Name: 침연 (macerated) 조직의 전자 현미경을 스캔하면 세포 외 매트릭스를 시각화하기 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: 배우세요 심장 조직의 탈세포화 및 주사전자현미경 기법을 이용한 세포외기질 시각화 방법을. 이 기술은 섬유증 연구와 심근병증 이해에 정성적 통찰을 제공하여 향후 치료 연구에 활용될 수 있습니다.

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이 연구는 미국 국립보건원(NIH), 심장, 폐 및 혈액 연구소(NIHLB)의 보조금으로 지원되었습니다: K01-HL-121045, K08-HL-094703, 5T32HL007411-35, P20 HL101425, U01 HL100398. 
이미징 및 조직 처리(NaOH 침용 후)는 Vanderbilt University Medical Center(VUMC) Cell Imaging Shared Resource(CISR)(NIH 보조금 CA68485, DK20593, DK58404, DK59637 및 EY08126에서 지원)를 사용하여 수행되었습니다. 특히 VUMC CISR의 핵심 책임자인 Sam Wells 박사와 W. Gray (Jay) Jerome 박사에게 귀중한 기술적 조언을 해주시고, 본 논문에서 소개한 기법을 촬영할 수 있도록 핵심 공간과 자원을 제공해 주신 것에 대해 감사드립니다. 
밴더빌트 대학의 중개 및 임상 연구를 위한 심장학 핵심 연구실의 Yan Ru Su 박사와 Kelsey Tomasek 박사에게 기술적 전문 지식을 제공하고 이 연구에 사용된 인체 조직 샘플을 수집해 주신 데 대해 깊은 감사 를 표하고 싶습니다.

윤리 문 : 동물 처리를위한 프로토콜 밴더빌트 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC에 의해 승인 된, AAALAC-국제 표준에 따라 수 M / 1백17분의 10 (돼지) 및 M / 219분의 10 (마우스) 및 실시를 프로토콜. 뱅크 인간의 심장 조직의 사용법은 밴더빌트 대학 의료 센터 IRB (프로토콜 번호 100887)에 의해 승인되었다. 1. 시료 채취 및 보관 <ol><li> 0.1 M 인산 완충액 (PB) 용액에 신선한 4 % 글루 타르 알데히드를 확인합니다. 주의 : 글루 타르 알데히드는 독성 흄 후드에서 작업용 장갑을 착용하십시오. <ol><li> 1,000 ml의 DH 2 O 21.8 g이 나 HPO 4, 6.4 g의의 NaH 2 PO 4. 양자 satis (품질 평가 점수)를 사용하여 PB, 산도 7.4의 0.2 M 원액을 </li><li> PB 원액 2.5 mL 및 2.1 ml의 DH 2 O.에 50 % 글루 타르 알데히드 400 μl를 추가 </li></ol></li><li> 덩어리를 담가 (더 큰 이상이 C 없다4 %의 글루 타르 알데히드 용액에 조직의 평방 미터). 주 : 작은 조각들도 사용될 수 있지만 쉽게 프로토콜 이후의 단계를 용이하게하기 위해 눈에 의해 가시화 될 수있는 충분한 크기 (NO 미만 5mm 2)이어야한다. </li><li> 4 ℃에서 무한히 저장 후, 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션. </li></ol> 심장 조직의 2. 탈세 포화 <ol><li> 10g의 수산화 나트륨 펠렛 / 100 ㎖ DH 2 O.을 사용 신선한 10 % NaOH 수용액을 주의 : 수산화 나트륨 용액은 부식성 및 알칼리 화상을 입을 수, 장갑을 착용하십시오. </li><li> DH 2 O.에서 조직을 씻어 </li><li> 6 실온에서 10 % NaOH 용액에 품어 - 십일 (까지에 붉은 갈색의 조직 변경 오프 흰색 또는 흰색). </li><li> 조직이 투명하게 될 때까지 DH 2 O에 씻어. </li><li> 실온에서 4 시간 동안 1 % 탄닌산의 조직을 담근다. 4 ML의 DH 2 O. 당 1 ml의 5 % 원액을 사용하여 주의 : 타닌산강한 자극은, 장갑을 착용하십시오. </li><li> 밤새 DH 2 O에 씻어. </li></ol> 3. Osmication과 (안전을위한 연기 후드에서) 심장 조직의 탈수 <ol><li> 21.4 g 나트륨 cacodylate, 10.0 g의 염화 칼슘 및 450 ml의 2 O. DH를 사용 cacodylate 나트륨 완충액, 0.2 M 스톡 용액을 제조 7.4의 pH를 조정하기 위해 필요에 따라 혼합 한 후 염산. Qs를 500 ml의 DH (2)와 O. 주의 : 나트륨 cacodylate 염산은 독성 흄 후드에서 작업용 장갑을 착용하십시오. </li><li> 50 ㎖ DH 2 O. 1g의 산화 오스뮴 결정을 용해시켜 안전 흄 후드에서 산화 오스뮴의 2 % 수용액 스톡 용액을 제조 주의 : 오스뮴 화이이 심한 흡입의 위험이 있습니다; 점막이나 안구의 증기 고정이 가능, 따라서 만 장갑과 흄 후드에서 처리합니다. 스플래시 가드를 권장합니다. </li><li> DH와 1 : 원액 1을 혼합 (0.1 M 나트륨 cacodylate 버퍼에 조직을 씻어 <suB&gt; 2 O) 5 회에 분 (또는 부드러운 교반 용). </li><li> 세 개의 버퍼 린스 총 두 번 이전 단계를 반복합니다. </li><li> 회에 1 시간 동안 0.1 M 나트륨 cacodylate 버퍼 (1 재고 나트륨 cacodylate 및 주식 산화 오스뮴 (1) 혼합)에 1 % 산화 오스뮴의 조직을 담가. </li><li> 5 분, 회 전자의 각 0.1 M 나트륨 cacodylate 완충액을 3 회 조직을 씻어. </li><li> 회에 15 분간 각각의 에탄올 농도를 증가 (30 %, 50 %, 75 %, 85 %, 95 %, 마지막으로 100 %)를 사용하여 조직을 헹군다. </li></ol> SEM 4. 단면 표면 준비 <ol><li> 또한, 100 %의 에탄올을 함유하는 얕은 페트리 접시에 100 % 에탄올에 조직을 옮긴다. </li><li> 양쪽의 플랫 시험편 위에 정삼각형의 양쪽을 형성하기 위해 서로 절단 날 크로스와 접촉되도록 두 개의 매우 날카로운 면도날을 잡아. 이를 달성하기 위해, 샘플의 오른쪽 측면에 하나의 블레이드를 배치 왼손 사용컷 좌측. 동시에, 지금까지 샘플 조각 우측의 좌측의 2 블레이드를 배치 오른손을 사용한다. 따라서, 상기 블레이드는 단일 부드러운 컷을 반대 방향에서 서로에 대해 활주한다. </li><li> 시험편을 손상시키지 않고 바람직하게는 가능한 한 큰 면적을 노광, 왜곡을 최소화 또는 강제 찢어와 시험편의 매우 깨끗한 컷을 만들기 위해 서로 플랫 블레이드 양측 활주. </li><li> 주사 전자 현미경의 검사를 위해 가장 깨끗한 가능한 단면 표면을 노출 각 시료에 대해 반복합니다. </li></ol> 5. 임​​계점 건조 (CPD) 심장 조직의 <ol><li> 조직이 항상 100 % 에탄올에 남아 있도록, 임계점 건조기 (CPD)의 샘플 홀더에 조직을 전송 주걱이나 핀셋을 사용한다. 홀더는 에탄올 및 전송이 몇 초 이상 더 이상 공기에 노출 된 조직으로 달성되도록 침지되어 있는지 확인합니다. </li><li> 우리 당 CPD를 작동ER 서 액체 이산화탄소와 에탄올을 대체 사이클 충전 및 퍼지-3을 작성한다. </li><li> 샘플의 임계점 건조를 달성하고 CO 2의 제어 배기와 대기압에 반환하기 위해 사용 설명서에 따라 CPD를 운영하고 있습니다. </li></ol> SEM에 대한 심장 조직 표본 6. 장착 <ol><li> 알루미늄 스터브의 상면에 탄소 접착제 탭을 접착하여, 각 시험편에 대한 SEM 샘플 스텁을 준비한다. </li><li> 실체 현미경의 도움으로 조심 (멀리 보이는 탭)에서 위를 향 관심 단면 표면과 접착 탭 시험편을 부착 한 최대한 가까운 샘플 스텁 표면의 평면과 평행하도록. 조사 또는 관심의 표면을 만지지 마십시오. </li><li> 페인트 응용 프로그램에 대한 이상적인 테이퍼 브러쉬를 달성하기 위해 나무 주걱 스틱을 휴식. 스터브에 부착을 향상시키기 위해, 기지국 및 시험편의 측면에은이나 카본 페인트를 적용한다. </li><li> 접지 관심 표면으로부터 충전 경로를 제공하기 위해, 관심의 표면의 가장자리까지 칠은 또는 탄소의 매우 얇은 라인을 확장한다. </li><li> 접지에 따라서 금속 스터브 탄소 탭 표면으로부터 도전로를 제공하는 탄소 탭 둘레은이나 카본 페인트 2-3 작은 덧 입힐 적용 후. </li><li> 전도성 페인트가 두 시간 동안 건조하도록 허용합니다. </li><li> 금 - 팔라듐 합금 또는 금 - 상대적으로 무거운 코팅 (40 내지 30 nm의 목표 범위)를 적용하기 위해 사용 설명서에 따라 스퍼터 코터를 운영하고 있습니다. 0.1 밀리바에 시료 챔버 펌프; 40 초에 타이머를 설정합니다. 8:00 위치 (보통 아르곤 가스 유량)에 오픈 세트 밸브. 를 눌러 시작 30mA에서 스퍼터 코팅을 시작합니다. 퍼플 글로우 방전은 시료 챔버에 표시해야한다. </li></ol> 심장 조직 표본의 7 SEM 시험 <ol><li> 화상 (P)을 최소화하도록 비교적 낮은 가속 전압에서 주사 전자 현미경 수행샘플에서 가난한 전하 손실과 관련된 먹는데는 (충전). 제안 된 초기 영상 조건은 다음과 같습니다 5 kV로는 10mm 작동 거리, 가속 전압. </li><li> 숙련 된 작업자의 도움으로, 고용은 Z 차원에서 상당한 기간 동안 연장하는 다수의 초점면에 섬유 또는 섬유의 초점을 필요로하는 이미징 조건에서 피사계 심도를 확장 할 거리를 작동 증가했다. <ol><li> 여기에 사용되는 현미경의 사용자 인터페이스 액세스에, 오른쪽 상단에있는 탐색 탭 (재료의 표 참조). </li><li> 스테이지 메뉴에서 좌표 탭에 액세스 할 수 있습니다. 다음 입력 된 작업 거리에 샘플 단계를 이동하는 탭에 이동을 클릭 좌표 Z에 대한 밀리미터에 더 큰 값을 입력, 작동 거리를 늘립니다. </li></ol></li><li> 숙련 된 오퍼레이터의 도움으로, 전자선에 관심 직교의 표면 위치를 검지 기울기 및 회전을 이용한다. 10 degr 30의 추가 기울기EES이 위치에서 매트릭스 구조의 관찰과 문서를 향상시킬 수 있습니다. <ol><li> 포커스 작동 거리를 지적, 여기에 사용되는 현미경의 경우, (재료의 표 참조) 사용자 인터페이스에 관심 준비된 표면 평면의 주변 근처의 표본을 집중하고 왼쪽 또는 오른쪽으로 슬라이드를 클릭하고 마우스 오른쪽 버튼을 누르고 . </li><li> 표면 반복 초점 반대 가장자리 근처에 이동하는 수동 사용자 인터페이스 조이스틱으로 이동합니다. 거리 작업하는 첫 번째 위치와 대략 동일하지 않은 경우, 경사 시편 (7.2 참조) 및 T의 기울기 값이 좌표 입력 스테이지 메뉴의 좌표 탭을 사용하여 두 위치에서 대략적인 합의를 달성했다. </li><li> 시편을 90도 회전 (필드 좌표 R에 값을 입력) 및 모든 위치가 거의 동일한 작동 거리에서 초점을 맞추고 때까지 과정을 반복합니다. 주 : 변압 SEM은 전하 소산을 개선하기 위해 사용될 수있다가능한 경우. 높은 진공 주사 전자 현미경의 표준 동작 모드이다. </li></ol></li></ol>

저자는 공개할 것이 없습니다.

단면 표면 처리 프로토콜 중 가장 중요한 단계입니다. 임계점 건조 공정에 도입 될 때까지 미세 구조를 보존하기 위해 탈수 시험편은 항상 100 % 에탄올에 남아 있어야한다. 따라서 표본의 슬라이스는 표본이 얕은 접시에 에탄올에 잠겨있는 동안 EM 시험을위한 표면을 수행해야합니다 달성했다. 노출 된 표면이 접촉 또는 후속 처리 중에 프로브되지 않는 것이 중요하다. 프로토콜의 SEM 부분에 관계없이 샘플 기원의 기본 전자 현미경 문제 해결이 필요할 수 있지만 더 중요한 수정은 유사한 매트릭스 관측 다른 조직 유형에이 기술의 응용 프로그램에 대한 예상되지 않습니다. 섬유 샘플에서 수집 한 이미지 ( &quot;충전&quot;) 나쁨 전하 소산에 의해 도입 된 유물하는 경향이 있습니다. 충전의 문제는 일반적으로 주사 속도를 증가, 가속 전압 (또한 정지 시간을 감소시킴으로써 최소화 될 수있다) 및 전자 빔의 스폿 사이즈를 감소시킨다. 여러 스캔 통합 저속, 높은 품질의 단일 스캔 이미지에 전하 아티팩트없이 잡음 품질 비교 신호의 화상...

섬유증은 정상적인 심근 콜라겐 네트워크를 파괴하는데, 이는 심근세포의 정상적인 기계론적 기능에 매우 중요하며, 1,2 세포 간 통신, 세포 내 신호 전달 및 세포 생존에 매우 중요합니다 3. 섬유증의 발병은 심장 기능의 주요 결정 요인이며, 다양한 병인으로 인해 발생하는 심장 간질의 섬유화 리모델링은 좌심실 경직 증가와 이완기 기능 장애를 유발한다 4. 심근 섬유증은 또한 부정맥을 유발할 수 있으며, 섬유화 재형성의 진행이 일반적인 현상이든 국소 현상이든 상관없이 허혈성 및 비허혈성 심근병증 환자의 나쁜 예후와 밀접한 관련이 있다 5. 마찬가지로, 심근 섬유증이 없는 것은 심실 기능 회복과 장기 생존에 대한 강력한 예측 변수이다 6. 
섬유증의 특징은 과도한 콜라겐의 침착이며, 이는 강철 7의 인장 강도를 가지며 여러 수준에서 심근 세포 기능에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다. 과도하게 콜라겐 기질로 인한 기계적 힘은 심근세포 위축 8,9, 수동 조직 경직 10, 긴장 수축으로 인한 심근 경직 11-13, 나머지 심근세포 집단에 대한 산소 전달 감소를 유발할 수 있습니다. 심근세포와 myoFbs의 간극연접 결합은 또한 심장의 전기적 특성을 손상시켜 부정맥 14-16의 발병 위험을 높일 수 있습니다. 혈관주위 섬유증은 벽내 관상동맥과 세동맥의 혈관 운동 반응성을 변화시키며, 17 산소 공급을 감소시켜 심근세포의 생존을 감소시키는 내강 협착에 기여한다 17-22. 허혈성 손상 또는 에너지 불균형의 초기 부위에서 발생하는 병원성 섬유화 및 전기 리모델링은 필연적으로 심부전으로 진행됩니다. 
심근세포 괴사는 섬유화 반응을 시작하며, 이후 섬유화 재형성은 병인에 관계없이 발생할 수 있습니다. 심장 섬유증을 조절하는 방법을 찾는 것은 허혈성 및 특발성 심근병증, 고혈압성 심장병증, 비후성 심근병증, 판막 심장 질환 및 이영양증의 치료에 임상적으로 도움이 될 것이다 23-42. 섬유성 질환 진행이 어떻게 시작되는지에 관계없이, 용해성 profibrotic factor는 간질공간을 통과하여 초기 섬유성 흉터에서 멀리 떨어진 부위에서 간질성 및 외측성 섬유아세포의 활성화를 유발하여 궁극적으로 심부전으로 이어지는 연쇄 효과를 생성할 수 있습니다. 최적의 시나리오는 수축기 펌프 부전, 이완기 심부전 또는 기타 말기 결과로 진행되기 전에 심근병증의 보상적 비대 단계에서 적용할 수 있는 표적 치료법을 사용하여 섬유질 생성 과정을 활용하는 것입니다. 궁극적인 목표는 섬유증을 역전시켜 죽은 심근세포를 대체하고 심장 기능을 완전히 회복하는 것입니다. 
매트릭스의 중요성은 널리 알려져 있지만, 매트릭스를 연구하는 방법은 주로 주요 구조 구성 요소, 특히 콜라겐의 정량적 측정과 다른 매트릭스 및 모세포 단백질의 상대적 수준으로 제한됩니다. 이 프로토콜은 심장 매트릭스의 질적 차이를 평가하는 데 유용한 거의 사용되지 않는 기술을 강조합니다. 이 기술은 최근 심장 질환의 다양한 병인(인간 이식에서)으로 인한 심장 매트릭스의 근본적인 차이를 비교 및 대조하고, 치료되지 않은 동물과 비교하여 신경교세포성장인자(GGF) 뉴레굴린-1β 동형으로 처리된 경색 후 돼지의 심장을 검사하고(43), MDX의 심장 조직 매트릭스 차이를 조사하는 데 사용되었습니다 다양한 연령대의 생쥐(Duchenne Muscular Dystrophy의 일반적으로 사용되는 동물 모델)를 야생형 대조군과 비교했습니다. 이 기법은 1979년 콜필드(Caulfield) 박사와 보그(Borg) 박사에 의해 처음 소개되었지만, 45-47 이 강력한 기법을 사용한 연구는 거의 없었으며, 여기에서 약간의 수정만으로 다시 도입되었다. 이 방법론은 단순히 기질 성분 함량 및/또는 섬유증 수준을 측정할 때 간과될 수 있는 세포외 기질 미세 구조에 대한 정성적 정보를 제공하기 때문에 귀중한 연구 도구입니다.

<table><tbody><tr><td>염화칼슘</td><td>전자 현미경 과학</td><td>12340</td><td>100g</td></tr><tr><td>탄소 접착제</td><td>전자 현미경 과학</td><td>12664</td><td>30g</td></tr><tr><td>탄소 접착제 탭</td><td>전자 현미경 과학</td><td>77825</td><td>스텁에 맞추기 위해</td></tr><tr><td>양면 면도날 스테인레스 스틸</td><td>Ted Pella, Inc</td><td>121-6</td><td>250/pkg</td></tr><tr><td>에탄올</td><td>전자 Microscopy Sciences</td><td>15055</td><td>450ml</td></tr><tr><td>글루테알데히드, 50% 용액</td><td>전자 현미경 Sciences</td><td>16310</td><td>EM 등급, 증류 정제</td></tr><tr><td>염산</td><td>전자 현미경 과학</td><td>16760 또는 16770</td><td>100ml</td></tr><tr><td>인산일나트륨 NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9251-250G</td><td>250g</td></tr><tr><td>오스뮴 Tetroxide</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>19100</td><td>1 g</td></tr><tr><td>은 전도성 접착제</td><td>전자 현미경 Sciences</td><td>12686-15</td><td>15 g</td></tr><tr><td>수산화나트륨 (NaOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045-1KG</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>인산나트륨 이염기성(Na2HPO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3264-500G</td><td>500g</td></tr><tr><td>탄닌산, 5% 수성&nbsp;</td><td>전자 현미경 과학</td><td>21702-5</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>트리하이드레이트 나트륨 카코딜레이트</td><td>전자 현미경 과학</td><td>12300</td><td>100 g</td></tr><tr><td>금-팔라듐 합금 또는 금</td><td>정제 시스템, Inc.&nbsp;</td><td>스퍼터 코터 제조사 및 모델에 따라</td> <td>다름</td></tr><tr><td>임계점 건조기</td><td>전자 현미경 과학</td><td>850</td><td></td></tr><tr><td>일반 목재 애플리케이터</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-102</td><td></td></tr><tr><td>Quanta 250 환경 SEM</td><td>FEI</td><td>Q250 SEM</td><td></td></tr><tr><td>스퍼터 코터</td><td>Cressington Scientific Instruments Ltd.</td><td>모델 108</td><td></td></tr><tr><td>Alluminum SEM Sample Stubs</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>75220-12</td><td>miscroscope 특이적</td></tr></tbody></table>

침연 (macerated) 조직의 전자 현미경을 스캔하면 세포 외 매트릭스를 시각화하기

Scanning Electron Microscopy of Macerated Tissue to Visualize the Extracellular Matrix

섬유증은 병인에 관계없이 모든 형태의 심장 질환의 구성 요소이며, 심장 기질 생물학 분야에서 많은 진전이 이루어졌지만 기질이 형성되는 방식, 생리학적 및 병리학적 리모델링이 어떻게 다른지, 그리고 가장 중요한 것은 치유를 촉진하고 섬유증을 억제하기 위해 기질 역학을 어떻게 조작할 수 있는지와 관련된 주요 격차가 여전히 있습니다. 현재 심장 섬유증을 조절, 예방 또는 되돌릴 수 있는 치료 옵션은 없습니다. 그 이유 중 하나는 심근경색 후 죽거나 죽어가는 심근세포를 즉시 대체하기 위해 발생하는 것과 같은 심장 흉터 형성의 순전한 복잡성일 수 있습니다. 세포외 기질 자체는 상주 세포를 활성화하고 침투 세포를 소멸된 병변으로 안내하는 데 도움을 줌으로써 리모델링에 참여합니다. 기질은 또한 정상적인 기질 회전율과 섬유성 신호 전달에 중요한 모세포 단백질을 위한 일종의 저장 사물함입니다. 매트릭스는 또한 심장 조직에서 전기 기계적 역할을 하는 것으로 입증되었습니다. 섬유증을 평가하기 위한 대부분의 기술은 본질적으로 정성적 기법이 아니며, 두 그룹을 비교하는 데 유용하지만 기본 매트릭스 구조와 관련된 정보를 제공하지 않는 정량적 결과를 제공합니다. 여기에서 강조된 것은 심장 매트릭스 미세 구조를 시각화하는 기술입니다. 탈세포화된 심장 조직의 주사 전자 현미경은 기존의 정량적 연구 방법으로는 놓칠 수 있는 구조의 현저한 차이를 보여줍니다.

강조 표시된 기술은 사용하지 않는 인간의 심장 이식 기증자 (그림 1), 이식, 야생형과 이영 마우스 (그림 3)에서 마음에서 외식 조직에서 심장 조직에, 그리고 돼지에서 후 심근 경색 심장 샘플에 적용되었다 심장 손상 모델 (그림 2). 도 1에 도시 된 바와 같이, 인간의 심장 행렬은 단면에서 보았을 때, 벌집 형 패턴을 표시 가교 된 단백질의 복잡한 직조이다. 각 &#39;벌집&#39;구조는 그림 1의 평면도를 고려할 때 인터 디스크로 연결하면로드 할 때 은유 &#39;터널&#39;을 통해 길이 실행으로 약 40 μm의 폭, 일반적으로 단일 심근 세포를 우회,., 여러 심근 구상 할 수있다 세 차원으로 확장된다. 또한 1 하이라이트도절삭 가공 (그림 1,...

여기에 표시된 것은 탈세포화된 심장 조직에서 세포외 기질 미세 구조를 시각화하는 방법입니다.

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix ...

이 방법의 전반적인 목표는 세포나 기타 비매트릭스 물질이 없는 상태에서 심장 매트릭스의 구조를 시각화하는 것입니다. 이 방법은 섬유화 분야의 핵심 질문, 특히 매트릭스 함량의 차이가 매트릭스의 조직화에 어떤 영향을 미치는지, 그리고 이러한 변화가 다양한 심근병증이나 기타 섬유성 질환에 어떻게 영향을 줄 수 있는지를 해결할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 정량적 측정치를 보완하는 데 사용할 수 있는 매트릭스의 정성적 관찰 결과를 제공한다는 점입니다.Galindo 박사와 Sawyer 박사는 심근경색 후 돼지를 정기적으로 치료했을 때 나타나는 유전자 발현의 변화가 치료 후 기질 함량의 변화와 유사하다는 점을 발견한 후 이 기술을 사용할 아이디어를 처음 떠올렸습니다. 이 방법이 처음인 사람은 정밀한 운동 능력이 요구되기 때문에 이전의 SEM 시료 준비 경험이 없다면 어려움을 겪을 수 있습니다. 조직 시료는 쉽게 보일 수 있을 만큼 충분히 커야 하며, 4 °C에서 4% 글루타르알데하이드 용액에 보관해야 합니다.냉장 보관된 조직을 꺼내어 증류수로 씻어냅니다. 그 후, 펠렛을 물에 녹여 갓 제조한 10% 수산화나트륨 용액에 조직을 담급니다. 이때 적절한 안전 주의 사항을 반드시 준수하십시오.조직을 수산화나트륨 용액에 넣고 상온에서 6~10일 동안 유지합니다. 조직의 색이 오프화이트색 또는 흰색으로 변하면 다음 단계로 진행하십시오. 그 후, 조직이 투명해질 때까지 증류수로 헹굽니다.다음으로, 장갑을 착용하고 조직을 1% 탄닌산 용액에 담가 상온에서 4시간 동안 처리합니다. 탄닌산 처리가 끝나면, 조직을 증류수로 하룻밤 동안 헹굽니다. 준비 단계로, 장갑을 착용하고 흄 후드 내에서 0.2 M 소듐 카코딜레이트 완충액 스톡 용액과 2% 오스뮴 테트라옥사이드 수용액 스톡 용액을 제조합니다.osmium tetroxide는 흡입 시 매우 위험하므로 스플래시 가드(splash guard)를 사용하십시오. 이제 sodium cacodylate 완충액을 0.1 M 농도로 희석하고, 조직을 이 용액에 넣어 가볍게 흔들어주며 5분 동안 배양합니다. 완충액을 두 번 교체하여 sodium cacodylate로 조직을 총 3회 세척하십시오.다음으로, sodium cacodylate 스톡 용액과 osmium tetroxide 스톡 용액을 1:1 비율로 혼합합니다. 조직을 이 혼합액에 넣고 회전기(rotator)에서 1시간 동안 배양합니다. 이후 조직을 0.1 M sodium cacodylate로 되돌려 완만하게 흔들어주며 5분 동안 배양합니다.15분 동안 이 배스 용액을 두 번 교체하십시오. 그 다음, 농도가 증가하는 일련의 에탄올 배스를 사용하여 조직을 탈수하십시오. 각 배스에서 부드럽게 흔들어주며 15분 동안 조직을 담가 두십시오.다음으로, 조직과 용액을 100% 에탄올로 채워진 얕은 페트리 접시에 옮깁니다. 그 다음, 매우 날카로운 면도날 두 개를 조심스럽게 잡는데, 날의 평평한 측면이 서로 맞닿게 하고 절단면이 교차하여 시료 위에서 정삼각형의 두 변을 형성하도록 합니다. 이제 주로 사용하는 손을 사용하여 두 번째 면도날을 샘플의 맨 왼쪽에 배치하고 오른쪽으로 절단합니다.따라서, 양쪽 방향에서 칼날을 서로 맞물려 밀어내어 왜곡이나 찢어지는 힘을 최소화하면서 한 번에 매끄럽게 절단합니다. 목표는 시료를 손상시키지 않으면서 최대한 넓은 표면적을 노출시키는 것입니다. SEM으로 관찰하기에 충분한 만족스러운 단면이 준비될 때까지 이 과정을 반복하십시오.스패튤라 또는 핀셋을 사용하여 조직을 100% 에탄올에 침전된 상태로 유지하며 CPD의 샘플 홀더로 옮깁니다. 조직이 공기에 노출되는 시간은 수 초 이내여야 합니다. CPD를 사용하여 에탄올을 액체 이산화탄소로 교체하고, 제조사의 지침에 따라 건조 사이클을 수행합니다.그 다음, 각 시편에 대해 SEM 샘플 스터브를 준비합니다. 알루미늄 스터브의 상단 표면에 카본 접착 탭을 부착합니다. 실체 현미경 하에서, 관심 있는 단면이 탭의 반대 방향인 위쪽을 향하게 하고 스터브 표면과 최대한 평행하도록 시편을 접착 탭에 조심스럽게 부착합니다.관심 표면을 탐침으로 찌르거나 손으로 만지지 마십시오. 가장 작고 다루기 어려운 표본의 경우, 나무 도포봉을 부러뜨려 스패튤라로 사용하십시오. 또한, 표본을 떨어뜨려 분실하는 것을 방지하기 위해 커다란 여과지 위에서 작업하십시오.접착력을 높이려면, 부러진 어플리케이터 스틱을 사용하여 끝이 가늘어지는 브러시를 만들고, 시편의 바닥면과 측면에 은 또는 탄소 도료를 도포하십시오. 관심 표면의 가장자리까지 매우 얇은 도료 선을 그리십시오. 이렇게 하면 관심 표면에서 접지까지의 전하 경로가 형성됩니다.그 후, 카본 탭의 주변부에 전도성 페인트를 두세 번 소량 도포하여 탭 표면에서 금속 스터브까지 전도성 경로를 형성합니다. 이는 접지 역할을 합니다. 시편을 따로 두고 전도성 페인트가 2시간 동안 마르도록 합니다.건조가 완료되면, 스퍼터 코터를 작동하여 시편에 금-팔라듐 합금 또는 금을 비교적 두껍게 코팅합니다. 30~40 nm 두께의 코팅이 적당합니다. 시료의 전하 소산 불량과 관련된 문제를 최소화하기 위해 비교적 낮은 가속 전압에서 주사 전자 현미경 관찰을 수행하십시오.가변 압력 모드를 사용할 수 있는 경우 이를 사용하십시오. 먼저, Z축 방향으로 섬유에 초점을 맞출 수 있도록 충분한 피사체 심도를 확보하기 위해 작동 거리를 조정하십시오. 이를 위해 우측 상단의 Navigation 탭을 엽니다.그런 다음 스테이지 메뉴에서 Coordinates 탭으로 들어갑니다. 해당 탭에서 Z 좌표에 20 millimeters와 같이 더 큰 값을 입력하십시오. 마지막으로 Go To 탭을 눌러 변경 사항을 실행합니다.다음으로, 관심 표면을 전자빔과 직교하도록 배치합니다. 마우스 오른쪽 버튼을 클릭한 채로 왼쪽 또는 오른쪽으로 밀어, 준비된 관심 표면 평면의 주변부 근처에서 시편의 초점을 맞춥니다. 이때 초점이 맞은 작동 거리(working distance)를 기록합니다.그런 다음, 수동 사용자 인터페이스 조이스틱을 사용하여 시야를 반대쪽 가장자리로 이동하고 초점 맞추기 방법을 반복합니다. 작동 거리가 변경되었다면, 시편을 기울여 두 위치에서 대략적으로 일치하도록 조정합니다. 스테이지 메뉴의 좌표(Coordinates) 탭을 사용하여 T 좌표에 기울기 값을 입력하십시오.이제 R 좌표 필드에 이 값을 입력하여 시료를 90도 회전시키십시오. 그 다음, 모든 위치가 거의 동일한 작동 거리에서 초점이 맞을 때까지 틸팅 과정을 반복하십시오. 설명된 기술은 사용되지 않은 인간 심장 이식 공여자의 심장 조직에 적용되었습니다.인간의 심장 매트릭스는 교차 결합된 단백질들이 복잡하게 얽혀 있으며, 횡단면에서는 벌집 모양의 패턴을 나타냅니다. 각각의 벌집 구조는 너비가 약 40 microns이며, 일반적으로 단일 심근세포를 둘러싸고 있습니다. 개재판에 의해 연결된 여러 개의 심근세포는 터널과 같은 형태의 관을 통해 세로로 뻗어 있는 막대 모양으로 생각할 수 있습니다.탈세포화된 조직의 SEM 촬영은 구조적 정보를 제공할 뿐만 아니라, 돼지의 경색된 심장 조직과 같이 손상 또는 비손상성 심근병증에 대한 유의미한 정성적 평가를 가능하게 합니다. 별도의 연구에서는 NRG-1 beta의 GGF2 동형 단백질이 심부전의 잠재적 치료법이 될 수 있음이 밝혀졌습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 관심 표면을 노출시키는 기술과 시료 장착 방법을 포함하여 주사 전자 현미경을 위한 심장 조직의 처리 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다.이 절차 이후에 질량 분석법, RNA 시퀀싱 및 다양한 기타 분석법과 같은 다른 기술을 사용하여 세포외 기질 단백질과 신호 전달 및 기타 조직학적 관찰 현상에 관여하는 다른 요소들을 측정할 수 있습니다. 또한, 사산화오스뮴은 점막의 증기 고정 가능성 때문에 위험한 화학 물질임을 잊지 마십시오. 항상 니트릴 장갑을 착용하고 비산 방지 가드나 후드 섀시를 사용하여 흄 후드 내에서 작업해야 함을 기억하십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

우리는 invadopodia로 인한 매트릭스 저하를 시각화를위한 형광 젤라틴으로 코팅 현미경 coverslips를 생산을위한 원형 방법을 설명합니다. 사용 가능한 소프트웨어를 사용하여 전산 기술이 혼합 된 인구 내에 전체 미세 필드를 포함한 다세포 그룹에 대한 하나의 세포 매트릭스 proteolysis의 결과 수준을 정량화를 위해 제공됩니다.

단일 및 다세포 상황에서 Invadopodia로 인한 세포 외 기질 Proteolysis의 양적 측정

세포 외 기질은 상처 치유, 염증과 종양 발생시 상당한 개조를 겪는다. 우리는 섬유의 역학뿐만 아니라 표면 형광 또는 이광자 현미경을 사용하여 높은 공간 및 시간 해상도를 가진 메쉬 형상의 매트릭스 성분을 시각화하는 신규의 intravital 면역 형광 현미경 방식을 제시한다.

표면 형광을 가진 조직 매트릭스 구성 요소 및 두 개의 광자 현미경의 장기의 intravital 면역 형광 이미징

이 프로토콜은 조직 또는 종양에서 ECM 단백질을 농축하고 ECM이 풍부한 제제를 펩타이드로 탈당화 및 분해하여 질량 분석법으로 단백질 구성을 분석하는 절차를 설명합니다.

질량 분석기 분석을위한 펩티드로 조직과 소화에서 세포 외 기질 단백질의 농축

우리는 고분자 crowders (MMC)를 이용하여 세포 외 기질 단백질이 풍부한 세포 - 유래 매트릭스를 획득하기 위해 프로토콜을 제시한다. 또, 구조의 성숙을 유지하면서 배양 시간을 단축 차원의 Organotypic 피부 공동 배양 세대에서 MMC를 포함하는 프로토콜을 제시한다.

개선 2D 및 3D 스킨<em&gt; 체외</em거대 분자의 크라우 딩 사용&gt; 모델

세포외 기질은 세포의 미세환경을 정의하고 세포 거동 및 표현형을 조절하는 데 중요한 역할을 합니다. 우리는 세포 유래 세포 외 기질의 분리를 위한 신속한 방법을 설명하며, 이는 현미경, 생화학적, 단백질체학 또는 기능 연구를 위해 다양한 규모에 적용할 수 있습니다.

세포 유래 세포 외 매트릭스의 빠른, 분리, 기능 연구에 대한 확장 방법, 및 분석

대 식 세포 세포 외 트랩은 새로 설명된 엔터티. 이 기사는 confocal 현미경 검사 법 방법에 집중할 것 이다 그리고 그들은 어떻게 시각 생체 외에서 그리고 vivo에서 폐 샘플에서.

Confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 대 식 세포 세포 외 트랩을 시각화

이 프로토콜의 목표는 재생 비 계 임 플 란 트의 일환으로 전 임상 평가 위한 적당 한 상처 복구에 대 한 대상 전체 기질 섬유의 생산입니다. 이러한 섬유는 빈 섬유 막에 섬유 아 세포의 문화에 의해 생성 하 고 세포 막의 해체에 의해 추출.

희생 빈 섬유 막 세포 배양을 통해 기질 섬유의 생산

이 프로토콜은 생체 조사 후 뮤린 유방 지방 패드의 탈세포화 및 후속 하이드로겔 형성방법을 제시한다.

세포외 매트릭스 하이드로겔을 사용하여 정상 조직 방사선 효과 연구

우리는 스캐닝 전자 현미경의 자동화 된 이미징 절차와 함께 배열 단층 촬영 샘플로 사용하기 위해 대형 전송 지원에 직렬 섹션의 리본과 컬렉션의 준비를 설명합니다. 이 프로토콜을 통해 로컬, 희귀 한 이벤트의 스크리닝, 검색 및 표적 이미징및 대량 데이터 볼륨을 수집 할 수 있습니다.

스캐닝 전자 현미경 을 사용하여 대량 정보의 표적 수집을위한 배열 단층 학워크

현재 프로토콜은 비알코올성 지방간염(NASH) 동안 세포외 기질(ECM) 리모델링의 역학을 시각화하기 위한 신뢰할 수 있는 플랫폼을 구축하기 위해 간 상피내 관류/탈세포화 및 이광자 현미경 방법을 최적화합니다.

비알코올성 지방간염 마우스 모델에서 간 세포외 기질의 3D 이미징

우리는 다양한 계층적 수준에서 뼈 재생을 평가하는 프로토콜을 제안합니다. 이 다중 모달 접근법은 다양한 길이 척도에서 구조 분석을 가능하게 하여 시료 준비의 문제를 효과적으로 해결합니다. 또한 생체 재료가 뼈 재생을 촉진하는 효과를 평가하는 신뢰할 수 있는 워크플로우를 제공합니다.

골 재생 및 스캐폴드 성능 평가를 위한 다중 모드 접근법

배우세요 심장 조직의 탈세포화 및 주사전자현미경 기법을 이용한 세포외기질 시각화 방법을. 이 기술은 섬유증 연구와 심근병증 이해에 정성적 통찰을 제공하여 향후 치료 연구에 활용될 수 있습니다.

침연 (macerated) 조직의 전자 현미경을 스캔하면 세포 외 매트릭스를 시각화하기

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