시각화 폐렴 구균 심장 Microlesions 및 후속 심장 리모델링 내

다음 실험의 전반적인 목표는 감염된 마우스의 심장 내에서 ESMO 심장 미세 병변 형성에 대한 재현 가능한 프로토콜을 입증하는 것입니다. 이는 생쥐를 ESMO에 감염시키고 세균혈증의 발병을 허용함으로써 달성되며, 따라서 박테리아가 심근에 침입하여 미세한 병변을 형성할 수 있는 심장 혈관 구조에 접근할 수 있도록 합니다. 그런 다음 심장은 파라핀으로 삽입되어 기존 방식으로 염색 및 염색되거나 면역 형광 염색을 위해 OCT 화합물에 고정됩니다.

염색된 절편을 평가하면 심근 콜라겐 침착 및 회복기 내 심장 절편 및 심장 미세 병변 내 폐렴구균 캡슐에 무작위로 분포된 심장 미세 병변을 보여줄 수 있으며, 이를 통해 시술을 입증할 수 있습니다. Armand Brown이 제 연구실의 대학원생입니까? 이 방법은 생쥐의 침습성 폐렴 구균 질환 중 S 폐렴의 심장 손상 영향에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다.

또한 인간이 아닌 영장류 또는 인간과 같은 다른 시스템의 심장 샘플에도 적용할 수 있습니다. Todd Hewitt 육수에 함유된 ESMO Serotype four 균주 Tiger four를 620나노미터에서 0.5의 광학 밀도로 성장시키는 것부터 시작하십시오. 올바른 밀도의 펠렛이 되면 3, 500G에서 10분 동안 배양합니다.

다음 진공 선을 사용하여 상등액을 제거하고 10에 메마른 PBS를 가진 박테리아를 재suspend, 밀리리터 당 단위를 형성하는 000의 대령. 이제 10-12 주 된 밸브 C 마우스를 마취하고 한 쌍의 무딘 핀셋에서 부드러운 발가락 꼬집음으로 마취 상태를 확인하고 박테리아 현탁액이 있는 연꽃 주사기를 부착하고 27-30 게이지 바늘을 부착합니다. 그런 다음 마취된 쥐의 목덜미를 한 손으로 잡고 다른 손으로 복강내 현탁액 100마이크로리터를 주입한 다음 각 마우스를 케이지에 다시 넣습니다.

쥐는 일반적으로 주사 후 30-40초 후에 깨어납니다. S 폐렴의 정확한 복용량을 얻는 것이 중요하며, 그렇지 않으면 생쥐가 감염에서 회복되거나 너무 빨리 침습성 폐렴 구균 질환에 걸려 병변이 발생할 수 있습니다. 각 박테리아 균주에는 귀 렌즈 수준이 다르기 때문에 올바른 용량을 식별하는 데 시행 착오가 필요할 수 있습니다.

감염이 초기 단계까지 최소 24시간 동안 진행되거나 진행된 단계 감염의 경우 30시간 동안 진행되도록 합니다. 나중에 감염된 각 쥐를 안락사시킵니다. 먼저 혈액 샘플을 채취하여 알코올 면봉으로 꼬리를 소독하고 2-3mm 부분을 잘라냅니다.

싹둑싹둑 헤파린나트륨이 함유된 PBS에서 혈액을 밀리리터당 1단위씩 10배로 연속적으로 희석합니다. 삼부작 콩 혈액 한천 플레이트에 5단계 희석액을 도금하고 밤새 배양합니다.

다음 날에는 식민지 수를 계산합니다. 다음 섹션에 설명된 대로 심장 채취를 진행합니다. 또는 감염 후 30시간 후.

100마이크로리터의 식염수에 암피실린 복강간을 투여하여 쥐를 구출하려고 시도합니다. 36시간 동안 12시간마다 암피실린을 계속 투여하고 원하는 시점에 심장을 수집합니다. 첫째, 심장을 수확합니다.

안락사된 쥐를 수술대에 누운 자세로 고정시키고 가슴에 70% 에탄올을 분사하고 두드려 건조시킵니다. 수술용 가위와 집게를 사용하여 흉강을 엽니다. 흉곽을 제거하고 횡격막을 횡단하여 심장과 폐를 노출시킵니다.

그런 다음 심장과 연결된 혈관을 절단하고 집게를 사용하여 멍이 들지 않도록 심장을 부드럽게 절제합니다. PBS로 심장을 헹구고 관상 절편을 위한 조직 표본 수집 카세트에 넣습니다. 다음 카세트를 10%buffered 포르말린 해결책으로 옮기고, 다음 날에, 파라핀 끼워넣기를 위해 보내십시오.

초기 단계에서 심장 병변은 색상 외관의 변화와 경우에 따라 면역 세포의 존재로 식별할 수 있습니다. 진행된 병변에서는 면역 세포가 없고 커집니다. VA와 같은 병변이 그 자리에서 발견됩니다.

양전하를 띤 유리 슬라이드에 5미크론 심장 절편을 사용하여 먼저 절편을 동결한 다음 해동하고 자연 건조시킵니다. 슬라이드를 섭씨 25도에서 10분 동안 10% 중성 완충 포르민으로 고정합니다. 그런 다음 세 번 씻고 PBS로 씻을 때마다 5분 동안 고정액을 제거합니다.

15 분 동안 PBS에서 0.2 % tritton X 100으로 조직을 투과시킵니다. 스트레이트 PBS에서 세 번 더 세탁하여 세제를 제거합니다. 그런 다음 PBS에서 헹굼 후 한 시간 동안 PBS에서 10% 코팅 세럼으로 조직을 차단하고 섭씨 37도에서 2시간 동안 항혈청으로 섹션을 덮습니다.

순진한 토끼 항혈청으로 음성 대조군 치료 심장 조직은 XI 면역형광 염색을 쉽게 흡수하여 높은 백그라운드 수치를 유발하기 때문에 다양한 유형의 항체에 대한 배양 시간의 농도를 최적화해야 할 수 있습니다 2시간 후 PBS로 안티 혈청을 씻어냅니다. 그런 다음 용액을 2차 항체로 교체하고 슬라이드를 섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다. 이제 DPI를 밀리리터당 5밀리그램으로 적용하고 PBS로 슬라이드를 세척합니다.

마지막으로, 슬라이드를 바닥에 장착하고 컨포칼 현미경으로 저장하고 이미지화합니다. 파라핀을 제거하고 조직 부분에 수분을 공급하는 것으로 시작하십시오. 자일렌 세척제를 사용한 다음 등급별 알코올 세척제를 사용하십시오.

그런 다음 0.2% 포스포 메틱산으로 섹션을 5분 동안 목욕시킨 다음 5분 동안 물을 헹구고 0.1% 심각한 빨간색과 릭산으로 2시간 동안 염색합니다. 그런 다음 0.01 일반 염산으로 섹션을 3 분 동안 세척하고 70 % 에탄올로 1 분 동안 헹굽니다. 이제 등급이 매겨진 알코올 수조 시리즈를 반대로 하여 섹션을 탈수한 다음 광학 현미경 마운트를 사용하여 자일렌 세척을 수행하고 슬라이드를 평가합니다.

쥐는 호랑이와의 도전 이후 침습성 폐렴구균 질환에 걸렸습니다. 심실에서 4개의 긴장 심장 미세 병변이 관찰되었으며, 감염 후 24시간에서 30시간 사이에 병변 크기와 수의 증가가 관찰되어 폐렴이 실제로 병변 내에 있는지 확인했습니다. Tiger four에 의해 생성된 혈청형 4개의 캡슐형 다당류에 대해 절편을 염색했습니다.

이를 통해 미세병변 부위 내에 단단히 채워지고 조밀한 응집체가 존재함을 확인했습니다. 암피실린과 감염되지 않은 대조군으로 구조된 쥐의 심장 절편에 대해 피로 심각한 적색 염색을 수행했습니다. 구조에서.

염색의 존재와 강도가 급격히 증가했으며, 심실의 이전 병변 부위로 보이는 곳에서 띠가 흘러나왔습니다. 이 절차를 시도하는 동안 S 폐렴을 충분히 사용하여 쥐를 감염시켜 감염이 최소 28-30시간 동안 진행되도록 하여 균혈증과 심장 미세 병변이 형성될 충분한 시간을 갖도록 하는 것이 중요합니다.