Name: 쥐 뇌 미세 주입은 분자 기판 동기를 행동을 연구하기 위해 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: 배우세요 쥐 뇌 미세 주입 기법으로 행동과 정신 질환의 분자 기전을 연구하는 방법을. 정확한 캐뉼라 제작과 시약 전달로 신경과학 연구를 발전시킵니다.

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</ol>

저자 중 누구도 경쟁하거나 상충되는 이해관계를 가지고 있지 않습니다.

여기에 제시된 방법은 마이크로 인젝션 캐뉼라 및 동기 동작의 분자 기판을 밝히는데 도움이 될 microinjectors를 제조하는 효율적인 수단이다. 이 방법은 몇 가지 장점을 제공한다. 첫째, 자신의 임플란트와 microinjectors을 제조하여, 새로운 실험 매개 변수를 신속하게 최적화 할 수있다, 즉, 하나가 도착하기를 맞춤 제작 한 부품을 기다릴 필요가 없습니다. 둘째, 정맥의 작은 직경으로 인해, 더 캐뉼라를 동시에 주입 할 수있다. 이것은 생존을 향상시킬 수 있습니다 필요한 수술 시간을 단축하고, 또한 동물 당 여러 개의 임플란트를 할 수 있습니다. 고정비 패러다임 빠르게 단순히 원하는 보강 일정 포함 된 이벤트 전이 파라미터리스트를 적용하여 프로그레시브 비율 패러다임으로 전환 될 수 있기 때문에, 셋째, 조건화 챔버를 제어하는​​데 사용되는 소프트웨어를 용이 프로그레시브 비 스케줄을 수용한다. 되려고광범위하게 유용한, 일반적인 미세 주입 절차는 현재 거의 모든 시약의 미세 주입을위한 광범위하게 적용해야한다고 제시했다. 따라서, 우리는이 기술은 약간의 수정과 향후 유사한 높은 유틸리티로 계속 될 것으로 예상하고있다. 단지 약간의 변수를 변경함으로써, 이러한 접근 방법은 시약의 다양한 개수에 적용될 수있다. 가장 일반적으로 조작 할 것이다 매개 변수는 마이크로 인젝터는 정맥 돌출 길이, 사출의 볼륨 및 주입 속도를 포함한다. 예를 들어, 하나의 주사기는 일반적으로 만성 임플란트 주위 아교 흉터 형성을 방지하기 위해 캐뉼라 팁에서 더 돌출 할 수있다. 또한, 하나의 더 큰 부피를 주입해도된다. 그 사용에 비하여 (10 분의 추가 시간 확산 자주 7 - - 10 분 및 3) 선조체 바이러스 microinjections 들어, 1 μL의 부피는 통상적으로 사용되며,이 볼륨은 전형적으로 장기간에 걸쳐 주입하여약리 시약 D (일반적으로 0.3 - 3 분 플러스 1 - - 2 이상 0.5 μL 3 분의 추가 확산 시간). 사용자는 문헌을 참조 및 / 또는 경험적으로 자신의 요구에 가장 적합한 매개 변수를 결정해야한다. 주사 전에 마이크로 인젝터의 분사 패턴의 1) 캐 뉼러의 길이, 2) 마이크로 인젝터 길이, 3)의 품질, 및 4) 시스템 무결성에 관계없이,이 절차의 성공은 4 변수 결정적으로 의존한다. 미세 주입 위치가 마이크로 인젝터는 정맥에서 돌출 깊이에 의존하기 때문에 모두 캐 뉼러 (단계 1.2.8) 및 마이크로 인젝터 길이 (포스트 굽힘, 단계 2.2.1)를 모두 정확하게 모든 주제 사이에 알려진 균일 한 것을,이 필수적이다 . 이것은 쉽게 용이라도 그 최종 재 측정에 필요한 길이 아니다 구현 거부에 의해 제어 될 수있다. 이 가이드 뉼러 바로 아래에 발생하는 경우 또한, 주입 위치 만 예측 될 수있다. 따라서, 어떤 마이크로 인젝터를 미상 그테스트에 긴, 미세 스트림을 뿌리지 S (단계 2.4.6)을 거부해야합니다. 품질 주입은 또한 종래 주입 시스템의 무결성에 관한 것이다. 여러 관광 명소 랩 닦아에서 관찰 된 인젝터에서 모든 물을 분배 후 (전 시약과 충전에) 경우, 누수가 (단계 2.4.8에 대한 참고) 해결 될 필요가있다. PE20 튜브 내의 물에서 약물을 분리 버블 (단계 2.4.9)가없는 한, 하나의 기포 (마이크로 인젝터 시약을 충전 한 후) 인 경우, 또한, 후 분사가 부분적으로 막혀있다. 이 방해하거나 예방 주사를 전환 할 수 중 하나. 이 너무 쉽게 해결 될 수있다 (참고 단계 2.4.8에서). 하나는 세 가지 대안이있는 동물이 고정대에있는 동안 microinject하고자합니다. 첫째, 하나는 정위 매니퓰레이터 의해 단단히 유지되고 또한 PE20 튜브에 연결을 허용하도록 충분히 연장 될 수 있도록 마이크로 인젝터 칼라의 길이를 증가시킬 수있다. 둘째,에전자는 일시적으로 정맥을 이식하고 여기에 제시된 표준 마이크로 인젝터를 사용할 수 있습니다. 셋째, 하나 그린과 광택 유리 피펫 사용할 수 있습니다. (16, 17) 여기에 제시된 방법의 중요한 한계는 최상의 절차에 익숙 잘 처리 래트에서 수행된다는 점이다. 동일한 조사자 2 개월 이상 매일 랫트를 취급하기 때문에 결과 절에 설명 된 데이터에 사용되는 래트 특별한 처리 절차가 필요 없다. 이것은 최소 2 주 동안 외과 임플란트의 매일 관찰 및 조작을 포함했다. 그러나, 래트 급격히 응력에 의해 영향을받을 수 프리 펄스 억제 분석 이전에 사용되는 다양한 기술에 의해 순응된다. 이러한 특수 습관화 기술들이 앞서 상세히 좋게되어있다. (43)이 절차 이외에, 그것은 쥐 단축 microinjectors가 뒤 사용되는 마이크로 인젝션 절차에 순응하는 것이 바람직하다반지 &#39;가짜&#39;주사. 이러한 허위 주사 동안, 마이크로 인젝터가 조직 손상을 제한하기 위하여 조직으로 돌출하지 않는 것이 중요하다. 즉, 마이크로 인젝터가 더 이상 14mm 이상 절곡되어서는 안된다. 따라서, 본 기술의 구현에 필요한 최적의 철저한 습관화는 제한으로 간주 될 수있다. 여러 행동 패러다임 동기를 측정하기 위해 존재하지만, 일반적으로는 비 진보적 피사체 보강제를 수득 발휘 기꺼이 노력을 정량화하는데 사용된다. 누진 비율 패러다임은 종종 최종 완료된 비율 레버 프레스의 최대 수로서 정의되는 브레이크 포인트로 알려진 측정 값을 만들어 낸다.. 즉, 최대 그 보강재를 생성 응답 21 프로그레시브 비가 크기 보강제 민감하다. 예를 들어, 높은 코카인 (또는 수 크로스) 투여 량은 더 높은 브레이크 코카인 및 하부 (또는 수 크로스) 복용 breakp 낮은 수율을 생산OINT. (21, 22) 따라서, 브레이크 포인트는 동기 부여 및 / 또는 보강 효과에 대한 일상적으로 사용하는 프록시입니다. 21,23-26 중단 점의 의도는 동물이 응답하지 않을 때 결정하기 때문에, 진보적 인 비율 패러다임의 중요한 매개 변수입니다 세션 길이. 세션 길이가 유한 한 브레이크 포인트는 거짓 값에 캡을 넣을 수 있으며, 이는 비정상적자가 투여 또는 증가 포스트 보강 일시의 속도를 감소 사전 치료에 의해 악화 될 수있다. .이 혼란은 접근 방법의 수에 의해 극복 될 수있다. 예를 들어, 세션 동물은 평균 간 투여 간격의 일부 복수로 응답을 원천 징수 한 경우 종료 (44)이 방법의 더 일반적으로 적용 변형이 응답 한 번 세션을 종료하는 것입니다 주제에 걸쳐 일정하게 유지된다 일부 경험적으로 결정된 값으로 원천 징수하고. 우리는 단계 4.4.9.11에이 방법을 적용 할 수있는 방법을 제공하고 있습니다.

설치류와 인간은 행동적으로 관련된 자극1-3에 매우 유사한 방식으로 반응합니다. 이것은 설치류가 행동과 복잡한 정신 질환의 분자 기질을 설명하기에 적절한 주제임을 시사한다4. 동기 부여와 같은 복잡한 행동 과정의 분자 기질을 이해하려면 종종 뇌 미세 주입이 필요합니다. 뇌 미세주입 기술과 1차 동기 부여 분석이 모두 여기에 제시됩니다. 쥐가 피험자로 사용되지만 이러한 절차는 잘 다루어진 쥐에 쉽게 적용할 수 있습니다. 본 명세서에는 필요한 캐뉼러, 폐쇄기(dummy cannulae 또는 stylets) 및 마이크로인젝터의 제조를 위한 절차가 포함되어 있습니다. 제시된 방법은 조립식 도구보다 훨씬 더 유연하고 비용 효율적입니다. 이러한 유연성은 조건을 최적화할 때 유용하다는 것이 입증되었습니다. 중요한 것은 미세주입 절차를 사용하여 수많은 가설을 테스트할 수 있기 때문입니다. 여기에 제시된 기술은 광범위하게 적용할 수 있어야 합니다. 예를 들어, 수용체 리간드는 신경 화학을 이해하기 위해 미세 주입 될 수 있습니다3,5,6; 세포 투과성 펩타이드 및 소분자는 세포 내 신호 전달 경로를 이해하기 위해 미세 주입될 수 있습니다7-10; 독소, 이온 채널 차단제 또는 길항제 칵테일을 미세 주입하여 회로1,11,12를 이해할 수 있습니다.
여기에 제시된 일반 프로토콜은 사용자가 특정 요구에 맞게 쉽게 조정할 수 있지만, 가벼운 손 제지 하에서만 깨어 있는 설치류에서 미세 주입이 발생하기 때문에 이 절차는 특히 행동 분석에 적합합니다. 마취나 특별한 구속이 필요하지 않습니다. 이것은 뇌 자체에 통증 감각이 없기 때문에 가능하다. 그러나 마취를 사용하지 않는 경우 이전에 입체적으로 이식된 캐뉼러를 통해 미세 주입이 이루어져야 합니다. 이는 통각(유해) 수용기(유해수용기)가 두피에 존재하기 때문이며, 뇌를 둘러싼 막인 수막(meninges)13과 두개골을 덮고 있는 막인 골막(periosteum)14에 존재하기 때문입니다. 마취 하에서 미세 주입이 때때로 바람직하다는 점에 유의해야 합니다. 한 가지 예는 바이러스를 주입하는 경우이며, 스테인리스 스틸 바늘15 또는 유리 피펫을 통해 바이러스를 직접 주입할 수 있는데, 이는 조직 손상을 줄이고 형질도입 효율을 향상시킬 수 있기 때문입니다. 16,17 아래에 설명된 마이크로인젝터는 이러한 목적으로 수정될 수 있으며, 이를 수행하는 방법에 대한 제안은 토론에서 찾을 수 있습니다. 다른 JoVE 논문에서 정위 유축성 뇌 캐뉼라 이식을 입증했기 때문에18-20 이러한 절차는 여기에서 다루지 않습니다.
우리는 동기를 정량화하는 분석법과 함께 이러한 미세주입 절차를 제시합니다. 동기 부여 된 행동에 대한 여러 설치류 모델이 현재 활주로 상자 및 장벽 확장과 같이 사용 중입니다. 여기에서는 조작적 반응이 강화자에 의해 유지되는 동기를 정량화하기 위해 강화의 조작적 점진적 비율 일정을 사용하는 방법을 설명합니다. 누진적 비율에 대한 반응은 강화자 크기에 반응합니다. 21,22 따라서, 이 분석법은 동기 부여 및/또는 효능 강화를 위한 대용물로 일상적으로 사용됩니다. 21,23-30 몇 가지 훌륭한 리뷰에서 이 주제를 자세히 다루었기 때문에,21,24 우리는 주로 실용적인 관심사에 초점을 맞출 것입니다.

<table><tbody><tr><td>Cannula 튜빙</td><td>Amazon 공급/ 소형 부품</td><td>HTXX-26T-60</td><td>26 G, 하이포튜브 S/S 316-TW 26GA</td></tr><tr><td>Obturator</td><td>아마존 공급/ 소형 부품</td><td>GWXX-0080-30-05</td><td>33 게이지, 와이어 S/S 316LVM 0.008 IN</td></tr><tr><td>마이크로인젝터 와이어</td><td>MicroGroup</td><td>33RW 304</td><td>33 게이지</td></tr><tr><td>Super Glue</td><td>Loctite</td><td>3924AC</td><td>액체, 비젤, 오토클레이브 가능</td></tr><tr><td>마이크로 인젝터 플라스틱 튜빙</td><td>Becton Dickson 427406</td><td></td><td>PE20</td></tr><tr><td>중량 지혈</td><td>세계 정밀 기기</td><td>501241-G</td><td></td></tr><tr><td>룰러</td><td>피셔</td><td>09-016</td><td>150 mm</td></tr> <tr><td># 7 집게</td><td>스톨</td><td>52100-77</td><td>Dumont, Dumostar</td></tr><tr><td>로터리 툴</td><td>Dremmel</td><td>285</td><td>2 단</td></tr><tr><td>절단 디스크</td><td>McMaster Carr</td><td>3602</td><td>15/16" x 0.025"</td></tr><tr><td>마이크로인젝션 펌프</td><td>하버드 장치</td><td>PhD 2000</td><td></td></tr><tr><td>1 ul 유리 주사기</td><td>Hamilton</td><td>7001KH</td><td>바늘 스타일: 25s/2.75"/3</td></tr><tr><td>면 팁 애플리케이터</td><td>Fisher</td><td>23-400-101</td><td></td></tr><tr><td>랩 와이프</td><td>Kimwipes</td><td>34133</td><td></td></tr><tr><td>운영 소프트웨어</td><td>Coulbourn</td><td>그래픽: State</td><td></td></tr><tr><td>Operant Chambers,</td><td>Coulborun</td><td>Habitest</td><td></td></tr></tbody></table>

쥐 뇌 미세 주입은 분자 기판 동기를 행동을 연구하기 위해

Rodent Brain Microinjection to Study Molecular Substrates of Motivated Behavior

뇌 미세주입은 동기 부여와 같은 복잡한 행동의 분자 기질을 설명하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이러한 목적을 위해 설치류는 적절한 모델이 될 수 있는데, 부분적으로는 행동적으로 관련된 자극에 대한 반응과 자극-행동 결과를 파싱하는 회로가 인간과 설치류 간에 놀라울 정도로 유사하기 때문입니다. 복잡한 거동의 분자 기질을 연구할 때 특정 시스템을 수정, 증강 또는 침묵시키는 시약의 미세 주입은 매우 유용한 기술입니다. 그러나 결과 해석을 돕기 위해 미세주입 부위를 정확하게 타겟팅하는 것이 중요합니다. 최소한의 비용으로 정확한 미세주입과 무제한의 맞춤화가 가능한 수술 도구 및 미세주사 바늘의 제조 방법을 제시합니다. 중요한 것은 이 기술이 필요한 수술 절차를 다루는 다른 JoVE 기사와 함께 수행될 경우 깨어 있는 설치류에서 성공적으로 완료될 수 있다는 것입니다. 또한 동기를 측정하는 데 적합한 많은 행동 패러다임이 있습니다. 점진적 비율(progressive ratio)은 (종종 기하급수적으로) 증가하는 작업 요구 사항에도 불구하고 반응을 유지하기 위해 강화제의 효능을 정량화하는 일반적으로 사용되는 방법입니다. 이 분석은 강화 크기 및 약리학적 조작에 민감하여 효능 및/또는 동기를 강화할 수 있습니다. 또한 점진적 비율 강화 일정을 수용하기 위해 조작 소프트웨어를 프로그래밍하는 간단한 접근 방식을 제시합니다.

여기에서 우리는 상기 절차를 얻을 수있다 결과의 예를 도시한다. 표시된 첫 번째는 바이러스 벡터 (그림 3)에 의해 형질 전환 된 전형적인 지역이다. 일반적으로 3 ~ 1mm의 형질 볼륨 선조체 조직을 얻을 수있다. 형질 영역의 부피 카발리의 방법을 사용하여 직렬 섹션에 걸쳐 정량화 될 수있다 (32)이 중요한 것은, 형질 볼륨은 형질되는 조직의 형태와 같은 많은 요인에 의존한다.; 바이러스 혈청 형; 프로모터; 속도 및 주입 부피; 주입 된 입자의 수​​; 인젝 산도; 및 만니톨과 같은 삼투압 시약, 여부, 사용되었다. 33, 34 일반적으로, 우리는 10 분에 걸쳐 10 ~ 12 입자 / ㎖, 1 μL /면을 microinject 및 obturators 교체 7 분 추가 이전 할 수 있습니다. 또한, pH가 테이트 8. 다음 주위 통상, 우리는 동기가 어느 유전자의 발현에 의해 조작 될 수 있음을 보여준다 (도 4)또는 약리 시약 미세 주입 (그림 5). 그림 4에서 우리는 독점적으로 디자이너 마약 (DREADDs)에 의해 활성화 디자이너 수용체를 표명했다. DREADD 수용체 코딩 영역은 내부 리보솜 항목 사이트 및 mCitrine 카세트으로 이어졌습니다. mCitrine는 형질 감염된 세포의 편리를 육안으로 확인 할 수 있습니다. DREADD는 이종삼 G- 단백질 Gαq에 커플 링시켰다. 성상 세포, 28,35 및 DREADD 자체를 자극 할 수 Gαq 결합 DREADD의 활성화는 클로자핀-N-산화물 (CNO, 3 ㎎ / ㎏, IP)의 전신 투여에 의해 활성화 될 수있다. 14,22,36 쥐에 훈련을받은 레버는 3 레버 프레스 60 연속 일 동안 매일 1 시간 세션 동안 마실 1 기회를 얻었다 에탄올 보강에 대한 반응한다. 다음, 쥐 금욕을 강요하고, 핵 핵심 성상 세포를 중격 의지에 Gαq 결합 DREADDs 표현했다. 삼주의 절제, 자기 ADMI에 의욕 후<html> nister 에탄올 브레이크 포인트에 의해 측정 하였다. 핵 21,27-30 활성화 CNO 전신 투여를 통해, 절제는 차량에 비해 후 에탄올자가 투여를 재개 쥐의 의욕을 감소 코어 성상 중격 의지. 중요한 것은, CNO 대신 DREADD의 녹색 형광 단백질을 발현시켰다 동등 훈련 코호트에 영향을 미치지 않았다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/53018/53018fig3.jpg" /> 마이크로 인젝션 된 바이러스에 의해 형질도 3 대표 복측 선조체 지역.이 이미지는 핵의 영역은 위의 방법에 따라 형질 감염시켰다 아스트로 중격 의지를 나타낸다. 데이터는 저작권 소유자의 허가를 불 등. 13에서 재 인쇄되어 있습니다. 그 세부 사항은 첨부 된 간행물 및 보충 자료에서 발견 될 수있다.&quot;빈&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/53018/53018fig4.jpg" /> 자기 관리] 에탄올에 쥐 그림 4. 동기 부여는 핵 핵심 성상 세포를 중격 의지에. 표현을 통해-바이러스가 표현 할 일주를 허용 한 후 바이러스가 미세 주입하고, 동기는 브레이크 포인트를 통해 측정 한 형질 전환 유전자를 활성화하여 감소 하였다. 유전자는 전용 디자이너 마약 (DREADDs)에 의해 디자이너 수용체 활성화 된 표현. 일원 분산 분석 (F (2,30) = 3.29, P = 0.04)은 Scheffe 사후에 의해 밝혀 다음에 그 클로자핀-N-산화물의 전신 투여에 의한 DREADD의 활성화 (CNO, 3 ㎎ / ㎏, IP ) 크게 대신 DR의) CNO는 녹색 형광 단백질 (GFP를 표현했다 동등하게 교육을받은 집단에 영향을 미치지 아니합니다 차량에 비해 절제 후자가 관리] 에탄올에 쥐의 의욕을 감소EADD. 데이터는 저작권 소유자의 허가를 불 등. 13에서 재 인쇄되어 있습니다. 그 세부 사항은 첨부 된 간행물 및 보충 자료에서 발견 될 수있다. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/53018/53018fig5.jpg" /> 그림 간극 결합 차단제 5. 미세 주입은 절제 후 에탄올을-관리 자체에 쥐의 의욕을 증가 두 간극 결합 차단제는 에탄올 관리 자체에 쥐 (브레이크 포인트를 통해 측정) 동기 부여에 미치는 영향을 평가 하였다 :. 메플로퀸 및 18 α - 글리시 레틴 산 (18-α)를. 두 일원 분산 분석은 핵으로 갭 접합 차단제의 미세 주사가 핵심이 절제 후 에탄올을-관리 자체에 쥐의 의욕을 증가 중격 의지 것으로 나타났다 (F (3,40) = 5.56, P = 0.003). 데이터는 저작권 소유자의 허가를 불 등. 13에서 재 인쇄되어 있습니다. 자세한 사항은이 책에서 찾을 수 있으며첨부 된 보충 자료.

설치류는 행동과 복잡한 정신 장애의 분자 기질을 조사하기에 적합한 모델입니다. 깨어 있는 설치류의 뇌 미세주입은 질병 기질을 밝히는 데 사용할 수 있습니다. 효율적이고 사용자 정의 가능한 뇌 미세주입 방법과 동기 부여를 정량화하는 조작적 패러다임의 실행이 제시됩니다.

Brain microinjection can aid elucidation of the molecular substrates of complex behaviors, such as motivation. For this purpose rodents can serve as ...

이 절차의 전반적인 목표는 캐뉼라와 마이크로 인젝터를 정확하게 제작하고 마이크로인젝션을 적절하게 수행하는 것입니다. 먼저 적절한 길이의 캐뉼라를 제작함으로써 이를 달성합니다. 두 번째 단계는 마이크로 인젝터를 절단하고 조립하는 것입니다.다음으로, 미세 주입기, 튜브 및 펌프를 준비하여 미세 주입을 준비합니다. 마지막 단계는 미세 주입을 완료하고 확산 기간이 지나도록 두는 것입니다. 궁극적으로, 미세 주입은 적절한 취급법을 시연하며 원하는 뇌 영역에 시약을 정확하게 주입하는 데 사용됩니다.마이크로인젝션 과정은 저희 실험실의 학생인 Ryan Poland가 수행할 것입니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 개인들은 어려움을 겪게 되는데, 이는 캐뉼라를 적절하게 배치하고 마이크로인젝션 위치를 정확히 잡기 위해 특별한 주의를 기울여야 하며 모든 단계에서 세심한 주의가 필요하기 때문입니다. 캐뉼라를 준비하려면 먼저 세밀한 펜을 사용하여 테이프 위에 15 millimeter 기준선을 긋습니다.그런 다음 이를 가이드로 삼아 날카로운 유성 마커를 사용하여 튜빙에 15 millimeter 간격의 구획을 순차적으로 표시합니다. 이어서 로터리 툴의 천천히 회전하는 절단 디스크에 캐뉼라 튜빙을 접촉시켜 홈을 냅니다. 표시된 지점에서 캐뉼라를 180도 회전시켜 튜빙의 반대편에도 홈을 냅니다.폐쇄가 발생할 수 있으므로 튜브를 완전히 절단하지 마십시오. 그 후, 튜브를 날카롭게 구부려 15 millimeter 길이의 구간으로 꺾어 분리합니다. 그런 다음 캐뉼라의 양 끝을 엄지와 검지로 잡고 절단된 디스크와 수직이 되도록 유지하십시오.뭉툭한 팁을 만들기 위해 커팅 디스크 표면에 캐뉼라 튜브의 끝부분을 대고 회전시킵니다. 그 후, 모든 버(burr)가 제거되고 캐뉼라 내부가 막히지 않았는지 확인하기 위해 26게이지 베벨 바늘로 캐뉼라의 양 끝을 리밍합니다. 폐쇄기 클램프를 준비하려면 중간 무게의 직선형 지혈겸자를 사용하여 캐뉼라의 약 절반 길이 지점을 고정한 다음, 캐뉼라가 벤치와 수직이 되도록 고정된 지혈겸자를 벤치 위에 놓습니다.그런 다음, 어토르 와이어(ator wire)의 한쪽 끝을 캐뉼라에 넣어 벤치에 닿을 때까지 밀어 넣습니다. 오버튜레이터(obturator)와 벤치가 접촉된 상태를 유지하면서, 손가락으로 집어 와이어를 굽혀 30도 각도를 만듭니다. 그 후, 캐뉼라에서 와이어를 제거하고 소형 대각 커터를 사용하여 굽은 지점에서 2.5 millimeters 떨어진 지점에서 남은 부분을 잘라냅니다.이 절차에서는 마이크로 인젝터 튜브의 한쪽 끝을 잠긴 직선형 지혈집게로 수직으로 잡습니다. 튜브에 장력을 유지하면서 지혈집게를 비틀어 지혈집게 주위에 최소 한 번 촘촘하게 감습니다. 다음으로, 마이크로 인젝터 튜브의 반대쪽 느슨한 끝에서 32 millimeters 지점을 측정하고, 이 지점을 두 번째 지혈집게로 수직으로 잡습니다.튜브가 끊어질 때까지 장력을 유지하면서 앞뒤로 굽힙니다. 그런 다음 마이크로 인젝터 튜브의 양 끝이 직선인지, 내경에 막힌 곳이 없는지 확인합니다. 줄자에 5mm 기준선을 긋고, 네이밍 펜을 사용하여 캐뉼라 튜브에 5mm 간격으로 구획을 순차적으로 표시합니다.다음으로, 튜브에 홈을 만들기 위해 표시된 지점에서 캐뉼라 튜브를 천천히 회전하는 컷오프 디스크에 접촉시킵니다. 그런 다음 마이크로 인젝터 칼라 튜브를 급격히 구부려 5mm 길이의 섹션으로 절단합니다. 각 마이크로 인젝터 튜브의 끝에서 약 2cm 떨어진 지점에 칼라를 하나씩 끼웁니다.마이크로 인젝터 튜브의 한쪽 끝에서 5mm 떨어진 지점에 소량의 순간접착제를 도포합니다. 그다음, 마이크로 인젝션 튜브 끝에서 1mm 거리가 되도록 접착제 도포 부위 위로 칼라를 밀어 넣습니다. 이후 칼라의 양쪽 끝을 접착제로 덮어줍니다.그 다음, 멸균 증류수가 채워진 1 mL 주사기에 26게이지 바늘을 부착합니다. 8 cm 길이의 마이크로 인젝터 플라스틱 튜브를 바늘에 끼우되, 튜브가 뚫리지 않도록 주의하십시오. 그 후 플라스틱 튜브의 반대쪽 끝을 건조된 마이크로 인젝터의 칼라 끝부분에 끼웁니다. 증류수가 채워진 주사기의 플런저를 밀어 통로가 확보되었는지 확인합니다. 이 단계에서, 완성된 마이크로 인젝터의 칼라 반대쪽 끝에서 15 mm 떨어진 지점을 95도로 구부립니다.다음으로, 플라스틱 튜브를 70cm 길이로 자른 후 마이크로 인젝터 칼라 위로 밀어 넣습니다. 마이크로인젝션을 위해 펌프를 준비하려면, 튜브에 마이크로인젝션 바늘의 직경, 원하는 주입 속도 및 목표 주입량을 설정하십시오. 그 다음, 정밀한 양이 자동으로 전달될 수 있도록 펌프 모드를 볼륨(volume)으로 설정합니다.다음으로, 주사기가 주입 용량에 0.2 µL를 추가한 양만큼 채워질 수 있도록 펌프 백스탑(backstop)을 조정합니다. 이제 가스 밀폐형 주사기의 팁을 소형 웨이 보트(whey boat)에 담긴 멸균수에 넣고, 내부 와이어가 고르게 윤활되도록 플런저를 가볍게 위아래로 움직여 줍니다. 펌프의 백스탑까지 플런저를 당겨 미세주입 바늘에 물을 채웁니다.다음 슬라이드입니다. 1 mL 멸균수가 채워진 주사기에 부착된 26게이지 바늘과 마이크로 인젝터에 연결된 PE 20 튜브입니다. 마이크로 인젝터를 통해 멸균수를 분사하여 분사 패턴과 거리를 점검하십시오.그다음 멸균된 마이크로 인젝터를 멸균 구역에 놓습니다. 바늘에서 튜브를 밀어내어 분리하고, 물이 흘러내리지 않도록 튜브를 세운 상태에서 바늘에 의해 손상된 부위 아래쪽의 튜브를 절단합니다. 이어서, 마이크로 인젝터 시린지의 플런저를 약간 앞으로 밀어 바늘 끝에 물방울을 형성시킨 후, 물이 채워진 PE 20 튜브를 바늘에 밀어 넣습니다.그 후, 샘플 로딩을 준비하기 위해 플런저를 완전히 앞으로 밀어 마이크로 인젝터 내에 에탄올 흔적이 남아 있지 않도록 합니다. 깨끗한 실험용 와이프로 마이크로 인젝터 팁에 형성된 물방울을 몇 번 터치하여 설정 상의 누출 여부를 확인하십시오. 그런 다음, 멸균수와 PE 20 튜브, 그리고 주입할 용액 사이에 기포를 만들기 위해 시린지 플런저를 0.2 µL 뒤로 당깁니다.그 후, 마이크로 인젝터를 주입할 시약에 담그고 시린지 플런저를 백스톱까지 천천히 당깁니다. 주입을 위해 동물을 준비하려면, 실험자의 가슴에 쥐의 가슴을 밀착시켜 고정합니다. Betadine에 적신 면봉으로 캐뉼라 주변 부위를 세척합니다.헤드 캡을 Betadine으로 3회 닦아낸 후, 에탄올로 2회 닦아냅니다. 그다음 용액이 채워진 마이크로 인젝터를 캐뉼라에 삽입합니다. 마이크로 인젝션 펌프의 시작 버튼을 누르고 기포의 이동을 관찰합니다.주입이 완료되면 마이크로 인젝터를 캐뉼라에서 제거하고 폐쇄물(obturator)로 교체합니다. 이 그림은 마이크로 주입된 바이러스에 의한 nucleus accumbens 성상세포 영역의 형질전환을 보여주며, 또 다른 그림은 nucleus accumbens에서 과발현된 트랜스젠을 활성화함으로써 쥐의 에탄올 자가 투여 동기가 감소함을 보여줍니다. CNO의 전신 투여를 통한 Core 성상세포 부위의 DREADD 활성화는, DREADD 대신 GFP를 발현하도록 동일하게 훈련된 대조군에서는 아무런 효과가 없었던 것과 비교하여, 금단 증상 이후 쥐의 에탄올 자가 투여 동기를 vehicle CNO 투여군 대비 유의미하게 감소시켰습니다.이 기술을 통해 맞춤형 뇌 미세주입 도구를 제작할 수 있으며, 실험 절차의 유연성을 더욱 높일 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때, 원하는 효과를 얻기 위해서는 정밀한 미세주입 위치 설정이 필수적이라는 점을 기억하는 것이 중요합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Behavior

행동

자유롭게 동물을 이동 고유 뇌 세포 지역에서 신경 전달 물질 수준의 모니터링 신경 전달 물질 방출과 행동 사이의 링크에 통찰력을 제공합니다. 그리고 기초 neurotransmission가 약리 또는 생리적 조작에 의해 변경하는 방법에 대한 정보, 전기 탐지와 결합하여 생체내 microdialysis 우수한 해부 학적 및 화학적 해상도를 제공합니다.

설치류에 살아서 Stereotaxic 외과

출처: Poland, R. et al. 동기 부여된 행동의 분자 기질을 연구하기 위한 설치류 뇌 미세 주사. J. Vis. 경험. (2015년)이 비디오에서는 주사기와 마이크로인젝터 튜브로 구성된 물로 채워진 미세 주입 설정이 정확한 약물 전달을 위해 사용됩니다. 사전 이식된 가이드 캐뉼라가 있는 쥐는 표적 뇌 미세 주사를 받아 조직 손상을 최소화하면서 깨어 있는 동물에게 치료제를 정확하게 투여할 수 있습니다.

깨어 있는 설치류 뇌에 치료제의 미세 주입 기반 전달

이 프로토콜은 마취된 쥐의 표적 뇌 부위에 약물을 정확하게 전달하기 위한 주입체의 조립 및 사용을 개략적으로 설명한 다음 기록된 전기 신호를 통해 신경 세포 활동을 모니터링합니다.

쥐의 뇌에서 전기생리학적 기록을 통한 약물 미세주입

출처: Paolone, G., et al. 설치류 뇌의 미세 주사를 위한 맞춤형 바늘. J. Vis. 경험. (2018).이 비디오는 구멍이 있는 석영 마이크로니들을 사용하여 설치류 뇌 마이크로니들 주사를 보여줍니다. 마이크로니들은 분사 속도를 제어하기 위해 주사기와 마이크로펌프에 부착됩니다. 주사액이 담긴 바늘을 전달 속도를 낮게 설정한 상태에서 뇌에 삽입합니다. 일단 배치되면 배송 속도가 빨라집니다. 잠시 멈춘 후 바늘을 빼냅니다.

석영 마이크로니들을 사용한 설치류 뇌 미세주사

마이크로 RNA는 뇌의 구조와 기능에 중요한 역할을한다. 여기에 우리가 과다 발현은 설계 miRNA의 발현 렌티 바이러스의 정위 주사를 사용하여 해마 miRNA의를 적용하는 방법을 설명합니다. 이 방법은을 평가하는 상대적으로 빠른 방법으로 사용할 수...

의 정위 주입 MicroRNA의 발현 마우스 해마 CA1 영역으로 렌티 바이러스 및 행동 결과의 평가

이 문서에서는 마우스의 뇌에 바이러스 벡터를 microinject하고 수집, 멸종 위기 및 회복 단계를 포함하는 에어컨 장소 환경 패러다임에서 테스트하는 방법에 대해 설명합니다.

크레 재조합이 코카인 컨디셔닝 장소 환경에있는 표적 유전자의 역할을 연구하는 표현 바이러스 성 벡터의 정위 미세 주입

여기에서는 약물의 미세 주입에 의한 뇌 심부 구조 억제와 동시 전기 생리학적 기록을 통한 실시간 모니터링이라는 두 가지 기능을 가진 유리 피펫을 제작합니다.

동시 전기 생리 녹화 및 설치류의 뇌에서 억제 에이전트의 마이크로 주사

렌티 바이러스는 cDNA를 표현 또는 shRNA를 생쥐의 특정 뇌 영역에서 유전자 발현을 조절할 수의 정위 주입. 여기, 우리는 오픈 필드 테스트 (OFT)과 강제 수영 시험 (FST)와 같은 행동 작업으로 정위 주사를 결합하는 프로토콜을 제시한다.

정위 사출 기술을 적용하는 것은 동물의 행동에 유전 적 영향을 연구하기

이 절차는 저렴하고 일반적으로 사용할 수있는 도구를 사용하여 고품질의 단백질과 RNA를 얻기 위해 이산 냉동 뇌 영역의 수집을 설명합니다.

다운스트림 분석을 위한 냉동 설치류 뇌 영역 모음

여기에 설명된 것은 각진 관상 접근 법을 사용하여 도전적이고 도달하기 어려운 뇌 영역(공간 제한으로 인해)을 표적으로 할 수 있는 입체적 절차입니다. 이 프로토콜은 마우스와 쥐 모델에 모두 적응할 수 있으며, 바이러스 구조의 캐뉼라 이식 및 미세 주입을 포함하여 다양한 신경 과학 응용 분야에 적용 될 수있다.

다목적 신경 과학 기술을 위한 적응가능한 각진 입체 적 접근 법

배우세요 쥐 뇌 미세 주입 기법으로 행동과 정신 질환의 분자 기전을 연구하는 방법을. 정확한 캐뉼라 제작과 시약 전달로 신경과학 연구를 발전시킵니다.

쥐 뇌 미세 주입은 분자 기판 동기를 행동을 연구하기 위해

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