라이브 셀 이미징 및 배아 상피 세포의 정량 분석 Xenopus laevis

본 실험 절차의 전체적인 목표는 배아 상피 세포의 형태를 분석하기 위한 실시간 이미징 및 간단한 정량화 방법을 시연하는 것입니다. 이를 위해 먼저 모든 도구와 장비를 준비합니다. 절차의 두 번째 단계는 개구리 배아에서 X explan을 절제하여 장기 배양을 위한 챔버에 보관하는 것입니다.

절차의 세 번째 단계는 상피 세포의 고해상도 이미지를 실시간으로 수집하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 Image J를 사용하여 상피 세포의 형태학적 세부 사항을 정량화하는 것입니다. 최종적으로 고해상도 공초점 현미경을 통해 추적된 세포 영역과 막 강도를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 피츠버그 대학교 생명공학과 Davidson 실험실의 Sagar Joshi입니다.

오늘은 Xenos lavia 배아 상피 세포의 라이브 셀 이미징 및 정량 분석 절차를 보여드리겠습니다. 저희는 실시간 세포 세포골격 변화를 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 그럼 시작하겠습니다.

동물 캡(animal cap) 배양을 위한 챔버를 준비하려면, 실리콘 그리스를 사용하여 맞춤형 아크릴 챔버 또는 작은 나일론 와셔를 45 by 50 mm 크기의 커버 글라스에 밀봉하십시오. 1/3 XMBS 내 1% BSA 1 mL를 챔버에 넣습니다. 작은 커버슬립 파편을 동일한 용액으로 코팅하고 실온에서 2~4시간 또는 4 °C에서 하룻밤 동안 배양하십시오.

X 설명편이 유리에 부착되는 것을 줄이려면, 챔버를 DFA 배지로 헹구고 채웁니다. Xs를 옮기기 직전에 커버슬립 조각들을 같은 방식으로 헹굽니다. 그다음, 1~4세포 단계에서 원하는 mRNA를 미세주입하여 원하는 단계까지 1/3 XMBS에서 배양한 DFA 배양 배아들이 담긴 접시에 이를 담급니다. 실체 현미경 하에서 경사형 개구부가 있는 전송 피펫을 사용하여 배아를 DFA 접시로 옮깁니다.

포셉을 사용하여 배아를 고정하고 동물극 캡(CapEx) 부위를 절제합니다. 헤어 루프를 사용하여 배아를 한 위치에 고정하십시오. 헤어 나이프로 동물극에 작은 절개를 넣습니다.

반복적으로 부드럽게 튕기듯 절개하여 절개 부위를 확장하고 캡 외배엽(cap ectoderm)을 제거합니다. 동일한 방식으로 3~4개의 외배엽 조직(explan)을 절제합니다. 그 후 전이 피펫(transfer pipette)을 사용하여 준비된 배양 챔버로 옮깁니다.

헤어 루프를 사용하여 각 X 설명서의 상피 세포가 챔버 바닥을 향하도록 배치합니다. 핀셋을 사용하여 커버슬립 조각의 중앙을 잡습니다.

끝부분을 실리콘 그리스에 담급니다. 각 X explan 위에 조각을 하나씩 배치합니다. 소량의 실리콘 그리스를 묻혀 각 조각을 가볍게 고정합니다.

X explan이 과도한 힘으로 완전히 으깨지지 않도록 주의하십시오. 챔버를 DFA로 채우고 챔버의 상단 가장자리를 실리콘 그리스로 코팅합니다. 그런 다음 24 x 40 millimeter 커버슬립으로 상단을 밀봉합니다.

기포를 줄이기 위해 챔버 내 DFA의 높이를 조절하고, 흘러넘친 액체는 티슈로 닦아냅니다. 이제 X 식물을 밀봉된 챔버 내에서 실온으로 하루 동안 장기 배양할 수 있으며, 공초점 현미경의 20 x 대물렌즈를 제자리에 배치합니다. X 설명편이 담긴 챔버를 현미경 스테이지 위에 올리고, 명시야 상태에서 챔버가 위치를 유지할 수 있도록 작은 균형추를 올립니다.

초점을 조절하고 coarse positioning을 사용하여 표면 세포의 apical end를 시각화합니다. 형광 모드로 전환하고 더 높은 배율의 대물렌즈를 사용하십시오. explan 상피의 단일 이미지 또는 타임랩스 영상을 수집하려면, 최적의 이미지를 얻을 수 있도록 획득 설정을 조정하십시오.

튜닝 및 이미징에 관한 팁은 본 프로토콜의 서술 부분을 참조하십시오. 레이저 출력은 가능한 한 낮게 유지하십시오. x explan 상피의 이미지 또는 타임랩스 영상을 캡처하십시오.

데이터 수집에 관한 제안은 프로토콜의 서면 부분을 참조하십시오. 공초점 이미지 파일은 다양한 방법으로 데이터를 추출할 수 있습니다. 다음은 bio formats 플러그인이 설치된 Image J 분석 소프트웨어를 사용하여 데이터 파일을 분석하는 두 가지 예시입니다.

상피 세포의 세포 면적을 측정하려면, 분석(analyze) 메뉴를 내리고 측정 설정(set measurements)을 클릭하십시오. 툴바에서 선택 도구(selection tool)를 선택하여 세포의 외곽선을 그은 뒤, 분석 메뉴에서 도구(tools)를 선택하고 ROI 관리자(ROI manager)를 선택하십시오. 관심 영역(regions of interest) 관리자를 열려면 Control T를 누르십시오.

ROI 매니저에 외곽선을 추가하려면, 이미지에서 원하는 만큼의 외곽선을 선택하여 추가하십시오. 그다음 'save'를 클릭하여 ROI 세트를 ROI 매니저에 저장하십시오. 'measure'를 클릭하십시오.

이제 결과 창에 각 ROI의 측정 면적이 표시됩니다. 세포막의 강도를 측정하려면 ImageJ 툴바에서 직선 도구를 선택하십시오. 막을 가로지르는 수직선을 그리십시오.

이전 예제와 같이 CTRL T를 누릅니다. 선택 영역을 ROI 매니저에 추가하려면, 분석(analyze) 메뉴를 내려 선을 따라 상대적 강도를 나타내는 그래프를 생성하기 위해 프로파일 플롯(plot profile)을 클릭하십시오. 그래프를 이미지로 저장하려면, 새로 나타난 플롯 창에서 저장(save)을 클릭하십시오.

파일 리스트 메뉴를 내려 '다른 이름으로 저장'을 선택하십시오. 지금까지 절제된 동물 CapEx 외식편의 배아 상피 세포를 실시간 이미징하고 정량화하는 방법을 보여드렸습니다. 이 절차를 수행할 때, DFA에 항생제와 항진균제를 추가하는 것을 잊지 않는 것이 중요합니다. 박테리아 및 곰팡이의 증식을 억제하기 위해, 커버슬립으로 외식편을 누를 때 각별히 주의하십시오. 필요 이상의 압력을 가하면 외식편이 으깨질 수 있기 때문입니다.

최상의 화질의 이미지 데이터를 얻기 위해 공초점 현미경의 설정을 최적화하는 것이 중요하다는 점을 기억하시기 바랍니다. 이것으로 모든 내용을 마칩니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.