Xenopus의 번역 손상을 식별 할 수있는 모델로 laevis의

이 절차의 전반적인 목표는 새로 전사된 mRNA의 간섭 또는 진핵 세포 연구에서 자주 발생하는 transfection efficiency 문제의 간섭 없이 번역 시작 인자에서 돌연변이의 첫 번째 결과를 평가하는 것입니다. 이는 먼저 돌연변이 야생형 및 대조군 또는 해당 플라스미드에서 GFP mRNA를 합성하여 수행됩니다. 다음으로 합성된 RNA는 6기에서 XUS Lavis cyte에 마이크로 주입되고 프로게스테론으로 성숙이 자극됩니다.

그런 다음 세포 성숙은 생식 소포 분해 시각화에 의해 평가되고 이끼 단백질 발현에 따라 활성화되는 MA 키나아제 캐스케이드의 일부 구성 요소는 웨스턴 블롯으로 분석됩니다. 마지막으로, XPO cyte myosis recovery에 필요한 moss 및 기타 mRNA의 mRNA Polyadenylation을 연구합니다. 궁극적으로 운동 세포 성숙.

웨스턴 블롯(western blot) 및 폴리아데닐화(polyadenylation) 분석은 번역 개시 인자(translation initiation factor)가 돌연변이될 때 단백질 발현의 잠재적인 영향을 보여주는 데 사용됩니다. 기존 방법 또는 생식 또는 토끼 망상적혈구와 동등하게 추출한 재구성된 세포 시스템에 비해 이 기술의 주요 장점은 MR에 도입된 돌연변이의 효과입니다. NA는 빠르게 관찰 할 수 있으며 여러 xop levies에서 쉽게 연구 할 수 있습니다. Cytes 더 일반적으로.

이 모델은 단일 거대 세포로 단순성의 장점을 가지고 있으며, 이를 사용하면 생화학 실험을 위한 상당한 양의 재료를 얻을 수 있습니다. 이 과정은 안정적인 세포주 생성에 비해 시간 효율적이기도 합니다. 이 된장은 번역 연구의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며, 예를 들어 ation 요인의 특정 영역의 역할을 더 잘 이해하거나 이 요인의 접합을 연구하는 데 도움이 될 수 있습니다.

우리는 먼저 전사의 간섭 없이 단백질 합성에 대한 돌연변이 번역 시작 인자의 영향을 연구하고 싶었을 때 이 방법에 대한 아이디어를 추가했습니다. 이러한 방식으로 우리는 이 두 가지 ome 메커니즘 사이의 잠재적인 피드백 루프를 피할 수 있습니다. 실제로, 재료 사본은 저장되고 저장됩니다.

프로게스테론으로 번역을 유발할 수 있습니다 배변 후 xus lavos cytes 및 텍스트 프로토콜에 따라 CRN을 준비한 후 10 x 걸레와 6.6% 포름알데히드를 사용하여 1.5% AROS 젤을 캐스팅합니다. 포름알데히드 8.8%, 아미드 60%가 포함된 0.2밀리리터 튜브에 샘플을 준비합니다.10 x 걸레 0.1 부피 및 1마이크로리터의 CRNA는 섭씨 70도에서 3분 동안 배양하고 튜브를 얼음 위에 10분 동안 놓습니다. 젤 선적 완충액의 2개의 마이크로리터를 추가하기 전에 5, 000 시간 G에 표본을 몇 초 동안 분리기로 만드십시오.

젤을 경멸하기 위해 90 볼트에서 20 분 동안 샘플을 실행하십시오. 뉴클레아제가 없는 물에 하룻밤 동안 담그십시오. 그런 다음 분석하여 CNA의 품질을 확인합니다.

분광 광도계를 사용하여 CNA 농도를 측정하고 샘플을 섭씨 영하 80도에서 보관하여 RNA의 미세 주입을 수행합니다. ND 96 배지를 사용하여 낙엽 제거 1-2시간 후 긁어낸 페트리 접시를 채웁니다. 접시의 긁힌 선을 따라 cyte를 배열합니다.

다음으로, 부러진 팁이 45도 각도로 배치 된 모세관 마이크로 피펫을 사용합니다. 모세관 끝을 약 150-200미크론 깊이로 색소가 있는 동물 영역 아래의 적도 영역에 삽입합니다. 60나노리터에 30나노그램의 CRNA를 첫 번째 난모세포에 주입합니다.

그런 다음 샘플이 누출되는 것을 방지하기 위해 모세관 팁을 제거하기 전에 5-10초 동안 기다립니다. 다음 cyte를 주입하려면 접시를 수동으로 이동합니다. 주입된 cyte를 3ml의 ND 96 배지로 채워진 24개의 well culture plate로 옮기고 섭씨 19도에서 유도하여 유사분열 성숙을 유발합니다.

ND 96의 난모세포를 섭씨 19도에서 15시간 동안 프로게스테론 또는 PG 밀리리터당 2마이크로그램으로 배양합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 돌연변이 표현형에 대한 야생형 EIF 4G one CRNA의 번역 효과를 테스트합니다. 실체 현미경으로 생식 소포 파괴 정도를 결정합니다.

PG 자극 후 성숙한 세포의 수를 검은 동물 기둥에 흰 반점의 존재로 계산합니다. 24시간까지 매시간 계수를 반복하여 서양 혈액 분석을 수행합니다. 섭씨 4도에서 마이크로 피펫 팁의 앞뒤 움직임을 사용하여 여기에 표시된 200마이크로리터의 완충액에 있는 10개의 cyte를 균질화합니다.

10, 000 시간 G에 중앙의 세포질 분획을 추출하기 위해 15분 동안 샘플을 원심분리하십시오. 상부 분획은 지질에 해당하고 하부는 세포 파편에 해당합니다. 세포질 분획을 수집하고 부분 표본을 저장하여 단백질 농도를 측정합니다.

SDS 페이지 및 웨스턴 블로팅을 실행하기 전에 나머지를 lamely 또는 Biss 샘플 버퍼와 1:1 비율로 결합합니다. 텍스트 프로토콜에 따라. 폴리 환기 분석을 수행하려면 조건당 5개의 cyte를 1.5ml micro fuge 튜브에 넣고 1ml의 nuclease가 없는 1개의 XPBS가 cyte를 세척합니다.

그런 다음 흄 후드 아래에서 제조업체의 지침에 따라 RNA 추출 키트를 사용하여 RNA를 분리합니다. RNA의 무결성을 확인하고 농도를 측정한 후, 첫 번째 혼합물에 다음 시약을 사용하여 CRNA 조건당 두 개의 결찰 혼합물을 준비합니다. pg로 자극되지 않은 cytes의 RNA를 두 번째 혼합물에 추가합니다.

PG 자극 난모세포에서 RNA를 추가합니다. 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양한 다음 섭씨 65도에서 20분 동안 배양합니다. CD NA 역전사 키트를 사용하여 효소를 비활성화합니다.

각 샘플에 대해 여기에 나열된 RT 혼합물을 준비합니다. 이전에 준비된 결찰 반응 10마이크로리터를 추가하고 PCR을 수행한 후 제조업체의 지침에 따라 RT를 수행하며, 4마이크로리터의 로딩 버퍼에서 각 반응에 다음 반응 혼합물 및 조건을 사용하고 110 볼트에서 3% 그로스 겔에서 각 샘플의 10마이크로리터를 실행합니다. 마지막으로 10분 및 20분 후에 겔을 분석하여 polyA 꼬리의 길이와 그에 따른 RNA 성숙을 반영하는 크기 변화를 관찰합니다. 이는 번역의 전제 조건입니다.

여기에서 볼 수 있듯이, 대조군 조건에서 주입된 미세난모세포의 동역학적 성숙은 야생형과 유사하며, PG 자극 후 12시간 및 24시간, PG 자극 후 24시간에 GVBD를 진행하는 유사한 수치를 보입니다. 성숙에 도달하는 난모세포의 비율은 야생형과 물 및 GFP 주입 대조군에서 유사하며, 이는 물 또는 대조군 또는 EIF 4G one CRNAs로 미세 주입하는 것이 우세한 음성 EIF 4G one과 함께 난모세포 근증 미세주입에 거의 영향을 미치지 않음을 나타내지만, PG 자극 후에도 GVBD의 급격한 감소를 초래했습니다. 이 그림은 야생형 CRNA에 대한 야생형 우세성 EIF 4G 1 CRNA의 비율이 증가함에 따라 성숙 결함이 복원될 수 있음을 보여줍니다.

예상대로 성숙을 거치는 세포의 비율도 마찬가지입니다. PG 자극이 없고 EIF 4G의 과발현이 없는 경우 내인성 이끼 발현이 감지되지 않았으며, 이전 결과와 마찬가지로 하나의 우세한 음성이 내인성 이끼에 거의 영향을 미치지 않았습니다. 또한, 이끼 유도의 상류에 작용하는 Aurora AEEG two는 단백질 조절 해제 또는 PG 자극 후 유도된 인산화 형태의 증거를 보여주지 않습니다.

반대로, 이끼에 의해 유도되는 irk two phosphorylation은 우세한 음성 EIF 4G 인산화가 존재할 때 억제됩니다. 일단 숙달되면 이 기술을 제대로 수행하면 5일 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 특정 나노그램 미만의 농도로 120나노리터의 CNA를 초과하지 않도록 기억하는 것이 중요합니다.

폴리솜 프로파일링 분석과 같은 방법을 수행하여 어떤 RNA가 제대로 번역되지 않거나 고도로 번역될 수 있는지 정의하는 것과 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다.