정량적 면역 형광 측정 글로벌 현지화 번역

이 실험의 전반적인 목표는 세포 부착의 초기 단계에서 발생하는 구획화된 번역 이벤트를 시각화하고 정량화하는 것입니다. 이 방법은 광범위하게 적용됩니다. 세포 이동, 부착 또는 조기 약물 반응을 분석할 때와 같이 신속한 특이적 번역 반응이 분석될 수 있는 경우 항상 사용할 수 있습니다.

이 기술의 주요 장점은 쉽고 빠르며 비용 효율적이라는 것입니다. 퓨로마이신(puromycin), 퓨로마이신(puromycin)에 대항하는 항체, 표준 컨포칼 스캔 이미징 시스템만 있으면 됩니다. 먼저 MRC-5 세포를 현탁액으로 만듭니다.

트립신화(Trypsinization)를 사용한 후 원심분리, 상층액을 제거한 다음 밀리리터당 40,000개의 세포에서 10% FBS로 DMEM에서 재현탁액을 사용합니다. 현탁액을 20분 동안 부드럽게 회전시켜 국소 접착 복합체를 완전히 분리합니다. 이것은 매우 중요합니다.

다음으로, 35mm 유리 바닥 접시 2개에 2mL 분취액 현탁액을 넣고 배양하여 세포 접착 및 SiC 형성을 가능하게 합니다. 40분 후, 한 플레이트에 시클로헥시미드를 투여하고 인큐베이터에 다시 넣습니다. 이 플레이트는 네거티브 컨트롤로 작동합니다.

55분 후, 미리 결정된 농도로 두 플레이트에 퓨로마이신을 바르고 플레이트를 5분 더 배양합니다. 1시간 동안 파종하고 5분 동안 퓨로마이신을 함께 투여한 후 얼음처럼 차가운 PBS 2ml로 각 플레이트를 두 번씩 세척합니다. 그런 다음 PBS에 4% 포름알데히드 1ml로 실온에서 15분 동안 세포를 고정합니다.

정착 후에, PBS로 세포를 3 번 세척하고십시오, 그 후에 실내 온도에 20 분 동안 PBS에 있는 0.5% 트리톤 X-100의 500 마이크로리터를 사용하여 세포를 permeabelize. 다음으로, PBS로 플레이트를 세 번 세척한 다음 PBS에 1% BSA 500마이크로리터를 적용합니다. 20분 더 실온 배양을 계속합니다.

과도한 BSA를 제거하려면 PBS에서 0.1% Tween-20으로 세포를 세 번 세척합니다. 이제 300마이크로리터의 항퓨로마이신 항체로 세포를 배양합니다. 0.1% Tween-20으로 3회 세척하여 결합되지 않은 항체를 제거합니다.

다음으로, 2개의 형광단 접합 2차 항체 혼합물 300마이크로리터를 적용하여 퓨로마이콜화된 폴리펩티드와 사실상을 시각화합니다. 어두운 곳에서 실온에서 한 시간 동안 세포를 배양합니다. 한 시간 후, 플레이트를 세 번 세척하여 결합되지 않은 항체를 제거한 다음 DAPI를 보충한 0.1% Tween-20 용액 300마이크로리터를 도포합니다.

DAPI가 실온에서 5분 동안 셀에 머물도록 합니다. 마지막으로 세포를 4번 더 세척하고 순수 PBS로 세척하여 마무리합니다. 그런 다음 이미징을 위해 2ml의 PBS에 세포를 보관합니다.

시중에서 판매되는 컨포칼 이미징 시스템을 사용하여 먼저 정량화를 위한 동적 범위를 최대화하는 적절한 설정을 결정합니다. 정량화에 대한 초점은 피크 크기 포화를 피하고 농도를 적절하게 조정한 경우에만 얻을 수 있습니다. 설정은 레이저 출력 이점과 오프셋을 신중하게 조정하여 얻을 수 있습니다.

먼저 확대/축소 비율과 픽셀 수를 조정하여 픽셀 크기를 최적화합니다. Nyquist 정리에 따라 그렇게하십시오. 그런 다음 스캔 속도를 줄이고 평균을 사용하여 신호 대 잡음비를 개선합니다.

그런 다음 Z축을 따라 적절한 상단 및 하단 초점면을 수동으로 결정하고 축 해상도를 계산하고 이 거리를 2.3으로 나누어 StepSize를 설정합니다. 일반적인 결과는 20-25개의 이미지 레이어입니다. 설정을 조정한 후 1.42 개구수의 60x Plan Apo 오일 이멀젼 대물렌즈를 사용하여 전체 단일 셀의 컨포칼 이미지를 획득합니다.

플루로포어 신호를 정량화하고 분석하려면 먼저 이미지 J에서 관심 있는 z 평면 레이어에 해당하는 이미지를 연 다음 그리기 도구를 사용하여 정량화가 필요한 셀을 통해 선을 만듭니다. 그런 다음 스트레이트를 두 번 클릭하여 선을 수정합니다. 강도 값은 선의 너비를 통해 평균화되므로 다른 구조에서 신호 중복을 피하기 위해 더 얇은 선을 사용하십시오.

그런 다음 라인을 따라 신호 밀도를 프로파일링합니다. 이제 플루로포어에 해당하는 채널에서 동일한 라인을 따라 신호 밀도를 수집하는 과정을 반복합니다. 값은 항상 선의 방향에 따라 정렬됩니다.

이제 프로필 데이터를 복사하여 분석을 위해 스프레드시트에 붙여넣습니다. 통계 분석을 진행하기 전에 관심 있는 모든 Z 평면 이미지에서 데이터를 수집하는 이 프로세스를 반복합니다. 대안적으로, 축을 따라 신호를 수집하는 대신에, 이미지의 영역으로부터 신호가 수집될 수 있다.

먼저 geometrical form 함수를 사용하여 관심 영역을 선택합니다. 그런 다음 배경을 피하기 위해 임계값 수준을 조정합니다. 픽셀 강도의 히스토그램에서 슬라이더를 이동하여 수량화에 포함될 픽셀을 조정합니다.

셀 외부의 모든 빨간색 픽셀을 제거하도록 임계값을 설정합니다. 이제 배경 신호가 아닌 관심 신호를 측정하는 데 필요한 측정 파라미터를 정의합니다. Limit to Threshold와 Integrated Density 옵션을 전환합니다.

그런 다음 measure 명령을 사용합니다. 그러면 선택한 영역의 평균 회색 값과 픽셀 수가 있는 새 창이 열립니다. 이제 동일한 임계값을 적용하여 전체 셀의 신호 강도를 결정하면서 프로세스를 반복합니다.

그런 다음 이 데이터를 사용하여 전체 셀의 신호에 대한 선택한 영역의 신호 비율을 계산합니다. purmycin-incorporation을 사용하여 번역 이벤트의 정확한 측정을 위해 축 방향 측정을 위한 최적의 조건을 먼저 평가했습니다. 농도의 스펙트럼과 5분 또는 10분 치료의 스펙트럼을 비교했다.

MRC-5 및 HeLa 세포에 대해 허용 가능한 퓨로마이신 농도는 Huh-7 세포에 필요한 농도보다 약간 높았습니다. 높은 퓨로마이신 농도로 10분 동안 처리된 세포는 대부분 더 작은 퓨로마이콜화된 폴리펩티드를 생성했습니다. 더 작은 폴리펩티드는 더 빨리 용해되며, 바람직하지 않다.

따라서 더 짧은 배양 시간이 더 바람직한 것으로 간주되었습니다. 시클로헥시미드 치료는 효과적이고 중요한 음성 대조군입니다. MRC-5 세포에서는 시클로헥시미드 처리 후 약한 퓨로마이신 신호만 검출되었습니다.

축 신호 정량화를 사용하여 새로 합성된 단백질에 해당하는 퓨로마이콜화된 폴리펩티드의 일반적인 국소화를 세포 내 다양한 수준에서 평가할 수 있습니다. 세포 전체에 걸친 신호의 정량적 분포도 가능했습니다. 두 기법 모두 전체 세포의 번역 이벤트를 정확하게 평가하기 위해 이미지 스택의 모든 Z 평면에 대한 신호를 정량화하는 것이 중요했습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 세포 내 구획에서 번역 이벤트를 평가하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 하루 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 생각할 때 퓨로마이신의 농도와 잠복기가 중요하다는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

확산을 제한하기 위해서는 배양 시간을 제한하는 것이 바람직합니다. 또한 이미지 획득 유형의 품질이 좋은 결과를 얻는 데 중요하다는 것을 인식하는 것도 중요합니다. 포름알데히드로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 화학 후드에서 작업하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.