Name: 고체 지질 나노 입자 (SLNs) 세포 내 타겟팅을위한 응용 프로그램 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: 학습하세요 생체적합성 고체 지질 나노입자 합성 및 특성 분석 방법을 통해 세포와의 상호작용을 조사하는 기술입니다. 이 방법은 약물 전달 및 생의학 연구에 활용될 수 있습니다.

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이 간행물에 보고된 연구는 존스 홉킨스 응용 물리학 연구소의 연구 및 탐색 개발 부서, 기술 이전 사무소 및 스튜어트 S. 재니 펠로우십 프로그램의 지원을 받았으며 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 국립 심장, 폐 및 혈액 연구소(National Heart, Lung, and Blood Institute)의 수상 번호 R21HL127355의 지원을 받았습니다.

SLNs 1. 처리 <ol><li> SLNs의 합성 참고 : 하위 20 나노 SLNs 1을 제조 피트 방법 1,17,20을 사용합니다. <ol><li> 무균 기술, bioreagents 또는 세포 배양 등급 시약 및 살균 물질 (즉, 피펫, 주걱, 유리 병 등)를 사용합니다. </li><li> SLNs의 합성 (그림 2)에 대한 바이오 안전성 캐비닛을 사용합니다. </li><li> 형광 염료의 0.6 ㎎을 결합하고 바이알 (15 mL)에 Heneicosane (지질, 5 중량 / 중량 % 지질 농도) 0.10 g에서 공동 용융 (나일 레드 (NIR)을, NIR 농도는 약 0.3 ㎎ / ㎖ 임) 90 ° C 및 교반. </li><li> 0.11 g의 폴리 옥시 에틸렌 (10) 올레 일 에테르 (계면 활성제, 5.5 중량 / 중량 % 계면 활성제 농도)를 추가합니다. 90 ℃에서 교반하고, 생성 된 혼합물을 동시 - 용융. </li><li> 90 ° C의 혼합물, 열 멸균 물 1.79 g을 넣고, 투명 나노 에멀젼이 형성 될 때까지 저어. 참고 : 계속 교반 및 제어 냉각, SL에서NS 생성됩니다. 이러한 조건은 중유 에멀젼 유 중수 에멀젼의 반전을 일으킨다. 이러한 지질 방울에 NIR 파티션으로 친 유성 분자. </li><li> 대조군 샘플로서 기능하기 위해서는, 형광 색소를 첨가하지 않고 평행 나노 에멀젼을 제조. 90 ° C, 및 바이알에서 교반 (15 mL)을 공동으로 용융물 Heneicosane 0.10 g 및 0.11 g의 폴리 옥시 에틸렌 (10) 올레 일 에테르 결합. <ol><li> 90 ° C의 혼합물, 열 멸균 물 1.79 g을 넣고, 투명 나노 에멀젼이 형성 될 때까지 저어. </li></ol></li><li> 또한 멸균 0.2 μm의 필터를 사용하여 각각의 나노 에멀젼을 살균. </li></ol><img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53102/53102fig2.jpg" /> 그림 SLNs의 합성 2. 도식. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53102/53102fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> </li><li> 입자 크기와 폴ydispersity <ol><li> 입자 크기 및 분산도 유리 큐벳을 사용 SLNs 1 및 입자 크기를 측정하기위한기구를 측정하기 위해 동적 광산란 (DLS)을 사용한다. </li><li> 시료의 측정에 앞서, 표준 제제와 측정을위한 제조사의 프로토콜은 다음 두 가지 알려진 표준 입자 크기를 측정한다. </li><li> 표준 용액 1.5 ㎖의 유리 큐벳을 채우고 샘플과 같은 측정 조건을 사용하여 표준 용액을 측정한다. 주 : 이전 단계는 각 표준에 대해 반복 하였다. </li><li> 제조 된 샘플을 측정합니다. 각각에 대해,하기 실험 파라미터들을 사용하여 100 초, 물의 굴절율 (1.33), 물의 점도의 실행 시간을 20 ° C (1.002 MPA · 초)에서. 주 :이 기술은 주파수가 나노 입자의 크기를 측정하기 위해 광을 시프트 이용한다. </li><li> 이상적 상대의 평균 입자 직경 및 분산도를보고CLE 크기 분포. </li></ol></li><li> 녹는 점과 녹는 잠열 <ol><li> SLNs (1)의 열적 거동을 조사하기 위해 자동 샘플러 및 액체 질소 냉각 소스를 구비 시차 주사 열량계 (DSC)를 사용한다. </li><li> 약 25 밀리그램의 질량과 40 μL의 알루미늄 팬에 AS-준비 SLNs를 피펫 및 기밀 DSC 스캔 중에 수분 손실을 최소화하기 위해 보편적 크림 퍼 프레스를 사용하여 팬을 밀봉. </li><li> 5 ~ 80 ° C에서의 각 나노 에멀젼을 측정한다. </li><li> 융점 계곡 융점 물질의 양으로 나눈 DSC 플롯에서 곡선 아래 면적의 적분을 나타내는 DSC 플롯에서 용융 잠열이 융해 잠열을 나타내는보고한다. </li></ol></li></ol> 섬유 아 세포와 수지상 세포 2. SLNs 상호 작용 <ol><li> 기본 인간 섬유 아세포의 문화 <ol><li> 문화 차 인간 Fi를broblasts 낮은 혈청 성장 보충 (LSGS) 키트 보충 (106 중) 인간 피부 섬유 아세포의 배양 액체 배지에서 제조업체의 지침에 따라. 80 % 합류에 도달시, 37 ℃, 5 % CO 2에서 배양 가습 분위기에서 세포를 유지한다. </li><li> MTT 및 이미징 웰 당 2 × 104 세포의 밀도로 분석 96 웰 플레이트에 시드 세포, 및 37 ° CO / N 종래 SLN 노광에서 평형을 허용 모두. </li><li> 지질 농도에 대하여, (도 4)에 표시하고, 각 웰 당 10 μL를 추가로 타임 제로에서, 완전 배지로 희석 SLNs 96 웰 플레이트에 웰 복제. </li><li> 인큐베이션 기간 동안, 37 ° C, 5 % CO 2에서 세포를 유지한다. </li></ol></li><li> MTT 독성 분석 <ol><li> SLNs으로 배양 24 시간 후에, 제조자의 프로토콜에 따라 MTT 분석을 이용하여 세포 생존력을 결정한다. &lt;/ 리&gt; <li> 한 번 세포를 세척하고 각 웰 (100 μL / 웰)에 새로운 배지를 추가합니다. 새로운 배지로 교체하기 전에 10 분 동안 70 % 메탄올 용액에 배양에 의해 제어 우물을 죽여. </li><li> 마이크로의 각 웰에 MTT 시약 (물론 당 10 μL)를 첨가하고, 37 ℃에서 O / N을 품어. </li><li> O / N 배양 한 후, 제조 업체의 프로토콜에 따라 제공되는 세제와 세포 내 formazin 결정을 (물론 당 100 μL) 용해. </li><li> RT에서 3 시간 배양 한 후, 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 570 nm의 파장에서 측정 된 흡광도 값을 얻었다. 참고 : 3- (4,5- dimethylthiazolyl-2) -2,5- 디 페닐 테트라 졸륨 브로마이드 (V / W)은 1 % 미만이어야 사용 MTT 시약. </li></ol></li><li> 형광 현미경 <ol><li> SLN와 섬유 아세포의 투여 후 특정 시점에서, 멸균 인산 완충 식염수 (PBS)로 두 번 씻어 섬유 아세포를 차가운 70 % 메탄올로 10 분 동안 고정한다. </li><li> 10 분 후, 대역 통과 (BP) 50분의 690 nm의 필터 세트를 사용하여, 거꾸로 현미경을 사용하여 PBS 캡처 이미지와 메탄올을 대체합니다. </li></ol></li><li> 마우스 골수 수지상 세포의 문화 <ol><li> 유도 마우스 골수 유래의 수상 세포 (BMDC)는 앞서 설명한 23,24. 간략히, 재조합 쥐 과립구 - 대 식세포 콜로니 - 자극 인자 (GM-CSF, 300 U / ml) 및 재조합 뮤린 IL-4와 2 × 6 / 플레이트에서 100mm 배양 접시에서 C57BL / 10 골수 플레이트 단일 세포 현탁액 (B 세포 인자는, 200 U / ㎖의 자극). 3 일마다 미디어를 변경합니다. </li><li> 7 일째, 37 ° C에서 세포를 0.5 μg의 5.0 / ㎖ 지질의 최종 농도로 요리 근적외선 SLNs로드를 추가하고 유지, 노출, 원하는 길이의 5 % CO 2 인큐베이터. </li><li> 판의 철저한 세척 한 다음, 50 ㎖ 튜브에 수집, 판에있는 모든 미디어를 흡입하여 요리에서 세포를 수집 (느슨하게 광고를 꺼 내려4 mM의 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA)을 함유하는 인산염 완충 생리 식염수 5 ㎖ (PBS)와 내재 세포). 동일한 50 ㎖ 튜브에서 얻은 세포 현탁액을 수집한다. </li></ol></li><li> 유동 세포 계측법을 통해 SLNs 법인의 평가 <ol><li> 2.4.3 점에서 얻어진 세포 현탁액의 농도를 결정하고 12mm X 75mm의 둥근 바닥 FACS 튜브에 3 × 105 세포를 분산. </li><li> PBS 1 ㎖를 첨가 한 후 4 ℃의 온도에서, 400 XG에서 5 분 동안 튜브를 원심 분리하여 세포를 세척한다. </li><li> 상층 액을 제거하고 방지하는 CD11c-FITC 모노클로 날 항체 (0.25 μg의 / ㎖ 최종)를 함유하는 PBS / 2 mM의 EDTA / 0.1 % 소 혈청 알부민 100 ㎕ (BSA) (염색 완충액)으로 펠렛을 재현 탁. 어둠 속에서 얼음에 30 분 동안 품어. </li><li> PBS 1 ㎖로 세포를 씻어 준 후 4 ℃의 온도에서, 400 XG에서 5 분 동안 원심 분리 튜브. </li><li> 뜨는을 취소하고 각을 재현 탁염색 버퍼 400 μL로 펠렛. 셀은 유동 세포 계수기 (아마도 파란색과 빨간색 레이저가 장착)와 샘플 수집을위한 준비가되어 있습니다. </li><li> 분석 소프트웨어 유세포를 사용하는 CD11c + 세포 (FITC 양성)의 모집단에 게이팅 및 (를 PerCP-Cy5.5 또는 APC 채널에서 측정) SLNs 관련 형광의 세기를 비교하여 DC에 의한 SLNs 혼입 수준을 평가. </li></ol></li></ol>

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본 연구에서는 SLNs의 합성과 세포 내 표적 응용 프로그램에 대한 적용 가능성은 탐구했다. 이러한 생체 적합성 나노 입자는 약물 전달, 유전자 침묵, 그리고 백신 기술을 25 ~ 30 등의 여러 응용 프로그램에 대한 배송 차량 등의 약속을 보여 주었다. 초소형 SLNs가 용이 한 공정으로 합성하고, 주요 피부 세포 및 주요 면역 세포와의 상호 작용을 탐색 하였다. SLNs는 모델 치료화물을 역임 형광 염료 (NIR)의 캡슐화를 포함하도록 설계되었다. PIT SLN 방법은 얻어진 입자의 성질 (융점의 입자 크기, 분산도, 융점 및 잠열) 동적 광산란 및 시차 주사 열량계를 사용하여 평가 하였다를 합성하는데 이용 하였다. 세포 내 대상에 대한 입자 크기 및 분산 분석 좁은 분산도 초소형 SLNs의 합성을 밝혀, 이상보내고 응용 프로그램. 이전에보고 된 바와 같이, 입자 크기가 세포의 상호 작용 (12)에 중요한 역할을 할 수있다. 나노 입...

나노 입자 기반 전달 비히클은 특히 셀룰러 시그널링 및 유전자 발현을 변경하는기구를 제공하고, 세포 내 표적 애플리케이션을위한 큰 약속을 보여 주었다. 이들 차량은 약물, 단백질 및 세포 반응에 영향과 표적 조직에서 원하는 효과를 달성하도록 설계된 핵산으로 로딩 될 수있다. nanocarriers 여러 유형의 지질, 폴리머, 실리콘, 및 자성 물질을 포함하여 치료 및 진단을 위해 유익 탐구되어왔다. 이러한 시스템으로 인해 치료 목표 조직에서 농도 및 독성의 감소를 증가 지역화 된 약물 전달에 대한 자신의 잠재력에 매력적이다. 고형분 지질 나노 입자 (SLNs)는 최근 유망한 약물 전달 비히클로 떠오르고있다 나노 입자 전달 시스템의 잘 연구 된 예이다. SLNs 용이 바이오 센싱 (1), (2) 화장품 및 t를 포함하여 다수의 애플리케이션 용으로 제형 화 될 수있다herapeutic 배달 3-7. 효용성은 향상된 생체 적합성 결과, 재 흡수성, 독성 지질 전적으로 구성되어 있다는 사실로부터 유래한다. 합성 과정에서, 친 유성 약물함으로써 비경 구 투여 용 약물 용해도 및 적합성을 증가 SLN 차량에 통합 될 수있다. SLN 차량은 또한 그 분해 및 클리어런스를 감소 및 치료 작용을 극대화 캡슐화 치료학을 안정하는 것을 돕는다. 이러한 차량으로 인해 체온 3,4,8,9에서 안정성에 특히 긴 연기, 제어 방출 제제에 적합하다. 중요한 지질 나노 입자의 약물의 캡슐화는 약물 분자의 극한 약동학 프로파일을 변경. 이것은 좁은 치료 지수를 가진 약물의 제어 방출을 허용함으로써 잠재적 이점을 제공한다. SLN-혼입 치료제의 방출 속도는 조정 지질 분해 속도 또는 약물의 확산 속도에 기초 할 수있다지질 매트릭스. SLNs는 종종 특정 표적 조직에 축적하도록 설계되었습니다. 예를 들어, 크기 (전형적으로는 10 nm 이상)는 종양 조직의 새는 혈관은 증착을 용이하게 순환의 유지를 증강시켜. 또한, 입자 투여 경로는 예컨대 림프절 10,11 특정 생리 학적 구조를 대상으로 잠재적으로 생체 분포를 변경하는 것으로 나타났다. 표적 조직에 침착, 적당한 세포 상호 작용을 달성하고 궁극적으로 나노 입자의 내재화에 의한 선택적으로 셀 (12)의 밖으로 이온 및 분자의 흐름을 제어하는 세포막의 능력에 도전. 세포 흡수를 용이하게하기 위해, 펩타이드, 작은 분자 및 모노클로 날 항체 (13, 14)을 포함하여 특정 리간드 nanocarriers을 수정하는 것이 가능하다. 수동 침투 및 나노 입자의 능동 수송을 모두 포함하는 여러 메커니즘세포막 이전 3,12,15을 설명 하였다. 일반적으로, 이것은 세포 - 나노 입자의 상호 작용은 이러한 세포 형태 또는 세포주기 단계 (12)와 같은 셀 - 특정 매개 변수 외에, 크기, 형상, 표면 전하 및 표면 화학을 포함하는 나노 입자의 물리 화학적 특성에 의해 영향을받는 것으로 입증되었다. 이전의 조사는 상전이 온도 (PIT)을 사용하는 방법 (17) (16) 및 국소 바이오 마커 검출 애플리케이션 1 서브 10 나노 SLNs의 합성을 증명했다. 이것은 온도가 서서히 변화시키면서 조성물은 일정하게 유지 2 부드러운 합성법이다. 가열 된 용액의 연속 교반,로는 나노 에멀젼의 RT 결과를 냉각시킨다. 보다 작은 입자 크기를 가진 1 SLNs의 합성 과정이 결과는 이전의 NaN 지질 합성을위한 다양한 방법을 이용하여보고oparticles 17 ~ 22. 얻어진 크기 규모는, 20nm 이하는, 증가 된 표면적과 상호 작용을위한 향상된 셀룰러 전위 세포 표적화 애플리케이션을위한 이점을 제공한다. 형광 염료 또는 치료를 제공하도록 설계 SLNs의 개략은,도 1에 도시된다. SLNs는 지질 내부 (예를 들면, 선형 알칸) 친 유성 화합물 (예를 들면, 염료 또는 치료제)의 결합을 허용하고, 계면 활성제의 외관의 구성 물에 둘러싸여 (예를 들어, 선형 비이 온성 계면 활성제). 본 연구에서는 SLNs는 형광 염료로드 된 입자 세포 상호 작용을 조사하기 위해 모델로 사용. 차 인간 피부 섬유 아세포 및 마우스 수지상 세포 독성 및 흡수 입자에 대하여 상호 작용을 특성화하기 위해 시간에 걸쳐 SLN 로딩 염료를 노출시켰다. 3- (4,5- 디메틸 티아 졸 -2- 일) -2,5- diphenylphenyltetrazolium 브로마이드 (MTT) 분석은 utili이었다적당한 투여 수준을 설정하기 위해 평탄화. 형광 현미경 및 유동 세포 계측법은 시험관 내에서 입자의 흡수를 검사하기 위해 사용하는 두 가지 방법이었다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53102/53102fig1.jpg" /> 주요 성분을 표시 SLN의 그림 1. 도식. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53102/53102fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table><tbody><tr><td>나일 레드 (NiR)</td> <td>Sigma</td><td>19123</td><td>BioReagent, 형광에 적합, &ge; 98.0%</td></tr><tr><td>Heneicosane</td><td>Aldrich</td><td>286052</td><td>98%</td></tr><tr><td>Brij O10</td><td>Sigma</td><td>P6136</td><td>Brij 97, C18-1E10, 폴리옥시에틸렌 (10) 올레일에테르</td></tr><tr><td>Water</td><td>Sigma</td><td>W3500</td><td>멸균 여과, BioReagent, 세포 배양</td></tr><tr><td>주사기 필터 0.2 &마이크로에 적합합니다. m Supor Membrane Low Protein Binding</td><td>Life Sciences</td><td>PN4612</td><td>비발열성</td></tr><tr><td>Nanotrac Ultra&nbsp;</td><td>Microtrac</td><td>일련 번호 U1985IS</td><td>계기</td></tr><tr><td>시차 주사 열량계</td><td>Mettlet-Toledo</td><td></td><td>Instument</td></tr><tr><td>주요 인간 섬유아세포&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>C-004-5C</td><td>Neonatal (HDFn)</td></tr><tr><td>Medium 106</td><td>Life Technologies</td><td>M-106-500</td><td>인간 피부 섬유아세포 배양을 위한 무균 액체 배지.</td></tr><tr><td>저혈청 성장 보충제 키트(LSGS 키트)</td><td>Life Technologies</td><td>S-003-K</td><td>완전한 LSGS</td></tr><tr><td>MTT 세포 증식 분석 키트</td>의 모든 구성 요소 <td>Trevigen</td><td>4890-025-K</td><td>테트라졸륨 염, 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide(MTT)</td></tr><tr><td>Safire2 마이크로플레이트 리더</td><td>Tecan</td><td>의</td> 환원을 기반으로 세포 증식 측정을 위한 민감한 키트----<td>기구</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P5493</td><td>분자생물학용</td></tr><tr><td>재조합 쥐 GM-CSF&nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>315-03</td><td>>97%, 감소 조건 하에서 SDS-PAGE에 의해 및은 염색으로 시각화.</td></tr><tr><td>재조합 쥐 IL-4&nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>214-14</td><td>>97%, 감소 조건 하에서 SDS-PAGE에 의해 및은 얼룩으로 시각화.</td></tr></tbody></table>

고체 지질 나노 입자 (slns) 세포 내 타겟팅을위한 응용 프로그램

Solid Lipid Nanoparticles (SLNs) for Intracellular Targeting Applications

나노 입자 기반 전달 차량은 세포 내 표적화 응용 분야에 큰 가능성을 보여주었으며 세포 신호 전달 및 유전자 발현을 특이적으로 변경하는 메커니즘을 제공했습니다. 이전 조사에서는 국소 약물 전달 및 바이오마커 검출 응용을 위한 초소형 고체 지질 나노입자(SLN)의 합성이 입증되었습니다. SLN은 유망한 약물 전달 매개체로 부상한 나노 입자 전달 시스템의 잘 연구된 예입니다. 이 연구에서는 SLN에 형광 염료를 주입하여 입자-세포 상호 작용을 조사하기 위한 모델로 사용했습니다. 위상 반전 온도(PIT) 방법은 생체 적합성 나노 입자의 초소형 집단을 합성하는 데 사용되었습니다. 나노 입자-세포 상호 작용 연구 전에 적절한 투여 수준을 설정하기 위해 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenylphenyltetrazolium bromide(MTT) 분석을 활용했습니다. 또한, 1차 인간 진피 섬유아세포와 마우스 수지상 세포는 시간이 지남에 따라 염료가 주입된 SLN에 노출되었으며 독성 및 입자 흡수와 관련된 상호 작용은 형광 현미경 및 유세포 분석을 사용하여 특성화되었습니다. 이 연구는 나노입자 전달 시스템인 초소형 SLN이 다양한 세포 유형의 세포 내 표적화에 적합하다는 것을 보여주었습니다.

PIT 방법은 SLNs를 합성하는 데 사용하고, 상전이 온도 수조를 이용하여 측정 하였다. 샘플을 서서히 가열하여 맑은 용액이 등장 할 때까지 온화하게 교반한다. heneicosane 지질을 사용하여 제조 SLNs위한 상전이 온도는 45 ° C. 표 1은 입자 크기, 분산도, 융점 SLNs 위해 용융 잠열을 요약 한 것이다. 전술 한 공정 조건을 사용하여 합성 SLNs은 18.59 및 16.87 nm의 평균 입자 직경 및 5.83 및 4.47의 다 분산도는 각각 (도 3)와 제어 SLNs와 근적외선로드 SLNs 결과. SLNs 분산액의 안정성은 두 개의 서로 다른 저장 온도 (4 및 23 °의 C)에서 6일 위에 입자 크기의 측정에 의해 모니터링 하였다. 입경 6 일 동안 변화가 없었다 (데이터는 미도시). SLNs의 열 동작은 investig했다시차 주사 열량계를 사용 ated. 합성 SLNs 각각 제어 SLNs와...

이 연구에서는 생체 적합성 나노 입자의 초소형 집단을 합성하는 방법과 세포 상호 작용을 평가하기 위한 몇 가지 시험관 내 방법을 설명했습니다.

고체 지질 나노 입자 (SLNs) 세포 내 타겟팅을위한 응용 프로그램

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter ...

이 절차의 전반적인 목표는 생체 적합성 나노입자의 초소형 집단을 합성하고, 그 물리적 특성을 규명하며, 입자와 세포 간의 상호작용을 조사하는 것입니다. 이는 먼저 상전이 온도법을 사용하여 지질 나노입자를 합성함으로써 수행됩니다. 이 과정 동안 지질과 계면활성제를 처음에 함께 용융시킵니다.정해진 양의 물을 첨가한 후, 상 분리가 일어날 때까지 혼합물을 가열합니다. 그 다음, 나노 에멀젼이 형성되고 고체 지질 나노입자(sln)의 합성이 완료될 때까지 혼합물을 지속적으로 교반합니다. 다음으로, 동적 광산란법(DLS)을 사용하여 입자 크기와 다분산 지수를 측정합니다.입자를 더욱 구체적으로 특성화하기 위해 융점과 융해 잠열을 결정하는 추가 기법으로 시차 주사 열량 측정법(DSC)이 사용되며, 최종적으로는 입자와 세포 간의 상호작용을 조사하기 위해 형광 현미경 및 유세포 분석법을 사용할 수 있습니다. 초음파 처리, 마이크로플루이딕 및 고압 균질화와 같은 기존의 고에너지 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 상대적으로 완만하게 합성하는 기술이며, 간단하면서도 확장성이 있다는 점입니다. LNS를 합성하려면 0.6 mg의 형광 염료 또는 기타 친지질성 화합물과 0.10 g의 선형 알칸 또는 지질을 혼합하십시오.15 milliliter 바이알에 성분들을 넣고 90 °C에서 가열하여 녹인 후 교반하고, 0.11 g의 선형 비이온성 계면활성제를 첨가합니다. 그다음 결과 혼합물을 90 °C에서 가열하여 녹이고 교반합니다. 이어서, 혼합물에 1.79 g의 멸균수를 첨가하고 90 °C로 가열하며 두 개의 상이 관찰될 때까지 용액을 육안으로 모니터링합니다.이제 투명한 나노 에멀젼이 형성될 때까지 혼합물을 저어줍니다. 대조군 샘플로 사용하기 위해 형광 염료를 첨가하지 않은 별도의 나노 에멀젼을 병행하여 준비합니다. 이후 멸균된 0.2 micron 필터를 사용하여 각 나노 에멀젼을 추가로 멸균합니다.입자 크기 측정용으로 설계된 기기에서 유리 큐벳을 사용하여 S lns의 입자 크기와 다분산 지수를 DLS로 측정합니다. 샘플을 측정하기 전, 제조사의 표준물질 준비 및 측정 프로토콜에 따라 기지 표준물질 두 가지의 입자 크기를 측정해야 합니다. 그다음, 각각 준비된 샘플을 측정합니다. 측정 시간은 100 seconds, 굴절률은 물의 굴절률, 점도는 20 °C에서의 물의 점도를 사용하십시오.S LNPs의 열적 거동을 조사하기 위해 입자 크기 분포의 평균 입경과 다분산 지수를 보고하십시오. DSC 분석을 위해, 먼저 약 25 mg 질량의 S LNPs를 40 µL 알루미늄 팬에 피펫으로 옮깁니다. DSC 스캔 중 수분 손실을 최소화하기 위해 유니버설 크림프 프레스를 사용하여 팬을 밀봉합니다. 각 나노 에멀젼을 5°C에서 80°C까지 측정하기 전, DSC 그래프에서 골(valley)이 녹는점을 나타내고 곡선 아래 면적의 적분값이 잠열을 나타내므로, 녹는점과 용융 잠열을 보고하십시오.DSC 그래프에서 시료의 양으로 나눈 값은 배양물의 융해 잠열을 나타냅니다. 인간 진피 섬유아세포 배양용 액체 배지 내에서 제조사의 지침에 따라 일차 인간 섬유아세포를 준비합니다. 저혈청 성장 보충제 키트를 첨가하여 37°C, 5% carbon dioxide의 가습 분위기에서 세포를 유지하며, MTT 및 이미징 분석을 위한 세포 파종 전, 세포 밀도가 80% confluence에 도달하면 계대 배양합니다.96-웰 플레이트에 웰당 20,000 cells의 밀도로 분주합니다. 0시점에 SLN에 노출시키기 전, 37 °C에서 하룻밤 동안 세포를 평형 상태로 둡니다. 완전 배지로 SLNs를 희석하여 원하는 지질 농도를 맞춘 후, 96-웰 플레이트의 각 반복 웰에 10 µL씩 첨가합니다. SLNs와 함께 24시간 동안 배양한 후, 제조사의 프로토콜에 따라 MTT assay를 사용하여 세포 생존율을 측정합니다. 세포를 한 번 세척하고 각 웰에 100 µL의 신선한 배지를 첨가합니다.대조군 웰을 70% methanol 용액에서 10분간 배양하여 사멸시킨 후, 신선한 배지로 교체합니다. 마이크로플레이트의 각 웰에 MTT 시약을 웰당 10 µL씩 첨가하고 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 하룻밤 배양이 끝나면, 제공된 계면활성제 용액 100 µL를 사용하여 세포 내 형태와 결정을 용해시킵니다. 제조사의 프로토콜에 따라, 흡광도 값을 측정하기 전 계면활성제 용액이 담긴 세포를 상온에서 3시간 동안 배양합니다.현미경 관찰 준비를 위해 마이크로플레이트 리더를 사용합니다. 섬유아세포를 멸균 인산 완충 식염수로 2회 세척합니다. 섬유아세포에 lns를 투여한 후 특정 시점에서 차가운 70% methanol로 세포를 10분 동안 고정합니다.10분 후, 도립 현미경을 사용하여 이미지를 캡처하기 전에 메탄올을 인산염 완충 식염수(PBS)로 교체하십시오. 합성된 S SLN의 결과, MTT 분석을 통해 대조군 S LNS의 평균 입자 직경은 18.59 nm, 다분산 지수는 5.83이었으며, Nile red가 탑재된 SLMs의 평균 입자 직경은 16.87 nm, 다분산 지수는 4.47로 나타났습니다. 세포 대사에 대한 용량 반응 효과를 측정한 결과, 입자 농도가 증가함에 따라 세포 생존율이 감소하는 것으로 확인되었습니다.SLN 단독에 노출된 세포와 Nile red가 탑재된 SLN에 노출된 세포 사이에 독성 차이는 관찰되지 않았습니다. 동시에 세포가 조직 배양 폴리스티렌에 부착되었는지 시각적으로 확인하였습니다. 5 µg/mL의 용량을 사용하여, 대표적인 세포 형태와 시간에 따른 형광 입자의 흡수를 입증하는 이미지를 촬영하였습니다.지질 입자의 흡수는 노출 2시간 후에 관찰되었습니다. 나노입자의 유입 수준은 유세포 분석법을 통해 마우스 골수 유래 수지상세포(B MDCs) 내 Nile red 형광 강도를 측정하여 결정하였습니다. 사용된 SNS의 농도와 B MDCs에서 평가된 형광량 사이에 직접적인 상관관계가 관찰되었습니다.이 영상을 시청한 후에는 생체 적합성 나노입자의 초소량 집단을 합성하고, 이들의 물리적 특성을 분석하며, 입자와 세포 간의 상호작용을 조사하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

생쥐의 양이온 liposomes/siRNA/ITSN-1s 단지 24 일 동안 72 시간마다 반복적으로 복고풍 궤도 주사 효율적으로 75 %에 ITSN - 초 발현 및 단백질 발현을 감소 마우스 폐 미세 혈관에 siRNA의 양면을 제공합니다. 이 기술은 동물 모델에서 높은 재현성, 부작용이없고 사망을 방지합니다.

양이온 성 리포좀을 통해 특정의 siRNA 반복 전달하여 마우스 폐 Intersectin-1의 장기 침묵. 전자 현미경에 의한 넉다운 효과의 평가

우리는 코어에 자체 조립 나노 구조를 포함하는 지질 입자의 운동 안정화를 위한 탄소 나노튜브의 스마트 응용에 대해 보고합니다. 지질 입자의 준비에는 약물 전달과 같은 생물 의학 응용 분야에 사용할 수 있는 다소 낮은 농도의 탄소 나노튜브가 필요합니다.

탄소 나노 튜브에 의해 안정화 내부 자기 조립 된 지질 입자의 용이 한 제조

이 프로토콜의 목표는 신경 표적 펩타이드가 있는 양이온성/음이온성 리포좀을 CNS 전달 시스템으로 사용하여 siRNA가 BBB를 통과할 수 있도록 하는 것입니다.  siRNA와 같은 치료를 위한 전달 시스템의 최적화는 프리온 및 기타 신경 퇴행성 질환에 대한 더 많은 치료 옵션을 가능하게 할 것입니다.

양이온과 음이온 리포좀을 사용 CNS에 치료의 siRNA 배달

액정 나노 입자 (LCNP) nanocarrier는 살아있는 세포의 세포막에 소수성화물의 제어 전달을위한 수단으로 이용된다.

액정 나노 입자 캐리어의 소수성화물 캡슐화의 대상 플라즈마 멤브레인 배달

여기 우리가 드라이 필름 방식에 기반 하 고 안전에 대 한 사용할 수 있습니다 양이온 nanoliposomes의 생성에 대 한 프로토콜을 설명 하 고 효율적인 전달 체 외에 문자 메신저 RNA.

체 외에서 의 효율적인 배달 양이온 Nanoliposomes의 세대 문자 메신저 RNA

이 문서에서는 falcarindiol 지질 코팅 74 nm 나노 입자에 캡슐화를 설명합니다. 인간 줄기 세포 지질 작은 물방울에 의해 나노 입자의 세포질 통풍 관 그리고 confocal 형광 이미징에 의해 모니터링 됩니다. 나노 입자 용 매 변화, 급속 한 주입 방법으로 조작 하 고 그들의 크기는 동적 산란 기법으로 측정 된다.

Falcarindiol 인간 중간 엽 줄기 세포에 의해 포함 된 새로운 지질 코팅 나노 입자의

화학적 성질을 준비 및 특성화 하는 방법 및 중성 충전 된, pH 반응 siRNA 나노 입자의 생물 활성이 제시 된다. 성공적인 siRNA에 대 한 기준은 크기, 형태학, 표면 전 하, siRNA 하 중 및 유전자 침묵과 같은 나노 의약품에 대해 논의 된다.

사이토 솔 릭 siRNA 전달을 위한 중성 충전, pH 반응 형 고분자 나노 입자의 제조

본 연구는 나노리포솜 제제에 대한 얇은 지질 막 방법을 이용한 고전적인 수분 공급에 대해 설명하고 나노입자 특성화에 이어. 47 kDa-친수성 및 구형 단백질인 타린(tarin)은 안정성을 개선하고, 빠른 클리어런스를 피하며, 통제된 방출을 촉진하는 전략으로 성공적으로 캡슐화되었습니다. 이 방법은 소수성 분자 캡슐화에 적응될 수 있다.

생리 활성 친수성 구형 단백질의 함정에 대한 나노 리포좀의 준비 및 특성화

이 프로토콜은 엇갈인된 헤링본 마이크로믹서 미세유체 장치를 사용하여 열감도 리포좀을 준비하기 위한 최적화된 파라미터를 제시합니다. 이것은 또한 리포솜으로 독소루비신과 인도시아닌 녹색의 공동 캡슐화와 통제/트리거된 약물 방출을 위한 독소루비신의 광열 트리거 방출을 허용합니다.

리소리피드 함유 온도 민감성 리포좀의 미세유체 생산

지질 나노 입자는 mRNA 및 DNA 캡슐화를 위한 미세유체 혼합 플랫폼 접근 방식을 사용하여 개발됩니다.

미세 유체 혼합 플랫폼을 사용하여 유전자 전달을 위한 지질 나노 입자 제조 및 특성화

2제트 CIJ 및 4제트 다중 입구 와류 믹서(μMIVM)를 포함한 CIJ(Confined Impact Jet) 믹서 기술을 사용하여 지질 나노입자(LNP)를 합성하기 위한 자세한 프로토콜이 시연됩니다. CIJ 믹서는 재현 가능한 난류 마이크로 혼합 환경을 생성하여 단분산 LNP를 생산합니다.

Synthesisizing Lipid Nanoparticles by Turbulent Flow in Confined Impact Jet Mixers(밀폐 충돌 제트 믹서에서 난류에 의한 지질 나노입자 합성)

학습하세요 생체적합성 고체 지질 나노입자 합성 및 특성 분석 방법을 통해 세포와의 상호작용을 조사하는 기술입니다. 이 방법은 약물 전달 및 생의학 연구에 활용될 수 있습니다.

고체 지질 나노 입자 (SLNs) 세포 내 타겟팅을위한 응용 프로그램

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