Name: 시각화 폐렴 구균 심장 Microlesions 및 후속 심장 리모델링 내 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: 배우세요 폐렴 구균 감염 마우스 심장 미세 병변 형성 및 심장 재형성 평가 프로토콜. 면역형광 및 조직학 염색법을 활용하여 심근 손상 기전과 회복 과정을 연구하는 방법을 익히세요.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 작업은 미국심장협회(American Heart Association)의 보조금 13IRG14560023과 CJO에 대한 NIH 보조금 AI078972 및 HL108054의 지원을 받았습니다. AOB에 대한 지원은 NIH National Center for Advancing Translational Sciences, NIH ULTR001120 및 F31 A110417701에서 제공했습니다.

참고 : 모든 마우스 실험을 검토하고 샌 안토니오 텍사스 건강 과학 센터의 대학 (프로토콜 # 1 13032-34-01C)에서 기관 동물 케어 및 사용위원회에 의해 승인되었다. 동물 관리 및 공법 89-544 (동물 복지 법) 및 그 수정, 보건 서비스 지침 및 실험 동물의 관리 및 사용을위한 설명서 (보건 복지부의 미국학과)에 부착 된 실험 프로토콜을 지원합니다. 1. 감염 <ol><li> 10-12 주 나이에 세 사이의 남성과 여성 모두의 BALB / c 마우스를 가져옵니다. 참고 : S. 폐렴 구균 혈청 형 4 변형 TIGR4 16 염기 서열 된 악성 임상 격리입니다. </li><li> 광학 밀도 (OD) 0.5 (620)에 도달 할 때까지 5 % CO 2에서 37 ° C에서 토드 - 휴이 국물 TIGR4 성장 (1.0 × 108 콜로니 형성 단위 [CFU] / ㎖에 상응 함). (3)에서 10 분 동안 원심 분리에 의해 펠렛 배양 폐렴500 XG 및 진공 라인을 사용하여 상층 액을 제거합니다. 일시 및 1.0 × 104 CFU / ml의 최종 농도로 멸균 인산 완충 식염수 (PBS)로 희석 된 세균. </li><li> 유도 챔버를 사용하여, 산소 2.5 % 증발 이소 플루 란과 쥐를 마취. 무딘 핀셋과 부드러운 발가락 핀치 마취 상태를 확인합니다. <ol><li> 한 손으로는 목덜미에 의해 마취 마우스를 잡고 똑바로하면, S. 100 ㎕와 각 마우스 복강 (IP)을 주입 (1.0 × 103 CFU의 도전 량에 해당) 27 ~ 30 게이지 바늘과 주사기를 사용 폐렴 서스펜션. 케이지에서 마우스 다시 놓습니다. 마우스는 일반적으로 주사 후 30 ~ 40 초 각성. </li></ol></li><li> 감염이 적어도 (초) 24 또는 30 (고급) 시간 동안 할 수있게합니다. <ol><li> CO 2 질식하여 쥐를 안락사. 마우스를 보장하기 위해 자궁 경부 전위를 수행하는 사망했다. 안락사는 더 제거에 의해 확인단계 1.6의 마음. </li></ol></li><li> 알코올 면봉으로 꼬리를 소독하고 2-3 밀리미터 부분을 싹둑. 혈액의 2 μl를 수집하고 직렬 나트륨 헤파린 1 U / ml의 다섯 배를 포함하는 PBS에 혈액을 10 배 희석. 플레이트 직렬 트립신 간장 혈액 한천 플레이트에 희석과 식민지에서 다음날 추정 해 균혈증의 수준을 계산 CO 2 5 %에서 37 ° C에서 밤새 품어. </li><li> 수술 플랫폼에서 부정사 위치에 마우스를 고정. 70 % 에탄올과 팻 건조와 가슴 스프레이. 수술 가위와 집게가 흉강을 열고 사용, 갈비뼈를 제거하고 심장과 폐를 노출하는 격막을 가로로 쪼개다. 사용 가위은 심장에 연결된 혈관을 잘라 부드럽게 집게와 멍 않도록주의 마음을 절제. </li><li> PBS과 마음을 씻어 후 관상 섹션 조직 절편 동안 획득 될 수 있도록 조직 표본 수집 카세트에 배치합니다. 파라핀 삽입, 놀이터 용파라핀 임베딩 보내 10 % 완충 포르말린 용액과 다음 날에 카세트 CE. <ol><li> 또한 드라이 아이스에 배치 된 cryomold 내에서의 OCT 화합물을 이용하여 플래시 동결. </li></ol></li></ol> 심장 병변 및 병변 내 폐렴 구균 2. 시각화 <ol><li> 마음의 4 챔버는 각 조직 섹션에서 볼 수 있도록 파라핀 심장 부분을 잘라. 5 μm의 두께에 슬라이드를 잘라. </li><li> 표준 방법 (17)를 사용하여 헤 마톡 실린 및 에오신 (H &amp; E)와 Deparaffinize와 얼룩 슬라이드. </li><li> 배율 :보기 H &amp; E는 낮은 (100X, 200X) 및 높은 (400 배, 1000 배 기름 침지)에서 광학 현미경을 사용하여 심장 섹션 스테인드. 심근에 microlesions의 존재에 대해 마음을 특성화. 여기에, 100X 1.3 개구 계획-NEOFLUAR 목표를 장착 한 자이스 Axioskop이 현미경을 사용하여 H &amp; E 이미지를 수집. 참고 : 조기 심장 리터 스테이지esions는 면역 세포, 단핵구 것으로 보인다 무엇 (단핵구와 과립구)의 존재 자신의 차 색깔 모양으로 어떤 경우에 차별된다. 특히 30 시간에서 본 고급 병변에서 면역 세포가 발견하고 큰 공포 병변이 자신의 자리에서 관찰되어 있습니다. 이것은 심장 병변 개발 초기 단계 면역 세포의 유입이 발생하면서 요구 것으로 나타나지 않음에 유의하는 것이 중요하다. </li></ol> Microlesions 내 폐렴 구균 3. 면역 형광 현미경 <ol><li> 양으로 대전 된 유리 슬라이드 위에 5 μm의 장소 섹션의 두께로 마이크로톰와 cryomolds에 제 마음입니다. 얼어 붙은 심장 섹션 해동 자연 건조하도록 허용합니다. (25 ° C에서의 pH 6.8-7.2) 10 분 ~ 10 % 중성 포르말린에 대한 부분을 수정합니다. </li><li> 다음 PBS로 다시 씻어, PBS에서 0.2 % 트리톤 X-100에서 15 분 동안 Permeabilize 하시려면, 5 분 동안 PBS에서 슬라이드 (3 배)를 씻으십시오. </li><li> 차단 티슈 섹션에 ì<html> 1 시간 동안 PBS에서 10 % 염소 혈청과 슬라이드에. </li><li> PBS, 커버 슬라이드를 씻어 1 토끼 항 혈청 형 4 폐렴 구균 항혈청과 심장 부분을 품어 : 1,000 PBS에서 10 % 염소 혈청과 2 시간 동안 37 ° C에서. 참고 : 음성 대조군의 경우 연구자들은 순진한 토끼 항혈청을 사용한다 </li><li> 37 ° C에서 30 분 동안 2,000 : 1 염소 항 - 토끼 FITC 결합 된 항체와 10 % 염소 혈청 PBS로 섹션을 PBS, 커버로 세척하고 배양 한 후. </li><li> 제조업체의 지시에 따라, 진핵 세포의 핵의 시각화를 위해 5 ㎎ / ㎖에서 DAPI (4 &#39;, 6 Diamidino -2- 페닐 인돌)를 사용합니다. 씻고 FluorSave과 조직 섹션을 탑재합니다. </li><li> 낮고 높은 배율에서 모두 공 촛점 현미경 시스템을 사용하여 형광 이미지를 획득. 최적의 결과를 수득하는데 따라 개구를 조정한다. 여기서, 60X 1.42 개구 수 대물와 촛점 시스템을 사용하여 형광 이미지를 획득. </li></ol>정화조 마우스의 &quot;&gt; 4. 항생제 구조 <ol><li> 이전에 1 단계에 표시된대로 TIGR4 1.0 × 103 CFU 쥐에 감염 IP를 시작합니다. </li><li> 30 시간의 감염 후에서 시작하여, 36 시간 동안 100 ㎕의 생리 식염수에 12 시간마다 약제 학적 등급을 암피실린 IP 하였다 (80 mg / kg 체중)을 투여. 파라핀 삽입 및 조직 절편에 대한 단계 1.6에 설명 된대로 원하는 시점과 과정에서 마음을 수집합니다. </li></ol> 5. 콜라겐 증착 검출 <ol><li> 표준 방법 (17)를 사용하여 탈 이온수, deparaffinize 및 수화물 조직 섹션과 자일 렌 등급 알코올 세척을 사용. 5 분 동안 수성 0.2 % 인 몰리브덴 산으로 섹션을 처리하고, 5 분 동안 탈 이온수로 씻어냅니다. </li><li> 실온에서 2 시간 동안 피크르산 0.1 %와 시리우스 레드 염색 섹션. </li><li> 3 분 동안 0.01 N 염산 부분을 세척하고 1 분 동안 70 % 에탄올을 사용하여 씻어. </li><li> Dehydra동일한를 사용하여 섹션을 테하지만 5.1에 설명 된 것과 세척의 순서를 반대로, 자일 렌 증가에 심장 섹션을 탈수 한 후 에탄올의 농도를 등급. </li><li> 현미경 평가를위한 설치 솔루션 마운트 조직 섹션. </li><li> 콜라겐 침착의 영역을 식별하기 위해 광학 현미경을 사용하여 낮은과 높은 배율에서 깊이 읽기 염색 분야 스테인드 조직 섹션을 확인합니다. 빨간색 심장의 심실 내 모든 지역은 콜라겐이 증착 된 영역입니다. 이 붉은 얼룩없이 지역은 콜라겐 침착 부족 건강한 조직의 사이트입니다. 여기서, 0.5 20X 대물 개구를 구비 한 현미경을 사용 Picro 시리우스 레드 염색 이미지를 획득. 참고 : 건강한 조직에 빨간색 아트리움 얼룩. </li></ol>

<ol><li>Corrales-Medina, V. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+complications+in+patients+with+community-acquired+pneumonia%3A+incidence%2C+timing%2C+risk+factors%2C+and+association+with+short-term+mortality%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Cardiac complications in patients with community-acquired pneumonia: incidence, timing, risk factors, and association with short-term mortality.</a> Circulation. 125, 773-781 (2012).</li>
<li>Corrales-Medina, V. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+bacterial+pneumonia+is+associated+with+the+occurrence+of+acute+coronary+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Medicine+%28Baltimore%29%22%5BJournal%5D)">Acute bacterial pneumonia is associated with the occurrence of acute coronary syndromes.</a> Medicine (Baltimore). 88, 154-159 (2009).</li>
<li>Corrales-Medina, V. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+complications+in+patients+with+community-acquired+pneumonia%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis+of+observational+studies%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Med%22%5BJournal%5D)">Cardiac complications in patients with community-acquired pneumonia: a systematic review and meta-analysis of observational studies.</a> PLoS Med. 8, e1001048(2011).</li>
<li>Corrales-Medina, V. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Risk+stratification+for+cardiac+complications+in+patients+hospitalized+for+community-acquired+pneumonia.+Mayo+Clin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc%22%5BJournal%5D)">Risk stratification for cardiac complications in patients hospitalized for community-acquired pneumonia. Mayo Clin.</a> Proc. 89, 60-68 (2014).</li>
<li>Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+11+common+viral+and+bacterial+pathogens+causing+community-acquired+pneumonia+or+sepsis+in+asymptomatic+patients+by+using+a+multiplex+reverse+transcription-PCR+assay+with+manual+%28enzyme+hybridization%29+or+automated+%28electronic+microarray%29+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Detection of 11 common viral and bacterial pathogens causing community-acquired pneumonia or sepsis in asymptomatic patients by using a multiplex reverse transcription-PCR assay with manual (enzyme hybridization) or automated (electronic microarray) detection.</a> Journal Of Clinical Microbiology. 46, 3063-3072 (2008).</li>
<li>Musher, D. M., Rueda, A. M., Kaka, A. S., Mapara, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+association+between+pneumococcal+pneumonia+and+acute+cardiac+events%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">The association between pneumococcal pneumonia and acute cardiac events.</a> Clin Infect Dis. 45, 158-165 (2007).</li>
<li>Brown, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcus+pneumoniae+translocates+into+the+myocardium+and+forms+unique+microlesions+that+disrupt+cardiac+function%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Streptococcus pneumoniae translocates into the myocardium and forms unique microlesions that disrupt cardiac function.</a> PLoS Pathogens. In press, (2014).</li>
<li>Orihuela, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminin+receptor+initiates+bacterial+contact+with+the+blood+brain+barrier+in+experimental+meningitis+models%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Laminin receptor initiates bacterial contact with the blood brain barrier in experimental meningitis models.</a> The Journal of Clinical Investigation. 119, 1638-1646 (2009).</li>
<li>Flick, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+elimination+of+the+binding+motif+on+fibrinogen+for+the+S.+aureus+virulence+factor+ClfA+improves+host+survival+in+septicemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Genetic elimination of the binding motif on fibrinogen for the S. aureus virulence factor ClfA improves host survival in septicemia.</a> Blood. 121, 1783-1794 (2013).</li>
<li>Cheng, A. G., DeDent, A. C., Schneewind, O., Missiakas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+play+in+four+acts%3A+Staphylococcus+aureus+abscess+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A play in four acts: Staphylococcus aureus abscess formation.</a> Trends Microbiol. 19, 225-232 (2011).</li>
<li>Arenal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+the+spatial+characteristics+of+myocardial+scar+tissue+determine+the+risk+of+ventricular+arrhythmias%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Do the spatial characteristics of myocardial scar tissue determine the risk of ventricular arrhythmias.</a> Cardiovasc Res. 94, 324-332 (2012).</li>
<li>Deneke, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+histopathology+of+electroanatomic+mapping+after+cooled-tip+radiofrequency+ablation+to+treat+ventricular+tachycardia+in+remote+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cardiovasc+Electrophysiol%22%5BJournal%5D)">Human histopathology of electroanatomic mapping after cooled-tip radiofrequency ablation to treat ventricular tachycardia in remote myocardial infarction.</a> J Cardiovasc Electrophysiol. 16, 1246-1251 (2005).</li>
<li>Bakker, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reentry+as+a+cause+of+ventricular+tachycardia+in+patients+with+chronic+ischemic+heart+disease%3A+electrophysiologic+and+anatomic+correlation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Reentry as a cause of ventricular tachycardia in patients with chronic ischemic heart disease: electrophysiologic and anatomic correlation.</a> Circulation. 77, 589-606 (1988).</li>
<li>Verma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+successful+ablation+sites+and+the+scar+border+zone+defined+by+substrate+mapping+for+ventricular+tachycardia+post-myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cardiovasc+Electrophysiol%22%5BJournal%5D)">Relationship between successful ablation sites and the scar border zone defined by substrate mapping for ventricular tachycardia post-myocardial infarction.</a> J Cardiovasc Electrophysiol. 16, 465-471 (2005).</li>
<li>Wu, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+risk+for+ventricular+tachyarrhythmias+and+sudden+cardiac+death%3A+is+there+a+role+for+cardiac+MRI%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Cardiovasc+Imaging%22%5BJournal%5D)">Assessing risk for ventricular tachyarrhythmias and sudden cardiac death: is there a role for cardiac MRI.</a> Circ Cardiovasc Imaging. 5, 2-5 (2012).</li>
<li>Tettelin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+genome+sequence+of+a+virulent+isolate+of+Streptococcus+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Complete genome sequence of a virulent isolate of Streptococcus pneumoniae.</a> Science. 293, 498-506 (2001).</li>
<li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematoxylin+and+eosin+staining+of+tissue+and+cell+sections%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections.</a> CSH Protoc. 2008, (2008).</li>
</ol>

저자는 이 연구에서 이해 상충이 없음을 선언합니다.

이 보고서에서, 재현성이 높은 방법을 유도 S. 폐렴은 IPD 동안 생쥐의 심장 microlesions을 매개 성 및 시각화를위한 기술이 시연된다. 마우스는 인간 패혈증 동안 발생하고, 심근 궁극적으로 세균 전좌 리드 유사한 고급 균혈증, 선도, 클리어런스에 대한 면역 시스템의 임계치를 능가 박테리아의 투여로 감염된다. S., 아직 알 수없는 이유 마음에 폐렴는 호스트 면역 반응에 의해 물러나지 복제 할 수 있습니다. 이것은 지속적인 조사의 대상이며,이 책은 참여하기위한 노력에 다른 연구자을 용이하게 할 수있다. H &amp; E 염색 심장 microlesions과 깊은 보라색 얼룩 파란색 내의 박테리아 반면, 심근 얼룩 핑크 이​​후 빨간색으로 표준 광학 현미경을 사용하여 microlesion 시각화 수 있습니다. 이 대조적 쉽게 detecti 수 있습니다감염의 나중 단계에서 microlesions의에 병변이 ...

지역 사회 획득 폐렴 (CAP)에 대한 성인의 입원 사망률 1-4에 기여 심장 관련 부작용에 대한 문서화 된 위험을 운반합니다. 코랄 레스 - 메디나 등의 등의 최근 연구에서. 심장 합병증과 및 / 또는 책임 폐렴 관련 사망 3의 27 %에 대해 관련이있는 것으로 밝혀졌다. 폐렴 구균 (폐렴), CAP 패혈증 5의 가장 흔한 원인, 직접 인정 성인 환자 6 많은 19 % 정도에서 심장 관련 부작용과 관련이있다. 폐렴과 관련된 심장 관련 부작용은 주파수 (6)의 내림차순 신규 또는 악화 울혈 성 심부전, 부정맥, 심근 경색 등이 있습니다. 브라운 등의 등의 최근 PLoS의 병원체 글에서., S. 폐렴은 myocardiu에 심장 혈관 내피 세포, 항목을 통해 전위 할 수있는 것으로 밝혀졌다m, 및 침습성 폐렴 구균 질환 (IPD) 7시 심실의 박테리아로 가득 이산 비 화농성 미세한 병변 (microlesions)의 형성. 심장 microlesion 형성의 증거는 폐렴 구균 감염에 굴복 한 인간이 아닌 영장류와 사람에서 심장 샘플에서 관찰되었다. 마찬가지로, 실험적으로 감염된 마우스는 재현성 심장 microlesions을 개발했다. 마우스에서 microlesion의 크기와 수는 긍정적 기간 및 균혈증, 혈청 심장 트로포 닌 수준의 심각도 및 비정상적인 심장 전기 생리학과의 상관 관계를 보였다. 마음에 세균 전좌는 혈액 - 뇌 장벽 및 폐렴 구균 성 수막염의 개발, 라미닌 수용체 혈소판, 혈관 내피 세포, 즉 콜린 결합 단백질 매개 내습 걸쳐 폐렴 전좌에 대한 책임 동일한 메커니즘을 통해 발생하는 것으로 밝혀졌다 활성화시키는 인자 수용체 의존적 8. Microles이온 형성은 심근 7 죽일 발견 된 폐렴 구균 기공 형성 독소 뉴 몰리이 필요합니다. 폐렴 구균 심장 microlesions은 황색 포도상 구균을 포함한 다른 그람 양성 세균에 의해 발생하는 화농성 연부 조직 및 심장 농양에서 구별된다. 이들은 호중구와 섬유소 침착 9,10 의해 둘러싸여 박테리아 단일 초점을 특징으로한다. Microlesions S.에 의해 형성 폐렴은 영향을받는 심장에 분포 크기, 작은, 그리고 면역 세포 침윤이 부족하다. 감염의 초기 단계 동안, microlesions는 S. 의한 폐렴은 심근 병증의 병적 징후를 연상 손상되거나 염증 조직의 영역으로 나타납니다. 일부 단핵구 그러나 그들의 존재는 수명이 짧고 병변은 빠른 속도로 동시에 GR 계속하면서 모양이 괴사되고 박테리아로 가득,이 시간 동안 관찰 할 수있다동물이나 항균 개입의 죽음까지 크기 아야. 중요한 항생제 개입 3 일 이내에, 넘치 면역 세포 침윤은 전 병변 부위에서 관찰이 강력한 콜라겐 침착을 수반한다. 유사 심장 리모델링은 심장 기능 11-15에 영향을 지속과 함께 경색에 따라 발생하는 것으로보고되었습니다. 따라서, microlesions 질병 에피소드에서 살아남은 회복기 개인의 심장 관련 사망의 발생률이 증가 IPD 동안 가능성이 발생하는 심장 관련 부작용에 ​​대한 잠재적 인 설명이다. 여기서, 명령은 감염의 초기와 후기 단계에서 IPD 심장 병변 형성 및 심장 microlesions의 가시화 실험 마우스 모델에 제공된다. 항균 개입하여 저장 한 동물에서 콜라겐 침착의 검출을위한 프로토콜이 설명된다. 이 문서의 목적은 F이다이 중요하고 새로운 폐렴 구균 병리에 다른 연구자의 연구를 acilitate.

<table><tbody><tr><td>Todd-Hewitt 육수&nbsp;</td><td>네오젠</td><td>7161A</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T 컴파운드&nbsp;</td><td>티슈텍(사쿠라 파인텍)&nbsp;</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>트리톤 X-100&nbsp;</td><td>Fisher Scientific (Acros)</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>일반 염소 세럼</td><td>Abcam</td><td>ab7481</td><td></td></tr><tr><td>항혈청형 4 폐렴구균 항혈청&nbsp;</td><td>Statens Serum Institut</td><td>16747</td><td></td></tr><tr><td>염소 항-토끼 FITC 결합 항체&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-096-144</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Fluorsave</td><td>Millipore</td><td>345789</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher Scientific</td><td>S70104</td><td></td></tr><tr><td>암피실린</td><td>시그마</td><td>A9393</td><td></td></tr><tr><td>포스포몰리브딕 산 0.2%&nbsp;</td><td>전자 현미경 과학</td><td>26357-01</td><td></td></tr><tr><td>0.1% 시리우스 레드 in picric acid&nbsp;</td><td>전자 현미경 과학</td><td>26357-02</td><td></td></tr><tr><td>0.01 N 염산&nbsp;</td><td>전자 현미경 과학</td><td>26357-03</td><td></td></tr><tr><td>조직 태그 현미경 슬라이드</td><td>Polysciences, Inc</td><td>24216</td><td></td></tr><tr><td>Paralube Vet 연고</td><td>Dechra</td><td>12920060</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin 및 Eosin 염색 키트</td><td>미지정&nbsp;</td><td></td><td>표준</td></tr></tbody></table>

시각화<em&gt; 폐렴 구균</em&gt; 심장 microlesions 및 후속 심장 리모델링 내

Visualization of Streptococcus pneumoniae within Cardiac Microlesions and Subsequent Cardiac Remodeling

균혈증 동안 폐렴 구균은 심근에 혈관 내피 세포에서 이동시키다 및 이산 박테리아 채워진 미세한 병변으로 인해 면역 세포 침투의 부재로 주목받는 (microlesions)를 형성 할 수있다. 때문에 심독성 제품의 석방, S.에 microlesions 내 폐렴이 자주 성인의 뇌 산염 침습성 폐렴 구균 질환 동안 관찰되는 심부전에 기여하는 것으로 생각된다. 여기에서 30 시간 내에 심장 microlesion 형성을 재현하기 위해 리드 실험 마우스 감염에 대한 프로토콜을 설명된다. 명령이 헤 마톡 실린 및 스테인드 마음 섹션과 초기와 후기 microlesions의 형태 학적 차이를 에오신에 microlesion 식별에 제공된다 강조 표시됩니다. 명령은 S. 검증을위한 프로토콜에 제공되고 폐렴 구균 캡슐 다당류에 대한 항체를 사용하여 microlesions 내 폐렴면역 형광 현미경. 마지막으로, 감염된 마우스 및 검색 및 회복기 마우스의 마음의 흉터 형성의 평가를 구출 항생제 개입을위한 프로토콜을 제공한다. 함께, 이러한 프로토콜은 S. 노출의 결과로서 심근 침윤 폐렴, 심근 사망, 심근 개형 기본 분자 메커니즘의 연구를 촉진 할 것이다 폐렴과 심장의 폐렴 구균에 대한 면역 반응.

H &amp; E에 의해 Microlesions의 시각화 심장 microlesions 그림 1. TIGR4와 해당 IP의 반칙으로 IPD와 마우스의 심장 부분을 염색 H &amp; E의 심실에서 관찰 헤 마톡 실린의 더 많은 수의 24 및 30 시간 게시물 감염 (HPI) 사이의 이러한 병변의 크기의 증가를 보여줍니다했다 병변 내에서 볼 수 -stained (즉, 보라색 블루) 폐렴 구균. Microlesions는 액포 같은 형태, 밀도 에오신 (적색) 병변 사이트에 바로 인접 심근 세포에서의 염색, 병변 내 diplococci, 면역 세포의 부재에 의해 일반적으로 특징 지어. 약 절반 병변은 볼 혈관에 인접했다. HPI (24) 사이에 30 microlesions 더 많은 실질적으로 큰되었다. 30 HPI에서 세포 외 박테리아는 종종 세포 사이의 병변에서 스트리밍 볼 수있다. <p class="jove_c...

연쇄상구균 폐렴은 심장에 별개의 비화농성 현미경 병변을 형성합니다. 요약된 것은 심장 미세 병변 형성의 쥐 모델에 대한 프로토콜입니다. 현미경을 사용한 미세 병변 시각화, 초기 미세 병변과 후기 미세 병변 구별, 회복기 동물의 심장에서 심장 리모델링을 감지하는 방법에 대한 지침이 제공됩니다.

시각화<em&gt; 폐렴 구균</em&gt; 심장 Microlesions 및 후속 심장 리모델링 내

During bacteremia Streptococcus pneumoniae can translocate across the vascular endothelium into the myocardium and form discrete bacteria-filled ...

다음 실험의 전반적인 목표는 감염된 생쥐의 심장 내에서 ESMO 심장 미세 병변 형성을 위한 재현 가능한 프로토콜을 입증하는 것입니다. 이는 생쥐에 ESMO를 감염시키고 균혈증이 발생하도록 유도하여, 박테리아가 심장 혈관에 도달해 심근을 침범하고 미세 병변을 형성하게 함으로써 달성됩니다. 그 후 심장은 파라핀에 매립하여 일반적인 방식으로 염색하거나, 면역형광 염색을 위해 OCT 화합물로 고정합니다.염색된 절편을 평가하면 심근 전반에 무작위로 분포된 심장 미세 병변, 콜라겐 침착 및 회복 중인 심장 절편과 심장 미세 병변 내의 폐렴구균 캡슐을 확인할 수 있으며, 이는 해당 절차를 입증합니다. Armand Brown은 본 연구실의 대학원생입니다. 이 방법은 마우스의 침습성 폐렴구균 질환 동안 S. pneumoniae가 심장에 미치는 손상 효과에 대한 통찰을 제공할 수 있습니다.이는 비인간 영장류나 인간과 같은 다른 계통의 심장 샘플에도 적용할 수 있습니다. 먼저 Todd Hewitt 배지에서 ESMO Serotype four strain Tiger four를 620nm에서 광학 밀도 0.5가 될 때까지 배양하십시오. 적정 밀도에 도달하면 배양액을 3,500 G에서 10분 동안 원심분리하여 펠렛을 형성합니다.그 후 진공 라인을 사용하여 상층액을 제거하고, 멸균 PBS를 사용하여 박테리아를 mL당 10,000 colony forming units 농도로 재부유시킵니다. 이제 10~12주령의 valve C 마우스를 마취시키고, 무딘 핀셋으로 발가락을 살짝 집어 마취 상태를 확인합니다. 박테리아 현탁액을 시린지에 넣고 27~30게이지 바늘을 장착합니다. 그런 다음 한 손으로 마취된 마우스의 목덜미를 잡고, 다른 손으로 현탁액 100 µL를 복강 내 주사한 후 각 마우스를 케이지에 다시 넣습니다.마우스는 보통 주사 후 30~40초 후에 깨어납니다. S pneumonia의 투여량을 정확하게 맞추는 것이 매우 중요한데, 그렇지 않으면 마우스가 감염으로부터 회복되거나 병변이 발달하기 전에 폐렴구균 침습성 질환으로 너무 빨리 진행될 수 있기 때문입니다. 각 세균 균주마다 독성 수준이 다르므로, 적절한 투여량을 결정하기 위해 시행 착오 과정이 필요할 수 있습니다.감염이 초기 단계에 이를 때까지 최소 24시간 동안, 또는 진행된 단계의 감염을 위해 30시간 동안 진행하도록 둡니다. 이후 감염된 각 마우스를 안락사시킵니다. 먼저 혈액 샘플을 채취하기 위해 알코올 솜으로 꼬리를 소독하고 2~3mm 섹션을 잘라냅니다.절단 부위에서 2 µL의 혈액을 채취합니다. 1 U/mL의 sodium heparin이 포함된 PBS로 혈액을 10배씩 단계 희석합니다. 희석액의 5단계 농도를 triptych soy blood agar 플레이트에 도말하고 하룻밤 동안 배양합니다.다음 날 콜로니 수를 측정합니다. 다음 섹션에 설명된 대로 심장을 수확하십시오. 또는 감염 후 30시간 후에 진행하십시오.100 µL의 식염수에 희석한 ampicillin을 복강 내 투여하여 마우스의 회복을 시도하십시오. 36시간 동안 12시간 간격으로 ampicillin 투여를 지속하고, 지정된 시점에 심장을 수집하십시오. 먼저, 심장을 적출하십시오.안락사시킨 마우스를 수술대 위에 등이 닿게 눕혀 고정하고, 가슴 부위를 70% ethanol로 분사한 후 가볍게 닦아 말립니다. 수술용 가위와 포셉을 사용하여 흉강을 엽니다. 늑골을 제거하고 횡격막을 절개하여 심장과 폐를 노출시킵니다.그 후 심장과 연결된 혈관을 자르고, 포셉을 사용하여 심장에 멍이 들지 않도록 조심스럽게 적출합니다. 심장을 PBS로 헹군 후 관상면 절편 제작을 위해 조직 표본 수집 카세트에 넣습니다. 그런 다음 카세트를 10% 완충 포르말린 용액으로 옮기고, 다음 날 파라핀 임베딩을 진행합니다.초기 단계에서 심장 병변은 색상 변화와 일부 사례에서는 면역 세포의 존재로 식별할 수 있습니다. 진행된 병변의 경우, 면역 세포는 사라지고 크기가 커집니다. 그 자리에는 VA와 유사한 병변이 발견됩니다.양전하 처리된 유리 슬라이드에 준비된 5 µm 두께의 심장 절편을 사용하며, 먼저 절편을 냉동시킨 후 해동하여 공기 중에 건조시킵니다. 25 °C에서 10% 중성 완충 포르말린으로 10분 동안 슬라이드를 고정합니다. 그 다음 PBS로 5분씩 3회 세척하여 고정액을 제거합니다.PBS 내 0.2% Triton X-100으로 15분 동안 조직을 투과화합니다. PBS로 세 번 더 세척하여 세제를 제거합니다. 그다음 PBS로 헹군 후, PBS 내 10% coat serum으로 1시간 동안 조직을 블로킹하고, 37°C에서 2시간 동안 항혈청으로 절편을 처리합니다.음성 대조군은 naive rabbit antiserum으로 처리합니다. 심장 조직은 XI 면역형광 염색제를 쉽게 흡수하여 배경 신호가 높게 나타나므로, 항체 종류에 따라 배양 시간과 농도를 최적화해야 할 가능성이 큽니다. 2시간 후, PBS로 antiserum을 세척합니다. 그 다음 용액을 2차 항체로 교체하고 슬라이드를 37 °C에서 30분 동안 배양합니다. 이제 5 mg/mL 농도의 DPI를 처리하고 슬라이드를 PBS로 세척합니다.마지막으로, 슬라이드를 마운팅하고 저장한 후 공초점 현미경으로 촬영합니다. 먼저 파라핀을 제거하고 조직 절편을 수화시킵니다. 자일렌으로 세척한 후 단계별 알코올 세척 과정을 거칩니다.그런 다음 절편을 0.2% 인산 용액에 5분 동안 담근 후, 5분 동안 물로 헹굽니다. 이어서 0.1% Sirius Red 및 Picric acid로 2시간 동안 염색합니다. 그 후 절편을 0.01 N 염산에 3분 동안 세척하고 70% ethanol로 1분 동안 헹굽니다. 이제 농도별 알코올 세척 단계를 역순으로 거쳐 절편을 탈수시킨 후, xylene으로 세척하고 광학 현미경으로 슬라이드를 마운트하여 평가합니다.Tiger 4 균주를 통한 공격 접종 후 마우스에서 침습성 폐렴구균성 질환이 발생하였습니다. 심실에서 4형 균주에 의한 심장 미세 병변이 관찰되었으며, 감염 후 24시간에서 30시간 사이에 병변의 크기와 수가 증가하는 것이 확인되었습니다. S. pneumoniae가 실제로 병변 내에 존재하는지 확인하기 위해, Tiger 4가 생성하는 혈청형 4 캡슐 다당류에 대해 절편 염색을 수행하였습니다.이를 통해 미세 병변 부위 내에 조밀하고 밀도가 높은 응집체가 존재함이 확인되었습니다. Ampicillin으로 구조된 쥐와 감염되지 않은 대조군의 심장 절편에 대해 Piro serious red 염색을 수행하였습니다. 구조군에서는.뇌실 내의 이전 병변 부위로 보이는 곳에서 밴드가 흘러나오는 양상을 보이며 염색의 존재감과 강도가 급격히 증가했습니다. 이 절차를 수행할 때, 균혈증과 심장 미세 병변이 형성될 충분한 시간이 확보될 수 있도록 S pneumonia를 충분한 양으로 감염시켜 감염 상태가 최소 28~30시간 동안 지속되게 하는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오.

visualization-streptococcus-pneumoniae-within-cardiac-microlesions

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

출처: Brown, A. O. 외 심장 미세병변 내 폐렴 구균의 시각화 및 이후 심장 재형성. J. Vis. 경험 (2015).이 영상은 마우스 심장 조직에서 세균 미세 병변을 현미경으로 시각화하는 과정을 보여줍니다. 폐렴구 균에 감염된 쥐의 심장은 채취, 세척, 고정 후 코로나 절제를 위해 가공됩니다. 이 절편들은 헤마톡실린과 에오신으로 염색한 후 현미경으로 검사하여 미세 병변 내에 서식하는 박테리아를 관찰합니다.

마우스 심장 조직 내 세균 미세병변의 현미경 시각화

출처: Brown, A. O., Orihuela, C. J. 심장 미세병변 및 이후 심장 재형성 내 폐렴연쇄상구균의 시각화. J. Vis. 경험 (2015)이 영상은 감염으로 인한 미세병변 내에 국한된 병원성 박테리아를 화학적으로 고정한 마우스 심장 조직 절편의 면역 염색을 시연합니다. 이 과정에는 조직 세척, 막 투과, 비특이적 부위 차단, 항체 표지, 핵 염색, 공초점 현미경을 통해 박테리아 군집을 검출하고 위치시키는 작업이 포함됩니다.

마우스 심장 조직 절편에서 박테리아가 채워진 미세병변의 면역염색 검사

이 연구는 자가면역 심근염에 걸린 쥐의 심장 이상을 평가하기 위한 비침습적 도구로서 자기 공명 현미경 이미징의 성공적인 확립을 보여줍니다.  이 데이터는 이 기술이 살아있는 동물의 질병 진행을 모니터링하는 데 사용될 수 있음을 나타냅니다.

마우스에있는 자기 공명 현미경 영상으로 실험자가 면역 심근염에있는 심장의 이상 유무 비 침습적 평가

여기에 표시된 것은 탈세포화된 심장 조직에서 세포외 기질 미세 구조를 시각화하는 방법입니다.

침연 (macerated) 조직의 전자 현미경을 스캔하면 세포 외 매트릭스를 시각화하기

신뢰할 수 있고 정확한 결과 평가는 임상 적 치료에 대한 임상 치료의 번역을위한 열쇠입니다. 현재의 논문은 돼지 급성 심근 경색 모델에서 심장 성능과 손상의 세 가지 임상 적으로 일차 결과 변수를 평가하는 방법에 대해 설명합니다.

급성 심근 경색의 돼지 모델의 주요 결과 평가

여기, 우리는 CD11c.DTR 마우스의 기관 내 디프테리아 독소 치료에 의해 유도되는 무균 성 심근염의 쥐 모델에서 심장 CD45 + 백혈구 침윤을 시각화하기위한 가벼운 시트 현미경 접근법을 설명한다.

Light Sheet Microscopy에 의한 심근 성 심근염의 Murine 모델에서의 백혈구 침윤의 정량적 시각화

여기 우리 현재 인간 iPS 세포 cardiomyocytes 기니 돼지 모델에서에서 파생 된 심장 근육 패치 이식 뒤 왼쪽된 심 실 cryoinjury의 유도 대 한 프로토콜.

기니 돼지 모델에서 심근 손상 후 심장 근육 패치 hiPSC 파생의 이식

이 프로토콜은 심낭과 그 내용물을 보존하면서 마우스에서 심근 경색을 유도하는 단계를 설명합니다.

온전한 심낭 허혈성 설치류 모델

여기에서, 우리는 콜라겐 선택적 조영 증진과 함께 건강하고 병리학적인 큰 포유동물 전심의 고해상도 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 이미지를 얻기 위한 프로토콜을 제시한다.

만성 질환을 앓고 있는 대형 포유류 심장 모델의 콘트라스트 강화 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 이미징을 위한 조직 준비 기술

재관류 급성 심근경색증(repAMI)에서 심장 손상의 3차원(3D) 재구성은 관련 질병에 영향을 미치는 패턴의 충실한 정량화 및 공동 국소화를 가능하게 합니다. 여기에서는 심장 손상, 위험 영역 및 면역 세포 반응의 동시 측정을 위해 자동화 가능한 라이트 시트 유도 이미징 접근 방식이 제공됩니다.

라이트 시트 형광 현미경을 이용한 재관류 급성 심근경색증의 심장 손상 및 면역 반응의 동시 3D 분석

배우세요 폐렴 구균 감염 마우스 심장 미세 병변 형성 및 심장 재형성 평가 프로토콜. 면역형광 및 조직학 염색법을 활용하여 심근 손상 기전과 회복 과정을 연구하는 방법을 익히세요.

시각화

더 많은 동영상 탐색