Протокол для изоляции первичных гепатоцитов человека и соответствующие основные популяциями Non-паренхиматозных клеток печени

Данный метод может помочь в решении ключевых вопросов в области гепатологии и токсикологии, а также предоставить возможность разработки новых моделей печени in vitro на основе сокультивирования и тканевой инженерии. Преимущество этой новой методики заключается в возможности выделения всех популяций клеток печени от одного и того же донора и из одного и того же небольшого фрагмента ткани печени. Чтобы начать процедуру, взвесьте свежепрепарированную ткань печени в стерильных условиях и поместите образец ткани печени в ламинарный шкаф.

Затем удалите кровь с поверхности образца ткани. После этого промойте канюли, используя 1X раствор для перфузии номер один. Используйте тканевый клей, чтобы зафиксировать оливки канюль в крупных кровеносных сосудах.

Затем проверьте перфузию и убедитесь в отсутствии утечек из канюль. После этого закройте все кровеносные сосуды, из которых просачивается прозрачный 1X перфузионный раствор, с помощью тканевого клея. Затем поместите канюлированный образец ткани печени в воронку Бюхнера.

Затем установите скорость потока перистальтического насоса в диапазоне от 7.5 до 14.6 миллилитров в минуту, в зависимости от количества используемых канюль и сопротивления тканей печени. Проводите перфузию ткани до полного вымывания цельной крови в течение не менее 20 и не более 30 минут. В некоторых случаях для оптимизации перфузии может потребоваться пережать одну из канюль пластиковыми зажимами или увеличить внутреннее давление в определенной области, аккуратно надавив шпателем на капсулу печени.

Полное изменение цвета с коричневато-красного на светло-коричневый или светло-желтый свидетельствует о хорошей перфузии. После этого замените перфузионную жидкость на раствор для переваривания, содержащий коллагеназу P. Затем перенастройте установку для этапа переваривания. Впоследствии обеспечьте циркуляцию раствора для переваривания в течение до 15 минут.

Периодически останавливайте перфузию и проверяйте степень переваривания. Крайне важно немедленно прекратить перфузию раствором для переваривания, когда образец ткани печени будет достаточно переварен. По готовности извлеките печень из устройства и поместите ее в стеклянную чашку.

Промойте внешнюю поверхность образца ткани ледяным стоп-раствором. Извлеките канюли из образца ткани печени. Затем с помощью скальпеля вскройте образец ткани печени, сделав надрез посередине области прикрепления канюль, следя за тем, чтобы капсула Глиссона оставалась неповрежденной.

Промойте образец ткани изнутри, затем полностью залейте его стоп-раствором. После этого аккуратно встряхните ткань, чтобы высвободить из нее клетки. Затем соберите клеточную суспензию и профильтруйте ее через воронку с марлей в 10 пластиковых пробирок объемом 50 мл.

Добавьте стоп-раствор в образец ткани печени до достижения конечного объема 500 milliliters. Затем центрифугируйте клеточную суспензию, соберите супернатант для последующего выделения NPC и объедините клеточные осадки в пластиковые пробирки объемом 250-milliliters. После этого промойте клеточные осадки раствором PBS.

Для этого центрифугируйте клеточную суспензию. Соберите супернатант, объедините осадки и ресуспендируйте осадок в среде для инкубации гепатоцитов. Затем определите количество и жизнеспособность клеток в полученной клеточной суспензии с помощью окрашивания трипановым синим.

Для выделения непаренхиматозных клеток печени центрифугируйте собранный супернатант, чтобы удалить оставшиеся эритроциты и гепатоциты. Соберите супернатанты и центрифугируйте их дважды, чтобы получить клеточные осадки для седиментации HCS, LEC, частично KC и оставшихся KC. Затем ресуспендируйте осадки в HBSS. После этого приготовьте градиенты плотности 25% и 50%, смешав раствор для градиента плотности и PBS, для проведения центрифугирования в градиенте плотности.

Осторожно нанесите раствор градиента плотности 25% поверх слоя раствора градиента плотности 50%. Затем аккуратно и медленно нанесите суспензию NPC поверх слоя раствора градиента плотности 25%, чтобы добиться четкого разделения обоих слоев. Центрифугируйте клеточную суспензию в градиенте плотности без разрыва слоя.

NPC находятся в интерфазе между слоями градиента плотности 25% и 50%. Аспирируйте погибшие клетки и клеточный дебрис из верхнего слоя и осторожно соберите интерфазу. После двойного центрифугирования проведите подсчет клеток для KC и фракции MPC.

Затем центрифугируйте фракцию NPC, используя ранее описанный этап двойного центрифугирования, и ресуспендируйте NPC в среде для посева клеток Купфера. Посейте фракцию, содержащую КК, в пластиковые сосуды для культивирования клеток с плотностью 5 × 10⁵ КК на квадратный сантиметр. Инкубируйте культуры КК в течение 20 минут в увлажненном инкубаторе при 37 °C и 5% carbon dioxide.

Первичные КК должны прикрепиться к пластику для культивирования клеток в течение короткого периода времени. Затем соберите супернатант, содержащий неприкрепившиеся НПК, которые состоят в основном из ЛЭК и ГСК. Чтобы отделить ЛЭК от ГСК, начните с центрифугирования супернатанта.

Затем промойте осадок раствором PBS. После второго центрифугирования ресуспендируйте клетки в среде для разделения звездчатых эндотелиальных клеток и проведите подсчет всех оставшихся клеток. Затем ресуспендируйте 10 миллионов клеток в одном миллилитре среды для разделения звездчатых эндотелиальных клеток.

Затем добавьте 20 µL блокирующего раствора из набора MAX и 20 µL микросфер CD31 для иммуномаркировки и инкубируйте полученную суспензию в течение 15 минут при температуре 4 °C. После этого отделите LEC от HSC согласно протоколу производителя для системы магнитной сепарации клеток MAX и соберите фракцию HSC. Элюируйте магнитно-задержанные CD31-положительные LEC и суспендируйте их в среде для культивирования звездчатых эндотелиальных клеток.

На этих изображениях представлены популяции изолированных клеток печени непосредственно после процесса изоляции, полученные с помощью фазово-контрастной микроскопии. Данный набор снимков демонстрирует изолированные и культивируемые клетки после 24 часов культивирования. Здесь представлена характеристика различных клеточных фракций на основе иммунофлуоресценции.

Через 24 часа после выделения PHH продемонстрировали положительные сигналы по маркеру гепатоцитов CK18, KC оказались положительными по маркеру CD68 через 24 часа после выделения, LEC проявили положительные сигналы по виментину через 72 часа после выделения, а HSC оказались положительными по GFAP через 72 часа после выделения. При выполнении данной процедуры важно помнить, что успех выделения зависит от оптимального переваривания образца ткани печени. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как контролировать процесс переваривания и как проводить разделение в градиенте плотности, что является критическими этапами данной процедуры.

После своей разработки этот метод открыл исследователям в области медицины путь к изучению функций и заболеваний печени в недавно созданных клеточных культурах in vitro и тканеинженерных моделях печени.