설계, 치료, 세포 도금 및 기능적으로 간 연결 회로의 구성, 모듈 형 신경 네트워크의 배양 표면

이 절차의 전반적인 목표는 공간적으로 제한되고 기능적이며 상호 연결된 신경 회로로 구성된 체외 모듈식 네트워크를 성장시키는 것입니다. 이는 먼저 PDMS 스텐실을 준비하여 배양 기질에 대한 세포 접착을 촉진하기 위해 단백질 층을 패턴화함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 배양 기질을 청소하는 것입니다.

특히 페트리 접시의 표면, 커버 슬립 및 다중 전극 어레이. 다음으로, PDMS 스텐실이 배양 기질에 증착되고 원하는 접착 단백질 층 패턴이 생성됩니다. 마지막 단계는 신경 신경교세포(neuronal glial cell)의 도금입니다.

궁극적으로, 다중 전극 어레이 기록과 칼슘 이미징은 달성된 모듈식 뉴런 네트워크의 역학을 보여주는 데 사용됩니다. 이 방법은 신경 세포 어셈블리 간의 의사 소통 역학 조사와 같은 신경 과학 분야의 주요 미해결 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며 실험 조건에 대응할 수 있습니다. 폴리메틸 소안 또는 PDMS는 먼저 1부 경화제와 10부의 염기제를 혼합하여 만듭니다.

5분 동안 혼합한 후 혼합물을 진공 챔버로 15분 동안 옮깁니다. 15분 후 기포가 있는지 확인하고 용액을 챔버에 15분 더 반환합니다. 다음으로, 스핀 코더에서 웨이퍼를 준비합니다.

질소 가스용 가스 손잡이를 엽니다. 스피너에 웨이퍼를 놓고 진공 청소기로 제자리에 고정합니다. 그런 다음 웨이퍼 위에 PDMS의 얇은 층을 붓습니다.

1000RPM으로 1분 동안 PDMS로 웨이퍼를 회전시켜 웨이퍼에 100미크론 두께의 PDMS 코팅을 만듭니다. 그런 다음 웨이퍼를 섭씨 100도의 핫 플레이트로 옮깁니다. 30분 동안 거기에서 굽습니다.

PDMS가 경화된 후 피펫을 사용하여 더 많은 PDMS로 스텐실 경계의 윤곽을 그립니다. 그런 다음 추가된 PDMS를 웨이퍼에 굽습니다. 이전과 마찬가지로 PDMS 테두리가 굳어지면 웨이퍼에서 실리콘 스텐실을 경계선으로 잘라 RIN을 시작합니다.

23mm 정사각형 유리 덮개는 증류수, 70% 에탄올, 아세톤, 이소프로판올, 마지막으로 증류수로 미끄러집니다. 다시 말하지만, 질소 가스 스트림 아래에서 사각형을 건조시킵니다. 그런 다음 각 커버 슬립에 하나의 패턴 PDMS 스텐실을 부드럽게 누릅니다.

스텐실이 있는 커버 슬립을 진공 챔버에 15분 동안 넣습니다. 진공 청소가 완료되면 PDL 1밀리리터를 스텐실에 떨어뜨리고 어셈블리를 20분 동안 진공 챔버에 다시 넣습니다. 20분 진공 사이클을 한 번 반복한 다음 다음 날 PDL을 밤새 건조시킵니다.

네트워킹 셀을 지원할 페트리 접시를 준비합니다. 첫. 3.5cm 접시를 PDL 1밀리리터로 2시간 동안 덮습니다. 나중에 실온에서 흡인으로 접시에서 PDL을 제거합니다.

그런 다음 증류수로 접시를 씻고 말리십시오. 접시가 건조되면 커버 슬립의 네 모서리에 따라 접시에 소량의 실리콘 그리스를 추가합니다. PDMS가 위를 향하도록 접시에 커버 슬립을 놓고 부드럽게 눌러 부착되었는지 확인합니다.

이제 A-P-D-M-S를 부드럽게 핀셋으로 잡아 커버가 미끄러져 PDL 패턴을 남깁니다. 마지막으로 접시를 자외선에 7분 동안 노출시켜 살균합니다. 먼저 다중 전극 어레이를 수돗물로 세척하여 세척한 다음 농축 효소 세제로 초음파 처리합니다.

이 단계를 세 번 반복합니다. 그런 다음 MEA를 순수한 증류수에서 세 번 초음파 처리 한 후 후드 아래에서 초음파 처리합니다. 전에 MEA를 증류수로 세척하십시오.

자외선으로 30분 동안 살균합니다. 다음으로 먼저 지원 네트워크를 준비합니다. PDMS를 12웰 또는 24웰 플레이트에 붓습니다.

PDMS가 굳으면 바늘로 제거합니다. 이제 디스크 중앙에 구멍을 뚫어 곰팡이 지지대로 작동하는 고리를 만듭니다. 이제 MEA 중앙에 금형 지지대를 배치하고 MEA의 외부 노출 표면을 덮습니다.

방에서 2시간 동안 그대로 두십시오. 그런 다음 PDL 세척, MEA의 외부 노출 표면을 증류수로 흡인하고 MEA가 건조될 수 있도록 금형 지지대를 제거합니다. 이제 도립 현미경으로 준비된 마이크로 매니퓰레이터에 스텐실을 부착합니다.

MEA의 전극과 일치하도록 패턴화된 구조를 검사하고 정렬합니다. 그런 다음 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 스텐실을 MEA 표면으로 내립니다. 부착되면 microm 매니퓰레이터를 올리고 필요한 경우 핀셋을 사용하여 PDMS가 분리되는 것을 방지하기 위해 소량의 압력을 가합니다.

이제 MEA를 15분 동안 진공 챔버로 옮깁니다. 그런 다음 PDL 1ml 방울을 스텐실에 바르고 20분씩 2회 주기 동안 진공 챔버로 돌아갑니다. 다음날 PDL을 밤새 말리십시오.

핀셋을 사용하여 측정에서 P DM S 스텐실을 제거합니다. 마지막으로 UV로 7분 동안 meas를 살균합니다. 그런 다음 준비 세포에서 세포를 배양하고 텍스트 프로토콜에서와 같이 현탁액을 준비할 준비가 됩니다.

Resus가 필요한 수의 세포를 현탁시킨 후 MEA 또는 커버 슬립의 패턴화된 영역 중앙에 플레이트를 부착합니다. MEA에는 100마이크로리터 용량과 커버 슬립이 적재되어야 합니다. 1000마이크로리터를 수용합니다.

플레이트 세포를 40분 동안 배양한 다음 도금 배지를 추가하여 4일마다 세포를 유지합니다. 신선한 보충제 성장 배지를 다시 추가하십시오. 6일 또는 7일이 지나면 그 시점에서 모듈 간의 뉴런 연결이 형성되기 시작해야 합니다.

신경교세포의 과잉 증식을 방지하기 위해 배양액을 유사분열방지제(anti-mitotic agent)로 희석한다. in vitro 4일 후, 14일 후에 PD DL 내에 부착된 뉴런이 600미크론 제곱미터의 반점을 코딩하는 것을 관찰할 수 있습니다. 문화에서 뉴런은 모듈 내부와 모듈 간에 자발적으로 연결을 형성하여 활성 기능 네트워크를 형성했습니다.

300미크론 정사각형의 뉴런 회로는 동일한 도금 농도를 유지하면서 PDMS 기능 크기를 가짐으로써 관찰되었습니다. 칼슘 이미징은 배양 네트워크에서 광범위하게 활동하기 위해 Forex 목표를 사용하여 수행되었습니다. 녹색 모듈과 분홍색 모듈 사이에는 더 많은 수의 연결이 표시되는 반면 파란색 및 빨간색 모듈은 다른 모듈에 덜 연결되어 있습니다.

칼슘 이벤트 발병의 명단 플롯은 100만 픽셀 이미지와 함께 30Hz에서 획득한 영화에 대해 표시됩니다. 녹색과 분홍색 모듈은 매우 동기화된 반면 파란색과 빨간색 모듈은 덜 동기화되었습니다. 따라서 3개의 별개의 회로로 구성된 피질 모듈식 네트워크는 시험관에서 21일 동안 기록되었습니다.

MEA를 사용하여 약 600미크론 떨어진 뉴런 회로가 상호 연결된 것으로 밝혀졌습니다. 그들의 전기 생리학적 활동이 재구성되었습니다. 정확한 타이밍 스파이크 감지 알고리즘을 사용하여 이 데이터의 5분 분량의 로스터 플롯을 색상으로 구분된 클러스터 데이터로 만들었습니다.

이를 통해 전체 네트워크 및 단일 클러스터 활동을 비교하고 클러스터 내 동기화에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 PDM 스텐실을 준비하고 이를 사용하여 신경교세포의 접착을 패턴화하여 기능적 모달 네트워크를 구축하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.