라이브 셀 이미징 및 배아 상피 세포의 정량 분석 Xenopus laevis

이 절차의 전반적인 목표는 배아 상피 세포 형태를 분석하기 위한 라이브 이미징 및 간단한 정량화 방법을 시연하는 것입니다. 이것은 먼저 모든 도구와 장치를 준비함으로써 수행됩니다. 절차의 두 번째 단계는 개구리 배아에서 X 엑스플랜을 절제하고 장기 배양을 위해 챔버에 보관하는 것입니다.

절차의 세 번째 단계는 상피 세포의 고해상도 이미지를 실시간으로 수집하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 이미지 J를 사용하여 상피 세포의 형태학적 세부 사항을 정량화하는 것입니다. 궁극적으로 고해상도 컨포칼 현미경을 통해 추적된 세포 영역과 막 강도를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 피츠버그 대학교 생명공학과 데이비슨 연구소의 사가르 조시입니다.

오늘 우리는 Xenos lavia 배아 상피 세포의 라이브 셀 이미징 및 정량 분석 절차를 보여 드리겠습니다. 우리는 이 절차를 사용하여 실시간 세포 세포골격 변화를 연구합니다. 시작하겠습니다.

동물 뚜껑 배양을 위한 챔버를 준비하려면 실리콘 그리스를 사용하여 맞춤형 아크릴 챔버 또는 작은 나일론 와셔를 45 x 50mm의 대형 커버 유리에 밀봉합니다. 1/3 XMBS에 1 밀리리터의 1 % BSA를 챔버에 첨가하십시오. 작은 커버 슬립 조각을 동일한 용액으로 코팅하여 실온에서 2-4시간 동안 또는 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다.

X explan이 유리에 접착되는 것을 줄이려면 The xs로 옮기기 직전까지 챔버를 헹구고 DFA 매체로 채우고 동일한 방식으로 커버 슬립 조각을 헹굽니다. 그런 다음 1-4 세포 단계에서 원하는 MR NA를 1/3 XMBS의 원하는 단계로 마이크로 주입 한 DFA 배양 배아 접시에 담그십시오. 비스듬한 개구부가 있는 전사 피펫을 사용하여 해부 실체 현미경으로 배아를 DFA 접시로 옮깁니다.

겸자를 사용하여 배아를 동물용 CapEx 식물을 절제합니다. 헤어 루프를 사용하여 한 자세로 배아를 지지합니다. 헤어 나이프를 사용하여 동물 기둥을 작게 절개합니다.

절개 부위를 확장하고 캡 외배엽을 제거하기 위해 반복적으로 부드럽게 튕깁니다. 같은 방식으로 3개 또는 4개의 x를 소비합니다. 그리고 전사 피펫을 사용하여 준비된 배양 챔버로 옮깁니다.

헤어 루프를 사용하여 상피가 챔버의 바닥을 향하도록 각 X explan을 배치합니다. 겸자 사용. 커버 슬립 조각을 중앙에 잡습니다.

끝 부분을 실리콘 그리스에 담그십시오. 각 X 설명 위에 하나의 조각을 놓습니다. 실리콘 그리스를 약간 뿌려 각 조각을 제자리에 가볍게 고정합니다.

과도한 힘으로 X 설명을 완전히 부수지 않도록 주의하십시오. 챔버를 DFA로 채우고 챔버의 상단 가장자리에 실리콘 그리스를 코팅합니다. 그런 다음 24 x 40mm 커버 슬립으로 상단을 밀봉합니다.

챔버 내의 DFA 레벨을 조정하여 기포를 줄이고 티슈를 사용하여 넘침을 제거합니다. X 식물은 이제 실온에서 하루 동안 밀폐된 챔버에서 장기간 배양할 수 있으며, 컨포칼 현미경의 20 x 대물렌즈를 제자리로 옮깁니다. X 엑스플랜이 포함된 챔버를 현미경 스테이지에 배치하고 챔버에 작은 균형 추를 배치하여 명시야 아래의 위치에 고정합니다.

초점을 조정하고 코스 포지셔닝을 사용하여 표재성 세포의 정점 끝을 시각화합니다. 형광 및 더 높은 출력 목표로 전환합니다. explan 상피의 단일 이미지 또는 타임랩스 동영상을 수집하려면 최상의 이미지를 얻을 수 있도록 획득을 조정하십시오.

튜닝 및 이미징에 대한 팁은 이 프로토콜의 서면 부분을 참조하십시오. 레이저 출력을 가능한 한 낮게 유지합니다. x explan 상피의 이미지 또는 타임랩스 동영상을 캡처합니다.

데이터 수집에 대한 제안은 프로토콜의 서면 부분을 참조하십시오. 컨포칼 이미지 파일은 다양한 방법으로 데이터를 마이닝할 수 있습니다. 다음은 bio formats 플러그인과 함께 Image J 분석 소프트웨어를 사용하여 데이터 파일을 분석하는 방법의 두 가지 예입니다.

상피 세포의 세포 면적을 측정하려면 분석 메뉴를 아래로 당겨 측정값 설정을 클릭합니다. 도구 모음에서 선택 도구를 선택하고 분석 메뉴에서 셀의 윤곽을 표시한 다음 도구를 선택한 다음 ROI 관리자를 선택합니다. 관심 영역 관리자를 열려면 컨트롤 t를 누릅니다.

ROI 관리자에 윤곽선을 추가하려면 이미지에서 원하는 만큼 윤곽선을 선택하여 추가합니다. 그런 다음 저장을 클릭하여 ROI 관리자에 설정된 ROI를 저장합니다. 측정을 클릭합니다.

이제 결과 창에 각 ROI의 측정된 영역이 표시됩니다. 세포막의 강도를 측정하려면 이미지 J 도구 모음에서 직선 도구를 선택합니다. 멤브레인을 가로질러 수직선을 그립니다.

이전 예제에서와 같이 Ctrl T를 누릅니다. ROI 관리자에 선택 항목을 추가하려면 분석 메뉴를 풀다운하고 플롯 프로파일을 클릭하여 라인 전체에 걸쳐 상대 강도 플롯을 생성합니다. 그래프를 이미지로 저장하려면 나타나는 새 플롯 창에서 저장을 클릭합니다.

목록 메뉴를 아래로 당겨 파일한 다음 다른 이름으로 저장하십시오.방금 절제된 동물 CapEx 설명에서 배아 상피 세포를 실시간으로 이미지화하고 정량화하는 방법을 보여드렸습니다. 이 절차를 수행하는 동안 DFA에 항생제와 항생제를 추가해야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 박테리아 및 곰팡이 성장을 억제하려면 필요한 것보다 더 많은 압력이 가해지면 ex explan이 깨질 수 있으므로 덮개 슬립 아래의 explant를 누를 때 각별한 주의를 기울이십시오.

또한 최대 품질의 이미지 데이터를 얻기 위해 컨포칼 현미경에서 최적의 설정을 유지하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 그게 다야. 지켜봐 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.