의 생명 공학에 대한 각질 기반의 나노 섬유의 합성

이 실험의 전반적인 목표는 생물 의학 응용을 위해 케라틴 기반 나노 섬유를 합성하고 특성화하는 것입니다. 이 방법은 상처 치유, 약물 전달 및 간, 뼈 및 근육과 같은 공학 조직과 같은 생체 의학 공학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 저렴하고 효율적이며 대규모 생산으로 업그레이드할 수 있다는 것입니다.

이 기술의 의미는 상처 치료 및 조직 재생을 위한 약물 전달로 확장됩니다. 이 방법은 전기 방사 나노 섬유 사용의 이점에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 조직 재생과 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 나노 섬유를 생성할 수 있는 고분자 물질을 만들기 어렵기 때문에 어려움을 겪을 것입니다.

화학적으로 처리되거나 변경되지 않은 약 20g의 사람 머리카락 조각을 조달하십시오. 머리카락은 어떤 길이든 될 수 있습니다. 따뜻한 물과 비누로 손으로 머리를 깨끗이 씻으십시오.

최종 헹굼을 위해 탈이온수를 사용하십시오. 머리카락을 600ml 비커 두 개에 넣고 섭씨 80도의 오븐에 1시간 동안 넣습니다. 건조되면 마른 머리카락을 600ml 비커에 고르게 나누고 각 비커에 10g의 머리카락을 넣습니다.

머리카락이 500ml 이상 채워지지 않도록 하십시오. 그런 다음 각 비커에 500ml의 과아세트산 용액(PAS)을 붓고 모든 머리카락을 덮습니다. 비커를 파라필름으로 덮고 12시간 동안 보관하십시오.

500미크론 체를 사용하여 PAS에서 모발을 분리하고 폐기물 PAS를 별도의 용기에 수집합니다. 탈이온수로 모발을 철저히 헹구어 남은 PAS를 제거하십시오. 헹군 모발을 500ml 플라스크에 넣은 후 400ml의 100밀리몰 트리스 베이스 용액(TBS)을 플라스크에 붓고 모발이 덮여 있는지 확인합니다.

그런 다음 플라스크를 섭씨 38도, 65RPM으로 설정된 진탕에 1시간 동안 넣습니다. 1시간 후 진탕에서 플라스크를 꺼냅니다. 약 400ml의 케라틴 추출 용액(KES)인 액체를 1000ml 비이커에 붓습니다.

머리카락이 들어 있는 플라스크에 400ml의 탈이온수를 붓고 머리카락이 덮였는지 확인한 후 플라스크를 한 시간 동안 진탕에 다시 넣습니다. 진탕에서 플라스크를 제거하고 남은 400ml의 KES를 이전에 수집한 KES와 함께 1000ml 비커에 붓습니다. 머리카락은 더 이상 필요하지 않으며 가장 가까운 쓰레기통에 버릴 수 있습니다.

텍스트 프로토콜에 설명된 대로 수집된 KES를 중화한 후 약 1/4이 찰 때까지 500밀리리터 둥근 바닥 플라스크에 용액을 붓습니다. 제조업체의 프로토콜에 따라 증류기를 1.25시간 동안 실행하여 플라스크가 단단히 연결되어 있는지 확인합니다. 모든 KES가 증류될 때까지 이 과정을 반복합니다.

증류된 KES 용액을 12개의 개별 14ml 원추형 튜브에 균등하게 붓습니다. 튜브를 1, 050회 G에서 10분 동안 원심분리합니다. 원심분리된 KES를 깨끗한 비커에 붓고 수집된 파편을 멀리 붓습니다.

모든 KES가 원심분리될 때까지 반복합니다. 다음으로, 투석 튜브 셀룰로오스 멤브레인을 24인치로 자르고 튜브의 한쪽 끝을 잘라 닫은 상태로 유지합니다. 투석 튜빙 셀룰로오스 멤브레인의 잘리지 않은 끝을 열고 원심분리 KES 용액 60ml를 튜빙에 천천히 붓습니다.

다른 클립을 사용하여 튜브의 이 끝을 닫습니다. 투석 튜브를 2, 000 밀리리터의 탈이온수 실린더에 넣고 24 시간 동안 그대로 두어 3-4 시간마다 실린더의 탈 이온수를 바꿉니다. 그런 다음 투석된 KES 용액을 뚜껑이 있는 병에 비우고 맨 위에 공간을 남겨 두십시오.

뚜껑을 덮은 병을 섭씨 영하 20도의 냉동고에 24시간 동안 넣습니다. 24시간 냉동 기간이 지나면 항아리의 뚜껑을 제거하고 동결 건조기 앰플에 넣습니다. 앰플에 씰을 놓고 손잡이를 돌려 0.133mbar의 진공 압력을 생성합니다.

수분이 모두 사라질 때까지 약 48시간 동안 샘플을 동결건조합니다. PCL 대 케라틴 비율이 90 대 10, 80 대 20, 70 대 30, 60 대 40인 10 중량 케라틴 용액에 10 중량 케라틴 용액을 첨가하여 PCL 케라틴 용액을 준비합니다. 약 8ml의 와류 PCL/케라틴 용액을 0.5mm 직경의 플라스틱 튜브가 장착된 10ml 일회용 주사기에 넣습니다.

유속이 시간당 2.5밀리리터로 설정된 주사기 펌프에 주사기를 놓습니다. 튜브에 연결된 바늘 끝에 전압을 가합니다. 튜브에 19-22 킬로볼트 전압을 적용하고 컬렉터 드럼을 약 200RPM으로 회전합니다.

섬유를 16제곱밀리미터 샘플로 자릅니다. 생체 적합성 실리콘 기반 접착제를 사용하여 각 샘플을 12mm 직경의 슬립을 덮도록 고정합니다. 섬유 샘플의 한쪽 끝을 커버 슬립 뒷면에 붙이고 커버 슬립 주위에 샘플을 감쌉니다.

그런 다음 샘플의 자유 끝을 커버 슬립 뒷면에도 붙이고 슬립 상단은 섬유 샘플로만 덮은 상태로 둡니다. 섬유 샘플을 24웰 플레이트에 넣습니다. 샘플을 80% 에탄올에 1시간 동안 담궈 살균합니다.

탈이온수를 사용하여 샘플에서 에탄올을 헹굽니다. 그런 다음 2ml의 기초 배지를 샘플에 피펫으로 넣고 5분 동안 전체 샘플을 덮습니다. 섬유아세포 3T3 세포를 사용하여 섬유 샘플을 시딩합니다.

대략 62가 있다 그래야 antiobiotics 및 10%fetal 둔감한 혈청으로 보충된 DMEM에 있는 세포를 중단하십시오, DMEM의 1 밀리리터 당 평방 센티미터 당 000의 세포. DMEM 해결책을 포함하는 3T3 세포의 1 밀리리터를 각 좋은 판으로 떨어뜨리십시오, 각 섬유 표본이 대략 62로 덮는다는 것을, 평방 센티미터 당 000의 세포. 웰 플레이트를 섭씨 37도에서 24시간 동안 배양하고 이산화탄소를 5%로 배양합니다.

건조된 PCL/케라틴 나노섬유 멤브레인을 절단한 후 900제곱밀리미터 샘플을 80% 알코올로 10분 배양 기간 동안 살균합니다. 그런 다음 탈이온수로 멤브레인을 철저히 씻으십시오. 다음으로, 섭씨 37도에서 15ml의 PBS, pH 7.5로 샘플을 배양하고 3일마다 완충액을 교체합니다.

1주와 7주의 지정된 간격으로 용액에서 멤브레인을 꺼냅니다. 탈이온수로 헹굽니다. 멤브레인 샘플을 동결 건조기 앰플에 넣습니다.

앰플에 씰을 놓고 완전히 건조될 때까지 24시간 동안 샘플을 동결 분해하기 위한 진공을 만듭니다. 다음으로, 구리 테이프를 사용하여 건조된 샘플을 주사 전자 현미경 또는 SEM 스테이지에 부착합니다. 스테이지를 스퍼터 코팅기 안에 놓고 1분 30초 동안 15밀리암페어의 금으로 코팅합니다.

샘플을 SEM의 챔버에 로드합니다. 1.5k볼트의 가속 전압과 5마이크로암페어의 전류에서 광섬유 샘플을 관찰합니다. PCL/케라틴 기반 나노섬유가 PCL/커틴 비율이 70 대 30, 80 대 20, 90 대 10인 용액에서 성공적으로 전기 방사된 대표 이미지가 여기에 나와 있습니다.

전기 방사 섬유는 고유 조직의 계수에 가까운 Young moduli를 갖는 것으로 밝혀졌습니다. Young's moduli는 케라틴 비율이 증가함에 따라 감소했습니다. 이 그림은 Young's modulus 대 PCL/keratin 비율의 변동에 대한 그래픽 추세를 보여줍니다.

여기에 표시된 푸리에 변환 적외선 분광법 스펙트럼은 PCL과 케라틴의 결합을 확인합니다. 1, 722 역 센티미터에서 측정된 주요 피크는 PCL 흡수 대역의 표준 기본 측정과 일치하며 모든 스펙트럼에서 볼 수 있습니다. PCL 케라틴 섬유의 세포 부착 및 증식은 섬유가 독성이 없으며 세포 성장을 지원한다는 것을 확인합니다.

나노섬유를 따라 사상포(filopodia)가 성장한다는 것은 섬유아세포와 PCL/케라틴 섬유 사이에 유리한 상호작용을 나타냅니다. 이 나노 섬유 합성 기술은 일단 숙달되면 제대로 수행되면 24시간 내에 완료할 수 있습니다. 전기 방사 절차를 시도하는 동안 폴리머 용액의 점도, 용액의 유속, 적용된 전압, 회전 드럼의 속도 및 섬유아세포 배양 단계를 기억하는 것이 중요합니다.

이 비디오를 시청한 후에는 PCL/kertain 기반 나노섬유에서 합성하는 방법과 의공학 분야에서의 중요성에 대해 잘 이해하게 될 것입니다. 이 절차에 따라 세포 생존율 및 생체 내 분해 테스트와 같은 다른 방법을 수행하여 조직에 대한 독성 반응, 조직 성장 및 섬유 분해에 대한 추가 질문에 답할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 재생 공학 분야의 연구자들이 피부 재생, 상처 치유 및 약물 전달과 같은 분야를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

TFE와 같은 유기 용제 및 고전압으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 항상 보안경, 실험실 가운, 장갑 착용, 용제의 적절한 폐기와 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.