셀 추적 염료를 사용하여 전지 부문 모니터링에 최적화 된 착색 및 확산 모델링 방법

이 방법의 전반적인 목표는 세포 추적 염료를 사용하여 복잡한 세포군 내의 서로 다른 면역 세포 하위 집합에 대한 세포 분열 정도를 직접 정량화하는 것입니다. 이는 먼저 세포 단백질에 안정적으로 결합하거나 세포막에 비공유적으로 삽입되는 것으로 알려진 형광 염료로 모세포 집합을 라벨링하여 자극에 반응하는 염료 라벨링 세포를 추적함으로써 달성됩니다. 형광 항체로 염색하고 다매개변수 유세포 분석기를 사용하여 분석하면 자극된 관심 면역 세포 유형 간의 차별적 반응을 검출할 수 있습니다. 이때 추적 염료로 염색되지 않은 대조군은 자가 형광과 구별할 수 있는 딸세포의 최저 형광 강도를 설정하는 데 사용되며, 추적 염료로 라벨링되었으나 자극되지 않은 대조군은 분열되지 않은 세포가 검출되는 형광 강도를 설정하는 데 사용됩니다. 일반적으로 자극을 주면 반응하여 증식하는 세포들이 점진적으로 어두워지므로 광범위한 강도 범위가 나타나지만, 무반응 세포들은 그렇지 않습니다.

최종적으로, 피크 모델링 소프트웨어를 사용하여 서로 다른 세대에 있는 세포의 상대적 빈도를 추정하면, 증식 지수나 전구세포 빈도와 같은 지표를 통해 서로 다른 집단 또는 자극에 따른 증식 반응을 정량적으로 비교할 수 있습니다. 트리튬성 티미딘 통합이나 KI 67 발현과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, DI 희석이 세포 분할에 대한 직접적인 측정치를 제공하며 이를 면역 표현형 분석 및 사이토카인 생성과 같은 다른 유세포 분석 측정법과 결합할 수 있다는 점입니다. 세포의 염료 흡수가 매우 빠르게 일어나므로 막 염료 염색 방법의 시각적 시연이 도움이 됩니다.

결과적으로, 밝고 균일한 염색 결과를 얻기 위해서는 숙련된 기술이 핵심입니다. 인간 말초혈액 단핵세포를 분리한 후, 혈소판 오염을 최소화하기 위해 상온에서 300 ×g로 5분 동안 원심분리하십시오. 그런 다음 펠릿을 1% BSA가 포함된 HBSS에 10⁷ cells/mL 농도로 재부유시킨 후 얼음에 보관하십시오.

500 µL의 aliquot를 제거하여 보관한 후, 또 다른 500 µL의 세포 aliquot를 12 x 75 mm 원추형 폴리프로필렌 튜브로 옮깁니다. 3.5 mL의 HBSS를 첨가하고 실온에서 400 ×g로 5분 동안 원심분리합니다. 세척하는 동안, PKH 26 GL 키트의 diluent C labeling vehicle 0.5 mL를 또 다른 12 x 75 mm 원추형 폴리프로필렌 튜브에 넣습니다. 잔류액이 15 ~ 25 µL 이하가 되도록 상층액을 조심스럽게 흡입하여 제거하되, 세포가 제거되지 않도록 주의합니다. 다음으로, 세포 펠릿에 diluent C labeling vehicle 0.5 mL를 첨가하고, 용액을 여러 번 흡입 및 분사하여 단일 세포 현탁액을 얻습니다.

이제 희석액 C가 담긴 튜브에 PKH 26 2 µL를 첨가하여 2 X XD 스톡을 준비합니다. 그 다음 즉시 세포 현탁액을 갓 준비한 2 X PKH 26 염색액에 피펫으로 옮기고, 세포가 염색액 전체에 균일하게 분산되도록 혼합물을 동시에 흡입하고 분사하는 과정을 여러 번 반복합니다. 1분 후, 세포막으로의 염색약 흡수를 중단시키기 위해 열 불활성화 혈청 1 mL를 첨가합니다. 세포를 원심 분리한 후, 펠렛이 제거되지 않도록 주의하여 상층액을 흡입하여 제거합니다.

그런 다음 10% 열불활성화 혈청이 포함된 완전 배지 4 mL에 펠렛을 분산시키고, 세포 현탁액을 새로운 폴리프로필렌 튜브로 옮깁니다. HBSS 및 1% BSA로 세포를 두 번 세척합니다. 적절하게 염색된 세포는 펠렛에서 뚜렷한 분홍색 색조를 나타냅니다. 세포 펠렛을 HBSS 및 1% BSA 1 mL에 다시 현탁한 후, 세포 수를 측정하고 최종 농도가 10⁷ cells/mL가 되도록 부피를 조절합니다. 표에 설명된 유세포 분석 프로토콜에 따라 세포를 염색한 후, 처음 5개의 튜브를 사용하여 전방 산란(forward scatter) 및 측방 산란(side scatter) 파라미터와 4개 형광 검출기 모두의 신호를 설정합니다.

특히 2번 튜브의 PKH 26 형광을 모니터링하는 데 사용되는 검출기의 경우, PKH 26으로 염색된 모든 세포가 세 번째에서 네 번째 decade의 단일 대칭 피크로 나타나며 마지막 채널에는 세포가 거의 없거나 전혀 없는지 확인하십시오. 다음으로, 컬러 보정 소프트웨어와 1번에서 5번 튜브까지 수집한 리스트 모드 파일을 사용하여, 다른 세 가지 형광색소를 모니터링하는 데 사용되는 검출기들의 각 형광체에 대한 컬러 오버랩 매트릭스를 설정하십시오.

그런 다음 이 행렬을 샘플 6의 리스트 모드 파일에 적용하십시오. PKH 26 라벨링의 존재가 7-AAD 양성 세포를 검출하는 능력에 영향을 주지 않는지 확인하기 위함입니다. 이제 방금 설정한 색상 중첩 행렬을 튜브 7의 리스트 모드 파일에 적용하십시오.

FE 대 PC 플롯에서 CD3 양성 CD4 음성 및 CD3 양성 CD4 양성 집단을 확인하십시오. anti-CD3, FE 및 anti-CD4 APC의 존재가 7-AAD 양성 세포를 검출하는 능력에 영향을 주지 않는지 확인하십시오. 마지막으로, tube 7의 색상 중첩 행렬(color overlap matrix)을 tube 8의 리스트 모드 파일(list mode File)에 적용하십시오.

이제 증식 분석 모듈이 포함된 프로그램을 엽니다. 분석할 데이터 세트에서 자극된 PKH 26 염색 파일을 불러옵니다. 다음으로, 이번 분석을 위한 파라미터를 선택합니다. 여기서는 생존 가능한 7-AAD 음성, CD3 양성 림프구로 게이팅된 PKH 26과, 작은 파편 및 큰 응집물을 제외하기 위한 forward scatter 대 side scatter를 선택합니다.

이 구역들을 정의할 때, 일반적으로 blast가 발견되는 높은 전방 산란(forward scatter) 영역이 포함되도록 주의하십시오. 다음으로, 증식 분석 마법사(proliferation wizard)를 엽니다. 시작 탭을 클릭하여 데이터 파일을 열고, 자극을 주지 않은 PKH 26 양성 대조군을 로드하십시오.

분열되지 않은 세포에 해당하는 부모 피크(parental peak)의 위치를 정의하십시오. 부모 피크의 위치와 너비 값을 기록하며 파일을 분석하십시오. 고정된 피크 너비가 필요한 경우, lock SD를 체크하고 PKH 26 음성 대조군을 로드한 후, PKH 26 음성 세포보다 높은 피크 채널을 설정하여 dimus 딸 세대의 세대 수를 조정하십시오.

이는 딸 세대 수를 설정합니다. 완료 시 모델을 정확하게 피팅할 수 있습니다. 자극된 PKH 26 양성 파일을 다시 불러오십시오.

구분 가능한 세대별 피크가 뚜렷하게 나타나면, 모델 옵션에서 floating 설정을 선택하십시오. 로그 십진수가 정확히 4.0이 아닌 경우, 본문에서 설명한 대로 세대 간 간격을 조정하십시오. 이제 자극된 샘플을 분석하여 부모 피크 위치에 해당하는 영역이 변함없이 유지되는지 확인하십시오.

마지막으로, 데이터 세트 내의 각 실험 파일에 대해 'analyze'를 선택하여 적용합니다. 방금 생성한 모델을 통해 각 실험 파일의 최적 적합(best fit) 결과로 도출된 원하는 증식 지표를 기록합니다. 이 첫 번째 데이터 시리즈는 혼합 기술이 PKH 26 형광 분포에 미치는 영향을 보여줍니다.

배양된 U 9 37 골수성 세포를 앞서 설명한 방법을 사용하여 세포 추적 염료로 염색하였으며, 첫 번째 히스토그램은 염색되지 않은 대조군 데이터를 보여줍니다. 사이토미터 설정은 이러한 세포의 자가형광이 첫 번째 디케이드(decade)에 위치하도록 조정하여, 첫 번째 채널에 축적되는 세포가 없거나 매우 적게 나타나도록 하였습니다. 두 번째 히스토그램은 PKH 26 염색이 잘 이루어졌음을 보여줍니다.

2x 세포와 2x 염료를 빠르게 혼합했을 때, 형광 분포는 밝고 균일하며 대칭적이었으나, 이전 히스토그램에 사용된 기기 설정에서는 범위를 벗어난 세포가 나타나지 않았습니다. 반면, 즉시 혼합하지 않고 2x 세포를 2x 염료에 추가했을 때는 더 불균일한 형광 분포가 관찰되었습니다. 이렇게 희미하게 염색된 소수의 하위 집단은 본 실험의 최종 히스토그램에서 이후 시점에 나타날 경우 딸세포로 잘못 해석될 수 있습니다. 또한, 3 µL의 고농도 에탄올 염료 스톡을 0.5 mL의 2x 세포 현탁액에 실수로 직접 추가했을 때도 불충분한 혼합이 발생하여, 매우 희미하고 오른쪽으로 치우친 형광 강도 분포를 보였습니다.

여기 PKH 20로 염색된 인간 말초혈액 단핵세포를 자극제인 Anti CD three 및 IL two 시약의 처리 여부에 따라 배양한 증식 실험의 전형적인 결과가 제시되어 있습니다. 96시간의 배양 후, 세포를 수확하여 anti CD three FE, anti CD 19 A PC 및 seven A a d로 대조 염색하였습니다.

두 가지 서로 다른 게이팅 전략을 비교하였습니다. 첫 번째 게이팅 전략에서는, CD3 대 7-AAD의 점 도표(dot plot)를 사용하였습니다. 살아있는 7-AAD 음성 CD3 양성 T 세포를 선택하기 위해 7-AAD가 사용되었습니다. 그 후, 블라스팅 림프구(blasting lymphocytes)는 포함하면서 커다란 응집체는 제외하기 위해 전방 산란광(forward scatter) 및 측방 산란광(side scatter) 영역을 사용하여 게이팅하였습니다.

염색되지 않은 대조군의 R1+R2 게이트 이벤트는 회색 히스토그램으로 표시되며, PKH 26으로 염색되었으나 자극되지 않은 세포는 파란색으로 표시됩니다. 자극되지 않은 대조군에서 생존해 있으나 분열하지 않은 T 세포가 밝고 대칭적이며 균질하게 염색된 것에 주목하십시오. 이 데이터는 이전 그림과 동일한 방식으로 게이팅되었으나, 이번 경우에는 세포를 anti-CD3와 IL-2로 자극했습니다. R1+R2 게이트 이벤트에 대한 PKH 26 히스토그램은 이제 주로 분열된 세포들을 포함하며, 각 딸세대별로 색상이 지정된 피크로 표시되는 감소된 강도를 나타냅니다.

청색 부모 피크에는 분열되지 않은 밝은 세포들이 일부 여전히 남아 있습니다. 고도로 분열된 세포들의 강도가 아직 염색되지 않은 세포들이 측정되는 영역과 겹치지 않는다는 점에 유의하십시오. 만약 이 영역들이 겹친다면, 여기에서 가장 낮은 강도의 딸 세대 세포 수를 기반으로 한 지표 추정치에 혼선을 줄 수 있습니다. 이전의 두 그림 세트와 동일한 데이터를 분석하였으나, 생존 가능한 T 세포를 선택하는 데는 광산란(light scatter)과 CD3만을 사용하였습니다.

이 게이팅 전략은 많은 사멸 세포를 제외하지만 모두 제외하지는 않으며, 이는 CD3 대 7-AAD 도트 플롯에 남아 있는 7-AAD 양성 사멸 세포의 작은 잔류 집단에 의해 입증됩니다. 면역표현형 분석에 사용되는 형광색소의 선택은 세포 추적 염료를 사용할 때 까다로운 보정 문제를 야기할 수 있는데, 이는 분열하지 않은 세포의 염색 강도가 매우 밝기 때문입니다. 본 실험에서는 24시간 된 말초혈액 단핵세포를 PKH26으로 표지한 후, CD3 및 CD4 항체와 생존력 염료로 대조 염색하였습니다.

이 데이터 시리즈에서, 2 µM PKH 26으로 표지된 세포들은 anti-CD3 FITC와 anti-CD4 APC로 대조 염색되었으며, 이전과 동일한 R1+R2 게이팅 전략을 사용하여 분석되었습니다. PKH 26의 APC 채널 유입(overlap)이 거의 없기 때문에, 보정(compensation) 적용 여부와 관계없이 CD4 양성과 음성 이벤트가 명확하게 구분되었습니다. 이 데이터는 최종 PKH 26 농도가 4 µM로 증가했을 때에도 생존 가능한 CD3 양성 CD4 양성 T 세포가 잘 구분되어 유지됨을 보여줍니다. anti-CD4 PerCP를 anti-CD3 FITC, 2 µM PKH 26 및 생존 염색 시약 ToPro-3와 함께 사용한 경우에는 PKH 26의 PerCP 채널 유입이 심해 훨씬 좋지 않은 결과가 나타났습니다.

보정되지 않은 데이터에서는 CD4 양성 세포와 음성 세포를 서로 구분할 수 없었으며, 보정을 적용한 후에도 간신히 구분되는 수준이었습니다. PKH 26의 최종 농도를 4 µM로 높이자, 보정을 적용한 후에도 CD4 양성 이벤트와 CD4 음성 이벤트를 구분하는 능력이 완전히 상실되었습니다. CP당 anti-CD4를 포함하거나 포함하지 않은 샘플들이 기본적으로 동일하다는 점에 유의하십시오.

염료 희석 프로파일을 피크 모델링 소프트웨어로 분석하여 연속적인 딸세포 세대의 세포 빈도를 추정할 때, 연속적인 딸세포 피크의 위치 또는 너비는 고정하거나 유동적으로 설정할 수 있습니다. 이는 모세포 피크 값에 대한 기준이며, 해당 값들은 자극되지 않은 대조군으로부터 추정됩니다.

예를 들어, 이 PKH 26 강도 프로파일은 중등도 반응자(moderate responder)의 자극되지 않은 96시간 배양물에서 얻은 것이며, 분할되지 않은 모세포를 나타내는 피크의 위치와 너비에 대한 1차 추정치를 mod fit 증식 위저드(proliferation wizard)에 제공하는 데 사용되었습니다. 피크 위치에 고정 설정을 사용하려면 각 세대별 피크의 평균값이 이전 피크 형광 강도의 정확히 절반이어야 합니다. 피크 위치에 플로트(float) 설정을 사용하면 최적의 적합도를 얻기 위해 필요한 경우 세대별 피크의 최종 위치가 예상 강도와 다르게 조정될 수 있습니다.

마찬가지로, 피크 너비(peak width)를 고정 설정으로 지정하면 각 세대 피크의 너비가 모세포 또는 비자극 대조군 피크의 너비와 동일해야 합니다. 피크 너비를 가변 설정으로 지정하면 이 표에서 최적의 적합도를 얻기 위해 최종 너비를 필요에 따라 독립적으로 변경할 수 있습니다. 구별 가능한 세대 피크가 뚜렷하게 나타난 두 명의 서로 다른 공여자에 대해 이전 그림들을 분석한 결과가 여기 제시되어 있습니다.

피크 위치와 너비를 모두 가변적으로 설정했을 때 최적의 reduced chi square 값이 얻어졌습니다. 구별 가능한 세대별 피크가 뚜렷하지 않은 증식 프로파일의 경우, 피크 위치를 고정 설정으로 유지하는 것이 권장됩니다. 이 데이터는 유세포 분석 면역 억제 분석법에서 두 가지 추적 염료를 사용하여 서로 다른 면역 세포 유형의 증식 이력을 개별적으로 모니터링하는 방법을 보여줍니다. 녹색으로 표시된 T effector 세포는 CFSE로 라벨링되었으며, 청색으로 표시된 T regulatory 세포는 cell view로 라벨링되었습니다.

Claret로 라벨링된 세포군을 다양한 비율로 혼합하고 anti CD3, anti CD28 및 방사선 조사된 보조 세포가 존재하는 환경에서 96시간 동안 배양했습니다. 그 후, 세포를 수확하여 anti CD4, PE size 7 및 live dead violet로 염색했습니다. 여기에는 live dead violet 양성 세포를 게이팅하여 제외한 후, treg 대 T effector 비율이 0.25:1인 경우의 대표 데이터가 나타나 있습니다.

응집체와 잔해물을 제외하고 림프구와 모세포를 포함하는 광산란 게이트를 적용한 후, CD4 양성 이벤트를 포함하는 게이트를 적용하였습니다. Cell View Claret 염색을 통해 생존 가능한 Treg 세포를 고도로 증식하여 구분하기 쉬운 생존 가능한 T 작동 세포와 용이하게 구별할 수 있었으며, 이에 따라 CFSE 양성 T 작동 세포와 Cell View Claret 양성 Treg 세포의 CFSE DIM 증식 프로파일을 ModFit Peak modeling 소프트웨어를 사용하여 분석하였습니다. 약 25,000개의 이벤트를 분석하였습니다.

이 중 48%는 생존 가능한 T effector였고, 6%는 생존 가능한 T reg였으며, 나머지는 사멸 세포, 보조 세포 및 잔해였습니다. 분석 기간 동안의 세포 수 증가 배수를 나타내는 산출된 증식 지수는 T effector의 경우 3.85, Treg의 경우 1.83이었습니다. 여기에서는 CFSE 염료 희석 프로파일로부터 산출된 T effector 세포의 증식 지수에 미치는 Treg 세포 농도의 영향이 나타나 있습니다.

treg 세포를 Cell View Claret으로 염색했는지 아니면 염색하지 않았는지에 관계없이 결과는 동일했으며, 이는 염색에 의해 treg 기능이 변하지 않았음을 나타냅니다. 예상대로 추적 결과, treg 세포의 농도가 감소함에 따라 T effector 세포의 증식 정도가 증가했습니다. 또한 서로 다른 treg 대 T effector 비율에서 Cell View Claret 염료 희석 프로파일로부터 Treg 세포 증식 지수를 산출하였습니다.

예상대로, T effector 세포의 농도가 증가함에 따라 T effector 세포가 없는 조건에서 Treg 세포의 증식은 최소한으로 일어났습니다. 하지만 Treg 세포 증식의 정도 또한 함께 증가하였습니다. 이 영상을 시청한 후에는 세포 추적 염료를 사용하여 세포 증식을 성공적으로 모니터링하는 방법, 적절한 형광색소 및 색상 보정 대조군을 선택하는 방법, 그리고 염료 희석을 기반으로 세포 분열을 정량화하기 위한 적절한 모델을 선택하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

본 절차와 더불어, 항원 특이적 T 세포 염색이나 휴지기 또는 서서히 분열하는 줄기세포 유사 세포의 회수를 위한 유세포 분석 분리(flow sorting)와 같은 실험적 질문에 답하기 위한 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 시청해 주셔서 감사합니다.