쥐 뇌 미세 주입은 분자 기판 동기를 행동을 연구하기 위해

이 절차의 전반적인 목표는 캐뉼라 및 마이크로 주입기를 정확하게 제조하고 미세 주입을 적절하게 수행하는 것입니다. 이것은 먼저 적절한 길이의 캐뉼러를 제조함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 마이크로 인젝터를 절단하고 조립하는 것입니다.

다음으로 마이크로 주입기, 튜브 및 미세 주입을 위한 펌프를 준비합니다. 마지막 단계는 미세주입을 완료하고 확산 기간을 통과하는 것입니다. 궁극적으로 미세주입을 사용하여 원하는 뇌 영역에 시약을 정확하게 주입하여 적절한 취급을 입증합니다.

미세 주입 중에는 내 연구실의 학생 인 Ryan Poland가 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 특별한 주의를 기울여야 하고 적절한 캐뉼러 배치 및 미세 주입 위치를 보장하기 위해 모든 단계에서 세심한 주의가 필요하기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 캐뉼러를 먼저 준비하려면 가는 펜을 사용하여 테이프에 15mm 기준선을 그립니다.

그런 다음 날카로운 영구 마커로 튜브의 15mm 섹션을 순차적으로 표시하기 위한 가이드로 사용하십시오. 다음으로 캐뉼러 튜브를 회전 도구의 느리게 회전하는 컷오프 디스크에 터치하여 노치합니다. 표시된 지점에서 캐뉼러를 180도 회전하고 튜브의 반대쪽에 노치를 만듭니다.

튜브를 완전히 절단하면 폐색이 발생할 수 있으므로 절단하지 마십시오. 그런 다음 튜브를 15mm 섹션으로 나누기 위해 튜브를 급격히 구부립니다. 그런 다음 엄지와 검지 사이의 절단 디스크에 수직으로 캐뉼라의 양쪽 끝을 잡습니다.

캐뉼러 튜브의 끝을 차단 디스크 표면에 대면서 캐뉼라 튜브를 회전시켜 뭉툭한 팁을 생성합니다. 그런 다음 26게이지 경사진 바늘로 캐뉼라의 양쪽 끝을 넓혀 모든 버가 제거되고 캐뉼라가 막히지 않았는지 확인합니다. 폐쇄기를 준비하려면 중간 무게의 직선 지혈기로 약 절반 길이의 캐뉼라 하나를 고정하고 캐뉼라가 벤치에 수직이 되도록 잠긴 지혈을 벤치에 놓습니다.

그런 다음 벤치에 도달할 때까지 에이터 와이어의 한쪽 끝을 캐뉼라에 공급합니다. 폐쇄기와 벤치 사이의 접촉을 유지하면서 30도 각도가 될 때까지 손가락으로 꼬집어 와이어를 구부립니다. 그런 다음 캐뉼러에서 와이어를 제거하고 작은 대각선 커터로 굴곡에서 2.5mm 떨어진 여분의 부분을 잘라냅니다.

이 절차에서는 잠긴 직선 지혈기로 마이크로 인젝터 튜브의 한쪽 끝을 수직으로 잡습니다. 튜브에 장력을 유지하면서 지혈을 비틀고 적어도 한 번 지혈 주위에 단단히 감습니다. 다음으로, 마이크로 인젝터 튜브의 반대쪽 느슨한 끝에서 32mm를 측정하고 두 번째 지혈기로 이 지점을 수직으로 잡습니다.

튜브가 끊어질 때까지 장력을 유지하면서 튜브를 앞뒤로 구부립니다. 그런 다음 마이크로 인젝터 튜브를 검사하여 양쪽 끝이 직선이고 내경이 막히지 않았는지 확인합니다. 줄자에 5mm 기준선을 그리고 영구 마커를 사용하여 캐뉼라 튜브의 5mm 부분을 순차적으로 표시합니다.

다음으로, 튜브에 노치를 내기 위해 표시된 지점에서 캐뉼라 튜브를 천천히 회전하는 절단 디스크에 터치합니다. 그런 다음 마이크로 인젝터 칼라 튜브를 급격히 구부려 5mm 섹션으로 나눕니다. 끝에서 약 2cm 떨어진 각 마이크로 주입기 튜브에 하나의 칼라를 밀어 넣습니다.

한쪽 끝에서 5mm 떨어진 마이크로 인젝터 튜브에 소량의 슈퍼 접착제를 바릅니다. 다음으로, 미세 주입 튜브 끝에서 1mm 떨어지도록 칼라를 슈퍼 글루 비드 위로 밉니다. 그런 다음 칼라의 양쪽 끝을 접착제로 덮습니다.

그런 다음 멸균수로 채워진 1ml 주사기에 26게이지 바늘을 부착합니다. 그리고 8cm 길이의 마이크로 인젝터 플라스틱 튜브를 바늘에 밀어 넣고 튜브에 구멍을 뚫지 않도록 한 후 플라스틱 튜브의 다른 쪽 끝을 건조된 마이크로 인젝터의 칼라 끝 위로 밀어 넣습니다. C.In 이 단계에서 특허 테스트를 위해 물이 채워진 주사기 플런저를 밀고 완성된 마이크로 인젝터를 칼라 반대쪽 끝에서 15mm로 95도 구부립니다.

그런 다음 플라스틱 튜브를 70cm로 자르고 마이크로 인젝터 칼라 위로 밀어 넣습니다. 미세 주입을 위해 펌프를 준비하려면 원하는 주입 속도인 미세 주입 바늘의 직경과 튜브의 목표 주입량을 설정합니다. 그런 다음 정확한 볼륨이 자동으로 전달되도록 펌프 모드를 볼륨으로 설정합니다.

다음으로, 주사기가 주입량에 추가로 0.2마이크로리터를 더한 만큼 채워질 수 있도록 펌프 백스톱을 조정합니다. 이제 꽉 조이는 주사기의 끝을 작은 유청 보트에 들어있는 멸균 수에 넣고 플런저를 부드럽게 펄럭여 내부 와이어를 균일하게 윤활합니다. 플런저를 펌프의 백스톱으로 당겨 미세주입 바늘에 물을 채웁니다.

다음 슬라이드. 1밀리리터 멸균 물 충전 주사기에 부착된 26게이지 바늘의 마이크로 인젝터에 연결된 PE 20 튜브. 마이크로 인젝터를 통해 멸균수를 분사하고 스프레이 패턴과 거리를 검사합니다.

그런 다음 멸균된 마이크로 인젝터를 멸균 필드에 놓습니다. 튜브를 바늘에서 밀어내고 바늘에 의해 손상된 부분 아래의 튜브를 자르고 물이 떨어지지 않도록 똑바로 세웁니다. 그런 다음 마이크로 인젝터 주사기 플런저를 약간 앞으로 밀어 바늘 끝에 물방울을 만들고 물이 채워진 PE 20 튜브를 바늘에 밀어 넣습니다.

그런 다음 플런저를 완전히 앞으로 밀어 샘플 로딩을 준비하고 마이크로 주입기에 미량의 에탄올이 남아 있지 않은지 확인합니다. 마이크로 인젝터 끝에 형성된 물방울을 실험실에서 깨끗한 물티슈로 몇 번 터치하여 누출 여부를 확인합니다. 그런 다음 주사기 플런저를 0.2 마이크로 리터 뒤로 당겨 멸균 물과 PE 20 튜브 및 주입 할 용액 사이에 기포를 만듭니다.

그런 다음 마이크로 인젝터를 주입할 시약에 넣고 주사기 플런저를 백스톱으로 천천히 당깁니다. 동물에게 주사를 놓을 준비를 하려면 쥐의 가슴을 실험자의 가슴에 대고 잡습니다. Betadine에 적신 면 어플리케이터로 캐뉼라 주변을 청소합니다.

베타딘으로 머리 뚜껑을 세 번 닦은 다음 에탄올로 두 번 닦습니다. 그런 다음 채워진 마이크로 인젝터를 캐뉼라에 놓습니다. 마이크로 주입 펌프의 시작을 누르고 기포의 움직임을 모니터링합니다.

주입이 완료되면 캐뉼러에서 마이크로 인젝터를 제거하고 폐쇄기로 교체합니다. 이 그림은 마이크로 주입된 바이러스에 의한 핵 측좌세포 성상세포 영역의 형질주입을 보여주며, 이 그림은 측좌핵에서 과발현된 전이유전자를 활성화하여 에탄올을 자가 투여하려는 쥐의 동기 감소를 보여줍니다. 핵심 성상세포 부위 CNO의 전신 투여에 의한 공포의 활성화는 비히클 CNO에 비해 금욕 후 에탄올을 자가 투여하려는 쥐의 동기를 현저히 감소시켰으며, 이는 한 번 숙달된 공포 대신 GFP를 발현하는 동등하게 훈련된 코호트에서 효과가 없었습니다.

이 기술은 맞춤형 뇌 미세 주입 도구와 실험 절차의 유연성을 더욱 높일 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 원하는 효과를 얻으려면 정확한 미세주입 위치가 필수적이라는 점을 기억하는 것이 중요합니다.