침연 (macerated) 조직의 전자 현미경을 스캔하면 세포 외 매트릭스를 시각화하기

이 방법의 전반적인 목표는 세포 또는 기타 비매트릭스 물질이 없는 상태에서 심장 매트릭스의 구조를 시각화하는 것입니다. 이 방법은 섬유증 분야의 주요 질문, 특히 매트릭스 내용의 차이가 매트릭스 조직에 어떤 영향을 미칠 수 있는지, 그리고 이러한 변화가 다른 심근병증 또는 기타 섬유성 질환에 어떤 영향을 미칠 수 있는지에 대한 답을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 정량적 측정을 보강하는 데 사용할 수 있는 매트릭스의 정성적 보기를 제공한다는 것입니다.

Galindo 박사와 Sawyer박사는 경색 후 돼지를 정기적으로 치료할 경우 치료 후 기질 함량의 변화와 유사한 유전자 발현의 변화가 있다는 것을 발견한 후 이 기술을 사용해야겠다는 아이디어를 처음 떠올렸습니다. 이 방법을 처음 사용하는 개인은 소근육 운동 기술이 필요하기 때문에 이전 SEM 샘플 준비 경험이 없는 경우 어려움을 겪을 수 있습니다. 조직 샘플은 쉽게 볼 수 있을 만큼 커야 하며 섭씨 4도에서 4% 글루타르알데히드 용액에 보관해야 합니다.

냉장 보관에서 티슈를 꺼내 증류수로 헹굽니다. 그런 다음 물 속의 펠릿으로 갓 만든 10% 수산화나트륨 용액에 조직을 담그십시오. 적절한 예방 조치를 취하십시오.

조직을 수산화나트륨 용액에 실온에서 6-10일 동안 보관하십시오. 조직의 색이 회백색 또는 흰색이 될 때 진행합니다. 그런 다음 티슈가 투명해질 때까지 증류수로 헹굽니다.

다음으로, 장갑을 끼고 조직을 1% 탄닌산에 실온에서 4시간 동안 담급니다. 탄닌산 목욕 후 증류수로 조직을 밤새 헹굽니다. 준비 과정에서 장갑을 낀 흄 후드에서 카코딜산 나트륨 완충액의 0.2몰 스톡 용액과 사산화오스뮴의 2% 수용액을 만듭니다.

사산화오스뮴은 심각한 흡입 위험이 있으므로 스플래시 가드를 사용하십시오. 이제 카코딜산 나트륨 완충액을 0.1몰 희석하고 부드러운 교반으로 5분 동안 그 안의 조직을 배양합니다. 완충액을 두 번 변경하여 조직을 카코딜산 나트륨으로 총 3회 세척합니다.

다음으로, 스톡 sodium cacodylate와 스톡 오스뮴 테트록사이드의 일대일 혼합물을 만듭니다. 한 시간 동안 회전기에서 새로운 혼합물의 조직을 배양합니다. 나중에 조직을 0.1몰 카코딜산나트륨으로 되돌리고 5분 동안 부드럽게 교반하면서 배양합니다.

이 목욕 용액을 15분에 걸쳐 두 번 교체하십시오. 그런 다음 농도가 증가하는 일련의 에탄올 욕조를 사용하여 조직을 탈수합니다. 티슈를 각 욕조에서 부드럽게 저어주면서 15분 동안 담가둡니다.

다음으로, 조직과 용액을 100% 에탄올로 채워진 얕은 페트리 접시에 옮깁니다. 다음으로, 두 개의 매우 날카로운 면도날을 조심스럽게 잡고 측면의 평평한 부분이 서로 접촉하고 절단 모서리가 교차하여 표본 위에 정삼각형의 두 변을 형성합니다. 이제 주로 사용하는 손을 사용하여 두 번째 블레이드를 샘플의 맨 왼쪽에 놓고 오른쪽으로 자릅니다.

따라서 반대 방향에서 블레이드를 서로 반대 방향으로 밀어 뒤틀림이나 찢어지는 힘을 최소화하면서 한 번의 부드러운 절단을 만듭니다. 목표는 시편을 손상시키지 않고 가능한 한 큰 표면적을 노출시키는 것입니다. SEM에서 검사할 수 있을 만큼 만족스러운 단면이 준비될 때까지 이 과정을 반복합니다.

주걱이나 핀셋을 사용하여 조직을 100% 에탄올에 담근 상태로 유지하면서 조직을 CPD의 샘플 홀더로 옮깁니다. 조직은 몇 초 이상 공기에 노출될 수 없습니다. CPD를 사용하여 에탄올을 액체 이산화탄소로 교체하고 제조업체에서 지정한 대로 건조 주기를 수행합니다.

그런 다음 각 표본에 대한 SEM 샘플 스터브를 준비합니다. 알루미늄 스텁의 상단 표면에 탄소 접착 탭을 부착합니다. 입체경 아래에서 관심 단면이 위를 향하고 탭에서 멀어지며 스터브 표면과 최대한 평면을 향하도록 시편을 접착 탭에 조심스럽게 부착합니다.

관심 표면을 조사하거나 만지지 마십시오. 가장 작고 가장 어려운 표본의 경우 주걱으로 사용하기 위해 나무 어플리케이터 스틱을 부러뜨립니다. 또한 떨어뜨린 표본을 잃지 않도록 큰 여과지 위에서 작업하십시오.

접착력을 높이려면 부러진 애플리케이터 스틱을 사용하여 테이퍼 브러시를 만들고 시편의 바닥과 측면에 은색 또는 탄소 페인트를 바르십시오. 매우 얇은 페인트 선을 관심 표면의 가장자리까지 연장합니다. 이것은 관심 표면에서 지면까지 충전 경로를 만듭니다.

그런 다음 탄소 탭 둘레에 두세 개의 작은 페인트 덩어리를 바르면 탭 표면에서 금속 스텁까지의 전도성 경로를 제공합니다. 이것은 땅으로 기능합니다. 표본을 따로 보관하고 전도성 페인트를 2시간 동안 건조시킵니다.

건조되면 스퍼터 코팅기를 작동하여 금, 팔라듐 합금 또는 금을 표본에 비교적 두꺼운 코팅으로 도포합니다. 30-40 나노미터 두께의 코팅이 바람직합니다. 상대적으로 낮은 가속 전압에서 주사 전자 현미경을 수행하여 샘플의 낮은 전하 소산과 관련된 문제를 최소화합니다.

사용 가능한 경우 가변 압력 모드를 사용하십시오. 먼저, Z 차원의 파이버에 초점을 맞출 수 있는 충분한 피사계 심도를 제공하기 위해 작동 거리를 개선합니다. 이렇게 하려면 오른쪽 상단의 탐색 탭을 엽니다.

그런 다음 스테이지 메뉴에서 좌표 탭에 액세스합니다. 여기에 Z 좌표에 대해 더 큰 값(예: 20mm)을 입력합니다. 마지막으로 Go To 탭을 눌러 변경 사항을 실행합니다.

다음으로, 관심 표면을 전자빔에 직각으로 배치합니다. 마우스 오른쪽 버튼을 클릭한 상태로 왼쪽이나 오른쪽으로 밀어 준비된 관심 표면면의 주변 근처에 표본의 초점을 맞춥니다. 집중된 working distance를 기록해 두십시오.

그런 다음 수동 사용자 인터페이스 조이스틱을 사용하여 보기를 반대쪽 가장자리로 이동하고 초점 방법을 반복합니다. 작동 거리가 변경된 경우 시편을 기울여 두 위치에서 대략적인 일치를 얻습니다. 스테이지 메뉴의 좌표 탭을 사용하여 T 좌표에 틸트 값을 입력합니다.

이제 이 값을 R 좌표 필드에 입력하여 시편을 90도 회전합니다. 그런 다음 모든 위치가 거의 동일한 working distance에 초점이 맞춰질 때까지 틸팅 프로세스를 반복합니다. 설명된 기술은 사용되지 않은 인간 심장 이식 기증자의 심장 조직에 적용되었습니다.

인간 심장 기질은 단면에 벌집 모양의 패턴을 가진 가교 단백질의 복잡한 짜임새입니다. 각 벌집 구조는 너비가 약 40미크론이며 일반적으로 단일 근세포를 우회합니다. 삽입된 디스크로 연결되면 여러 개의 심장 근세포가 터널과 같은 모양을 통해 세로로 달리는 막대로 상상할 수 있습니다.

구조적 정보를 제공하는 것 외에도 탈세포화된 조직의 SEM은 돼지의 경색된 심장 조직과 같은 손상 또는 무해한 형태의 심근병증에 대응하여 의미 있는 정성적 평가를 가능하게 할 수 있습니다. 별도의 연구에서는 NRG-1 베타의 GGF2 동형이 심부전의 잠재적인 치료제인 것으로 나타났습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 관심 표면을 노출시키고 표본을 장착하는 기술을 포함하여 주사 전자 현미경의 조직, 심장 조직을 처리하는 방법에 대해 잘 알게 될 것입니다.

이 절차에 따라 질량 분석기, RNA 염기서열분석 및 기타 다양한 분석과 같은 다른 기술을 사용하여 세포외 기질 단백질 및 신호 전달 및 기타 조직적 관찰 현상을 담당하는 기타 단백질을 측정할 수 있습니다. 또한 사산화오스뮴은 점막의 증기 고정 가능성으로 인해 위험한 화학 물질이라는 것을 잊지 마십시오. 스플래시 가드 또는 후드 띠를 사용하여 니트릴 장갑과 함께 흄 후드에서 작업하는 것을 항상 기억하십시오.