셀 추적 염료를 사용하여 전지 부문 모니터링에 최적화 된 착색 및 확산 모델링 방법

이 방법의 전반적인 목표는 세포 추적 염료를 사용하여 복잡한 집단 내에서 다양한 면역 세포 하위 집합에 대한 세포 분열 정도를 직접 정량화하는 것입니다. 이는 먼저 세포 단백질에 안정적인 결합을 제공하는 것으로 알려진 형광 염료로 모 세포 집단을 라벨링하거나 자극 카운터에 반응하는 염료 표지된 세포를 추적하기 위해 세포막에 비공유 결합을 삽입하고, 형광 항체로 염색하고, 다중 매개변수 유세포 분석을 사용한 분석을 통해 자극된 면역 세포 유형 간의 차등 반응을 검출할 수 있습니다. 그러나 추적 염료 염색되지 않은 대조군은 자가형광 추적 염료 표지와 구별할 수 있는 가장 낮은 딸 세포 형광 강도를 설정하는 데 사용되지만, 자극되지 않은 대조군은 분할되지 않은 세포가 검출되는 형광 강도를 설정하는 데 사용됩니다. 자극은 일반적으로 반응으로 증식하는 세포가 점차 희미해짐에 따라 광범위한 강도를 초래하지만 비반응자는 그렇지 않습니다.

궁극적으로, 피크 모델링 소프트웨어를 사용하여 서로 다른 세대에 있는 세포의 상대적 빈도를 추정하면 증식 지수 또는 전구체 빈도와 같은 메트릭을 사용하여 서로 다른 집단 또는 자극에 걸친 증식 반응을 정량적으로 비교할 수 있습니다. tritiated, thy incorporation 또는 KI 67 발현과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 DI 희석이 면역 표현형 분석 및 사이토카인 생산과 같은 다른 ME 유세포 분석과 결합할 수 있는 세포 분열을 직접 측정할 수 있다는 것입니다. 멤브레인 염료 염색 방법의 시각적 시연은 세포에 의한 염료 흡수가 매우 빠르기 때문에 도움이 됩니다.

결과적으로, 좋은 기술은 밝고 균일한 염색을 얻는 열쇠입니다. 인간 말초 혈액 단핵 세포를 분리한 후 300배 G와 실온에서 5분 동안 원심분리하여 혈소판 오염을 최소화합니다. 그런 다음 펠릿을 HBSS에 1%BSA를 더한 10에서 7번째 셀로 다시 현탁시키고 얼음 위에 놓습니다.

500 마이크로리터 Eloqua를 제거하고 예약한 다음 또 다른 500 마이크로리터 세포 분취액을 12 x 75 밀리미터 원추형 폴리프로필렌 튜브로 옮깁니다. HBSS 3.5ml를 첨가하고 세척하는 동안 400배 G 및 실온에서 5분 동안 셀을 스핀다운한 다음 PKH 26 GL 키트에서 0.5ml의 희석제 C 라벨링 비히클을 다른 12 x 75ml 원추형 폴리프로필렌 튜브에 추가하고 슈퍼 나틴을 조심스럽게 흡인하고 15-25마이크로리터 이하의 잔류 유체를 남기고 세포를 제거하지 않도록 주의합니다. 다음으로, 세포 펠릿에 0.5ml의 희석제 C 표지 비히클을 추가하고 용액을 여러 번 흡인 및 분주하여 단일 세포 현탁액을 얻습니다.

이제 희석제 C.Only가 들어 있는 튜브에 2마이크로리터의 PKH 26을 첨가하여 2개의 XD 스톡을 준비하고, 이제 즉시 세포 현탁액을 새로 준비된 2개의 XPKH 26 염료 용액에 피펫팅하고 혼합물을 여러 번 흡인 및 분주하여 염료 전체에 세포를 균일하게 분산시킵니다. 1분 후, 1ml의 열 비활성화 혈청을 첨가하여 염료가 세포막으로 흡수되는 것을 막습니다. 세포를 회전시킨 후 펠릿을 제거하지 않고 상층액을 조심스럽게 흡인합니다.

그런 다음 펠릿을 10% 불활성화 혈청을 함유한 4ml의 완전한 배지에 분산시키고 세포 현탁액을 새로운 폴리프로필렌 튜브로 옮깁니다. HBSS와 1%BSA로 세포를 두 번 세척하면 적절하게 염색된 세포가 펠릿에서 뚜렷한 분홍색을 띠게 됩니다.HBSS 1밀리리터에 BSA를 더한 세포 펠릿을 현탁액으로 재현한 후 세포를 계수한 다음 부피를 조정하여 밀리리터당 7번째 세포에 10의 최종 농도를 제공합니다. 표에 요약된 유세포 분석 프로토콜에 따라 세포를 염색한 후 처음 5개의 튜브를 사용하여 전방 산란 및 측면 산란 매개변수와 4개의 형광 검출기 모두에서 신호를 설정합니다.

특히 튜브 2에서 PKH 26 형광을 모니터링하는 데 사용되는 검출기의 경우. 모든 PKH 26 염색 세포가 3-4 decade 동안 단일 대칭 피크로 척도에 나타나고 마지막 채널에는 세포가 거의 또는 전혀 없는지 확인합니다. 다음으로, 튜브 1에서 5에 대해 수집된 색상 보정 소프트웨어 및 목록 모드 파일을 사용하여 다른 3개의 형광 색소를 모니터링하는 데 사용되는 검출기의 각 플루로에 대한 색상 중첩 매트릭스를 설정합니다.

그런 다음 이 행렬을 샘플 6의 목록 모드 파일에 적용합니다. PKH 26 라벨링의 존재가 7개의 A, A D 양성 세포를 검출하는 능력에 영향을 미치지 않는지 확인합니다. 이제 방금 설정된 색상 겹침 행렬을 튜브 7의 목록 모드 파일에 적용합니다.

FE 대 PC 플롯에서 CD 3개, 양성 CD 4개, CD 3개, 양성 CD 4개, 양성 모집단 4개를 식별합니다. 안티 CD 3, FE 및 안티 CD 4 A PC의 존재가 7 개의 A A D 양성 셀을 감지하는 능력에 영향을 미치지 않는지 확인하십시오. 마지막으로, 튜브 7의 색상 겹침 행렬을 튜브 8의 목록 모드 파일에 적용합니다.

이제 증식 분석 모듈이 포함된 프로그램을 엽니다. 분석할 데이터 세트에서 자극된 PKH 26 스테인드 파일을 로드합니다. 다음으로, 이 경우 분석을 위한 파라미터를 선택하고, 작은 파편과 큰 응집체를 제외하기 위해 viable 7 a a d negative cd, 3개의 positive lymphocytes 및 forward scatter versus side scatter에 대해 kkh 26 게이트를 선택합니다.

이러한 영역을 정의할 때는 일반적으로 폭발이 발견되는 높은 전방 산란 영역을 포함하도록 주의해야 합니다. 그런 다음 증식 마법사를 엽니다. 시작 탭을 클릭하여 데이터 파일을 연 다음 자극되지 않은 PKH 26 positive control을 로드합니다.

분할되지 않은 세포에 해당하는 부모 피크의 위치를 정의합니다. 파일을 분석하여 Parent peak Position과 Width에 대한 값을 확인합니다. 고정 피크 너비가 필요한 경우 잠금 SD가 P KH 26 네거티브 컨트롤을 로드하는지 확인하고 디머스 도터 생성의 피크 채널을 PKH 26 네거티브 셀 이상으로 설정하여 세대 수를 조정합니다.

이렇게 하면 딸 세대 수가 설정됩니다. 모델이 완료되면 정확하게 맞을 수 있습니다. 자극된 PKH 26 포지티브 파일을 다시 로드합니다.

구별 가능한 세대 간 피크가 분명한 경우 모델 옵션에서 부동 설정을 선택합니다. 로그 10년수가 정확히 4.0이 아닌 경우 문서에 설명된 대로 세대 간격을 조정합니다. 이제 자극된 샘플을 분석하고 부모 피크 위치의 영역이 변경되지 않았는지 확인합니다.

마지막으로 적용할 데이터 세트의 각 실험 파일에 대해 분석을 선택합니다. 이 모델은 방금 생성되었으며 데이터 세트의 각 실험 파일에 가장 적합한 결과로 생성된 원하는 증식 메트릭을 기록합니다. 이 첫 번째 데이터 시리즈는 PKH 26 형광 분포에 대한 혼합 기술의 효과를 보여줍니다.

배양시, U9 37 골수성 세포를 방금 설명한 방법을 사용하여 세포 추적 염료로 염색한 이 첫 번째 히스토그램은 염색되지 않은 대조군 데이터를 보여줍니다. 세포분석기 설정은 첫 번째 채널에 축적되는 세포가 없거나 매우 적은 첫 번째 10년 동안 이러한 세포의 자가형광을 배치하도록 조정되었습니다. 이 두 번째 히스토그램은 양호한 PKH 26 염색을 보여줍니다.

2개의 x 세포와 2개의 x 염료를 빠르게 혼합하면 밝고 균질하며 대칭적인 형광 분포를 얻을 수 있었지만 이전 히스토그램에 사용된 기기 설정에서 스케일을 벗어난 세포는 없었습니다. 즉각적인 혼합 없이 두 개의 x dye에 두 개의 x 세포를 첨가했을 때, 더 이질적인 형광 분포가 얻어졌습니다. 이 희미하게 표지된 세포의 이 작은 하위 집단은 이 실험의 최종 히스토그램의 나중 시점에 존재한다면 딸 세포로 잘못 해석될 것이며, 3마이크로리터의 농축 에탄올 염료 스톡이 실수로 0.5ml의 2 x 세포 현탁액에 직접 첨가되어 매우 희미하고 오른쪽으로 편향된 형광 강도 분포를 생성했을 때도 혼합 불량이 발생했습니다.

다음은 PKH 20 염색된 인간 말초 혈액 단핵 세포를 자극 유무에 관계없이 배양한 증식 실험의 전형적인 결과입니다. Anti CD 3 및 IL 2 시약이 표시되어 있습니다. 96시간의 배양 후, 세포를 수확하고 anti CD 3 FE anti CD 19 A PC 및 7 A a d로 counterstain 하였다.

두 가지 다른 게이팅 전략이 첫 번째 게이팅 전략인 CD 3 대 7의 점도표에서 비교되었습니다. A, A, D를 사용하여 7개의 살아있는 a, a d 음성 CD 3개의 양성 T 세포를 선택했습니다. 그런 다음 전방 및 측면 산란 영역을 사용하여 블라스팅 림프구를 포함하면서 큰 응집체를 게이트로 배출했습니다.

염색되지 않은 대조군에 대한 R 1 플러스 R 2 게이트 이벤트는 회색 히스토그램과 PKH 26 염색되었지만 자극되지 않은 세포는 파란색 노트로 표시되며, 자극되지 않은 대조군에서 생존 가능하지만 분열되지 않은 T 세포에 대한 밝은 대칭 균질 염색입니다. 이러한 데이터는 이전 그림과 동일한 방식으로 게이트되었지만, 이 경우 세포에 anti CD 3 및 IL 2로 자극했습니다. R 1 더하기 R 2 게이트 이벤트에 대한 PKH 26 히스토그램은 이제 각 딸 세대에 대해 컬러 피크로 표시되는 감소된 강도를 가진 대부분 분할된 셀을 포함합니다.

일부 밝고 분열되지 않은 세포는 여전히 파란색 부모 피크에 남아 있습니다. 고도로 분열된 세포의 강도는 염색되지 않은 세포가 측정되는 영역과 아직 겹치지 않으며, 이는 여기에서 가장 낮은 강도의 딸 세대에 있는 세포 수를 기반으로 한 지표의 추정을 혼동할 수 있습니다. 앞의 두 세트의 그림과 동일한 데이터를 분석했지만 생존 가능한 T 세포를 선택하기 위해 광 산란과 CD 3만 사용되었습니다.

이 게이팅 전략은 CD에 남아 있는 7개의 A A D 양성 죽은 세포의 작은 잔류 모집단이 3개 대 7개의 A A D 점도표에서 알 수 있듯이 많은 죽은 세포를 제외하지만 전부는 아닙니다. 면역 표현형 분석에 사용되는 형광 색소의 선택은 분열되지 않은 세포의 염색 강도가 매우 밝기 때문에 세포 추적 다이를 사용할 때 까다로운 보상 문제를 일으킬 수 있습니다. 이 실험에서는 24시간 된 말초 혈액 단핵 세포를 PKH 26으로 라벨링한 다음 CD 3 및 CD 4에 대한 항체와 생존력 염료로 대조염색했습니다.

이 일련의 데이터에서, 2 마이크로 몰 PKH 26으로 표지 된 세포는 안티 CD 3 FZ 7 A A D 및 안티 CD 4 A PC로 카운터 염색 한 다음 PKH 26이 A PC 채널로 거의 중복되지 않기 때문에 이전과 동일한 R 1 플러스 R 2 게이팅 전략을 사용하여 분석했습니다. CD 4개의 긍정적 및 부정적 사건은 보상의 적용 여부에 관계없이 명확하게 해결되었습니다. 이러한 데이터는 최종 PKH 26 농도가 4마이크로몰로 증가했을 때에도 생존 가능한 CD 3개의 양성 CD 4개의 양성 T 세포가 어떻게 잘 분해된 상태를 유지했는지 보여줍니다. 안티 CD 3 FE 2 마이크로몰 PKH 26 및 생존 다이 투 프로 3과 함께 안티 CD 4를 사용하면 PKH 26이 CP 채널당 크게 겹치기 때문에 훨씬 더 나쁜 결과를 얻을 수 있습니다.

CD 4개의 positive cells 및 negative cells는 보상되지 않은 데이터에서 서로 분리될 수 없었으며 보상이 적용되었을 때 미미하게 분리되었습니다. 최종 PKH 26 농도를 4마이크로몰로 증가시키면 보상이 적용된 후에도 CD 4개의 음성 이벤트에서 CD 4개의 양성 반응을 해결할 수 있는 능력이 완전히 상실되었습니다. CP당 anti CD four를 포함하거나 결여한 샘플이 본질적으로 어떻게 동일한지 주목하십시오.

연속적인 딸 세대에서 세포의 빈도를 추정하기 위해 피크 모델링 소프트웨어를 사용하여 염료 희석 프로파일을 분석할 때, 연속적인 딸 피크의 위치 및/또는 너비가 고정되거나 부동할 수 있습니다. 부모의 정점에 대한 가치와 관련하여. 이러한 값은 자극되지 않은 대조군에서 추정됩니다.

예를 들어, 이 PKH 26 강도 프로파일은 중간 정도의 반응자로부터 자극되지 않은 96시간 배양에서 추출한 것으로, mod fit proliferation wizard에 분할되지 않은 부모 세포를 나타내는 피크의 위치 및 너비에 대한 첫 번째 추정치를 제공하는 데 사용되었습니다. 피크 위치에 대해 고정 설정을 사용하려면 각 세대 피크의 평균이 이전 피크의 형광 강도의 정확히 절반이어야 합니다. 피크 위치에 대한 부동 설정을 사용하면 세대 피크의 최종 위치가 최상의 피팅을 얻기 위해 필요한 예상 강도와 다를

마찬가지로, 피크 너비에 대한 고정 설정은 각 세대 피크의 너비가 부모 또는 자극되지 않은 제어 피크의 너비와 동일해야 합니다. 피크 너비에 대한 부동 설정을 사용하면 이 표에서 가장 적합한 피팅을 얻기 위해 필요에 따라 최종 너비를 독립적으로 변경할 수 있습니다. 두 개의 서로 다른 기증자에 대한 이전 수치의 분석 결과는 뚜렷한 세대 간 정점이 분명한 이 기증자에 대해 표시됩니다.

가장 잘 감소된 카이 제곱 값은 구별 가능한 세대 피크가 분명하지 않은 증식 프로파일에 대해 피크 위치와 너비가 모두 떠 있을 때 얻어졌으며 피크 위치에 대한 고정 설정이 권장됩니다. 이러한 데이터는 유세포 분석 면역 억제 분석에서 서로 다른 면역 세포 유형의 증식 이력을 별도로 모니터링하기 위해 두 가지 추적 염료를 사용하는 것을 보여줍니다. 녹색으로 표시된 T effector 세포는 CFSE로 표지되었고 파란색으로 표시된 T 조절 세포는 cell view로 표지되었습니다.

Claret 표지된 세포 집단을 다양한 비율로 혼합하고 anti CD three, anti CD 28 및 방사선 조사된 부속 세포의 존재 하에서 96시간 동안 배양했습니다. 그 후, 세포를 수확하고 안티 CD 4, PE 크기 7 및 살아있는 죽은 보라색으로 염색했습니다. 여기. treg 대 T effector 비율이 0.25 대 1인 대표 데이터는 살아있는 죽은 보라색 양성 세포를 게이팅한 후에 표시됩니다.

림프구와 blast를 포함하지만 응집체와 파편은 제외된 light scatter gate를 적용한 후 CD 4개의 양성 이벤트를 포함하는 gate를 적용했습니다. Cell view claret staining을 통해 생존 가능한 treg 세포를 증식이 심한 생존 가능한 T effector 세포와 쉽게 구별할 수 있었으므로 mod fit peak 모델링 소프트웨어를 사용하여 CFSE 양성 T effector 세포 및 cell view Claret positive treg 세포에 대한 CFSE DIM 증식 프로파일을 분석했습니다. 약 25,000개의 이벤트가 분석되었습니다.

이 중 48%는 생존 가능한 T 효과기였고 6%는 생존 가능한 T reg였으며 나머지는 죽은 세포, 부속 세포 및 파편이었습니다. 분석 기간 동안 세포 수의 접힌 증가를 반영하는 계산된 증식 지수는 T effector의 경우 3.85, Tregs의 경우 1.83이었습니다. 여기서, CFSE 염료 희석 프로파일로부터 계산된 T effector 세포의 증식 지수에 대한 tregs 세포 농도의 효과를 나타내

treg 세포가 cell view claret으로 표지되었는지 아니면 염색되지 않은 상태로 남아 있는지 여부에 관계없이 결과는 동일했으며, 이는 treg 기능이 염색에 의해 변경되지 않았음을 나타냅니다. 예상대로 추적을 통해 트레그 세포의 농도가 감소함에 따라 텍터 증식 범위가 증가했습니다. Treg 세포 증식 지수는 또한 서로 다른 treg 대 T effector 비율에서 cell view claret 염료 희석 프로필에서 계산되었습니다.

예상대로, Tregs는 T effector cell 농도가 증가함에 따라 T effector cell이 없는 상태에서 최소한의 증식을 겪었습니다. 그러나 트레그 세포 증식의 정도도 증가했다. 동영상을 시청한 후에는 세포 추적 염료를 성공적으로 사용하여 세포 증식을 모니터링하는 방법, 적절한 형광 색소 및 색상 보상 제어를 선택하는 방법, 염료 희석을 기반으로 세포 분열을 정량화하기 위한 적절한 모델을 선택하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

이 절차와 함께 항원 특이적 T 세포를 염색하거나 정지 상태이거나 천천히 분열하는 줄기 유사 세포를 회수하기 위한 유동 분류와 같은 실험 질문에 답하기 위해 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 시청해 주셔서 대단히 감사합니다.