 게이트 이벤트에 대한 PKH 26 히스토그램은 이제 주로 분열된 세포들을 포함하며, 각 딸세대별로 색상이 지정된 피크로 표시되는 감소된 강도를 나타냅니다.청색 부모 피크에는 분열되지 않은 밝은 세포들이 일부 여전히 남아 있습니다. 고도로 분열된 세포들의 강도가 아직 염색되지 않은 세포들이 측정되는 영역과 겹치지 않는다는 점에 유의하십시오. 만약 이 영역들이 겹친다면, 여기에서 가장 낮은 강도의 딸 세대 세포 수를 기반으로 한 지표 추정치에 혼선을 줄 수 있습니다. 이전의 두 그림 세트와 동일한 데이터를 분석하였으나, 생존 가능한 T 세포를 선택하는 데는 광산란(light scatter)과 CD3만을 사용하였습니다.이 게이팅 전략은 많은 사멸 세포를 제외하지만 모두 제외하지는 않으며, 이는 CD3 대 7-AAD 도트 플롯에 남아 있는 7-AAD 양성 사멸 세포의 작은 잔류 집단에 의해 입증됩니다. 면역표현형 분석에 사용되는 형광색소의 선택은 세포 추적 염료를 사용할 때 까다로운 보정 문제를 야기할 수 있는데, 이는 분열하지 않은 세포의 염색 강도가 매우 밝기 때문입니다. 본 실험에서는 24시간 된 말초혈액 단핵세포를 PKH26으로 표지한 후, CD3 및 CD4 항체와 생존력 염료로 대조 염색하였습니다.이 데이터 시리즈에서, 2 µM PKH 26으로 표지된 세포들은 anti-CD3 FITC와 anti-CD4 APC로 대조 염색되었으며, 이전과 동일한 R1+R2 게이팅 전략을 사용하여 분석되었습니다. PKH 26의 APC 채널 유입(overlap)이 거의 없기 때문에, 보정(compensation) 적용 여부와 관계없이 CD4 양성과 음성 이벤트가 명확하게 구분되었습니다. 이 데이터는 최종 PKH 26 농도가 4 µM로 증가했을 때에도 생존 가능한 CD3 양성 CD4 양성 T 세포가 잘 구분되어 유지됨을 보여줍니다. anti-CD4 PerCP를 anti-CD3 FITC, 2 µM PKH 26 및 생존 염색 시약 ToPro-3와 함께 사용한 경우에는 PKH 26의 PerCP 채널 유입이 심해 훨씬 좋지 않은 결과가 나타났습니다.보정되지 않은 데이터에서는 CD4 양성 세포와 음성 세포를 서로 구분할 수 없었으며, 보정을 적용한 후에도 간신히 구분되는 수준이었습니다. PKH 26의 최종 농도를 4 µM로 높이자, 보정을 적용한 후에도 CD4 양성 이벤트와 CD4 음성 이벤트를 구분하는 능력이 완전히 상실되었습니다. CP당 anti-CD4를 포함하거나 포함하지 않은 샘플들이 기본적으로 동일하다는 점에 유의하십시오.염료 희석 프로파일을 피크 모델링 소프트웨어로 분석하여 연속적인 딸세포 세대의 세포 빈도를 추정할 때, 연속적인 딸세포 피크의 위치 또는 너비는 고정하거나 유동적으로 설정할 수 있습니다. 이는 모세포 피크 값에 대한 기준이며, 해당 값들은 자극되지 않은 대조군으로부터 추정됩니다.예를 들어, 이 PKH 26 강도 프로파일은 중등도 반응자(moderate responder)의 자극되지 않은 96시간 배양물에서 얻은 것이며, 분할되지 않은 모세포를 나타내는 피크의 위치와 너비에 대한 1차 추정치를 mod fit 증식 위저드(proliferation wizard)에 제공하는 데 사용되었습니다. 피크 위치에 고정 설정을 사용하려면 각 세대별 피크의 평균값이 이전 피크 형광 강도의 정확히 절반이어야 합니다. 피크 위치에 플로트(float) 설정을 사용하면 최적의 적합도를 얻기 위해 필요한 경우 세대별 피크의 최종 위치가 예상 강도와 다르게 조정될 수 있습니다.마찬가지로, 피크 너비(peak width)를 고정 설정으로 지정하면 각 세대 피크의 너비가 모세포 또는 비자극 대조군 피크의 너비와 동일해야 합니다. 피크 너비를 가변 설정으로 지정하면 이 표에서 최적의 적합도를 얻기 위해 최종 너비를 필요에 따라 독립적으로 변경할 수 있습니다. 구별 가능한 세대 피크가 뚜렷하게 나타난 두 명의 서로 다른 공여자에 대해 이전 그림들을 분석한 결과가 여기 제시되어 있습니다.피크 위치와 너비를 모두 가변적으로 설정했을 때 최적의 reduced chi square 값이 얻어졌습니다. 구별 가능한 세대별 피크가 뚜렷하지 않은 증식 프로파일의 경우, 피크 위치를 고정 설정으로 유지하는 것이 권장됩니다. 이 데이터는 유세포 분석 면역 억제 분석법에서 두 가지 추적 염료를 사용하여 서로 다른 면역 세포 유형의 증식 이력을 개별적으로 모니터링하는 방법을 보여줍니다. 녹색으로 표시된 T effector 세포는 CFSE로 라벨링되었으며, 청색으로 표시된 T regulatory 세포는 cell view로 라벨링되었습니다.Claret로 라벨링된 세포군을 다양한 비율로 혼합하고 anti CD3, anti CD28 및 방사선 조사된 보조 세포가 존재하는 환경에서 96시간 동안 배양했습니다. 그 후, 세포를 수확하여 anti CD4, PE size 7 및 live dead violet로 염색했습니다. 여기에는 live dead violet 양성 세포를 게이팅하여 제외한 후, treg 대 T effector 비율이 0.25:1인 경우의 대표 데이터가 나타나 있습니다.응집체와 잔해물을 제외하고 림프구와 모세포를 포함하는 광산란 게이트를 적용한 후, CD4 양성 이벤트를 포함하는 게이트를 적용하였습니다. Cell View Claret 염색을 통해 생존 가능한 Treg 세포를 고도로 증식하여 구분하기 쉬운 생존 가능한 T 작동 세포와 용이하게 구별할 수 있었으며, 이에 따라 CFSE 양성 T 작동 세포와 Cell View Claret 양성 Treg 세포의 CFSE DIM 증식 프로파일을 ModFit Peak modeling 소프트웨어를 사용하여 분석하였습니다. 약 25,000개의 이벤트를 분석하였습니다.이 중 48%는 생존 가능한 T effector였고, 6%는 생존 가능한 T reg였으며, 나머지는 사멸 세포, 보조 세포 및 잔해였습니다. 분석 기간 동안의 세포 수 증가 배수를 나타내는 산출된 증식 지수는 T effector의 경우 3.85, Treg의 경우 1.83이었습니다. 여기에서는 CFSE 염료 희석 프로파일로부터 산출된 T effector 세포의 증식 지수에 미치는 Treg 세포 농도의 영향이 나타나 있습니다.treg 세포를 Cell View Claret으로 염색했는지 아니면 염색하지 않았는지에 관계없이 결과는 동일했으며, 이는 염색에 의해 treg 기능이 변하지 않았음을 나타냅니다. 예상대로 추적 결과, treg 세포의 농도가 감소함에 따라 T effector 세포의 증식 정도가 증가했습니다. 또한 서로 다른 treg 대 T effector 비율에서 Cell View Claret 염료 희석 프로파일로부터 Treg 세포 증식 지수를 산출하였습니다.예상대로, T effector 세포의 농도가 증가함에 따라 T effector 세포가 없는 조건에서 Treg 세포의 증식은 최소한으로 일어났습니다. 하지만 Treg 세포 증식의 정도 또한 함께 증가하였습니다. 이 영상을 시청한 후에는 세포 추적 염료를 사용하여 세포 증식을 성공적으로 모니터링하는 방법, 적절한 형광색소 및 색상 보정 대조군을 선택하는 방법, 그리고 염료 희석을 기반으로 세포 분열을 정량화하기 위한 적절한 모델을 선택하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.본 절차와 더불어, 항원 특이적 T 세포 염색이나 휴지기 또는 서서히 분열하는 줄기세포 유사 세포의 회수를 위한 유세포 분석 분리(flow sorting)와 같은 실험적 질문에 답하기 위한 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 시청해 주셔서 감사합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

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