Name: 설계, 치료, 세포 도금 및 기능적으로 간 연결 회로의 구성, 모듈 형 신경 네트워크의 배양 표면 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: 배우세요 PDMS 스텐실을 이용한 단백질 패턴화로 신경교세포를 배양하여 공간적으로 제한된 기능적 신경 회로를 구성하는 방법입니다. 이 기법은 전기생리학적 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 유럽 프로젝트 BRIANBOW (FP7- 젊은 탐험가에 의해 지원되었다, 저자는 원고에 대한 유용한 의견을 박사 코포 Tessadori에게 감사를 표하고, 비디오에 사용 된 그래픽을 생산하는 그녀의 도움 실비아 Chiappalone 것입니다.

절차는 관리 및 실험 동물의 사용을 위해 NIH 기준에 따라 수행하고, 텔 아비브 대학 동물 관리 및 사용위원회 (허가 번호 - L-14-019)에 의해 승인되었다. 인스 트루먼 트와 PDMS 1. 준비 <ol><li> 웨이퍼 준비 (재료의 표를, 또는 미세 실험실에서 웨이퍼 주문), 메스와 핀셋 - 살균이 필요되지 않습니다. </li><li> 다음의 조건에 따라 폴리 D 라이신 (PDL) 용액을 제조 : 4 ㎎ / 0.1 M 보레이트 완충액 ㎖, pH가 8 및 -20 ℃에서. </li><li> 다음 절차에 따라 PDMS 스텐실을 준비합니다 : <ol><li> 베이스 10의 비율로 경화제를 함께 혼합함으로써 폴리 디메틸 실록산 (PDMS, 실리콘 엘라스토머)을 준비 : 1, 그 다음 약 5 분 동안이 물질을 교반한다. </li><li> 15 분 동안 두 번 진공 챔버의 각 시간을두고 확인 거품이 사라 졌어요. </li><li> 언제가스의 사용을 허용하도록 개방 질소 노브를 스피너에 실리콘 웨이퍼 (도 1a)를 배치하고, 이동하는 것을 방지하기 위해 진공을 사용 PDMS 스핀 코터를 준비 준비. </li><li> 웨이퍼 위에 PDMS를 붓고 1,000 rpm에서 1 분간 스피너를 활성화 (약 100 μm의 높이를 만듭니다). </li><li> 30 분 동안 100 ℃에서 핫 플레이트 상에 웨이퍼를 배치했다. </li><li> PDMS이 강화되면, 파스퇴르 피펫을 사용하여, PDMS와 스텐실의 경계를 설명합니다. 30 분 동안 100 ℃에서 핫 플레이트 상에 웨이퍼를 배치했다. </li><li> PDMS 경계가 강화되면, 경계에 따라 스텐실을 잘라 웨이퍼에서 실리콘 스텐실을 벗​​겨 메스를 사용 (하나의 패턴을 포함 제곱 PDMS). </li></ol></li></ol> 2. 페트리 접시 및 커버 슬립 준비 <ol><li> 다음 순서에 따라 23mm 정사각형 유리 커버 슬립을 준비하고 청소 : <ol><li> 증류수, 70 % 에탄올, 아세톤으로 세척 하였다. </li><html><li> 질소 이소프로판올과 빠른 건조와 세척 할 것. </li></ol></li><li> 커버 슬립에 패턴 PDMS 스텐실을 배치하고 부드럽게 그들이 단단히 유리 표면에 부착되어 있는지 확인을 누릅니다. 15 분 동안 진공 챔버에 배치합니다. </li><li> 스텐실에 PDL 1 ㎖를 삭제합니다. 두 번 20 분마다의 진공 챔버에 커버 슬립을 삽입하고, 건조 PDL O / N 두십시오. </li><li> 지원 셀 네트워크를 만들 수 페트리 접시를 준비합니다 : <ol><li> RT에서 2 시간 동안 PDL 1 ㎖와 접시 (3.5 cm)의 표면을 커버. 피펫을 사용하여 PDL 드롭을 제거합니다. </li><li> 증류수로 세척하고 건조 둡니다. 커버 슬립의 각 모서리에 실리콘 그리스의 아주 작은 방울을 놓습니다. </li></ol></li><li> 첨부 파일을 확인하기 위해 조심스럽게 페트리 접시 (즉, PDMS이 위를 향하도록한다)과 언론의 중심에 커버 슬립을 놓습니다. </li><li> 조심스럽게 핀셋을 사용하여 커버 슬립에서 PDMS를 제거합니다. 멸균, 7 분 동안 UV 조명에 노출. </li></ol>르 &quot;&gt; 3. 다중 전극 어레이 (MEA) 제조 <ol><li> 이 순서 (자료 표)에서 청소 MEA : <ol><li> 농축 효소 세제 탭 및 초음파 처리에서 물을 3 회 반복한다. </li><li> 증류수 3 회에 초음파 처리. </li><li> 30 분 동안 UV 증류 3 회 (후드, 1000 μL 팁) 물과 장소 씻으십시오. </li></ol></li><li> 네트워크 준비 지원 : <ol><li> 설계 지원 네트워크 금형을 준비합니다. <ol><li> 12 웰 플레이트 (22mm 직경)에 PDMS를 붓고. </li><li> PDMS 몰드 꺼내서 메스를 이용하여 경화 될 때, 링 모양을 만들 때 중앙에 구멍을 잘랐다. </li><li> MEA (그림 2A)의 중심에 설계 지원 네트워크 금형을 넣고 실온에서 2 시간 동안 PDL과 표면의 나머지 부분을 커버한다. </li></ol></li><li> 피펫을 사용하여 PDL을 제거하고 증류수로 세척한다. </li><li> 곰팡이를 제거하고 (그림 2A) 건조 둡니다. &lt;/ 리&gt; </ol></li><li> 다음과 같은 방법으로 MEA에 스텐실을 맞 춥니 다 : <ol><li> 지정된 마이크로 매니퓰레이터에 스텐실을 놓습니다. 정확하게 전극 패턴 구조를 맞추고 MEA 표면 (그림 2B)에 배치 될 때까지 스텐실을 낮추기 위해 거꾸로 현미경을 사용합니다. 참고 : 잘 청소 MEA와 연락이 PDMS와 MEA 자체 사이의 경쟁 접착력을 제공합니다. </li><li> 미세 조작기를 올리고, 필요한 경우가 MEA로부터 분리 방지 위에 PDMS 압력 소량 적용 핀셋을 사용한다. </li><li> 조심스럽게 MEA 표면에 스텐실을 누르면 단단히 부착, 잘 정렬되어 있는지 확인하기 위해 현미경을 사용합니다. (도 2C-D). </li></ol></li><li> 15 분 동안 진공 챔버에서 MEA를 배치; 스텐실에 PDL의 1 ml의 드롭을 넣어. </li><li> 20 분 각각 진공 챔버로 2 회를​​ 삽입합니다. 인큐베이터에서 O / N 건조 PDL을 남겨주세요. </li><li> 도금하기 전에, 다자간 환경에서 PDMS에게 스텐실을 제거하고 w 멸균 사용하여 세척ater에. 7 분 동안 UV 조명 아래에 배치합니다. </li></ol> 4. 해​​부와 문화 <ol><li> 헤르 조그 외. 2011 21에 기술 된 바와 같이 문화를 준비합니다. </li></ol> 5. 도금 <ol><li> 혈구 (결과에서 논의 된 회로의 크기에 따라 최적의 농도)을 사용하여, 도금에 필요한 세포의 수를 계산한다. <ol><li> 반드시 계산 챔버 (혈구)를 확인 깨끗하고 그것에 커버 슬립 (청소 사용 알코올)을 배치합니다. </li><li> 매체 (1:20 희석) 190 μL의 도금에서 세포 현탁액 10 μL 희석. </li><li> 로드 (10) 카운팅 챔버의 에지 상으로 희석하고 셀 μL 천천히 자체를 채울 수 있도록 챔버 세포를 피펫. </li><li> 거꾸로 현미경을 사용하여 혈구 그리드를 시각화. 다이렉트 카운팅함으로써 챔버 내의 세포 수를 (건강한 세포가 둥글게한다)을 결정. 큰 광장 witho 내에서 세포를 계산가장자리를 횡단하는 사람들을 UT. </li><li> 세포의 농도를 계산한다 : 세포의 총 수 / 1000 μL = 희석 배수 × × 104 (혈구의 영역) 계산 총 세포. 참고 : 예를 들어, 희석 배수가 20이었고, 계산은 전체 셀 (100)과 같다 : 100 × 20 × 104 = 0.1 × 10 7 세포 / μL 1000 또는 1 × 10 1백분의 6 μL. 0.75 × 106 세포 판형하기 위해, 세포 중 75 μl를 취할. </li></ol></li><li> 단일 MEA 또는 페트리 접시 당 도금에 필요한 세포의 수를 고려해야 응집을 방지하기 위해 세포를 재현 탁하고, patternate 영역의 상단에, 중앙에 그들을 플레이트 (필요한 경우에는 배지에 세포를 희석 할 수있다) . MEA를 들어, 중간에 100 μL 드롭을 배치합니다. 커버 슬립의 경우, 중간에 1000 μL 드롭을 배치합니다. </li><li> 40 분 동안 37 ° C에서 도금 세포를 품어. 1까지, 도금 세포에 도금 매체 추가MEA mL 당 및 커버 슬립 당 ​​2 ml의. </li><li> 0.5 펜 연쇄상 구균, 2 % B-27와 0.75 % 루타가 풍부한 신선한 성장 배지로 희석, 4 일마다 37 ° C로 유지하고. </li><li> 또는 폐해를 방지하기 위해 다른 항 유사 분열 제 6/7 DIV에서, 섬 사이의 연결을 본 후, 10 ㎕의 매체에 희석 / ㎖ FUDR은 (12.5 ml의 MEM (최소 필수 중간 이글) 25 mg을 우리 딘 + 62.5 mg을 유리 딘) 자라. </li></ol>

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기능적으로 상호 연결된 회로로 구성된 시험 관내에서 2D 모듈러 신경 네트워크를 성장 프로토콜을 설명한다. 절차는 세포 접착층을 패턴에 기초한다. 패터닝 PDMS 스텐실 원하는 네트워크 아키텍처의 음 재생 기능에 의해 달성된다. PDMS 스텐실 셀룰러 접착제 층이 증착되는 영역을 정의한다. 세포가 도금되면, 그들은 자발적으로 코팅 된 섬에 조립하고 활성 간 연결 회로에 자기 조직화. MEA의 칼슘 이미징을 사용하여 기록 기능 모듈 형 네트워크의 녹음이 제시되었다. 제시된 프로토콜은 정식으로 처음 다음 절차에 비해 수정되었습니다. 첫째, PDMS 스텐실 &#39;정렬에 문제가 해결되어야했다. 정렬 (스텐실 표면을 만진 후,이 위치를 변경하지 않는 것이 좋습니다) 첫 번째 시도에서 달성해야하기 때문에,이 문제는 해결되었습니다수동 절차를 포기하고 MEA 기록 영역에서 정확한 공판 증착 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 수행하는 새로운 방법에 대한 옵트. 해결되어야하는...

실험적이고 이론적 인 증거는 뇌 일시적 서로 다른 기본 성형 및 뇌의 상태와 상호 작용하는 동적 기능 유닛으로 간주 될 수있는 셀 어셈블리 1-5의 배위 활성화를 통해 동작 할 가능성을 지원한다. 기능 모듈 방식에 의존하고 또한 뇌 회로의 구조적 -6,7- 모듈러 조직과 관련된다. 어떻게 기능과 뇌 회로의 구조가 서로 서로를 형성하는 것은 여전히​​ 신경 과학의 주요 열려있는 질문 중 하나입니다. 이 질문에 대한 깊은 이해를 제공하기 위해, 그것이 해결하는 것이 가능하다, 여기서 적어도 부분적으로, 이러한 문제를 최적 실험 프레임 워크를 파악하는 것이 중요하다. 생체 내 실험에서 신경 네트워크의 시공간적 역학의 조작을 제어하기 때문에 체외 신경 네트워크 모델의 개발이 용이 ACC 인해 상당한 관심의 대상이며, 도전essibility, 모니터링, 조작 및 8,9 모델링. 최근, 진보 된 기판의 패터닝 방법에 의해 지원되는 기술에 대한 시험 관내 소정 모듈러 구조 (3)의 범위를 개발하기 위해 부과 된 토폴로지 (10)와 네트워크의 기능적 특성을 연구하는 신경 네트워크를 유도 할 수있다. 특히, 방법은 최근 4,11 물리적 제약을 부과하여 네트워크를 구성하는 데 사용 하였다. 실제로, 신경 네트워크의 구조 및 기능 사이의 관계를 연구하는 신경 세포의 상호 작용을 어셈블리 단순화하지만 그럴듯한 표현을 제공하기 위해, 시험 관내 시스템은 상호 접속 된 신경 하위 집단을 제공한다. 널리 연구 2D 균질의 연결을 문화는 회로의 자기 조직 응급 배선에 어떤 공간 제약을 부과하지 않습니다. 따라서 가능한 접근 방법은 말다툼에서 다른 신경 세포 인구의 위치를​​ 인위적으로 상호 연결된 셀 어셈블리입니다 모양ially 별개의 영역. 이 지역들 사이의 거리가 간 어셈블리 연결을 방지하지 않습니다. 네트워크 복잡성 상당한 오버 제어를 유지하면서 이러한 접근법은 동기화 모델 6,7,12의 풍부한 레퍼토리를 제공하는 것으로 나타났다. 모듈의 연결 조립체의 재현성 배양을 용이하게하기 위해, 프로토콜은 제시되고 설명된다 축삭 및 수상 돌기로 연결된 뉴런 네트워크 클러스터로의 자기 조직화를 조립한다. 의 연결을 문화의 물리적 제한에 대한 고분자 구조는 polydimtheylsiloxane (PDMS)에서 작성되었습니다. PDMS는 널리 가스 (13)에 생체 적합성, 투명성과 투과성 때문에 생물 의학 응용 프로그램에 사용되는 엘라스토머이다. PDMS 스핀 코팅 잭맨 등 알에서 전술 한 바와 같이 &quot;마스터&quot;에 액체 PDMS를. (16) T에 의해 2075 14,15 구조를 준비하고 미세 가공 SU8에서 제외됩니다그는 다른 크기의 간 연결 모듈로 구성되어 신경 네트워크를 패턴 화 달성 그들은 모두를 성공적으로 된 커버와 마이크로 전극 배열 (다자간) 17 ~ 20에서 얻어졌다. 모듈들 사이의 연결 밀도는 모듈들 사이의 일시적인 동기 상태로 균일 문화 전형적인 완전히 동기화 된 네트워크에서, 네트워크 동기화의 기능을 변경할 수있다.

<table><tbody><tr><td>PDMS, Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nalgene 진공 챔버</td><td>Thermo</td><td>5305-0609</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lysine PDL</td><td>Sigma</td><td>P7886</td><td></td></tr><tr><td>실리콘 그리스 - SILICAID 1010</td><td>aidchim Ltd</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>스핀 코터</td><td>Laurell - Technologies Corporation</td><td>WS-650-23</td><td></td></tr><tr><td>12웰 배양 플레이트</td><td>시그마</td><td>CLS3336</td><td></td></tr><tr><td>5-플루오로-2'-데옥시우리딘</td><td>시그마</td><td>F0503</td><td></td></tr><tr><td>우리딘</td><td>시그마</td><td>U3003</td><td></td></tr><tr><td>MEA1060-Inv-BC</td><td>다중 채널 시스템</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TC02</td><td>다중 채널 시스템</td><td></td><td></td></tr><tr><td>펜 연쇄상 구균</td><td>생물학 산업 Beit Haemek</td><td>03-033-1C</td><td></td></tr><tr><td>B-27</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>glutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>MEM 최소 필수 매체 독수리</td><td>생물학 산업 Beit Haemek</td><td>01-025-1B</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 전극 어레이 4Q</td><td>다중 채널 시스템</td><td>60-4QMEA1000iR-Ti-pr</td><td>청소 설명서: <a href="http://www.multichannelsystems.com" target="_blank">http:// www.multichannelsystems.com</a></td></tr><tr><td>실리콘 웨이퍼</td><td>microchem</td><td>SU8-2075</td><td>준비 프로토콜: <a href="http://www.microchem.com" target="_blank">http://www.microchem.com</a></td></tr></tbody></table>

설계, 치료, 세포 도금 및 기능적으로 간 연결 회로의 구성, 모듈 형 신경 네트워크의 배양 표면

Design, Surface Treatment, Cellular Plating, and Culturing of Modular Neuronal Networks Composed of Functionally Inter-connected Circuits

뇌는 조정 활성화 및 신경 어셈블리의 동적 통신을 통해 작동합니다. 가장 큰 의문은 가장 다양한 뇌 기능의 기초가 동적 모티프의 광대 한 레퍼토리는, 뇌 회로의 고정 위상 및 모듈 형 조직에서 나올 수있는 방법이다. 고유 실험 어려움을 제시 신경 회로의 생체 내 연구에 비해 체외 준비가 조작하고 실험 신경 시스템의 구조적, 역학적, 화학적 특성을 조사하기 위해 훨씬 더 큰 가능성을 제공합니다. 이 작품은 공간적으로 별개의, 기능적으로 상호 연결된 신경 어셈블리로 구성 모듈 형 네트워크의 성장 수있는 시험 관내 실험 방법을 설명합니다. 프로토콜 복잡도의 위상 다른 레벨에서 신경 네트워크의 2 차원 구조를 제어한다. 원하는 네트워크 패턴이 될 수 있습니다일반 커버 슬립 기판 내장 된 마이크로 전극 배열에 모두 달성했다. 미세 가공 된 구조물은 실리콘 웨이퍼 상에 양각 및 원하는 네트워크 아키텍처의 부정적인 특징을 통합 생체 적합성 고분자 스텐실을 만드는 데 사용된다. 스텐실은 세포 접착을 촉진하는 분자 층으로 표면 코팅 과정 동안 배양 기판 상에 배치된다. 스텐실 제거한 후, 뉴런 도금 이들은 자발적 코팅 분야로 재. 구획 간 거리가 감소함으로써, 격리 또는 상호 연결된 하나의 연결 회로를 얻을 수있다. 세포 생존을 촉진하기 위해, 세포는 배양 접시의 외주에 위치하고지지 신경 네트워크와 공 배양된다. 기판 매립 마이크로 전극 배열 및 칼슘 이미징을 사용하여 각각 얻어진 모듈러 네트워크 활동의 전기 생리 광학 녹음 제시된다. 각 모듈은 spont을 표시하는 동안aneous 글로벌 동기화가 모듈 간 동기화의 발생 회로들 사이의 연결 밀도에 의해 조절된다.

약 100 ㎛의 두께를 갖는 특징 실리콘 웨이퍼 상 SU8-2075 PDMS 몰드를 형성하기 위해 사용되었다. 패턴은 변의 길이와의 거리가 200 내지 700 ㎛의 (도 1b)를 가변하여, 여러 사이즈의 사각형으로 구성되었다. 사각형의 크기와 20 배 목표의 (측면 길이 &lt;400 μm의와 섬에 대한) (측면 길이 &lt;800 μm의와 섬에 대한) 10 배의 시야에 맞게 선택되었다. 세 개의 매개 변수, 즉 회로 사이의 도금 셀 밀도, 거리, 회로 &#39;크기는 단층 또는 클러스터를 얻는 회로뿐만 아니라 그들의 부과 연결을 형성하기위한 결정이다. 그러나, 이들 파라미터들은 자발적 회로 &#39;크기 증가 접속을 확립 확률, 두 회로 사이의 고정 된 거리 주어진 보낸 독립적이지. ~ 300의 작은 신경 모듈,이 작품에서 논의 된 예에서 X 300 μm의, 연결거리가 ~ 300보다 크지 때 설립되었다 - 400 μm의, 동안 많은 신경 모듈 ~ 거리가 작은 ~ 700 μm의 때 700 X 70...

이 원고는 공간적으로 제한, 기능적으로 상호 연결된 신경 회로로 구성된 체외 모듈 형 네트워크에서 성장하는 프로토콜을 설명합니다. 마스크는 폴리머 기판 위에 배양 세포 접착을 촉진하는 단백질 패턴 층을 사용한다. 도금 뉴런 코팅 분야 자발적인 연결을 설정 및 전기 생리 활성을 나타내는에서 성장.

The brain operates through the coordinated activation and the dynamic communication of neuronal assemblies. A major open question is how a vast repertoire ...

이 절차의 전반적인 목표는 공간적으로 제한되고 기능적으로 서로 연결된 신경 회로로 구성된 인비트로(in vitro) 모듈형 네트워크를 배양하는 것입니다. 이를 위해 먼저 배양 기질 위에 세포 접착을 촉진하는 단백질 층을 패턴화하기 위한 PDMS 스텐실을 준비합니다. 두 번째 단계는 배양 기질을 세척하는 것입니다.구체적으로 페트리 접시, 커버 슬립 및 다중 전극 어레이의 표면이 해당됩니다. 다음으로, PDMS 스텐실을 배양 기질 위에 올려놓고 원하는 접착 단백질 층 패턴을 형성합니다. 마지막 단계는 신경 글리아 세포를 도말하는 것입니다.최종적으로, 다중 전극 어레이 기록과 칼슘 이미징을 사용하여 구현된 모듈형 신경망의 역동성을 보여줍니다. 이 방법은 신경 집합체 간의 통신 역동성을 조사하는 것과 같이 신경과학 분야의 주요 미결 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며, 대조 실험 조건이 함께 마련될 것입니다. 폴리메틸실록산 또는 PDMS는 먼저 경화제 1분량을 베이스 제제 10분량과 혼합하여 만듭니다.5분 동안 혼합한 후, 혼합물을 진공 챔버로 옮겨 15분 동안 둡니다. 15분 후 기포 발생 여부를 확인하고, 용액을 다시 챔버에 넣어 15분 더 유지합니다. 그 다음, 스핀 코더에서 웨이퍼를 준비합니다.질소 가스 밸브를 엽니다. 웨이퍼를 스피너 위에 올리고 진공으로 고정합니다. 그런 다음 웨이퍼 위에 PDMS를 얇게 붓습니다.웨이퍼를 PDMS와 함께 1000 RPM에서 1분간 회전시켜 웨이퍼 위에 100 micron 두께의 PDMS 코팅층을 형성합니다. 그런 다음 웨이퍼를 100 °C로 설정된 핫플레이트로 옮깁니다. 그 상태로 30분 동안 베이킹합니다.PDMS가 경화된 후, 피펫을 사용하여 스텐실 경계선을 따라 PDMS를 추가로 도포합니다. 그 다음, 웨이퍼 위에서 추가된 PDMS를 베이크합니다. 이전과 마찬가지로 PDMS 경계선이 경화되면, 경계선을 따라 스텐실을 절단하고 웨이퍼에서 실리콘 스텐실을 떼어내어 RINs를 시작합니다.23 millimeter 정사각형 유리 커버슬립을 증류수로 세척한 후, 70% ethanol, 아세톤, 이소프로판올 순으로 세척하고 마지막으로 증류수로 헹굽니다. 다시 질소 가스 기류 하에서 정사각형 커버슬립들을 건조시킵니다. 다음으로, 각 커버슬립 위에 패턴이 형성된 PDMS 스텐실 하나를 부드럽게 누릅니다.스텐실이 부착된 커버슬립을 진공 챔버에 넣고 15분 동안 처리합니다. 진공 처리가 끝나면, 스텐실 위에 PDL 1 mL를 떨어뜨리고 어셈블리를 다시 진공 챔버에 넣어 20분 동안 처리합니다. 20분 진공 사이클을 한 번 더 반복한 후, 다음 날까지 PDL을 밤새 건조시킵니다.네트워킹 세포를 배양할 페트리 접시를 준비합니다. 먼저, 3.5 centimeter 접시에 PDL 1 milliliter를 넣고 2시간 동안 처리합니다. 이후 실온에서 흡입법으로 접시의 PDL을 제거합니다.그런 다음 증류수로 접시를 세척하고 건조시킵니다. 접시가 마르면 커버슬립의 네 모서리에 맞춰 소량의 실리콘 그리스를 접시에 도포합니다. PDMS 면이 위를 향하도록 커버슬립을 접시 위에 올리고, 가볍게 눌러 완전히 부착되었는지 확인합니다.이제 커버슬립에서 PDL 패턴만 남기고 A-P-D-M-S를 핀셋으로 조심스럽게 제거합니다. 마지막으로 디쉬를 7분 동안 UV에 노출시켜 멸균합니다. 먼저, 다중 전극 어레이(multi electrode array)를 수돗물로 세척하여 깨끗이 닦아낸 후, 농축 효소 세제에서 초음파 세척합니다.이 단계들을 세 번 반복하십시오. 그 후 후드 아래에서 순수 증류수로 MEA를 세 번 초음파 처리하십시오. 처리 전에는 MEA를 증류수로 세척하십시오.UV 광선으로 30분 동안 멸균합니다. 다음으로, 지지 네트워크를 먼저 준비합니다. PDMS를 12-well 또는 24-well 플레이트에 붓습니다.PDMS가 경화되면 바늘을 사용하여 제거합니다. 이제 디스크 중앙에 구멍을 내어 링 형태로 절단하며, 이는 몰드 지지대로 사용됩니다. 이 몰드 지지대를 MEA 중앙에 배치하고 MEA의 외부 노출 표면을 덮습니다.이를 상온에서 2시간 동안 방치하십시오. 그 다음 PDL 세척액과 증류수를 사용하여 MEA의 외부 노출 표면을 흡입 제거하고, MEA가 건조될 수 있도록 몰드 지지대를 제거하십시오. 이제 도립 현미경 하에서 준비된 마이크로 매니퓰레이터에 스텐실을 부착하십시오.패턴 구조를 검사하고 MEA의 전극과 일치하도록 정렬합니다. 그다음 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 스텐실을 MEA 표면으로 내립니다. 부착되면 마이크로 매니퓰레이터를 들어 올리고, 필요한 경우 핀셋을 사용하여 PDMS가 떨어지지 않도록 약간의 압력을 가합니다.이제 MEA를 진공 챔버로 옮겨 15분 동안 둡니다. 그 다음 스텐실에 PDL 1 mL를 한 방울 떨어뜨리고 진공 챔버로 다시 옮겨 20분씩 2회 사이클을 수행합니다. 다음 날까지 PDL을 하룻밤 동안 건조시킵니다.핀셋을 사용하여 측정 장치에서 P DM S 스텐실을 제거하십시오. 마지막으로, 측정 장치를 7분 동안 UV 멸균하십시오. 그러면 준비 배양 세포를 위한 준비가 완료되며, 텍스트 프로토콜에 따라 현탁액을 준비하십시오.필요한 수의 세포를 부유시킨 후, MEA 또는 커버슬립의 패턴 영역 중앙에 분주하십시오. MEA에는 100 µL를 로딩해야 하며, 커버슬립에는 1000 µL까지 수용 가능합니다.플레이트의 세포를 40분 동안 배양한 후, 4일마다 세포 유지를 위해 플레이팅 배지를 추가합니다. 보충제가 첨가된 신선한 성장 배지를 다시 추가합니다. 6일 또는 7일 후에 모듈 간의 신경 연결이 형성되기 시작할 것입니다.글리아 세포의 과도한 증식을 방지하기 위해 항분열제로 배양액을 희석합니다. 인비트로(in vitro) 배양 4일 후, 14일이 지나면 600 microns square 크기의 PD DL 코딩 스팟 내에 뉴런이 부착된 것을 관찰할 수 있습니다. 배양 과정에서 뉴런은 모듈 내부 및 모듈 간에 자발적으로 연결을 형성하여 활성 기능 네트워크를 구축합니다.도말 농도를 동일하게 유지하면서 PDMS 피처 크기를 조절하여 300 micron 정사각형의 신경 회로를 관찰하였습니다. 배양된 네트워크의 광범위한 활성도를 확인하기 위해 Forex 대물렌즈를 사용하여 칼슘 이미징을 수행하였습니다. 녹색 모듈과 분홍색 모듈 사이에는 더 많은 수의 연결이 관찰된 반면, 파란색 및 빨간색 모듈은 다른 모듈과의 연결성이 더 낮게 나타났습니다.100만 픽셀 이미지로 30Hz에서 획득한 동영상에 대한 칼슘 이벤트 시작 시점의 로스터 플롯(roster plot)이 제시되어 있습니다. 녹색 및 분홍색 모듈은 매우 높은 동기화를 보인 반면, 파란색 및 빨간색 모듈은 동기화 정도가 낮았습니다. 따라서, 세 개의 서로 다른 회로로 구성된 피질 모듈 네트워크를 in vitro 21일 차에 기록하였습니다.MEA를 사용하여 약 600 µm 거리에 있는 신경 회로들이 서로 연결되어 있음을 확인하였습니다. 이들의 전기생리학적 활성을 재구성하였습니다. 정밀한 타이밍 스파이크 검출 알고리즘을 사용하여, 색상으로 구분된 클러스터 데이터가 포함된 5분간의 데이터 로스터 플롯을 작성하였습니다.본 과정은 전체 네트워크와 단일 클러스터의 활성도를 비교하며, 클러스터 내 동기화에 대한 통찰을 제공합니다. 이 영상을 시청한 후에는 PDM 스텐실을 준비하고 이를 사용하여 신경교세포의 부착 패턴을 형성함으로써 기능적 모달 네트워크를 구축하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 프로토콜은 설정을 돌보는에서 녹음 및 전기 MEAs의 문화를 자극하기 위해 필요한 정보를 제공합니다.

어떻게 문화, 기록 및 미세 전극 배열에의 연결을 네트워크를 자극 (MEAs)에

다목적 플라즈마 리소그래피 기술은 휴대폰 첨부 파일을 안내에 대한 안정된 표면 패턴을 생성하기 위해 개발되었습니다. 이 기술은 천연 조직을 모방하고 몇 가지, 서로 다른 세포 유형을 공부에 사용되었음을 포함 셀 네트워크를 만들어 적용할 수 있습니다.

세포 네트워크의 창조를위한 플라즈마 리소그래피 표면 Patterning

이 비디오는 해마 뉴런이 있는 평면 미세 전극 어레이에 결합된 3D 뉴런 배양의 발달을 보여줍니다. 분리된 뉴런은 미세 전극 어레이의 활성 영역에서 2D 네트워크를 형성하고 멤브레인 인서트가 있는 다중 웰 플레이트의 유리 마이크로비드에 부착됩니다. 이러한 뉴런 코팅된 마이크로비즈를 전극으로 전달하면 상호 연결된 3D 신경망으로 구성됩니다.

micro-electrode arrays에 결합된 3차원 뉴런 네트워크 구축

이 비디오는 모듈러 뉴런 네트워크를 구축하기 위해 패턴화된 다중 전극 어레이(MEA)에서 뉴런 세포를 배양하는 과정을 보여줍니다. 이 방법을 사용하면 신경 신호 전달 및 세포 상호 작용을 연구할 수 있습니다.

Constructing Patterned Neuronal Circuits on a Multi-Electrode Array

하나의 신경 세포의 미세 유체의으로 배열 및 생체 적합 물질 코팅의 칩 플라즈마 패턴 물 마스킹을위한 프로토콜을 설명합니다. 고도로 상호 공동 배양은 최소 셀 입력을 사용하여 제조 될 수있다.

단일 셀의 정밀도와의 연결을 공동 문화의 준비

이 연구에서는 3D 뉴런 배양이 평면 MEA(Micro-Electrode Arrays)에 결합되는 새로운 실험 모델을 presented. 3D 뉴런이 유리 마이크로비즈로 구성된 골격에 뉴런을 파종하여 네트워크를 구축하고, 그 위에서 뉴런이 자라나 상호 연결된 3D 구조를 형성합니다.

마이크로 전극 배열에 3D 엔지니어링의 연결을 문화의 인터페이스 : 혁신을<em&gt; 체외</em&gt; 실험 모델

이 원고는 마이크로 조직 공학 신경 네트워크의 제작에 대해 자세히 설명합니다. 3 차원 크기의 마이크론 크기의 구조물은 관 모양의 하이드로 겔에 둘러싸인 집적 된 신경 세포군에 걸친 길쭉한 정렬 축색관으로 구성됩니다. 이러한 살아있는 비계는 신경 회로를 재구성하거나 조절하기위한 기능적 중계 역할을하거나 회색 - 흰색 물질 신경 조직학을 모방 한 생물 여과 테스트 베드 (bifidelic test-bed) 역할을 할 수 있습니다.

신경 시스템 재구성, 변조 및 모델링을 위해 해부학 적으로 영감을받은 3 차원 미세 조직 공학 신경 회로망

이 프로토콜에서 결합 해리 인간의 pluripotent 줄기 세포 파생 뉴런에 대 한 재현 방법에 설명 하 고 이다 3D에 범위 cocultures, 무료 부동 조건, 그리고 이후 이러한 분야를 유지 하 immunoanalysis와 multielectrode 배열 녹음 분야의 측정 시 냅 스 회로 활동.

3D Cocultures 이다 인간 만능 줄기 세포에서 신경 세포의 시 냅 스 마이크로 회로 모델링

이 프로토콜 문화 분류 기본 murine 뉴런을 플라스틱 칩의 사용을 설명 합니다. 이 칩은 소, 사용자 친화적인, 고해상도와 호환, 라이브, 그리고 형광 영상. 이 프로토콜에서는 이러한 칩 내 쥐 hippocampal 신경 격판덮개 유체 절연, axotomy 및 immunostaining을 수행 하는 방법을 설명 합니다.

Compartmentalizing 기본 Murine 뉴런에 대 한 조립된 플라스틱 미세 칩의 사용

이 프로토콜은 인간 줄기 세포로부터 분화된 배양 뉴런에 순환 올레핀 공중합체로 성형된 구획화된 미세 유체 칩의 사용을 입증한다. 이 칩은 기존의 구획 형 폴리 (디메틸 실록산) 장치보다 사전 조립되고 사용하기 쉽습니다. 바이러스성 표지, 유동성 격리, 축사 절제술 및 면역 염색을 포함하여 다중 일반적인 실험 패러다임은 여기에서 기술됩니다.

사전 조립된 플라스틱 미세유체 칩 내에서 인간 줄기 세포 유래 뉴런의 구획화

마이크로미터 규모의 3D 프린팅을 통해 신경 세포 배양을 위한 고분자 장치의 신속한 프로토타이핑이 가능합니다. 원리 증명으로, 뉴런 사이의 구조적 연결은 신경돌기 성장에 영향을 미치는 장벽과 채널을 만들어 제한되었으며, 이러한 조작의 기능적 결과는 세포 외 전기 생리학에 의해 관찰되었습니다.

2광자 중합 마이크로 스케일 신경 세포 배양 장치의 3D 프린팅

배우세요 PDMS 스텐실을 이용한 단백질 패턴화로 신경교세포를 배양하여 공간적으로 제한된 기능적 신경 회로를 구성하는 방법입니다. 이 기법은 전기생리학적 연구에 활용됩니다.

설계, 치료, 세포 도금 및 기능적으로 간 연결 회로의 구성, 모듈 형 신경 네트워크의 배양 표면

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