마이크로 전극 배열에 3D 엔지니어링의 연결을 문화의 인터페이스 : 혁신을 체외 실험 모델

이 절차의 전반적인 목표는 마이크로 전극 어레이에 결합된 체외 3차원 뉴런 네트워크의 새로운 모델을 제시하는 것입니다. 이는 먼저 MEA의 중앙 부분을 폴리 데 라이신과 라미닌의 혼합 용액으로 컨디셔닝한 다음 접착 단백질인 라미닌 및 폴리리신으로 마이크로비드를 코팅하여 수행됩니다. 두 번째 단계는 처리된 마이크로비즈의 현탁액을 멀티웰 플레이트에 분배하여 자체 조립하여 균일한 층을 형성하는 것입니다.

절차의 세 번째 단계는 제곱밀리미터당 2000개의 세포 밀도로 MEA의 활성 영역에 세포를 플레이트하여 2D 뉴런 네트워크를 생성하는 것입니다. 도금 후 6-8시간 후에 현탁액이 멀티웰 플레이트에서 MEA로 전달되고 마이크로비드가 육각형의 컴팩트한 구조로 자체 조립될 수 있습니다. 궁극적으로 컨포칼 현미경은 3D 네트워크를 시각화하는 데 사용되며, 이는 MEA를 통해 성장한 기존의 2D 뉴런 네트워크와 비교됩니다.

체외 BDI 차원 세포 배양과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 BDI 차원 모델에서 소마타와 성장 원뿔이 평평하고 안돈과 상승이 모든 방향으로 퍼질 수 없다는 것입니다. 또한 파열 활성은 BDI 차원 네트워크의 전기 생리학적 역학을 지배하는 반면 3차원 네트워크에서는 무작위 스펙 활성이 공존합니다. 2008년 Nature Method에 발표된 Sophie Potto의 연구 논문에서 MICROBITS를 3차원 네트워크 구축을 위한 발판으로 사용한 논문을 읽었을 때 이 방법에 대한 아이디어가 처음 떠올랐습니다.

그런 다음 이 방법을 저에게 적용하여 최초의 3차원 체외 녹음을 만들었습니다. PDMS 엘라스토머를 준비하려면 페트리 접시에서 경화제와 폴리머를 1:9의 부피 비율로 혼합합니다. 그런 다음 혼합물을 흔들어 진공 챔버에 10분 동안 넣어 기포를 제거합니다.

PDMS 제약 조건을 구성하려면 PDMS 재료를 성형기에 삽입한 다음 섭씨 120도에서 30분 동안 오븐에 넣습니다. PDMS 제약 조건은 외부 및 내부 직경이 각각 22.0mm와 3.0mm이고 도금 전날 높이가 650마이크로미터인 실린더 모양이어야 합니다. 실체 현미경으로 마스크를 MEA의 활성 영역에 연결한 다음 섭씨 120도의 오븐에서 PDMS 마스크를 멸균합니다.

다음으로, 70% 에탄올의 원뿔형 바이알에 유리 마이크로비즈를 2시간 동안 살균하고, 이후 30분마다 회전하여 모든 마이크로비즈를 노출시킵니다. 바이알에서 에탄올 용액을 제거하고 멸균된 물로 마이크로비즈를 두 번 헹굽니다. 그런 다음 PDMS 마스크로 구분된 MEA 영역의 중앙 부분을 밀리리터당 0.05마이크로그램의 폴리리신과 라미닌 혼합 용액 24마이크로

마이크로비드를 접착 단백질, 라미네이트 및 폴리리신으로 밀리리터당 0.05마이크로그램으로 코팅합니다. 그런 다음 섭씨 37도의 인큐베이터에 하룻밤 동안 넣어 안정적이고 오래 지속되는 신경 네트워크를 얻습니다. 그 후, 처리된 마이크로비드의 현탁액을 멤브레인 인서트가 있는 멀티웰 플레이트에 분배하여 자체 조립되어 균일한 층을 형성합니다.

그런 다음 멤브레인의 각 웰을 0.5 밀리리터의 배지로 채 웁니다. 이 단계에서 뉴런이 도금될 준비가 될 때까지 섭씨 37도, 이산화탄소 5%의 인큐베이터에 넣습니다. E 18 임신한 암컷 쥐를 희생한 후, 쥐 배아를 얻은 다음 각 쥐 배아에서 하마 캄피를 제거합니다.

얼음처럼 차가운 행크에 넣으십시오. 칼슘과 마그네슘이 없는 소금 용액의 균형을 맞추십시오. 다음으로, 0.05%의 DNA가 함유된 0.125%의 tryin Hanks 용액에서 섭씨 37도에서 18-20분 동안 조직을 해리합니다.

그 후, peor 피펫으로 상층액을 제거하십시오. 5분 동안 10%FBS가 포함된 배지를 첨가하여 효소 분해를 중지합니다. 다음 FBS를 가진 매체를 제거하고 성장 매체, 그것의 보충교재 1%L-글루타민 및 Gentamycin로 밀리리터 당 10 마이크로그램에 한 번 세척하십시오.

그런 다음 매체를 제거하십시오. 500마이크로리터의 성장으로 다시 채우십시오. 보통. 그것의 보충교재 1%L-글루타민 그리고 Gentamycin는 밀리리터 당 10 마이크로그램에 있습니다.

세포의 유백색 현탁액이 분명해질 때까지 좁은 PE 피펫으로 조직 펠릿을 기계적으로 해리합니다. 그 후, 소량의 세포 현탁액을 성장 배지로 희석하여 2.0 밀리리터의 최종 부피를 얻는다. 혈구 분석기 챔버로 얻은 세포 농도를 계산합니다.

그런 다음 이 농도를 1:5의 비율로 희석하여 마이크로리터당 600-700개의 원하는 세포 농도를 얻습니다. 제곱밀리미터당 2000개의 세포 밀도로 세포를 PDMS 제약 조건에 의해 정의된 MEA의 활성 영역에 플레이트화하여 2D 뉴런 네트워크를 생성합니다. 그런 다음 MEA 장치를 섭씨 37도에서 5% 가습된 이산화탄소 대기가 있는 인큐베이터에 넣습니다.

3D 배양 구축을 위한 예비 단계를 완료하려면 마이크로리터당 600 - 700 세포의 세포 농도를 가진 160 마이크로리터의 현탁액을 멀티-웰 플레이트 내부에 위치한 마이크로비드 단층의 표면에 분배합니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 5% 가습된 이산화탄소 분위기의 인큐베이터에 멀티웰 플레이트를 배치하고, 도금 후 6-8시간 후에 마이크로비드와 뉴런이 있는 현탁액 30-40마이크로리터를 PDMS 제약 조건에 의해 구분된 MEA 영역으로 이동합니다. 각 전달 후 마이크로비즈가 육각형 구조로 자체 조립될 때까지 약 30분 정도 기다립니다.

모든 레이어가 증착되고 PDMS 제약 조건에 의해 구분된 영역의 맨 위에 있는 300마이크로리터의 매체에서 자발적으로 조립됩니다. MEA에 결합된 3D 구조를 섭씨 37도, 5% 이산화탄소의 인큐베이터에 48시간 동안 넣습니다. 그 후, 시험관 내에서 3주 후에 보충제와 함께 1ml의 성장 배지를 추가하면 3D 구조가 PDMS 제약 없이 안정적입니다.

다음은 MEA 표면에 결합된 단일 비드 층의 DIC 이미지입니다. 검은색 점의 위치는 전극의 공간적 레이아웃을 나타냅니다. 빨간색 신호에 의해 반사되는 맵 2에 대한 면역형광 염색은 MEA의 전극 평면에 직접 결합된 마이크로비드 주변 뉴런의 수지상 가지화 및 ADA의 분포를 표시합니다.

이 이미지는 성숙한 유사분열 후 뉴런에서 발현되는 새로운 N에 대해 뉴런이 표시되는 고도로 상호 연결된 네트워크를 표시하는 A 3D 배양의 Zack 시퀀스의 최대 투영을 보여줍니다. 그리고 gaba의 경우, 다음은 3D 구성의 해마 네트워크에 대한 대표적인 전기생리학적 기록입니다. 다음은 2D 구성의 해마 네트워크의 대표적인 전기생리학적 기록입니다.

이 과정을 숙달하면 7시간 안에 완료할 수 있습니다. 그러나 절차에는 다른 날에 수행된 여러 단계가 있기 때문에 전체 절차를 실현하기 위한 시간 추정은 단지 표시일 뿐이라는 점에 유의할 가치가 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 먼저 이뇨제의 2D 층을 MEA의 전극에 도금한 다음 3D 구조를 실현하기 위해 멀티 웰 플레이트에서 MEA로 마이크로비트 및 뉴런의 현탁액을 매우 조심스럽게 전달하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

이 기술은 컴퓨터 신경과학 분야의 연구자들이 네트워크 연결이 어떻게 새로운 네트워크 역학을 형성할 수 있는지 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 마이크로 전극 어레이에 결합된 체외 3차원 뉴런 네트워크를 구축하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.