시각화

다음 실험의 전반적인 목표는 감염된 생쥐의 심장 내에서 ESMO 심장 미세 병변 형성을 위한 재현 가능한 프로토콜을 입증하는 것입니다. 이는 생쥐에 ESMO를 감염시키고 균혈증이 발생하도록 유도하여, 박테리아가 심장 혈관에 도달해 심근을 침범하고 미세 병변을 형성하게 함으로써 달성됩니다. 그 후 심장은 파라핀에 매립하여 일반적인 방식으로 염색하거나, 면역형광 염색을 위해 OCT 화합물로 고정합니다.

염색된 절편을 평가하면 심근 전반에 무작위로 분포된 심장 미세 병변, 콜라겐 침착 및 회복 중인 심장 절편과 심장 미세 병변 내의 폐렴구균 캡슐을 확인할 수 있으며, 이는 해당 절차를 입증합니다. Armand Brown은 본 연구실의 대학원생입니다. 이 방법은 마우스의 침습성 폐렴구균 질환 동안 S. pneumoniae가 심장에 미치는 손상 효과에 대한 통찰을 제공할 수 있습니다.

이는 비인간 영장류나 인간과 같은 다른 계통의 심장 샘플에도 적용할 수 있습니다. 먼저 Todd Hewitt 배지에서 ESMO Serotype four strain Tiger four를 620nm에서 광학 밀도 0.5가 될 때까지 배양하십시오. 적정 밀도에 도달하면 배양액을 3,500 G에서 10분 동안 원심분리하여 펠렛을 형성합니다.

그 후 진공 라인을 사용하여 상층액을 제거하고, 멸균 PBS를 사용하여 박테리아를 mL당 10,000 colony forming units 농도로 재부유시킵니다. 이제 10~12주령의 valve C 마우스를 마취시키고, 무딘 핀셋으로 발가락을 살짝 집어 마취 상태를 확인합니다. 박테리아 현탁액을 시린지에 넣고 27~30게이지 바늘을 장착합니다. 그런 다음 한 손으로 마취된 마우스의 목덜미를 잡고, 다른 손으로 현탁액 100 µL를 복강 내 주사한 후 각 마우스를 케이지에 다시 넣습니다.

마우스는 보통 주사 후 30~40초 후에 깨어납니다. S pneumonia의 투여량을 정확하게 맞추는 것이 매우 중요한데, 그렇지 않으면 마우스가 감염으로부터 회복되거나 병변이 발달하기 전에 폐렴구균 침습성 질환으로 너무 빨리 진행될 수 있기 때문입니다. 각 세균 균주마다 독성 수준이 다르므로, 적절한 투여량을 결정하기 위해 시행 착오 과정이 필요할 수 있습니다.

감염이 초기 단계에 이를 때까지 최소 24시간 동안, 또는 진행된 단계의 감염을 위해 30시간 동안 진행하도록 둡니다. 이후 감염된 각 마우스를 안락사시킵니다. 먼저 혈액 샘플을 채취하기 위해 알코올 솜으로 꼬리를 소독하고 2~3mm 섹션을 잘라냅니다.

절단 부위에서 2 µL의 혈액을 채취합니다. 1 U/mL의 sodium heparin이 포함된 PBS로 혈액을 10배씩 단계 희석합니다. 희석액의 5단계 농도를 triptych soy blood agar 플레이트에 도말하고 하룻밤 동안 배양합니다.

다음 날 콜로니 수를 측정합니다. 다음 섹션에 설명된 대로 심장을 수확하십시오. 또는 감염 후 30시간 후에 진행하십시오.

100 µL의 식염수에 희석한 ampicillin을 복강 내 투여하여 마우스의 회복을 시도하십시오. 36시간 동안 12시간 간격으로 ampicillin 투여를 지속하고, 지정된 시점에 심장을 수집하십시오. 먼저, 심장을 적출하십시오.

안락사시킨 마우스를 수술대 위에 등이 닿게 눕혀 고정하고, 가슴 부위를 70% ethanol로 분사한 후 가볍게 닦아 말립니다. 수술용 가위와 포셉을 사용하여 흉강을 엽니다. 늑골을 제거하고 횡격막을 절개하여 심장과 폐를 노출시킵니다.

그 후 심장과 연결된 혈관을 자르고, 포셉을 사용하여 심장에 멍이 들지 않도록 조심스럽게 적출합니다. 심장을 PBS로 헹군 후 관상면 절편 제작을 위해 조직 표본 수집 카세트에 넣습니다. 그런 다음 카세트를 10% 완충 포르말린 용액으로 옮기고, 다음 날 파라핀 임베딩을 진행합니다.

초기 단계에서 심장 병변은 색상 변화와 일부 사례에서는 면역 세포의 존재로 식별할 수 있습니다. 진행된 병변의 경우, 면역 세포는 사라지고 크기가 커집니다. 그 자리에는 VA와 유사한 병변이 발견됩니다.

양전하 처리된 유리 슬라이드에 준비된 5 µm 두께의 심장 절편을 사용하며, 먼저 절편을 냉동시킨 후 해동하여 공기 중에 건조시킵니다. 25 °C에서 10% 중성 완충 포르말린으로 10분 동안 슬라이드를 고정합니다. 그 다음 PBS로 5분씩 3회 세척하여 고정액을 제거합니다.

PBS 내 0.2% Triton X-100으로 15분 동안 조직을 투과화합니다. PBS로 세 번 더 세척하여 세제를 제거합니다. 그다음 PBS로 헹군 후, PBS 내 10% coat serum으로 1시간 동안 조직을 블로킹하고, 37°C에서 2시간 동안 항혈청으로 절편을 처리합니다.

음성 대조군은 naive rabbit antiserum으로 처리합니다. 심장 조직은 XI 면역형광 염색제를 쉽게 흡수하여 배경 신호가 높게 나타나므로, 항체 종류에 따라 배양 시간과 농도를 최적화해야 할 가능성이 큽니다. 2시간 후, PBS로 antiserum을 세척합니다. 그 다음 용액을 2차 항체로 교체하고 슬라이드를 37 °C에서 30분 동안 배양합니다. 이제 5 mg/mL 농도의 DPI를 처리하고 슬라이드를 PBS로 세척합니다.

마지막으로, 슬라이드를 마운팅하고 저장한 후 공초점 현미경으로 촬영합니다. 먼저 파라핀을 제거하고 조직 절편을 수화시킵니다. 자일렌으로 세척한 후 단계별 알코올 세척 과정을 거칩니다.

그런 다음 절편을 0.2% 인산 용액에 5분 동안 담근 후, 5분 동안 물로 헹굽니다. 이어서 0.1% Sirius Red 및 Picric acid로 2시간 동안 염색합니다. 그 후 절편을 0.01 N 염산에 3분 동안 세척하고 70% ethanol로 1분 동안 헹굽니다. 이제 농도별 알코올 세척 단계를 역순으로 거쳐 절편을 탈수시킨 후, xylene으로 세척하고 광학 현미경으로 슬라이드를 마운트하여 평가합니다.

Tiger 4 균주를 통한 공격 접종 후 마우스에서 침습성 폐렴구균성 질환이 발생하였습니다. 심실에서 4형 균주에 의한 심장 미세 병변이 관찰되었으며, 감염 후 24시간에서 30시간 사이에 병변의 크기와 수가 증가하는 것이 확인되었습니다. S. pneumoniae가 실제로 병변 내에 존재하는지 확인하기 위해, Tiger 4가 생성하는 혈청형 4 캡슐 다당류에 대해 절편 염색을 수행하였습니다.

이를 통해 미세 병변 부위 내에 조밀하고 밀도가 높은 응집체가 존재함이 확인되었습니다. Ampicillin으로 구조된 쥐와 감염되지 않은 대조군의 심장 절편에 대해 Piro serious red 염색을 수행하였습니다. 구조군에서는.

뇌실 내의 이전 병변 부위로 보이는 곳에서 밴드가 흘러나오는 양상을 보이며 염색의 존재감과 강도가 급격히 증가했습니다. 이 절차를 수행할 때, 균혈증과 심장 미세 병변이 형성될 충분한 시간이 확보될 수 있도록 S pneumonia를 충분한 양으로 감염시켜 감염 상태가 최소 28~30시간 동안 지속되게 하는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오.