Name: 정량적 면역 형광 측정 글로벌 현지화 번역 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: 배우세요 정량적 면역 형광 측정법으로 세포 부착 초기 단계에서 아세포질 번역 사건을 시각화하고 정량화하는 방법을. 푸로마이신과 항체를 사용하여 신속하고 비용 효율적인 분석이 가능합니다.

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원고의 중요 한 읽기에 감사 박사 Rachid Mazroui (라 발 대학교, 퀘벡, 캐나다) 하 고. 우리는 그들의 기술 지원에 대 한 연구 센터의 세포 이미징 단위 감사. M. É. Huot는 Fonds 드의 주니어 1 연구 학자 검색 뒤 퀘벡-건강 (FRQ-S). 이 작품은 건강 연구의 캐나다 학회 (번호 CIHR, 걸 레-286437 M. É를 부여에 의해 지원 되었다 합니다. Huot)입니다.

1. 결정의 Puromycilation 조건 참고:이 기술은 MRC 5 세포 접착 과정 5 동안 지역화 된 번역을 평가 하는 데 사용 하는 방법에 설명 합니다. Puromycilation 셀에 행 해질 수 있다, 그것은 치료 조건 puromycin 농도 및 원하는 각 셀 라인에 대 한 동일 하지 않기 때문에 사용 될 특정 셀 라인에 대 한 puromycilation 조건을 최적화 하는 것이 중요 보육 시간입니다. 이러한 조건이 정의 되는 방법 표시, 3 예제 셀 라인 (즉, 헬러, MRC-5, 그리고 허-7) 다른 보육 시간 puromycin의 농도 증가 함께 취급 했다 ( 그림 1).
<ol><li>성장 동일한 숫자의 적절 한 0.5 mL에 24-잘 접시의 세포의 배양 시험 전에 16 h 완료합니다. 시드 30000 MRC-5 셀, 50000 HeLa 세포, 또는 잘 당 50000 허 7 셀. 60-70% 합류 (그림 1A)를 초과 하지 않도록 하는 것을 확인 하십시오.</li>
	<li>준비 6 튜브 1.5 mL puromycin (0, 5, 10, 15, 20, 및 30 µ g/mL)의 농도 증가 함께 완전 한 세포 배양 매체의와 함께 합니다. 37 ° c.에 미리 따뜻한</li>
	<li>는 Puromycin 매체 (1.2에서 준비 단계)의 각 농도에서 0.5 mL 전송 각각 6 새로운 튜브로 튜브 및 모든 6 새로운 튜브를 50 µ g/mL의 최종 농도에 cycloheximide를 추가. 37 ° c.에 미리 따뜻한</li>
	<li>완전 한 문화 매체 (행 1 및 2)의 0.5 mL와 매체를 변경합니다. 세 번째 행에 대 한 추가 cycloheximide ( 그림 1B)의 50 µ g/mL로 보완 하는 완전 한 문화 매체의 0.5 mL. 
	참고: Cycloheximide 치료 단백질 puromycilation 번역 신장 차단 하는 기능 때문에 대 한 가장 부정적인 제어로 설립 되었습니다. Cycloheximide 치료 puromycilated 단백질 신호 5 , 18의 손실에 이르게 puromycin 설립 필요 번역 신장, 때문에.</li>
	<li>37 ° C (5% CO 2)에서 15 분 동안 품 어.</li>
	<li>추가 단계 1.2 두 번째 행에서에서 열 A, B, C, D, E 및 f.에에서 각각 0, 2.5, 5, 7.5, 10, 및 15 µ g/mL의 최종 농도 얻기 위해 준비 puromycin 매체의 0.5 mL 동시에 세 번째 행 ( 그림 1C) cycloheximide-보충 매체 (1.3 단계)에 puromycin의 0.5 mL을 추가.</li>
	<li>37 ° C (5% CO 2)에서 5 분 동안 품 어.</li>
	<li>0.0, 2.5, 5, 7.5, 10, 15 µ g/mL ( 그림 1C)의 최종 농도를 단계 1.2 첫 번째 행에서에서 준비 puromycin 매체의 0.5 mL을 추가.</li>
	<li>37 ° C (5% CO 2)에서 5 분 동안 품 어.</li>
	<li>씻어 각 행 1 ~ 3 1 mL와 함께 차가운 1 X의 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 5 분 추가 후의 첫 번째 행 (워시에 두 번)의 우물에 puromycin에서 잘. 1 X Laemmli 버퍼의 75 µ L를 추가 (4% 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS), 4 %2-mercaptoethanol 0.120 M Tris HCl pH 6.8, 0.004 %bromophenol 블루, 그리고 10% 글리세롤)를 각 상태에 대 한 전체-세포 lysates.</li>
	<li>실행 10% SDS polyacrylamide 젤 전기 영동 (SDS-PAGE) puromycin 법인을 평가 하기 위해 준비 된 샘플의 1/3을 사용 하 여.
	<ol><li>Puromycin 설립 방지 puromycin 항 체 (12 D 10) 1:25,000 1 차적인 항 체 외피 버퍼 (2% 소 혈 청 알 부 민 (BSA)), 430 mM NaCl, 10 mM Tris pH 7.4, 및 0.01%의 비율로 희석을 사용 하 여 서쪽 오 점 분석의 수준 결정 나트륨 아 지 드). 
		참고: 단계 1에서에서 설명한 대로 만든 다른 셀 선 추출 물에 해당 하는 대표적인 이미지는 그림 2에서 예제로 표시 됩니다.</li>
	</ol></li></ol> 2. Cellulo에서 지역화 된 번역 시각화 참고: 여기에 설명 된 기술은 접착 과정 5 동안 SICs MRC-5 셀에서 내에서 지역화 된 번역을 평가 하기 위해 사용 되었다. MRC 5 셀 여기에서 사용 된다, 비록 다른 셀 라인 단계 2.1에에서 설명 된 동일한 방법론으로 사용할 수 있습니다.
<ol><li>준비 셀.
	행 크에 0.25 %trypsin / 2.21 m m ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA)를 사용 하 여 <ol><li>분리 MRC-5 셀 &#39; s 균형 소금 솔루션 (HBSS). 원심 분리 (200g x 5 분) 15 mL 원뿔 원심 분리기 튜브에 의해 셀 펠 렛 및 Dulbecco에서 그들을 중단 &#39; s 수정이 글 매체 (DMEM) 세 챔버와 계산 후 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 40, 000 셀/mL에서 보충.</li>
		<li>품 어에 그들을 유지 하기 위해 20 분에 대 한 튜브 회전자를 사용 하 여 부드러운 회전에서 37 ° C에서 일시 중단 된 셀. 
		참고:이 단계는 초점 접착 단지의 완전 한 분리에 대 한 있도록 중요.</li>
		<li>정지 MRC-5 셀 (40, 000 셀/mL) 두 35 m m 유리 하단 요리 접시 2 mL. Puromycilation 분석 결과 대 한 첫 번째 35 m m 유리 하단 접시를 사용 하 여 (단계 2.1.5 참조) 부정적인 제어로 두 번째를 사용 하 여 (단계 2.1.6 참조).</li>
		<li>세포 접착 및 SIC 형성 있도록 55 분 37 ° C (5% CO 2)에서 세포를 유지.</li>
		<li>이전 제 1 정의 농도 사용 하 여 35 m m 유리 하단 요리 (시험) 매체에 추가 puromycin. MRC 5 셀을 치료 하려면 10 µ g/mL puromycin 37 ° C (5% CO 2)에서 5 분.</li>
		<li>부정적인 컨트롤 추가 cycloheximide 두 번째 35 m m 유리 하단 접시 40 분 미리 50 µ g/mL cycloheximide ( 그림 2B)와 그들을 치료 하는 세포를 뿌리기 후. 다음, cycloheximide 또한, 후 15 분 추가 단계 2.1.5 (예: 사용 10 µ g/mL puromycin MRC-5 (5% CO 2) 37 ° C에서 5 분)에서 같은 농도 및 부 화 시간을 사용 하 여 매체에 puromycin.</li>
		<li>씻어 얼음의 2 mL로 두 번 각 플레이트 1 X PBS 및 실 온 (RT)에서 15 분 동안 4% 포름알데히드 (1 X PBS에 희석)의 1 mL와 함께 셀을 수정. 
		주의: Paraformaldehyde 사용 해야 합니다 엄격 하 게 화학 후드.</li>
	</ol></li> <li>Immunostaining.
	<ol><li>Paraformaldehyde 고정, 1 X PBS의 2 mL로 세 번 세척 하 고 세포를 permeabilize를 RT 20 분에 대 한 PBS-TritonX-100 (0.5%)의 500 µ L에서 품 어.</li>
		<li>특이 항 체 바인딩 방지 하기 위해, 500 µ L PBS와 샘플을 차단 &#8211; 실시간에서 20 분 (1%) BSA</li>
		<li>PBS-Tween20 (0.1%)의 2 개 mL로 세 번 세척 하 고 실시간에 1 시간에 대 한 1 X PBS에 안티 puromycin 항 체 (12 D 10) 희석 1:12,500의 300 µ L로 품 어</li>
		<li>PBS Tween20 (0.1%)의 2 개 mL로 3 번 세척 하 고 반대로 마우스 IgG는 fluorophore를 활용의 300 µ L로 품 어 (여기, 488 nm) 희석 puromycilated polypeptides를 시각화 하는 PBS와 phalloidin 활용 된 다른 fluorophore를 (여기, 555 nm) 에 F-말라 시각화. 실시간에서 1 시간에 대 한 품 어</li>
		<li>PBS Tween20 (0.1%)의 2 개 mL로 세 번 세척 하 고 다음 5 분 동안 RT에서 300 µ L에 PBS Tween20 (0.1%)의 1 µ g/mL 4 보충 품 어 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).</li>
		<li>는 PBS Tween20 (0.1%)의 2 개 mL로 세 번 세척 하 고 1 X PBS의 2 mL로 씻어. 이미지 수집 동안 1 X PBS의 2 ml에서 샘플을 유지 하 여 건조에서 세포를 방지.</li>
	</ol></li></ol> 3. Immunofluorescent 이미지 수집 참고: 다음 방법론 어떤 상용 confocal 이미징 시스템 함께 사용할 수 있습니다.
정량화에 대 한 동적 범위를 극대화 하기 위해 각 fluorophore <ol><li>결정 적절 한 설정을. 
	참고: 대표적인 정량화만 얻을 수 있습니다 픽셀 채도 피할 경우 신호 임계값 제대로 조정 됩니다. 이러한 설정은 수 얻을 레이저 전력, 높은 전압 (HV), 신중 하 게 조정 하 여 달성 그리고 오프셋.
	<ol><li>조정 확대/축소 계수 (X 5) 및 픽셀 (512 x 512) 픽셀 크기를 최적화할 수. 
		참고:이 이상 2.3 번 보다 작아야 광학 해상도, Nyquist 법칙에 따라.</li>
		<li>스캔 속도 (12.5-20 µs/픽셀)을 감소 하 고 위에서 언급 한 설정 신호 대 잡음 비율 개선 (2-3 시간) 평균 사용.</li>
	</ol></li> <li>수동으로 적절 한 정상을 결정 하 고 최적의 스텝 크기 (0.4 µ m/슬라이스)와 z 축 따라 초점 비행기 아래쪽. 
	참고: 단계 크기 비행기 Nyquist 법칙에 따라 2.3을 나눈 축 해상도 의해 결정 됩니다. 일반적으로 20-25 레이어는 부착 세포의 전체 셀 깊이 커버 하는 데 필요한.</li>
	<li>60 X 계획 Apo 기름 침수 목적 (1.42 숫자 조리개)으로 전체 단일 셀의 공초점 이미지 획득.</li>
</ol> 4. Immunofluorescent 이미지 정량화 <ol><li>농축의 결정.
	<ol><li>관심의 z-평면 레이어 ImageJ 소프트웨어 (http://fiji.sc에서 사용할 수 있는 프리웨어)을 사용 하 여 인수 셀 데이터 파일에서 해당 이미지를 엽니다.</li>
		<li>선 그리기 도구를 사용 하 여 선 그리기 (도구 모음 &#8594; 직선) 정량화 원하는 셀의 영역을 통해. 두 번 클릭 하 여 선 두께 수정 &#34; 직선; &#34; 강도 값 ( 그림 3에 8에서 설정) 라인의 폭을 통해 평균 됩니다. 
		참고: 얇은 라인을 다른 구조에서 신호 중복을 피하기 위해 선호 된다.</li>
		<li>라인을 제대로 설정 프로필 결정된 축 따라 신호 밀도 (메뉴 모음 &#8594; 분석 &#8594; 플롯 프로필). 
		참고: 새 창이 열립니다 선택한 z-평면 섹션에 대 한 라인을 따라 (특정 fluorophore) 선택 된 채널의 각 픽셀에 대 한 신호 강도에 해당 하는 프로필을 보여줍니다.
		<li>반복 (즉, 488, 568, 및 405에 대 한 하나에 대 한 정량화) 해당 fluorophore 사용 하는 각 채널에 대 한 프로세스 <ol>. 
			참고: 신호 강도 값은 항상 주문할 수 그린된 라인의 방향을 따라.</li>
		</ol></li> <li>선택한 z-평면 계층의 quantifications에 해당 프로 파일의 각 픽셀에 대 한 숫자 회색 배율 조정 값을 얻기 위해 프로 파일 데이터를 복사 (이미지 창에서 메뉴 모음 &#8594; 복사) 모든 스프레드시트 소프트웨어에 붙여 넣습니다.</li>
		<li>반복 단계 취득된 공초점 이미지의 각 z-평면 섹션 및 정량화 원하는 각 채널에 대 한 4.1.1-4.1.4. 
		참고: 다른 z-평면 레이어의 정량화 각 z-평면 계층에 대 한 라인을 따라 각 픽셀의 합계 값을 계산 하 여 신호의 특별 한 우라늄 농축의 일반적인 평가 얻기 위해 풀링된 수 있습니다. 이러한 유형의 풀링 그린 선 평균 값에 포함 된 각 z-평면 계층에 대 한 동일한 경우 달성 될 수 있다만.</li>
		<li>층의 다 수 다른 채널의 전체 셀 정량화에 대 한 대체 방법으로 StackprofileData 라는 매크로 사용 하 여 (추가 파일 참조). 
		참고:이 매크로 https://imagej.nih.gov/ij/macros/StackProfileData.txt에 자유롭게 액세스할 수 있으며 다음과 같이 사용할 수 있습니다: <ol><li>매크로 텍스트 파일에 붙여 및 저장 합니다</li>.
			<li>모든 셀의 confocal 레이어가 포함 된 이미지 파일을 엽니다.</li>
			<li>선 그리기, 단계 4.1.2에에서 설명 된 대로 매크로 가져올 새로운 창을 열고 (메뉴 모음 &#8594; 플러그인 &#8594; 매크로 &#8594; 실행)에 해당 하는 StackprofileData 매크로 이전에 저장 된 텍스트 파일을 선택 하 고 클릭 &#34; 오픈. &#34; 
			참고: 다음 매크로 수입, 새 창 라는 &#34; 결과 &#34; 열리고 모든 결정된 축 따라 정량화의 각 z-평면 레이어 나열 됩니다 및 이미지 파일에 채널.</li>
			<li>각 채널에 대 한 데이터를 복사 (메뉴 모음 &#8594; 편집 &#8594; 복사) 그래픽 프로 파일 표현에 해당 하는 신호 quantifications를. 스프레드시트 소프트웨어에 그것을 붙여 넣습니다. 각 z-평면 계층에 대 한 라인을 따라 각 픽셀에 대 한 각 채널의 합계 값을 계산 합니다. 이러한 값을 사용 하 여 그림 3에 제시 하는 것과 유사한 그래픽 표현을 만들.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>지정 된 세포질 영역 또는 볼륨에 신호의 정량화.
	<ol><li>ImageJ 소프트웨어 이미지 파일을 엽니다.</li>
		<li>기하학적 양식 기능을 사용 하 여 관심 영역을 표시 하는 영역 그리기 (도구 모음 &#8594; &#34; 사각형, &#34; &#34; 타원형, &#34; 또는 &#34; 다각형 &#34;). 
		참고: 정량화 값 그려진된 형태에 해당 하는 영역에 대 한 결정 됩니다.</li>
		<li>조정 임계값을 피하기 위해 어떤 배경 신호 (메뉴 모음 &#8594; 이미지 조정 &#8594; 임계값); 픽셀 농도 막대 그래프 형태로 표현 하기 위해 새 창이 나타납니다. 슬라이더를 사용 하 여 정량화에 픽셀을 포함 하거나 제외할 값을 변경 합니다. 픽셀을 빨간색으로 강조 표시는 정량화에 포함 될 셀을 밖에 서 빨간색 픽셀을 제거 하는 임계값을 선택.</li>
		<li>배경 신호 없이 선택 된 영역 내에서 픽셀 신호 척도를 측정 매개 변수 정의 (메뉴 모음 &#8594; 분석 &#8594; 측정 설정), 확인 하 고 있는지는 &#34; 임계값 제한 &#34;와 &#34; 통합 밀도 &#34; 상자.</li>
		<li>측정 선택 된 영역에 대 한 정량적 값 (메뉴 모음 &#8594; 분석 &#8594; 측정). 
		참고: 새 창 아래에 표시 됩니다 신호 강도 정량화는 &#34; IntDen &#34; 평균 회색 값과 선택된 영역 내의 픽셀 수의 제품을 나타내는 식별.</li>
		<li>기하학적 형태를 사용 하 여 전체 셀을 포함 하는 영역 그리기 (도구 모음 &#8594; &#34; 사각형, &#34; &#34; 타원형, &#34; 또는 &#34; 다각형 &#34;) 총 신호에 해당 값을 가져오는 단계 4.2.3-4.2.5와 함께 진행. 관심의 영역 내에서 신호 비율을 얻기 위해 전체 신호 선택 된 영역 내에서 신호 비율 계산.</li>
		<li>각 z-비행기에 대 한 셀 볼륨의 정량화를 반복 단계 4.2.2-4.2.6. 필요에 따라 기하학적 형태를 적응.</li>
		<li>복사/붙여넣기에서 얻은 데이터는 &#34; 결과 &#34; 그래픽 묘사 및 평균 값을 찾기 위해 스프레드시트에 각 z-평면 계층에 대 한 윈도우.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

최근의 기술 진보는 변환 upregulation에 관련 된 메커니즘의 이해 또는 신경 개발, 약물 반응 및 전이 등의 생물학적 프로세스에서 특정 한 mRNAs의 억압에 대 한 수 있다. 여기에 설명 된 비용 효율적인 방법론 번역 이벤트를 RNA 의무적인 단백질 세포 접착, 마이그레이션, 및 침략 등의 전이성 프로세스를 규제 하는 방법을 공부 하는 셀에 구상 될 수 있습니다.
수많은 방법은 de novo 단백질 번역을 평가 하기 위해 개발 되었습니다, 하지만 그들은 모두 같은 전략, 늘이는 polypeptide 감지 moiety 태그로 수정 된 아미노산을 통합 공유. 이 메서드의 첫 번째 35S 방사선 아르기닌 법인 새로 번역 된 단백질에 의존합니다. 비록 그것은 특정 조건 하에서 번역의 일반적인 속도 비교 하기 위한 효율적인, 방사선된 아미노산의 사용 게이 방법을 대부분 연구 팀 거죠. 따라서, 소설의 개발 방법, 석양 등 비 방사성 레이블을 ...

다른 세포질 기능에 의해 번역의 규칙 새로운 도구와 mRNA 번역 및 규제 단백질 합성1,2 의 subcellular 지 방화를 결정 하는 방법을 개발 하기 위해 많은 연구 팀을 묻는 메시지가 있다 ,34. 이러한 최근의 기술 진보에 대 한 번역 upregulation 또는 신경 개발, 약물 반응 및 전이5 같은 생물 학적 과정 동안 특정 mRNAs의 억압 메커니즘의 향상 된 이해 허용 ,6,,78. 그러나, 이러한 방법의 대부분 비싼 또는 유해 시 약 및 특정 장비를 대부분 실험실을 사용할 수 없는 필요 합니다. 따라서, 번역 이벤트의 급속 한 평가 대 한 허용 하는 비용 효율적인 방법은 구체적으로 이러한 잠재적인 문제를 회피 하 개발 되었다. 이 방법은 특정 세포 프로세스 동안 발생 하는 급성 변환 변조 감지 및 또한 번역 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 지역화에 대 한.
여기에 설명 된 방법은 확산 개시 센터 (SIC)5라는 subcellular 구획 내에서 지역화 된 번역을 모니터링 하는 데 사용 되었다. SICs 과도 구조 초기 접착 단지 위에 지역화 된 시드 셀에 있습니다. SICs 및 접착 단지 가지는, 비록 그들의 운명은 밀접 하 게 연결 됩니다. 실제로, SICs 접착의 초기 단계 동안 접착 사이트에 초점 접착 복잡 한 성숙에 점차적으로 사라질 알려져 있습니다. 우리는 발견 특히 mRNA 번역 (예를 들어, Sam68, FMRP, 및 G3BP1)을 제어 하려면 알려진 RNA 의무적인 단백질 및 RNAs 이러한 내에서 농축 된 polyadenylated 구조5. 여기 설명 된 방법을 사용 하 여, 우리는 SIC 관련 mRNA 번역 검사점 수 역할의 규칙 세포 세포 접착을 통합 시드 보였다. Puromycin 설립에 따라이 메서드는 적응된 버전의 번역 분석 결과 (일몰) 표면 감지의 간주 될 수 있습니다. 원래는 비 방사성 레이블이 아미노산을 사용 하 여 글로벌 단백질 합성 속도 측정을 개발, 단백질 puromycilation de novo 단백질 합성9를 시각화 하는 효율적인 방법을 제공 합니다. 이 방법은 puromycin, 번역 리보솜10조 체인 종료를 차단 하는 항생제의 고유 동작에 의존 합니다. 실제로, puromycin tyrosyl-tRNA, 펩 티 드 사슬 펩 티 드 결합의 형성을 통해 elongating으로 수 있는 구조적으로 유사한 이다. 그러나, 성장 펩 티 드 사슬에 puromycin 바인딩 puromycin tRNAs에서 발견 hydrolysable 에스테 르 결합 대신 비 hydrolysable 아 미드 유대를가지고 있기 때문에 다음 aminoacyl-tRNA와 함께 형성 되 고에서 새로운 펩 티 드 결합을 방지 합니다. 따라서, polypeptides를 elongating에 puromycin의 설립 적극적으로 번역 mRNA9,11,12에 해당 하는 수많은 잘린된 puromycilated polypeptides의 조기 출시에 결과 .
짧은 시간과 부 내에서 활성 번역 평가 가능 했다이 메서드를 사용 하 여 (예를 들어, 5 분) 동안 puromycin 항생제 5 분 동안 보충 된 셀에 대 한 지시는 특정 항 체를 사용 하 여 세포 접착 세포 접착 하는 동안 다른 시간 지점에서5를 처리 합니다. 이 분석 결과의 정밀도 높은 특정 항 체에 대하여 puromycilated moiety 지시에 의존 합니다. Puromycilated polypeptide의 immunofluorescent 감지 또한 confocal 이미징 시스템을 사용 하 여 좋은 정확성과 계량 수 새로 번역 된 mRNA의 일반적인 subcellular 재분할을 제공 합니다.
이 방법은 신경 알갱이 만듦6,,1314, 등의 프로세스에 관련 된 변환 규제 메커니즘을 공부 하는 실험실의 많은 수에 대 한 관련 옵션을 제공 하는 15, morphogen mRNA 지역화, 그리고 개발16,17동안 번역. 그것은 또한 급속 한 생물 학적 이벤트, 셀 이동, 접착, 또는 침략, 또는 단순히 변환 변경5, 를 일으킬 수 있는 약물 치료를 평가 하기 위해 동안 지역화 된 또는 compartmentalized 번역을 공부 하는 데 적합 7 , 18. 전반적으로,이 메서드를 사용 하면 지역화 된 또는 제어 번역 이벤트의 시각화를 위한, 정확, 신속 하 고 비용 효율적인 방식으로.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>wisent</td><td>319-005-CL</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>wisent</td><td>325-043 EL</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12483020</td><td></td></tr><tr><td>Puroycin 항체 12D10</td><td>EMD 밀리포어</td><td>MABE343</td><td>웨스턴 블롯 희석 1:25,000 면역형광 희석 1:10,000</td></tr><tr><td>안티-마우스 IgG, HRP 결합 항체</td><td>세포 신호 전달 technology</td><td>7076</td><td>western blot dilution 1:8,000</td></tr><tr><td>western lightning plus-ecl</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEL104001EA</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor 488 Conjugate)</td><td>세포 신호 전달 기술</td><td>4408</td><td>면역형광 희석 1:400</td></tr><tr><td>CF568 Phalloidin</td><td>biotium</td><td>00044</td><td>면역형광 희석 1:400</td></tr><tr><td>시클로헥스미드</td><td>시그마</td><td>C1988-1G</td><td>50&마이크로; g/ml 최종 농도</td></tr><tr><td>DAPI(4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>최종 농도 1&micro; g/ml</td></tr><tr><td>퓨로마이신</td><td>바이오 베이직</td><td>PJ593</td><td>2.5&마이크로; g/ml에서 10&micro; g/ml</td></tr><tr><td>Ibidi &micro;-Dish 35mm, 높이, ibiTreat</td><td>Ibidi</td><td>81156</td><td></td></tr><tr><td>MRC-5 세포</td><td>ATCC</td><td>CCL-171</td><td></td></tr><tr><td>HeLa 세포</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>Huh-7</td><td>세포 Dr. Mazroui (Universit&eacute; Laval)</td>Fv1000 <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>올림푸스</td><td></td><td>컨포칼 이미징 시스템</td></tr><tr><td>피지 소프트웨어</td><td></td><td></td><td>http://fiji.sc</td></tr><tr><td>PBS (Phosphate BuffeRed Saline)</td><td>bio-Basic</td><td>PD8117</td><td></td></tr><tr><td>포름알데히드 37% 용액</td><td>바이오 베이직</td><td>C5300-1</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>바이오 베이직</td><td>TB0198</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>피셔 바이오 시약</td><td>BP9702-100</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>피셔 바이오 시약</td><td>BP337-500</td><td></td></tr></tbody></table>

정량적 면역 형광 측정 글로벌 현지화 번역

Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation

MRNA 번역 조절 메커니즘 여러 질병에서 뿐만 아니라 세균 선 개발, 세포 분화, organogenesis, 등 다양 한 생물학 과정에서 포함 된다. 다 수의 출판물에서는 특정 메커니즘 단단히 mRNA 번역 규제 설득 나타났습니다. 단백질 식의 번역 유도 규칙에 대 한 관심 증가 연구 하 고 de novo 단백질 합성에서 cellulo에따라 새로운 방법의 개발을 주도하 고 있다. 그러나, 이러한 방법의 대부분은 복잡 한, 그들이 비용이 많이 드는 고 공부 될 수 있다 mRNA 대상의 수를 제한 하는 자주. 이 원고만 기본적인 시 약 및 측정 하 고 다양 한 조건에서 어떤 셀 라인에서 발생 하는 mRNA 번역에 변화를 시각화 confocal 형광 이미징 시스템을 필요로 하는 방법을 제안 합니다. 이 메서드는 최근 시간, 따라서 생물 다양 한 동안 짧은 기간에 대 한 드 노 보 번역 시각화의 가능성을 제공 하는 짧은 기간 동안 부착 셀의 subcellular 구조에서 지역화 된 번역을 표시 하는 데 사용 됩니다. 프로세스 또는 특정 자극에 응답에서 변환 활동에 변화를 확인.

관찰 하기 위해 정확 하 게 번역 이벤트 puromycin 관을 사용 하 여, 그것은 각각 다른 puromycin 법인 활동 (그림 1)9,11 보여주기 때문에 각 셀 라인에 대 한 최적의 조건을 결정 하는 중요 한 ,,1218. 따라서, puromycin 설립의 유효성을 검사, 그것은 puromycin의 농도 증가의 표준된 스펙트럼과 원하는 셀 라인을 치료 하는 데 필요한 (1.0, 2.5, 5.0, 7.5, 10.0, 및 15.0 µ g/mL) 다른 기간 (5, 10 분)에 대 한. 지역화 된 번역 또는 약물 치료에 대 한 초기 응답 평가, 부 화 시간 단축이 선호 (예를 들어,...

이 원고 시각화 및 subcellular 구획에서 지역화 된 번역 이벤트를 계량 하는 방법을 설명 합니다. 이 원고에 제안 접근 기본 confocal 이미징 시스템 및 시 약을 필요로 하 고 신속 하 고 비용 효율적인.

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and ...

이 실험의 전반적인 목적은 세포 부착의 초기 단계에서 일어나는 구획화된 번역 이벤트를 시각화하고 정량화하는 것입니다. 이 방법은 광범위하게 적용 가능합니다. 세포 이동, 부착 또는 초기 약물 반응을 분석할 때와 같이 신속하고 특이적인 번역 반응을 측정해야 하는 경우에 이 방법을 사용하십시오.이 기술의 주요 장점은 간편하고 신속하며 비용 효율적이라는 점입니다. puromycin, puromycin 항체 및 표준 공초점 스캔 이미징 시스템만 있으면 됩니다. 먼저, MRC-5 세포 현탁액을 만듭니다.트립신화를 수행한 후, 원심분리를 통해 상층액을 제거하고, 10% FBS가 포함된 DMEM에 1mL당 40,000 cells 농도로 재현탁합니다. 초점 접착 복합체(focal adhesion complexes)를 완전히 해리시키기 위해 현탁액을 완만하게 회전시키며 20분 동안 배양합니다. 이 과정은 매우 중요합니다.다음으로, 두 개의 35mm 유리 바닥 배양 접시에 현탁액 2 mL씩을 분주하고, 세포 부착 및 SiC 형성이 이루어지도록 배양합니다. 40분 후, 한 개의 플레이트를 cycloheximide로 처리하고 다시 배양기에 넣습니다. 이 플레이트는 음성 대조군으로 사용됩니다.55분 후, 미리 결정된 농도의 puromycin을 두 플레이트에 모두 처리하고 5분 동안 더 배양합니다. 세포 파종 후 1시간과 puromycin 처리 5분이 경과하면, 각 플레이트를 ice-cold PBS 2 mL로 두 번 세척합니다. 그런 다음 PBS에 희석된 4% formaldehyde 1 mL를 사용하여 실온에서 15분 동안 세포를 고정합니다.고정 후, PBS로 세포를 3회 세척하고, 실온에서 20분 동안 500 µL의 0.5% triton X-100(PBS 내)을 사용하여 세포를 투과화합니다. 다음으로, 플레이트를 PBS로 3회 세척한 후, 500 µL의 1% BSA(PBS 내)를 처리합니다. 실온에서 20분 더 배양을 계속합니다.과잉 BSA를 제거하기 위해, 0.1% Tween-20가 포함된 PBS로 세포를 3회 세척합니다. 그런 다음, 300 µL의 anti-puromycin 항체를 처리하여 세포를 배양합니다. 0.1% Tween-20로 3회 세척하여 결합되지 않은 항체를 제거합니다.다음으로, puromycolated 폴리펩타이드와 de factem을 시각화하기 위해 두 종류의 형광체 결합 2차 항체 혼합물 300 µL를 처리합니다. 세포를 실온의 암소에서 1시간 동안 배양합니다. 1시간 후, 결합되지 않은 항체를 제거하기 위해 플레이트를 3회 세척한 다음, DAPI가 첨가된 0.1% Tween-20 용액 300 µL를 처리합니다.DAPI를 세포 내에 5분 동안 상온에서 유지합니다. 마지막으로, 세포를 네 번 더 세척하며, 순수 PBS로 세척하여 마무리합니다. 그 후, 이미징을 위해 2 mL의 PBS에 세포를 보관합니다.시판되는 공초점 이미징 시스템을 사용하여, 먼저 정량 분석을 위한 다이내믹 레인지를 최대화하는 적절한 설정을 결정하십시오. 피크 크기 포화를 방지하고 농도를 적절하게 조절해야만 정량 분석이 가능합니다. 이 설정은 레이저 출력과 오프셋을 세심하게 조정하여 얻을 수 있습니다.먼저, 픽셀 크기를 최적화하기 위해 확대 배율과 픽셀 수를 조정하십시오. 이는 나이퀴스트 정리에 따라 수행합니다. 다음으로, 스캔 속도를 낮추고 평균화(averaging)를 사용하여 신호 대 잡음비를 개선하십시오.그다음, Z축을 따라 적절한 상단 및 하단 초점 평면을 수동으로 결정하고, 축 방향 해상도를 계산한 뒤 이 거리를 2.3으로 나누어 StepSize를 설정합니다. 일반적인 결과값은 20~25개의 이미지 레이어입니다. 설정이 조정되면, 개구수 1.42의 60x Plan Apo 오일 침강 렌즈를 사용하여 단일 세포 전체의 공초점 이미지를 획득합니다.형광체 신호를 정량화하고 분석하려면, 먼저 ImageJ에서 관심 있는 z-평면 층에 해당하는 이미지를 엽니다. 그런 다음, 그리기 도구를 사용하여 정량화를 원하는 세포를 가로지르는 선을 긋습니다. 이어서, Straight를 더블 클릭하여 선의 두께를 수정합니다. 선의 너비 전체에 걸쳐 강도 값이 평균화되므로, 서로 다른 구조의 신호가 겹치는 것을 방지하기 위해 더 얇은 선을 사용하십시오.그 다음, 해당 선을 따라 신호 밀도를 프로파일링합니다. 이제 형광체에 해당하는 채널에서 동일한 선을 따라 신호 밀도를 수집하는 과정을 반복하십시오. 값들은 항상 선의 방향에 따라 정렬됩니다.이제 프로파일 데이터를 복사하여 분석을 위해 스프레드시트에 붙여넣으십시오. 통계 분석을 진행하기 전, 관심 있는 모든 Z 평면 이미지에서 데이터를 수집하는 이 과정을 반복하십시오. 또는, 축을 따라 신호를 수집하는 대신 이미지의 특정 영역에서 신호를 수집할 수도 있습니다.먼저 기하학적 형태 함수를 사용하여 관심 영역을 선택합니다. 다음으로, 배경이 포함되지 않도록 임계값 수준을 조정합니다. 픽셀 강도 히스토그램에서 슬라이더를 이동하여 정량 분석에 포함될 픽셀을 조정합니다.세포 외부의 모든 빨간색 픽셀을 제거하도록 임계값을 설정하십시오. 이제 배경 신호가 아닌 관심 신호를 측정하는 데 필요한 측정 파라미터를 정의하십시오. 임계값(threshold) 및 통합 밀도(integrated density) 옵션의 제한 설정을 전환하십시오.다음으로, measure 명령어를 사용하십시오. 그러면 선택한 영역의 평균 회색값(mean gray values)과 픽셀 수가 표시된 새 창이 열립니다. 이제 동일한 임계값을 적용하여 세포 전체의 신호 강도를 결정하는 과정을 반복하십시오.그런 다음 이 데이터를 사용하여 선택된 영역의 신호와 전체 세포 신호의 비율을 계산합니다. 퍼미신(purmycin) 통합을 이용한 번역 이벤트의 정확한 측정을 위해, 먼저 축 방향 측정의 최적 조건을 평가하였습니다. 5분 또는 10분 처리 시의 농도 범위에 따른 결과를 비교하였습니다.MRC-5 및 HeLa 세포에 적합한 puromycin 농도는 Huh-7 세포에 필요한 농도보다 다소 높았습니다. 고농도의 puromycin으로 10분 동안 처리한 세포에서는 주로 크기가 작은 puromycolated 폴리펩타이드가 생성되었습니다. 이러한 작은 폴리펩타이드들은 더 빠르게 확산되었으며, 이는 바람직하지 않은 결과입니다.따라서 더 짧은 배양 시간이 더 바람직한 것으로 판단되었습니다. Cycloheximide 처리는 효과적이고 중요한 음성 대조군입니다. MRC-5 세포에서 cycloheximide 처리 후에는 약한 puromycin 신호만 검출되었습니다.축 방향 신호 정량화를 통해, 새로 합성된 단백질에 해당하는 puromycolated 폴리펩타이드의 일반적인 국소화를 세포 내의 서로 다른 수준에서 평가할 수 있었습니다. 세포 전체에 걸친 신호의 정량적 분포 또한 가능했습니다. 두 기술 모두에서, 세포 전체의 번역 이벤트를 정확하게 평가하기 위해서는 이미지 스택의 모든 Z 평면의 신호를 정량화하는 것이 중요했습니다.이 영상을 시청한 후, 여러분은 세포 내 구획에서 번역 이벤트를 평가하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 숙달되면, 적절히 수행했을 때 이 기술은 하루 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 고려할 때, puromycin의 농도와 배양 시간이 중요하다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.확산을 제한하려면 배양 시간을 제한하는 것이 바람직합니다. 또한, 좋은 결과를 얻기 위해서는 이미지 획득 방식의 품질이 매우 중요하다는 점을 인식하는 것이 중요합니다. 포름알데히드를 사용하는 작업은 매우 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안에는 항상 화학 후드 내에서 작업하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 점을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

이 비디오는 단순 포진 바이러스-1 감염에서 감염된 세포 단백질 0, ICP0 이동을 모니터링하는 방법을 보여줍니다. Post-de novo synthesis, ICP0는 핵으로 전위되었다가 나중에 감염이 진행되는 동안 세포질로 이동합니다. 면역형광 현미경 검사는 단백질의 세포 내 국소화를 밝히고 분석하여 감염 단계 전반에 걸친 단백질의 이동에 대한 통찰력을 제공합니다.

감염된 세포의 바이러스 단백질 국소화를 위한 면역형광 기술

여기 포유류의 조직 배양 세포에서 endoplasmic 소포체 - 관련 mRNAs을 시각화하는 방법을 설명합니다. 이 기술은 형광등에 이어 세포질 내용을 제거 할 digitonin과 플라즈마 막의 선택적 permeabilization을...

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이 프로토콜은 NLS-NES-GFP 단백질의 핵 임포트에서 실시간 변화를 정량화함으로써 모터 뉴런과 유사한 NSC-34 세포 내에서 핵 세포질 수송 속도를 민감하게 측정하는 방법을 설명합니다.

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골의 정확한 지역화는 Golgi의 세포질 기능을 이해 하기 위한 필수적입니다. 그러나, 기존의 광학 현미경은 하위 골 구조를 해결 하기 위해 수 없습니다. 여기는 양적 단백질의 하위 Golgi 지역화가 결정을 기반으로 하는 기존의 현미경 슈퍼 확인 방법에 대 한 프로토콜에 설명 합니다.

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포 르 말린 조정의 파라핀 끼워 넣어진 조직 샘플 (FFPE)에 관심사의 단백질을 측정 하는 수단으로 이미지 분석와 결합 하 여 면역 형광 조직학 유효성을 양적 immunoblotting 사용 하 여를 설명 합니다. 우리의 결과 일상적인 생 검 견본에 있는 바이오 마커 단백질의 상대적 수량을 ascertaining에 대 한 면역 형광 조직학의 유틸리티를 보여 줍니다.

면역 형광 측정 바이오 마커 단백질 일상적인 조직 샘플에 대 한 유효성을 검사 하는 표준으로 세포의 양적 Immunoblotting

여기, 우리 면역 형광 염색 법을 사용 하 여 마커 단백질, confocal 현미경 검사 법 및 컴퓨터 기반 분석 시 냅 스 단백질의 분포를 결정 하는 양적 접근 방식을 설명 합니다.

면역 형광 검사를 사용 하 여 마우스 뇌의 시 냅 스 단백질의 다른 유형의 분포를 측정

Reproducibly 개별 oocytes, 단일 분자 RNA 형광 제자리에서 mRNAs의 숫자를 카운트를 교 잡 (RNA-물고기) 비 부착 한 세포에 대 한 최적화 되었다. Oocytes 수집 했다, 대 본 특정 프로브 때 교배 하 고 이미지 정량화 소프트웨어를 사용 하 여 계량.

Murine Oocytes에 계량 및 방화 mRNAs 단일 분자 형광에서 제자리 교 잡 (SM-물고기)의 사용

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정량적 면역 형광 측정 글로벌 현지화 번역

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