Name: 라이브 셀 이미징 및 배아 상피 세포의 정량 분석 Xenopus laevis /em (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-23T17:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 51 s
Description: 배우세요 Xenopus laevis 배아 상피 세포의 라이브 이미징 및 정량 분석 방법을 공초점 현미경과 Image J 소프트웨어를 활용하여 세포 형태학적 변화를 실시간으로 관찰하고 분석하는 기술을 습득하세요.

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이 작품은 국립 보건 연구소 (R01 - HD044750), 국립 과학 재단 (National Science Foundation)에서 경력 부여, 그리고 미국 심장 협회 (보조금을 시작)의 지원에 의해 지원되었다. 분자 생물학과 합성 mRNA 그녀의 도움 HY 김, M. 폰 Dassow 및 J. 만주국 (매일 연구실 책임에 대한 도움), 그리고 린 장 : 저자 데이비슨 연구소 회원 주셔서 감사합니다. 우리는 지난 몇 년 동안 다양한 방법을 개발하고 테스트하여,이 프로토콜의 일부에 기여한 모든 개구리 실험실 (특히 레이 켈러의 더그 DeSimone의)에서 실험적인 노력을 인정합니다. 우리는 각각 멤 - GFP 및 moesin - GFP의 plasmids 그들의 종류의 선물 리차드 할랜드와 존 월링포드 감사드립니다.

<ol><li>Ninomiya, H., Winklbauer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+coating+controls+mesenchymal+shape+change+through+tissue-positioning+effects+and+reduction+of+surface-minimizing+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Epithelial coating controls mesenchymal shape change through tissue-positioning effects and reduction of surface-minimizing tension.</a> Nat Cell Biol. 10 (1), 61-61 (2008).</li>
<li>Kay, B. K., Peng, H. B. Xenopus laevis: Practical Uses in Cell and Molecular Biology. , Academic Press. New York. (1991).</li>
<li>Cross, M. K., Powers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obtaining+eggs+from+Xenopus+laevis+females%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Obtaining eggs from Xenopus laevis females.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>Cohen, S., Au, S., Pante, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+Xenopus+laevis+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of Xenopus laevis oocytes.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal Tables of Xenopus laevis (Daudin). , Elsevier North-Holland Biomedical Press. Amsterdam. (1967).</li>
<li>Davidson, L. A., Ezin, A. M., Keller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+wound+healing+by+apical+contraction+and+ingression+in+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motil+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Embryonic wound healing by apical contraction and ingression in Xenopus laevis.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 53 (3), 163-163 (2002).</li>
<li>Joshi, S. D., Dassow, M. von, Davidson, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+control+of+excitable+embryonic+tissues%3A+three+stimuli+induce+rapid+epithelial+contraction%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Experimental control of excitable embryonic tissues: three stimuli induce rapid epithelial contraction.</a> Exp Cell Res. 316 (1), 103-103 (2010).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

우리는 혀끝의 세포 피질 및 Xenopus의 배아에서 상피 세포의 세포 세포막을 진동의 이미지를 동적으로 변화하는 cytoskeleton에 우리가 실험실에서 정기적으로 사용되는 실험 프로토콜을 제시했습니다. 이 프로토콜의 최적화 필수적이며, 설정 중 일부는 현미경 시스템을 하나의 유형에 따라 변경됩니다 있으며 단백질 하나의 타입은 이미지에 관심이있다, 하나는 상피 세포 모양의 라이브 영상을위한 출발점으로이 프로토콜을 사용해야합니다 . 함께, 프로토콜 단계 (explant 절연, 이미징 및 시각화 휴대폰과 하위 세포 구성 요소의, 그리고 부량 방법론) 상피 morphogenesis 연구를 포괄적인 절차를 제공합니다. 기억에 중요한 측면 <ol><li> 배아에 마이크로 사출을위한 고품질의 mRNA를 준비하는 것이 중요합니다. mRNA 튜브가 저하되지 않도록 얼음에 저장됩니다. 일단 테스트, 튜브가 -80에 저장된 ° C를 작은 aliquots 여러 동결 - 해동...

라이브 셀 이미징 및 배아 상피 세포의 정량 분석 xenopus laevis</em

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

배아 상피 세포가 여러 세포 조직은 이러한 세포 표면적과 셀 높이의 변화로 자신의 형상의 변화를 받아야 어디 morphogenesis을 연구하는 이상적인 모델 역할을하고, 세포가 유사 분열을 받아야하고 마이 그 레이션하는 곳. 또한 상피 세포는 인접한 조직에 morphogenetic 움직임을 통제할 수<sup&gt; 1</sup&gt;. 상피 세포와 조직을 연구하는 전통적인 방법은 화학 고정 및 세포 형태이나 관심의 특정 단백질의 지방화를 결정하는 histological 방법을 포함하고 있습니다. 이러한 방식은 유용하고 세포 형태와 조직 구조의 &quot;스냅샷&quot;을 제공하기 위해 계속하지만, 많은 여러 가지 단백질이 이동하거나 특정 위치로 집중하는 방법 세포가 특정 모양을 습득하고, 어떤 경로로 세포들이 최종 향해 수행하는 방법에 대한 이해에 남아 차별 운명. 고해상도 라이브 영상 전통적인 방법을 보완하고 또한 다세포 상피 시트의 형성, 유지 보수 및 morphogenesis 관련 동적 세포 프로세스에 더 직접적인 조사가 있습니다. 여기에서 동물 캡 조직의 고립에서 실험 방법을 보여줍니다<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; 함께 상피 morphogenesis의 분자 및 세포 연구를 확대 할 수 상피 세포와 간단한 측정 방법의 공촛점 이미징에 배아.

Xenopus 배아 상피 조직은 상피 morphogenesis 동안 극성 개발 및 형태의 변화와 같은 세포 행위를 연구하는 이상적인 모델 시스템입니다. 고정 샘플 전통 조직학 점점 라이브 셀 이미징 공촛점에 의해 보완되고있다. 여기 개구리 조직을 분리 및 라이브 세포 공촛점 현미경을 사용하여 라이브 상피 세포 및 cytoskeleton을 시각화하는 방법을 보여줍니다.

라이브 셀 이미징 및 배아 상피 세포의 정량 분석 Xenopus laevis</em

배아 상피 세포는 다세포 조직이 기하학적 구조의 변화를 겪는 형태 발생 과정을 연구하는 데 이상적인 모델로 활용되며, 구체적으로는 ...와 같은 변화가 일어납니다.

본 절차의 전반적인 목표는 배아 상피 세포의 형태를 분석하기 위한 라이브 이미징 및 단순 정량화 방법을 시연하는 것입니다. 이를 위해 먼저 모든 도구와 장치를 준비합니다. 절차의 두 번째 단계는 개구리 배아에서 X explant를 적출하여 장기 배양을 위한 챔버에 보관하는 것입니다.절차의 세 번째 단계는 상피 세포의 고해상도 이미지를 실시간으로 수집하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 Image J를 사용하여 상피 세포의 형태학적 세부 사항을 정량화하는 것입니다. 최종적으로 고해상도 공초점 현미경을 통해 추적된 세포 영역과 막 강도를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 안녕하세요, 피츠버그 대학교 생명공학과 데이비슨 연구실의 Sagar Joshi입니다.오늘은 Xenos lavia 배아 상피 세포의 라이브 셀 이미징 및 정량 분석 절차를 보여드리겠습니다. 이 절차는 세포 세포골격의 실시간 변화를 연구하는 데 사용됩니다. 그럼 시작하겠습니다.동물 캡(animal cap) 배양을 위한 챔버를 준비하려면, 실리콘 그리스를 사용하여 맞춤형 아크릴 챔버 또는 작은 나일론 와셔를 45 by 50 millimeter 크기의 커버 글라스에 밀봉합니다. 챔버에 1/3 XMBS에 희석된 1% BSA 1 mL를 넣습니다. 작은 커버슬립 파편을 동일한 용액으로 코팅한 후, 실온에서 2~4시간 또는 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.X 설명자가 유리에 부착되는 것을 줄이기 위해, 챔버를 DFA 배지로 헹구고 채웁니다. X를 옮기기 직전에 커버슬립 조각들을 동일한 방식으로 헹굽니다. 그런 다음, 1~4 세포기에 원하는 mRNA를 미세 주입하여 원하는 단계까지 성장시킨 DFA 배양 배아들이 담긴 접시에 이들을 침전시킵니다(1/3 XMBS 포함). 해부용 실체 현미경 하에서 경사형 입구가 있는 전송 피펫을 사용하여 배아를 DFA가 담긴 접시로 옮깁니다.포셉을 사용하여 배아에서 동물극 외배엽(animal CapEx) 조직을 절제하십시오. 헤어 루프를 사용하여 배아를 한 위치에 고정하십시오. 헤어 나이프로 동물극에 작은 절개창을 만듭니다.반복적으로 부드럽게 튕기듯 절개하여 절개 부위를 넓히고 캡 외배엽(cap ectoderm)을 제거합니다. 같은 방식으로 3~4개의 설명물(explan)을 절제합니다. 그리고 전이 피펫을 사용하여 준비된 배양 챔버로 옮깁니다.헤어 루프를 사용하여 각 X 설명편의 상피 세포층이 챔버 바닥을 향하도록 배치하십시오. 핀셋을 사용하여 커버슬립 조각의 중앙을 잡으십시오.끝부분을 실리콘 그리스에 담급니다. 각 X explan 위에 조각을 하나씩 배치합니다. 소량의 실리콘 그리스를 톡톡 찍어 각 조각을 가볍게 고정합니다.X 설명판을 과도한 힘으로 완전히 으깨지 않도록 주의하십시오. 챔버를 DFA로 채우고 챔버의 상단 가장자리에 실리콘 그리스를 도포하십시오. 그런 다음 24 x 40 millimeter 커버슬립으로 상단을 밀봉하십시오.기포를 줄이기 위해 챔버 내 DFA의 높이를 조절하고, 넘친 액체는 티슈로 닦아냅니다. 이제 X 식물을 밀폐된 챔버 내에서 실온으로 하루 동안 장기 배양할 수 있습니다. 공초점 현미경의 20x 대립렌즈를 제자리에 맞춥니다. X 설명체가 들어 있는 챔버를 현미경 스테이지 위에 놓고, 명시야 하에서 챔버가 제자리에 고정되도록 챔버 위에 작은 균형 추를 올립니다.초점을 조절하고 코스 포지셔닝(course positioning)을 사용하여 표면 세포의 정단부를 시각화합니다. 형광 모드로 전환하고 더 높은 배율의 대물렌즈를 사용하십시오. explan 상피의 단일 이미지 또는 타임랩스 영상을 수집하려면, 최적의 이미지를 얻을 수 있도록 획득 설정을 조정하십시오.튜닝 및 이미징에 관한 팁은 이 프로토콜의 서면 부분을 참조하십시오. 레이저 출력을 가능한 한 낮게 유지하십시오. x explan 상피의 이미지 또는 타임랩스 영상을 캡처하십시오.데이터 수집에 관한 제안은 프로토콜의 서술 부분을 참조하십시오. 공초점 이미지 파일은 다양한 방법으로 데이터를 추출할 수 있습니다. 다음은 bio formats 플러그인이 설치된 Image J 분석 소프트웨어를 사용하여 데이터 파일을 분석하는 두 가지 예시입니다.상피 세포의 세포 면적을 측정하려면, 분석(analyze) 메뉴를 아래로 내려 측정 항목 설정(set measurements)을 클릭하십시오. 툴바에서 선택 도구(selection tool)를 선택하고 분석(analyze) 메뉴에서 도구(tools)를 선택한 다음 ROI 매니저(ROI manager)를 통해 세포의 외곽선을 그리십시오. 관심 영역 매니저(regions of interest manager)를 열려면 Control+T를 누르십시오.ROI 매니저에 외곽선을 추가하려면, 이미지에서 원하는 만큼의 외곽선을 선택하여 추가하십시오. 그런 다음 저장(save)을 클릭하여 ROI 세트를 ROI 매니저에 저장하십시오. 측정(measure)을 클릭하십시오.이제 결과 창에 각 ROI의 측정 면적이 표시됩니다. 세포막의 강도를 측정하려면 ImageJ 툴바에서 직선 도구를 선택하십시오. 막을 가로질러 수직선을 그리십시오.이전 예제와 같이 CTRL T를 누릅니다. 선택 영역을 ROI 매니저에 추가하려면 분석(Analyze) 메뉴를 내려 선을 따라 상대 강도 플롯을 생성하는 프로파일 플롯(Plot Profile)을 클릭하십시오. 그래프를 이미지로 저장하려면 새로 나타난 플롯 창에서 저장(Save)을 클릭하십시오.파일 메뉴의 리스트를 내려 '다른 이름으로 저장'을 선택하십시오. 지금까지 적출된 동물의 CapEx 설명편에서 배아 상피 세포를 실시간 이미징하고 정량화하는 방법을 보여드렸습니다. 이 절차를 수행할 때 DFA에 항생제와 항진균제를 추가하는 것을 잊지 않는 것이 중요합니다. 박테리아 및 진균의 증식을 억제하기 위해 설명편을 커버슬립으로 누를 때 각별히 주의하십시오. 필요 이상의 압력을 가하면 설명편이 으깨질 수 있기 때문입니다.최상의 품질의 이미지 데이터를 얻기 위해 공초점 현미경의 설정을 최적화하는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오. 이것으로 모든 설명을 마치겠습니다. 시청해 주셔서 감사합니다. 여러분의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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연구

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생물학

좋은 팁을 사용하면 우리가 닭 somites이나 신경 튜브의 하위 도메인에 플라스미드 DNA를 주입 micropipettes. 플라스미드의 농도는 단일 transfected 세포를 생성하기 위해 조정됩니다. 우리는 다음 세포가 clonal 인구로 발전 수 있습니다.

칙 태아의 단일 세포 Transfection

실시간 이미징 배아 조직은 오랜 기간 동안 도전합니다. 여기에서 우리는 높은 공간과 시간적 해상도를 가진 오랜 기간 동안 여자가 척수의 세포와 하위 세포 변화를 감시하기위한 분석을 제시. 이 기술은 신경계와 개발 배아의 다른 지역에 맞게 조정 할 수 있습니다.

개발 Neuroepithelium의 세포 문제의 고해상도 라이브 영상

Xenopus laevis는 세포의 운명 사양 및 기본 세포 배양의 개별 망막 세포의 생리 기능을 연구하기위한 이상적인 모델 시스템을 제공합니다. 여기 망막 조직을 해부하고 칼슘 활동 이미징 및 현장 하이브리드 화에 의해 분석 기본 셀 문화를 생성하는 기법을 제시한다.

의 해부, 문화, 및 분석<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; 배아 망막 조직

여기에서 우리는 필요한 도구를...

생체 마우스 Neuroepithelium에서 단일 세포 분열의 라이브 영상

원고는 여기 Xenopus의에서 찬란 태그 리간드의 분비 및 확산을 분석하는 방법의 간단한 세트를 제공합니다. 이는 리간드 분포를 수정하는 다른 단백질의 능력을 시험하고 morphogen 기울기 조절 메커니즘에 대한 통찰력을 제공 할 수 있도록 실험을위한 컨텍스트를 제공한다.

공 촛점 분석을 사용하여<em&gt; 아프리카 발톱 개구리 laevis의</em&gt;의 Wnt 및 쉬 Morphogen 그라디언트의 변조기를 조사하기 위해

이 프로토콜은 vasculature를 시각화하고 Xenopus tropicalis 의 복잡성을 정량화하기위한 형광 기반의 방법을 보여 줍니다 . 혈관은 생체 내에서 심혈관 질환 발달을 연구하기 위해 유전 적 및 / 또는 약리학 적 조작 후 배아의 박동 심장에 형광 염료를 주입 한 후 수분 내에 영상화 될 수있다.

의 배아 혈관 신생에 대한 시각화 및 정량 분석<em&gt; Xenopus tropicalis</em

우리는 형광 칼슘 화상 진찰을 계면 혼성화에서 결합하는 2개의 부분 프로토콜을 제시합니다, 실험자가 단하나 세포 수준에 유전자 발현 단면도와 칼슘 활동의 패턴을 상호 연관시키는 것을 허용하.

제노푸스 라에비스의 신경 전구체 특성화를 위한 형광 칼슘 이미징 및 후속 시토 혼성화

우리는 제노푸스 laevis 배아로부터 분리된 깊은 자궁 근세포세포로부터 점도 상피 오르가노이드를 개발하는 간단한 프로토콜을 기술합니다. 다능성 선조는 상피 잔잔 세포 전구체를 재생하고 오르가노이드 표면의 세포 전이의 개시 및 진행을 실시간으로 추적할 수 있도록 합니다.

제노푸스 배아 세포에서 점동 상피 오르가노이드: 생성, 배양 및 고해상도 라이브 이미징

광 시트 기반 형광 현미경 검사는 발달 생물학에서 가장 가치있는 도구입니다. 비교 연구의 주요 문제는 주변 분산입니다. 우리의 프로토콜은 여러 표본의 동시 라이브 이미징을위한 실험 프레임 워크를 설명하고, 따라서, 적극적으로이 문제를 해결.

샘플 챔버 기반 광시트 형광 현미경에서 여러 곤충 배아의 동시 라이브 이미징

우리는 Xenopus laevis 알에서 희석되지 않은 세포질 추출물의 제조 및 라이브 이미징 방법을 설명합니다.

제노푸스 라에비스 동적 세포질 조직을 시각화하기 위한 계란 추출물 준비 및 라이브 이미징 방법

여기에서 우리는 척추동물 Xenopus laevis 배아에서 알려진 조직 운명을 가진 세포 계통의 질량 분석 기반 단백질체 특성 분석을 설명합니다.

발달 중인 (개구리) 배아의 세포 계통 유도 질량 분석법 단백질체학

배우세요 Xenopus laevis 배아 상피 세포의 라이브 이미징 및 정량 분석 방법을 공초점 현미경과 Image J 소프트웨어를 활용하여 세포 형태학적 변화를 실시간으로 관찰하고 분석하는 기술을 습득하세요.

라이브 셀 이미징 및 배아 상피 세포의 정량 분석 Xenopus laevis

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