פרוטוקול הבידוד של hepatocytes האדם הראשי הקביל סרן אוכלוסיות של תאים בכבד ללא parenchymal
30 במרץ 2016
מתוארת טכניקה לבידוד הפטוציטים אנושיים ותאי כבד לא פרנכימליים מאותו תורם. סוגי תאי הכבד השונים בונים את הבסיס למודלים תפקודיים של כבד והנדסת רקמות. שיטה חדשה זו שואפת לבודד תאי כבד בתפוקה גבוהה ובכדאיות.
שיטה זו עשויה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחומי ההפטולוגיה והטוקסיקולוגיה, ולהעניק לנו הזדמנות לפיתוח מודלים חדשים של תרביות משותפות (co-culture) in vitro ומודלים של כבד בהנדסת רקמות. יתרונה של טכניקה חדשה זו הוא היכולת לבודד את כל אוכלוסיות תאי הכבד מאותו תורם ומאותה פיסה קטנה של רקמת כבד. כדי להתחיל בהליך זה, שקלו את רקמת הכבד שחולצה זה עתה תחת תנאי סטריליות, והניחו את דגימת רקמת הכבד תחת מ这篇文章 flujo אוויר למינרי.
לאחר מכן, נקו את הדם מפני השטח של דגימת הרקמה. לאחר מכן, שטפו את הקנולות באמצעות תמיסת פרפוזיה 1X one. השתמשו בדבק רקמות כדי לקבע את זיתי הקנולות בכלי הדם הגדולים יותר.
לאחר מכן, בדקו את הפרפוזיה ואת הדליפות מהקנולות. לאחר מכן, סגרו בעזרת דבק לרקמות את כל כלי הדם המדליפים תמיסות פרפוזיה 1X שקופות. לאחר מכן, הניחו את דגימת רקמת הכבד עם הקנולות לתוך משפעל בוכנר.
לאחר מכן, קבעו את קצב הזרימה של משאבת הפריסטלטיקה בין 7.5 ל-14.6 מיליליטר לדקה, בהתאם למספר הקנולות שנעשה בהן שימוש ולהתנגדות של רקמת הכבד. בצעו פרפוזיה לרקמה עד שכל הדם ינוקה, למשך 20 דקות לפחות ועד מקסימום 30 דקות. במקרים מסוימים, עשוי להיות צורך לסגור אחת הקנולות באמצעות תפסים מפלסטיק או להגביר את הלחץ הפנימי של אזור מסוים על ידי לחיצה עדינה על קפסולת הכבד בעזרת שפכטל, וזאת על מנת למטב את הפרפוזיה.
שינוי צבע מלא מאדום-חום לחום בהיר או צהוב בהיר מעיד על פרפוזיה טובה. לאחר מכן, החליפו את נוזל הפרפוזיה בתמיסת עיכול המכילה collagenase P. לאחר מכן, סדרו מחדש את המערך לשלב העיכול. בהמשך, בצעו זרימה מעגלית של תמיסת העיכול למשך עד 15 דקות.
עצרו את הפרופוזיה מדי פעם ובדקו את מידת העיכול. חיוני להפסיק מיד את הפרופוזיה עם תמיסת העיכול כאשר דגימת רקמת הכבד מעוכלה מספיק. הוציאו את הכבד מהמכשיר כאשר הוא מוכן והניחו אותו בצלחית זכוכית.
שטפו את החלק החיצוני של דגימת הרקמה בתוך תמיסת עצירה (Stop Solution) קרה מאוד. הוציאו את הקנולות מדגימת רקמת הכבד. לאחר מכן, השתמשו בסקלפל כדי לפתוח את דגימת רקמת הכבד על ידי חריץ במרכז האזור שבו היו מחוברות הקנולות, והקפידו שקפסולת גליסון (Glisson's capsule) תישאר שלמה.
שטפו את החלק הפנימי של דגימת הרקמה ולאחר מכן כסו את כל דגימת הרקמה בתמיסת עצירה (Stop Solution). לאחר מכן, נערו את הרקמה בעדינות כדי לשחרר ממנה את התאים. לאחר מכן, אספו את תרחיף התאים וסננו אותו דרך משפך גזה לתוך 10 מבחנות פלסטיק בנפח 50-milliliter.
הוסיפו תמיסת עצירה (Stop Solution) נוספת לדגימת רקמת הכבד עד להגעה לנפח סופי של 500 milliliters. לאחר מכן, סבבו את תרחיף התאים בצנטריפוגה, אספו את העילאי עבור בידוד NPC מאוחר יותר, וקבצו את משקעי התאים לשפופרות פלסטיק של 250-milliliters. לאחר מכן, שטפו את משקעי התאים בעזרת PBS.
לשם כך, סבב במרכז centrifuge את תרחיף התאים. אסוף את הנוזל העליון (supernatant), איחד את המשקעים, ושחזר את המשקע בתווך דגירה להפטוציטים.
כדי לבודד את תאי הכבד שאינם פהנכימליים, סנטריפיגו את העילאי שנאסף כדי להסיר את הכדוריות האדומות וההפטוציטים שנותרו. אספו את העילאיים וסנטריפיגו אותם פעמיים כדי לקבל את משקעי התאים עבור שיקוע של HCS, LEC, חלק מה-KC וה-KC שנותרו. לאחר מכן, השעיקו מחדש את המשקעים ב-HBSS. לאחר מכן, הכינו מדרג צפיפות של 25% ו-50% על ידי ערבוב של תמיסת מדרג הצפיפות עם PBS לצורך סנטריפיגציה במדרג צפיפות.
שפוך בזהירות את תמיסתו של מדרג הצפיפות בריכוז 25% מעל שכבת תמיסת מדרג הצפיפות בריכוז 50%. לאחר מכן, הנח בזהירות ובאיטיות את תרחיף ה-NPC מעל שכבת תמיסת מדרג הצפיפות בריכוז 25% כדי להשיג הפרדה ברורה בין שתי השכבות. סבב את תרחיף התאים על מדרג הצפיפות ללא הפסקה.
ה-NPC ממוקמים בממשק שבין שכבות מדרג הצפיפות של 25% ו-50%. שאבו את התאים המתים ואת ששאריות התאים מהשכבה העליונה ביותר ואספו את הממשק בזהירות. לאחר סנטריפוגה כפולה, בצעו ספירת תאים עבור ה-KC ופלקציית ה-MPC.
לאחר מכן, סובב במרכזית את פראקציית ה-NPC באמצעות שלב הצנטריפוגציה הכפולה שתואר קודם לכן, והשהה את ה-NPC שנית בתמיסת זריעה לתאי קופפר (Kupffer Cell seeding medium). זרע את הפראקציה המכילה את ה-KC על כלי תרביות תאים מפלסטיק בצפיפות של 5×10⁵ KC לסנטימטר רבוע. דגרי את תרביות ה-KC למשך 20 דקות באינקובטור לח במטמפר של 37 °C ו-5% carbon dioxide.
תאי KC ראשוניים צריכים להיספח לפלסטיקה של תרבית התאים בפרק זמן קצר. לאחר מכן, אספו את העליון המכיל את תאי ה-NPC שאינם נספחים, המורכבים בעיקר מ-LEC ו-HSC. כדי להפריד בין LEC ל-HSC, התחילו בצנטריפוגה של העליון.
לאחר מכן, שטפו את המשקע באמצעות PBS. לאחר הצנטריפוגה השנייה, השעיכו שוב את התאים במצע הפרדת תאי אנדוטל מסוג stellate ובצעו ספירת תאים לכל התאים שנותרו. לאחר מכן, השעיכו 10 מיליון תאים במיליליטר אחד של מצע הפרדת תאי אנדוטל מסוג stellate.
לאחר מכן, הוסיפו 20 µL של תמיסת חסימה (blocking solution) מהערכה של MAX ו-20 µL של microbeads CD31 עבור סימון אימונולוגי, והדגירו את התוצאה למשך 15 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הפרידו את ה-LEC מה-HSC כפי שמתואר בפרוטוקול היצרן עבור מערכת מיון תאים מופעלת מגנטית max, ואספו את פракציית ה-HSC. אלוטו את ה-LEC חיוביים ל-CD31 שנשמרו מגנטית והשעו אותם במצע תרבית לתאי אנדותל מסוג stellate cell.
כאן, התמונות מציגות את אוכלוסיות תאי הכבד המבודדים השונות מיד לאחר תהליך הבידוד בתצפית של מיקרוסקופ ניגודיות פאזה. סט תמונות זה מציג את התאים המבודדים והמטופחים לאחר 24 שעות של תרבית. כאן מוצגת האפיון המבוסס על אימונופלואורסצנציה של פראקציות תאים שונות.
PHH הראו אותות חיוביים עבור הסמן של ההפטוציטים CK18 24 שעות לאחר הבידוד, KC היו חיוביים עבור הסמן CD68 24 שעות לאחר הבידוד, LEC הראו אותות חיוביים לווימנטין 72 שעות לאחר הבידוד, ו-HSC היו חיוביים ל-GFAP 72 שעות לאחר הבידוד. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור שבידוד מוצלח תלוי בעיכול אופטימלי של דגימת רקמת הכבד. לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לכם הבנה טובה לגבי אופן השליטה בעיכול וכיצד לבצע הפרדה במדרג צפיפות, שהם השלבים הקריטיים של הליך זה.
לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום המחקר הרפואי לחקור תפקודים ומחלות של הכבד בתרביתי תאי in vitro שנוצרו לאחרונה ובמודלים של כבד בהנדסת רקמות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר טכניקה לבידוד הפטוציטים אנושיים ותאים כבדיים שאינם פראנכימליים מאותו תורם. שיטה זו שואפת להשיג תפוקה גבוהה וחיוניות גבוהה של תאי כבד, שהם חיוניים למודלים פונקציונליים של כבד ולהנדסת רקמות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- הפטולוגיה
- טוקסיקולוגיה
- הנדסת רקמות
רקע
- בידוד תאי כבד הוא קריטי למחקר וליישומים טיפוליים.
- שיטות נוכחיות עשויות שלא להניב את כל אוכלוסיות תאי הכבד מתורם בודד.
- שיפור חיוניות התאים והתנובה יכול לשפר מודלים in vitro.
- טכניקה זו נותנת מענה למגבלות בשיטות בידוד קיימות.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה לבידוד של כל אוכלוסיות תאי הכבד מחתיכה בודדת של רקמת כבד.
- שיפור החיוניות והתנובה של תאי כבד מבודדים.
- סיוע בפיתוח של מערכות חדשות לתרבית משותפת (co-culture) in vitro.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- שקילה של רקמת כבד שחולצה זה עתה.
- ניקוי דם מפני השטח של הרקמה.
- שטיפת קנולות עם תמיסת פרפוזיה.
- שימוש בדבק רקמות להצמדת קנולות לכלי דם.
תוצאות עיקריות
- הטכניקה מבודדת בהצלחה מספר סוגים של תאי כבד.
- הושגו תנובה גבוהה וחיוניות גבוהה של התאים.
- הודגם פוטנציאל לשיפור מודלים של כבד in vitro.
- השיטה מאפשרת את חקר תפקוד הכבד והרעילות שלו.
מסקנות
- שיטה זו מספקת דרך מהימנה להשגת תאי כבד למחקר.
- היא פותחת אפיקים חדשים להנדסת רקמות ולבדיקת תרופות.
- מחקרים עתידיים יכולים להשתמש בטכניקה זו עבור יישומים שונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
גישה להפטוציטים אנושיים ראשוניים מפוהרים ותאים כבדיים שאינם פרהנכימליים מתורם בודד מאפשרת שחזור של מודלים של כבד אנושי הרלוונטיים מבחינה פיזיולוגית לבדיקות של רעילות ומטבוליזם של תרופות. יכולת זו תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטית בשלבים מוקדמים של הגילוי, על ידי אספקת מערכת רלוונטית למחלה השומרת על תפקוד ההפטוציטים באמצעות איתות פראקריני מתאי קופפר, תאי אנדותל של הכבד ותאי כוכב של הכבד. השיטה מגבירה את הביטחון החזוי בזיהוי מובילים על ידי הפחתת השונות הביולוגית הקשורה למונו-קלטורות שעברו דה-דיפרנציאציה.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות במיקרו-סביבה רב-תאית של הכבד המשקפת פתופיזיולוגיה in vivo.
- ערך תפעולי: מספק מקור מתחדש של הפטוציטים ותאי NPC יציבים פנוטיפית לצורך בדיקות מעורבות של מטרות (target engagement) עקביות.
- ערך מדעי: תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות המעורבות בפגיעה בכבד המושרית על ידי תרופות, באמצעות מודלים של תרבית משותפת (co-culture) הלוכדים תקשורת בין-תאית.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מספק מערכות ביולוגיות מוסמכות עם הרכב תאי מוגדר לצורך סטנדרטיזציה ושימוש חוזר במבחנים.
- ערך תפעולי: מייצר פלטים כמותיים כגון הפרשת אלבומין, ייצור Urea ופעילות CYP450 לצורך הערכה מהימנה של תרכובות.
- ערך מדעי: מאפשר סריקה פנוטיפית בפורמטים של תלת-ממד (3D) או תרביות משולבות (co-culture) החוזים טוב יותר רעילות כבדית קלינית.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מציע מערכת רלוונטית למחלה לצורך חקר פתופיזיולוגיה של הכבד והערכת מועמדים טיפוליים בהקשר אנושי.
- ערך תפעולי: מאפשר גילוי של סממנים ביולוגיים תרגומיים על ידי מתאם בין תוצאות in vitro לתוצאות קליניות.
- ערך מדעי: תומך בהפחתת סיכונים מכניסטית על ידי בידוד תרומתן של אוכלוסיות תאים בודדות למסלולי פגיעה בכבד.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
אוכלוסיות התאים המבודדות משתלבות ברצף הגילוי, החל מתיקוף מוקדם של מטרות, דרך זיהוי מובילים ועד להערכת בטיחות פרה-קלינית, ובכך מספקות מקור רציף של ביולוגיה של כבד אנושי לצורך עידון איטרטיבי של המודלים.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות ובבירור מסלולים ביולוגיים על ידי אפשור קריאות פונקציונליות בתרביות משותפות המדמות את הסינוסואיד הכבדי.
- סריקה: מספק תאים המוכנים לבדיקה בעלי חיוניות גבוהה ובידוד סטנדרטי למסעות סריקה של תרכובות הניתנים לשחזור.
- אנליטיקה: מספק מדידות כמותיות של משתנים תלויים כגון יצירת מטבוליטים, רדיקלים חופשיים של חמצן ושחרור ציטוקינים לצורך ניתוח השוואתי של תנאים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין ממצאי גילוי לתיקוף פרה-קליני באמצעות מקור ניתן להרחבה של תאי כבד אנושיים ראשוניים השומרים על סמנים פונקציונליים מרכזיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמת בידוד רב-פעמית המפחיתה את התלות במקורות רקמה משתנים ותומכת בעקביות בין פרויקטים שונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בהערכת הפטוטוקסיות על ידי שמירה על הדיפרנציאציה והתפקוד של ההפטוציטים באמצעות תרבית משותפת (co-culture) של NPC.
- ערך תפעולי: מבטיח סטנדרטיזציה ויכולת הרחבה של ייצור תאי כבד מדגימות של תורם בודד, תוך הפחתת השונות בין סדרות ייצור.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת החלטות ה-go/no-go על ידי אספקת נתוני בטיחות מוקדמים הרלוונטיים לבני אדם, המפחיתים את שיעור הנשירה בשלבים מאוחרים עקב רעילות כבדית.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של תרכובות מותאם-סיכון, בהתבסס על פרופילי סיכון כבדיים מכניסטיים המופקים ממודלים רלוונטיים פיזיולוגית.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטכניקות פרפוזיה, סרטיפוגציה במדרג צפיפות ונהלי מיון תאים.
- תלוי בגישה לרקמת כבד אנושית טרייה ולציוד ייעודי כגון משאבות פריסטלטיות ומפרידי תאים מגנטיים.
- מחייב סטנדרטיזציה של פרוטוקולי בידוד בין צוותים כדי להבטיח איכות חיות ועקביות של התאים בין אתרים שונים.
- כולל שיקולי התאמה בעת מעבר מדגימות רקמה קטנות לייצור בקנה מידה גדול עבור פורמטים של סריקה בריבוי בארות.
- מגבלות מעשיות כוללות שונות בין תורמי רקמה ואת אופיים הרגיש לזמן של תהליכי בידוד התאים לאחר כריתה, אשר יש לנהל באמצעות SOPs סטנדרטיים.
שאלות נפוצות בתחום הביופארמה
Chapters in this video
0:05
Title
0:33
Perfusion and Digestion of Liver Tissue Sample
2:36
Isolation of Hepatocytes
3:56
Isolation of Non-parenchymal Liver Cells
5:16
Separation of Kupffer Cells, Endothelial Cells, and Stellate Cells
7:07
Results: Morphology of Human Parenchymal and Non-parenchymal Liver Cells in Suspension and After Adherence
7:57
Conclusion
