고체 지질 나노 입자 (SLNs) 세포 내 타겟팅을위한 응용 프로그램
2015년 11월 17일
이 연구에서는 생체 적합성 나노 입자의 초소형 집단을 합성하는 방법과 세포 상호 작용을 평가하기 위한 몇 가지 시험관 내 방법을 설명했습니다.
이 절차의 전반적인 목표는 생체 적합성 나노 입자의 초소형 집단을 합성하고 물리적 특성을 특성화하며 입자 세포 상호 작용을 조사하는 것입니다. 이것은 먼저 위상 반전 온도 방법을 사용하여 지질 나노 입자를 합성함으로써 수행됩니다. 이 과정에서 지질과 계면활성제는 초기에 공동 용융됩니다.
일정량의 물을 첨가한 후 상 분리가 발생할 때까지 혼합물을 가열합니다. 그런 다음 혼합물을 나노 에멀젼이 생성되고 고체 지질 나노 입자 또는 sln의 합성이 완료 될 때까지 계속 교반합니다. 다음으로, 동적 광 산란 또는 DLS를 사용하여 입자 크기와 다중 분산도를 측정합니다.
시차 주사 열량계 또는 DSC는 입자를 추가로 특성화하기 위해 융점과 용융의 잠열을 측정하는 데 사용되는 추가 기술이며, 궁극적으로 형광 현미경 및 유세포 분석을 사용하여 입자 세포 상호 작용을 조사할 수 있습니다. 초 초음파 처리 미세유체 및 고압 균질화와 같은 기존 고 에너지 방법에 비해이 기술의 주요 장점은 이것이 간단하고 확장 가능한 비교적 부드러운 합성 기술이라는 것입니다. LNS를 합성하기 위해 0.6mg의 형광 염료 또는 기타 친유성 화합물과 0.10g의 선형 알칸 또는 지질을 결합합니다.
15ml 바이알 코어용융에 성분을 섭씨 90도에서 용융하고 저어준 다음 선형 비이온 계면활성제 0.11g을 추가합니다. 그런 다음 생성 된 혼합물을 섭씨 90도에서 mlt하고 저어줍니다. 다음으로, 1.79g의 멸균수를 혼합물에 넣고 섭씨 90도로 가열하고 두 단계가 관찰될 때까지 용액을 육안으로 모니터링합니다.
이제 투명한 나노 에멀젼이 형성될 때까지 혼합물을 저어줍니다. 대조군 샘플로 사용하기 위해 형광 염료를 첨가하지 않고 별도의 나노 에멀젼을 병렬로 준비합니다. 멸균 0.2 미크론 필터를 사용하여 각 나노 에멀젼을 추가로 살균합니다.
DLS를 사용하여 입자 크기를 측정하기 위해 기기 설계에서 유리를 사용하여 S lns의 입자 크기 및 폴리 분산도를 측정합니다.샘플을 측정하기 전에 두 가지 알려진 표준의 입자 크기를 표준 준비 및 측정을 위한 제조업체의 프로토콜에 따라 측정해야 합니다. 다음으로, 각각에 대해 준비된 대로 샘플을 측정합니다. 100초의 런타임, 물의 굴절률 및 섭씨 20도에서 물의 점도를 사용합니다.
DSC를 사용하여 S LNS를 약 25mg 질량의 40마이크로리터 알루미늄 팬에 넣기 위해 DSC의 첫 번째 피펫을 사용하여 S lns의 열 거동을 조사하기 위해 입자 크기 분포의 평균 입자 직경 및 폴리 분산도를 보고합니다. DSC 스캔 중 수분 손실을 최소화하기 위해 범용 크림프 프레스를 사용하여 팬을 밀폐합니다. 섭씨 5도에서 80도까지 각 나노 에멀젼을 측정하기 전에 DSC 플롯에서 융점과 용융의 잠열을 보고하며, 여기서 밸리는 융점과 곡선 아래 영역의 적분을 나타냅니다.
DSC 플롯에서 재료의 양으로 나눈 값은 용융 배양의 잠열을 나타냅니다. 1차 인간 섬유아세포(primary human fibroblasts)는 인간 진피 섬유아세포(human dermal fibroblasts)의 배양을 위한 액체 배지에서 제조업체의 지침에 따랐습니다. 저혈청 성장 보충제 키트가 보충되어 MTT 및 이미징 분석 종자 세포 모두에 대해 80% 합류점에 도달하면 섭씨 37도, 5% 이산화탄소 및 하위 배양의 가습 분위기에서 세포를 유지합니다.
20의 조밀도에 96의 좋은 판에서는, 우물 당 000의 세포. 원하는 지질 농도를 달성하기 위해 완전한 배지에서 SLM을 0으로 희석하고 SLN에 노출되기 전에 밤새 세포가 섭씨 37도에서 평형을 이루도록 하고 S lns로 배양 24시간 후 96웰 플레이트의 각 복제 웰에 웰당 10마이크로리터를 추가하고 제조업체의 프로토콜에 따라 MTT 분석을 사용하여 세포 생존력을 측정합니다. 세포를 한 번 씻고 각각에 100 마이크로 리터의 신선한 배지를 첨가하십시오.
새로운 배지로 교체하기 전에 70% 메탄올 용액에서 10분 동안 배양하여 제어 우물을 죽입니다. 마이크로플레이트의 각 웰에 웰당 10마이크로리터의 MTT 시약을 추가하고 하룻밤 배양 후 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 배양하고 제공된 세제 용액 100마이크로리터로 세포 내 형태 및 결정을 용해시킵니다. 제조업체의 프로토콜에 따라 흡광도 값을 얻기 전에 실온에서 3시간 동안 세제 용액의 세포를 배양합니다.
마이크로플레이트 리더를 사용하여 현미경 검사를 준비합니다. 섬유아세포를 멸균 인산염 부풀어 오른 식염수로 두 번 세척합니다. lns와 함께 섬유아세포를 투여한 후 특정 시점에 차가운 70% 메탄올로 10분 동안 세포를 고정합니다.
10분 후 도립 현미경을 사용하여 이미지를 캡처하기 전에 메탄올을 인산염 완충 식염수 또는 PBS로 교체합니다. 합성된 S SLN은 MTT 분석을 사용하여 평균 입자 직경이 18.59이고 폴리 분산도가 5.83인 대조군 S LNS와 평균 입자 직경이 16.87나노미터이고 폴리 분산도가 4.47인 나일 레드 로딩 SLM을 생성했습니다. 세포 대사에 대한 용량 반응 효과는 입자 농도 증가가 세포 생존율 감소로 이어지는 경우 측정되었습니다.
SLN에만 노출된 세포와 나일홍색이 투여된 세포 간의 독성 차이는 관찰되지 않았습니다. 증권 시세 표시기. 병행하여 세포가 조직 배양에 대한 순응도를 육안으로 검사했습니다. 폴리스티렌과 이미지는 대표적인 세포 형태와 시간 경과에 따른 형광 입자의 흡수를 모두 보여주기 위해 밀리리터당 5마이크로그램에 해당하는 용량을 사용하여 촬영되었습니다.
지질 입자 흡수는 노출 후 2시간까지 관찰되었습니다. 나노 입자 통합 수준은 유세포 분석을 통해 쥐 골수 유래 수지상 세포 또는 B MDC에서 나일 적색 형광의 강도를 측정하여 측정되었습니다. 사용된 SNS의 농도와 B MDC에서 평가된 형광의 양 사이의 직접적인 상관관계가 관찰되었습니다.
이 비디오를 시청한 후에는 생체 적합성 나노 입자의 초소형 집단을 합성하고, 물리적 특성을 특성화하고, 입자 세포 상호 작용을 조사하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.
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개요
이 연구는 생체 적합성 나노입자의 매우 작은 모집단을 합성하고 다양한 시험관 내 방법을 통해 그들의 세포 상호작용을 평가하는 방법을 제시합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 나노입자 합성
- 생체 적합성
- 세포 상호작용
배경
- 생물학적 시스템에서 나노입자의 거동을 이해하는 것이 중요합니다.
- 생체 적합성 나노입자는 약물 전달에 잠재적인 응용이 있습니다.
- 나노입자의 특성화는 효과적인 사용을 위해 필수적입니다.
- 시험관 내 방법은 세포 상호작용에 대한 통찰력을 제공합니다.
연구 목적
- 매우 작은 생체 적합성 나노입자를 합성합니다.
- 그들의 물리적 특성을 특성화합니다.
- 나노입자와 세포 간의 상호작용을 조사합니다.
사용된 방법
- 나노입자 합성을 위한 위상 반전 온도 방법.
- 지질과 계면 활성제의 공동 용융.
- 가열 및 위상 분리를 통한 나노 에멀젼 생성.
- 입자 크기 및 다분산도 측정을 위한 동적 광 산란(DLS).
주요 결과
- 매우 작은 지질 나노입자의 성공적인 합성.
- 물리적 특성의 특성화가 생체 적합성을 확인했습니다.
- 시험관 내 방법이 중요한 세포 상호작용을 나타냈습니다.
- 동적 광 산란이 정확한 입자 크기 측정을 제공했습니다.
결론
- 합성된 나노입자는 생물의학 응용에 유망합니다.
- 특성화 기술은 나노입자 특성을 평가하는 데 효과적입니다.
- 생체 내 상호작용을 탐구하기 위한 추가 연구가 필요합니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Solid lipid nanoparticles (SLNs) offer a scalable, biocompatible platform for intracellular targeting, enabling precise modulation of cellular signaling and gene expression in discovery workflows. Their synthesis via the phase inversion temperature method supports reproducible nanoparticle production for preclinical evaluation of drug delivery systems. This approach enhances predictive confidence in target validation by characterizing nanoparticle-cell interactions across relevant cell types.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through controlled nanoparticle delivery to primary human fibroblasts and murine dendritic cells.
- Operational Value: Provides a standardized system for assessing cellular uptake and toxicity using fluorescence microscopy and flow cytometry.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by correlating nanoparticle concentration with cellular response via MTT assay and fluorescence intensity.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative particle size and polydispersity data via DLS for formulation consistency in screening campaigns.
- Operational Value: Establishes biocompatible nanoparticle preparations suitable for high-throughput cellular interaction assays.
- Assay Readiness: Uses MTT assay to define non-toxic dosing ranges prior to mechanistic studies, improving assay window reliability.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Demonstrates intracellular targeting capability in two distinct cell types, supporting extrapolation to disease-relevant models.
- Biomarker Alignment: Facilitates fluorescent dye loading (e.g., Nile red) for tracking nanoparticle biodistribution in preclinical systems.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables go/no-go decisions based on uptake kinetics and viability thresholds observed in dose-response studies.
Pipeline & Workflow Integration
SLN synthesis and characterization fit within the discovery-to-preclinical continuum, supporting lead identification through formulation optimization and mechanistic insight.
- Discovery Biology: Tests delivery hypotheses by tracking nanoparticle internalization and cellular effects over time.
- Screening: Delivers standardized, ultra-small nanoparticles with defined size (16.87 nm) and low polydispersity (4.47) for consistent compound or probe evaluation.
- Analytics: Provides multi-parametric readouts including particle size (DLS), thermal behavior (DSC), viability (MTT), and uptake (fluorescence/flow cytometry).
- Translational Research: Bridges in vitro findings to preclinical models by demonstrating biocompatibility and cellular interaction in primary human and murine cells.
- Enterprise Reuse: Establishes a modular nanoparticle platform adaptable to various lipophilic payloads for repeated use across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in delivery studies by correlating nanoparticle dose with cellular response.
- Operational Value: Enables reproducible synthesis via a simple, scalable phase inversion temperature method without high-energy equipment.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by minimizing late-stage failure through early assessment of nanoparticle-cell interactions.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of delivery systems based on uptake efficiency and safety profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in lipid-based nanoparticle formulation and phase behavior analysis.
- Dependent on access to DLS, DSC, fluorescence microscopy, and flow cytometry for characterization.
- Necessitates standardized cell culture protocols for primary human dermal fibroblasts and murine dendritic cells.
- Requires optimization of surfactant-lipid ratios and aqueous phase volume for reproducible nanoemulsion formation.
- Limited to lipophilic payloads due to the lipid matrix encapsulation mechanism of SLNs.
