Name: 의 생명 공학에 대한 각질 기반의 나노 섬유의 합성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 43 s
Description: 배우세요 전기방사 기법을 이용한 각질/PCL 나노섬유 합성 및 특성 분석 방법을. 이 기술은 조직 공학, 상처 치유 및 약물 전달을 위한 생의학적 응용에 활용됩니다.

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저자는 지원 자금에 대한 혁명 금속 생체 적합 물질에 대한 공학 연구 센터 (ERC-0812348) 및 나노 기술 학부 교육 (EEC 1242139)을 통해 국립 과학 재단 (National Science Foundation)에게 감사의 말씀을 전합니다.

모든 프로토콜은 연구 준수 및 윤리 노스 캐롤라이나 A &amp; T 주립 대학 사무실의 지침을 따릅니다. 각질 추출 4 1. 화학 준비 <ol><li> 흄 후드, 2 % 중량 / 부피 초산 용액 (PAS) 1000 ml의를 준비하는 것은 탈 (DI) 물 980 ml의 초산 20 ㎖를 추가합니다. </li><li> 100 mM 트리스 염기 용액 (TBS) : 1000㎖를 제조 DI 물 1000 ml의 트리스베이스의 12.2 g을 추가하고 완전히 용해 될 때까지 교반한다. </li><li> DI 물 30 ㎖에 진한 염산 4 mL로 흘려 흄 후드에 묽은 염산 수용액 (DHAS)을 준비한다. </li><li> 화학적으로 처리되거나 변경되지 않은 인간의 머리 잘라낸의 약 20 g의 조달. 헤어 길이 될 수 있습니다. </li><li> 따뜻한 물과 비누로 손으로, 철저하게 머리를 씻으십시오. 마지막 헹굼에 대한 탈 (DI) 물을 사용합니다. </li><li> 80 ºC O를 두 개의 600 ㎖의 비커에 머리와 장소를 넣어1 시간 동안 VEN. </li><li> 비커의 바닥으로부터 액체를 배출시키고 모발이 완전히 건조 될 때까지 오븐에서 제자리. </li><li> 분할은 각 비커에 머리 10g을 배치, 600 ml의 비커 사이에 균일하게 머리를 건조. 500 개 이상의 ml의를 채우기 위해 머리를 허용하지 않습니다. </li><li> 머리를 모두 커버해야하고 각각의 비이커에 PAS 500 ml에 따르십시오. 12 시간 동안 파라 필름 및 저장과 비커를 커버. </li></ol> 케라틴 추출물 솔루션 2. 준비 <ol><li> 500 μm의 체를 사용하여 PAS에서 머리를 분리합니다. 별도의 용기에 폐기물 PAS를 수집합니다. 남은 PAS를 제거하는 DI의 물로 머리를 씻어. </li><li> 500㎖의 플라스크에 세척 머리를 놓습니다. 머리가 포함되어 있는지 확인하고, 플라스크에 TBS 400ml를 붓고. 38 ºC, 1 시간 동안 65 rpm으로 설정 떨고 욕조에 넣어 플라스크. </li><li> 1 시간 후, 각질 추출 용액의 약 400 ㎖ (KES)에 액체를 목욕을 흔들어에서 제거하고 부어, 난1,000 비이커 NTO. </li><li> 모발 덮고 1 시간 동안 진탕 수욕 제자리 않도록 보장 머리 함유 플라스크에 탈 이온수 400ml를 붓는다. 진동 화장실에서 플라스크를 제거하고 이전에 수집 된 KES으로 1,000 ml의 비이커에 KES의​​ 나머지 400 ml에 붓는다. 모발은 더 이상 필요하지 않은 가장 가까운 쓰레기 수용 플라스크 밖으로 버려진 폐기 될 수있다. </li></ol> 케라틴 추출물 솔루션 3. 농도 <ol><li> 증류수로 맨 윗줄에 rotodistiller 목욕을 입력하고 90 ºC로 설정합니다. 200 rpm으로 설정 회전 속도. 냉각수 냉각 펌프를 켜고 -10 ºC로 설정합니다. </li><li> pH 미터를 사용하여, KES의​​ pH를 모니터링 천천히 pH가 7.0에 도달 할 때까지 KES 1 mM의 DHAS을 추가 피펫을 사용합니다. 용액을 추가로 천천히 교반한다. </li><li> 전체에 대한 분기까지 둥근 바닥 플라스크에 500 ml의에 중화 KES을 따르십시오. 제조업체에 따라 증류기를 실행1.25 시간 동안 프로토콜입니다. <ol><li> KES의 모든 때까지 단계를 반복 3.3 증류되고있다. 플라스크에 단단히 연결되어 있는지 확인합니다. </li></ol></li></ol> 케라틴 추출물 솔루션 4. 투석 <ol><li> (12) 별도의 14 ML 원뿔 튜브에 동일하게 KES 솔루션을 따르십시오. 10 분 동안 1,050 XG에서 튜브를 원심 분리기. </li><li> 수집 된 파편에서 멀리 부어해야하고, 깨끗한 비커에 원심 분리 KES을 따르십시오. KES의 모든 원심 분리 될 때까지 반복합니다. </li><li> 채우기 2,000 ml의 DI 물과 실린더를 졸업했다. </li><li> 이십사인치 투석 튜브 셀룰로오스 막을 잘라, 그것을 폐쇄 유지하도록 튜브의 한쪽 끝을 클립. </li><li> 더 유연하고 쉽게 열 수 있도록 DI 워터의 실린더 튜브의 길이를 딥. </li><li> 투석 튜빙 셀룰로오스 막의 비 클립핑 단부를 열고 천천히 원심 튜브에 KES 용액 60 ㎖에 붓는다. 튜브의이 끝을 닫습니다 다른 클립을 사용합니다. </li><li> 디 넣어DI 물 2,000 ml의 실린더 alysis 튜브와 24 시간 동안 앉아서 할 수 있습니다. 실린더에있는 모든 3 ~ 4 시간을 DI 물을 변경합니다. </li><li> 24 시간 기간 후, 24 시간 동안 -20 ° C에서 냉동실에 상단의 공간과 장소를 떠날 확인되고, 덮인 항아리에 투석 KES 솔루션을 비 웁니다. </li></ol> 5. 동결 건조 각질 추출 솔루션 <ol><li> -86 ºC에 동결 건조기를 설정합니다. </li><li> , 냉동실에서 냉동 KES를 포함하는 항아리를 제거 항아리 떨어져 뚜껑을하고​​, 동결 건조 앰플에 배치합니다. 앰플에 씰을 놓고 0.133 mbar에서의 진공 압력을 생성하기 위해 노브를 돌려. 모든 수분이 멈출 때까지 약 48 시간 동안 샘플을 동결 건조. </li></ol> 전기 방사 솔루션 6. 준비 (10 중량 % 각질 솔루션) <ol><li> 동결 건조기에서 각질 가루를 제거하고 무게. </li><li> 10 % 중량 / 중량을 만들 케라틴 분말 DI 물 추가각질 솔루션입니다. </li></ol> 10 % 중량 PCL 솔루션 7. 준비 <ol><li> 및 트리 플루오로 에탄올 (TFE) - PCL (90 kDa의 ε 카프로 락톤 폴리머, 망간 70)을 얻었다. 교반 O / N에 의해​​ TFE에 무게 PCL으로 10 %를 준비하고 균질 혼합물을 구하십시오. </li></ol> 각질 / PCL 솔루션 8. 준비 <ol><li> 10 중량 % PCL 용액을 미리 준비하고, 10 중량 % 각질 솔루션을 얻습니다. 90:10, 80:20, 70:30 10 ml의 PCL / 각질 솔루션, 60:40 비율을 만들기 위해 현명한 PCL 용액 드롭으로 각질을 추가합니다. </li><li> 전기 방사 전에 PCL / 각질 용액의 균질 한 혼합물을 수득 vortexer를 사용합니다. </li></ol> 전기 방사 PCL 9. 생산 / 케라틴 섬유 <ol><li> 0.5 mm 직경의 플라스틱 튜브가 장착 된 10 ㎖의 일회용 주사기에 PCL / 각질 솔루션의 약 8 ml에 놓습니다. 유속은 2.5 ㎖ / 시간으로 설정된다 주사기 펌프에 주사기를 놓는다. </li><li&gt; 관에 접속 침의 선단에 전압을인가 (~ 수평으로부터 30도를 드럼 수집 섬유로부터 ~ 23cm 위치 등). 튜브에 22 kV의 전압과 약 200 rpm에서 집 드럼을 회전 - 19을 적용합니다. <ol><li> 샘플을 실행하기 전에 알루미늄 호일로 집 드럼을 감싸. 알루미늄 호일은 양쪽 끝에서 라벨 테이프를 적용하여 안정적인지 확인하십시오. 참고 : 섬유는 알루미늄 호일에 형성한다 (그림 2 참조) RT에서 섬유 커버 호일을 저장합니다. </li></ol></li></ol> PCL / 각질 나노 파이버 (10) 기계 분석 <ol><li> 8mm에서 60mm로 샘플을 잘라. 디지털 마이크로 미터를 사용하여 두께를 기록해야합니다. 준비 각 구성의 경우, 5 개의 샘플을 사용합니다. </li><li> 인장 시​​험기에 60 × 8 밀리미터 샘플을 연결합니다. 샘플을 연결하는 맞춤 설계 시편 홀더를 사용합니다. 이중 사용 색인 카드로 만들어 시편 홀더 간의 샘플 샌드위치양면 테이프. 10mm / 분의 변위 율 10 N 부하 셀을 적용한다. 참고 : 시편 홀더는 38mm 50 mm의 내부 창 40mm로 62mm로 설계되었습니다. </li><li> 확장 레코드 및 소프트웨어 프로토콜에 따라 소프트웨어를 통해 부하 값. </li><li> 시험 샘플의 면적으로 나눔으로써 힘 응력을 계산한다. 다음으로, 초기 길이만​​큼 길이의 변화로 나누어 변형을 계산한다. </li><li> X 축에 스트레인 값에 대해 대응하는 Y 축 응력을 플롯하여 응력 - 변형 곡선을 생성한다. </li><li> 경사 탄성률 같음 선형 영역에서의 영률을 계산한다. 변형의 오프셋 (offset) 0.2 %를 복용하고 선형 영역 곡선에 평행 한 선을 그려 응력 변형 플롯에서 인장 강도를 결정합니다. </li><li> 이전 분석 소프트웨어 (8)를 사용하여 분산 분석을 사용하여 수득 중으로 기계 데이터의 통계적 분석을 수행한다. P 값 &lt;0.05 우리통계적으로 유의 한 것으로 간주 다시. </li></ol> 11. 표면 형태와 구조 특성 <ol><li> 전기 방사 된 섬유의 형태를 관찰하기 위해 15 kV의 전압 및 5 μA의 전류 가속의 파라미터를 주 사형 전자 현미경 (SEM)을 사용한다. <ol><li> SEM으로 촬상에 앞서, 섬유의 단면이 2cm를 잘라내어 구리 테이프를 사용 SEM 스테이지에 부착. 약 11 nm 두께의 금 층을 만드는 데 1 분 30 초 동안 15mA에서 금을 스퍼터 코터와 코트 안에 무대를 놓습니다. SEM의 챔버로 샘플을로드합니다. 섬유 샘플을 관찰한다. </li></ol></li><li> PCL과 각질 사이의 화학 결합의 특성을 적외선 분광기 (FTIR)를 푸리에 변환을 사용합니다. 자석 홀더에 전기 방사 나노 섬유 막 2cm 2 부를 넣고 실험 전에 건조한 공기 정화 시스템. (200) 검사에 대한 스펙트럼을 구하여 역을 이용하여 스펙트럼을 분석소프트웨어 프로토콜에 따라 ndard 소프트웨어. </li><li> 표준 소프트웨어를 사용하여 스펙트럼 분석을 수행하고 제조 업체의 프로토콜에 따라 나노 섬유의 각 비율의 삼중를 사용합니다. </li></ol> 셀 섬유의 상호 작용의 연구 (12) <ol><li> 16mm 2 샘플로 섬유를 잘라. 12 mm 직경으로 된 커버에 각 시료를 해결하기 위해 생체 적합성, 실리콘 기반의 접착제를 사용합니다. </li><li> , 다음,도 커버 슬립 위로 샘플의 자유 단을 접착제, 커버 슬립 주위 샘플 랩에만 덮여 슬립 상단 떠나는 커버 슬립 위로 섬유 샘플의 일단 접착제 섬유 샘플. </li><li> 24 웰 플레이트에서 섬유 샘플을 놓습니다. 1 시간 동안 80 % 에탄올에 침지시켜 샘플을 소독. </li><li> DI 물을 사용하여 샘​​플에서 에탄올 헹군다. 그런 다음, 피펫 전체 샘플을 커버 확인하고 샘플 상에 기초 배지 2 ㎖. 5 분 후 매체를 제거합니다. </li><li> 사용 섬유 아세포 (3)T3 세포는 섬유 샘플 시드. DMEM 1 ㎖ 당 / cm이 약 62,000 세포가 존재한다는 항생제 등이 10 % 소 태아 혈청 (FBS)으로 보충 된 둘 베코 변성 이글 배지 (DMEM)에서 세포를 일시. </li><li> 각 섬유 샘플 / cm이 약 62,000 세포로 피복되어 있도록 각 웰 플레이트 3T3 세포 함유 DMEM 용액 1ml를 놓는다. 37 ° C에서 24 시간 5 % CO 2 잘 번호판을 품어. 주 : 사용 5 % CO 2 수준은 일반적 일 생리적 범위 셀 매체의 pH를 유지할 수 있기 때문이다. </li></ol> 나노 섬유 매트릭스 (13) 저하 <ol><li> 잘라 사각형 약 30mm X 30mm로 PCL / 각질 나노 섬유 멤브레인을 건조시켰다. </li><li> 10 분의 배양 기간 동안 80 % 알코올로 900mm 2 샘플을 소독하고 DI 물로 깨끗이 씻는다. 37 ºC에서, PBS, pH를 7.5 15 ml의 샘플을 품어. 버피를 교체3 일마다 FER. </li><li> 지정된 간격으로 용액 중 세포막을 타고 일주 7 주, 및 DI의 물로 씻어. </li><li> 동결 건조 앰플로 막 샘플을 놓습니다. 앰플에 실을 삽입하고 진공을 만들려면 노브를 돌려. 완전히 건조 될 때까지 24 시간 동안 동결 건조. </li><li> 구리 테이프를 사용 SEM 단계로 건조 된 샘플을 연결합니다. 1 분 30 초 동안 15mA에서 금을 스퍼터 코터와 코트 안에 무대를 놓습니다. </li><li> SEM의 챔버로 샘플을로드합니다. 1.5 kV의 5 μA의 전류의 가속 전압에서 섬유 샘플을 관찰한다. </li></ol>

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</ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.

인간의 머리에서 각질의 추출이 성공적으로 이루어졌다. 아세트산은 케라틴은 트리스 자료 추출 할 수 있도록, 인간의 머리에 산화제로서 작용. 케라틴 분말의 제조 인해에만 연구 목적으로 행해졌 사실 소규모이었다. 이 과정은 이미 대규모 제조 산업에서 확립되었다. 소규모 케라틴 추출 목적은 오염 배치 다양성 및 비용 효율성을 제어 할 수 있었다. 각질 추출이 절차의 제한 단계이다. 2 % - 케라틴 분말의 수율은 0.7 매우 낮다. 0.4 g의 각질 - 인간의 머리카락의 20g는 0.14을 얻었다. 전기 방사 된 섬유를 생산하는 또 다른 중요한 단계는 전기 방사에 적합한 용액 제형된다. 케라틴 용이 DI 물에 분산시키고, 그러나, 전기 방사시, 케라틴 / 물 용액은 섬유 형성을 초래하지 않았다. 필요한 m을 제공한다나노 파이버를 생성하는 공중 합체를 olecular 상호 작용은 용액에 도입 하였다. TFE에 용해 PCL은 수소 결합을 통해 각질과 더 강하게 상호 작용을 할 수 있었...

전기 방사 나노 섬유는 중합체를 달성 방법으로서 널리 인식되고있다. 섬유는 나노 스케일에서 제조 될 수 있고, 섬유 한 사용자 정의 속성이다. 이러한 발전과 전기 방사 나노 섬유의 특성은 특히 조직 공학에서 생물 의학 공학 애플리케이션에 특히 흥미 있었다. 전기 방사 나노 섬유는 세포 외 매트릭스 유사성을 가지고있어 세포의 부착, 이동 및 증식을 촉진이. 때문에 세포 외 기질 (ECM)이 유사성, 전기 방사 섬유 상처 드레싱, 약물 전달을 돕기 위해 원료로 사용 될 수 있고, 예컨대 간, 뼈, 심장, 근육 (3)와 같은 조직 공학에 대한. 합성 및 천연 기원의 다른 중합체의 다양한 다른 애플리케이션 의공학 4 전기 방사 섬유를 만드는 데 사용되어왔다. 최근에이 성장하고있다합성 및 천연 중합체 (4)를 혼합하여 복합 나노 파이버의 개발의 terest. 이러한 조성물에서 최종 제품은 일반적으로 또한 천연 고분자에서 생물학적 단서와 속성을 채택하면서 합성 고분자와 관련된 기계적 강도를 상속합니다. 합성 및 천연 중합체는 나노 복합체의 합성에 사용되는 바와 같이,이 실험에서, PCL 및 케라틴이 제시된다. 각질은 머리, 양모와 손톱에서 발견되는 천연 중합체이다. 그것은 많은 아미노산 잔기를 포함 주목할만한 관심 시스테인 4,5입니다. 이상적으로 천연 중합체는 biorenewable 생체 적합성 및 생분해 될 것이다. 또한도 6에 포함 된 생체 물질에 세포 증식 및 부착을 강화하면서 각질이 모든 특성을 가지고 세. 폴리 카프로 락톤 (PCL)를 크게하는 흡수성 합성 폴리머조직 공학 4. 이러한 중합체는 이전 구조적 및 기계적 안정성을 평가되고 있으며, 그러나, 세포 친 화성이 부족하고 긴 분해율을 나타낸다. PCL의 소수성 특성은 세포 친 화성 (7)의 부족에 대한 가능성이 담당합니다. 그러나, PCL는 다른 폴리머와 매우 혼합 됨으로써 한계로 가입합니다. PCL / 각질 복합 PCL의 기계적 특성을 설명하고 다양한 생명 의학 애플리케이션을위한 이상적인 선택하고, 각질의 생물학적 특성을 통합해야합니다.

<table><tbody><tr><td>인간의 머리카락&nbsp;</td><td></td><td></td><td>그린즈버러의 현지 이발소에서 획득</td></tr><tr><td>과아세트산</td><td>시그마 알드리치</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCL(e-카프로락톤 폴리머)</td><td>시그마 알드리치</td><td>502-44-3</td><td>Mn 70-90 kDa</td></tr><tr><td>트리플루오로에탄올(TFE)</td><td>시그마 알드리치</td><td>75-89-8</td><td></td></tr><tr><td>트리스 베이스(TrizmaTM 베이스 분말)</td><td>시그마 알드리치</td><td></td><td>>99.9% 결정질</td></tr><tr><td>염산</td><td>Fischer Scientific</td><td>A144C-212 Lot</td><td>093601 Waltham, MA</td></tr><tr><td>Kwik-Sil</td><td>World Precision Instruments</td><td></td><td>Sarasota, FL</td></tr><tr><td>셀룰로오스 멤브레인</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>12 - 14 kDa 분자 절단</td></tr><tr><td>광학 현미경</td><td>Olympus BX51M</td><td>BX51M</td><td>일본</td></tr><tr><td>주사 전자 현미경</td><td>Hitachi SU8000</td><td>SU8000</td><td>일본</td></tr><tr><td>탁상용 Shimadzu 기계</td><td>북미 분석 및 측정 기기 AGS-X 시리즈</td><td>AGS-X 시리즈&nbsp;</td><td>컬럼비아, 메릴랜드</td></tr><tr><td>푸리에 변환 적외선 분광법</td><td>Bruker Tensor 2 기기&nbsp;</td><td></td><td>Billerica, MA</td></tr><tr><td>Microcal Origin 소프트웨어</td><td></td><td></td><td>Northampton, MA</td></tr><tr><td>X-ray diffraction (XRD)</td><td>Bruker AXS D8 Advance X-ray Diffractometer</td><td></td><td>Madison, WI</td></tr><tr><td>Fibroblast 3T3&nbsp; cell</td><td>American Tissue Type Culture Collection</td><td></td><td>Manassas, VA</td></tr><tr><td>Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>Grand Island, NY</td></tr><tr><td>Spectra max Gemini XPS 마이크로플레이트 리더</td><td>분자 장치</td><td></td><td>Sunnyvale, CA</td></tr><tr><td>학생- Newman-Keuls 사후 테스트</td><td>SigmaPlot 12 소프트웨어</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

의 생명 공학에 대한 각질 기반의 나노 섬유의 합성

Synthesis of Keratin-based Nanofiber for Biomedical Engineering

다양한 분야에서의 응용을위한 범용성 및 잠재적으로 인해 전기 방사, 자주 나노 파이버를 제조하기 위해 사용되고있다. 이러한 다공성 나노 섬유의 생산은 그들의 독특한 물리 화학적 특성에 큰 관심이다. 여기에서 우리는 폴리 (ε 카프로 락톤)를 포함하는 케라틴 (PCL) 나노 섬유 (즉, PCL이 / 케라틴 합성 섬유)의 제조에 정교한. 수용성 각질 제 머리카락으로부터 추출 된 다른 비율의 PCL과 혼합 하였다. PCL / 각질의 혼합 용액을 설정 실험실 설계 전기 방사를 이용한 나노 섬유 멤브레인로 변신했다. 섬유 형태 얻어진 나노 파이버의 기계적 특성을 관찰 주 사형 전자 현미경 및 인장 시험기를 사용하여 측정 하였다. 또한, 나노 파이버의 분해성 화학적 특성은 FTIR에 의해 분석 하였다. SEM 이미지는 다른 조성의 PCL / 케라틴 섬유의 균일 한 표면 형상을 나타내었다. 이 PCL / keratiN 섬유는 또한 영률 실패 점 등 뛰어난 기계 특성을 보였다. 섬유 아세포의 세포 부착과 좋은 세포 생존 능력을 증명하여 증식 할 수 있었다. 상술 한 특성에 따라, 우리는 강하게 천연 및 합성 고분자 나노 파이버가 혼합 된 다양한 생물 의학 응용에 사용할 수있는 복합 재료의 우수한 현상을 나타낼 수 있음을 주장하고있다.

섬유 형태론 섬유의 SEM 이미지는 모든 섬유 조성물 얻어졌다. 도 3 참조. 섬유 화상 섬유가 랜덤하게 배향되어 있음을 확인한다. 기계 테스트 기계적으로 강한 섬유는 일반적으로 다양한 조직 공학 응용 프로그램이 필요합니다. 이 섬유는 특정 스트레스와 환경 조건 (9)에서 충분한 강도와 유연성을 유지해야한다. 일반적으로, 스캐 폴드 효과 차폐 스트레스를 피하기 위해 목표 조직에 가까운 계수를 갖고 생체의 도중 및 / 또는 시험 관내 세포의 성장 (10)에 충분한 강도를 유지하는 것이 요구된다. 인장 시​​험기의 영률 및 섬유의 파단 강도를 측정...

전기 방사 나노 섬유는 비 기계적 무결성을 중량으로 세포의 성장과 증식을 지원하는 높은 표면적을 갖는다. 이러한 나노 섬유는 의치 넓은 응용 범위를 가진다. 여기서 우리는 전기 방사 기술을 이용하여 각질 / PCL 나노 섬유를 제조하고, 조직 공학에서의 응용 가능성을 위해 섬유를 특성화.

Electrospinning, due to its versatility and potential for applications in various fields, is being frequently used to fabricate nanofibers. Production of ...

본 실험의 전반적인 목표는 생의학적 응용을 위한 케라틴 기반 나노섬유를 합성하고 그 특성을 분석하는 것입니다. 이 방법은 상처 치유, 약물 전달, 그리고 간, 뼈, 근육과 같은 조직 공학 분야의 핵심 질문들에 대한 답을 찾는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 비용이 저렴하고 효율적이며, 대규모 생산으로 확장 가능하다는 점입니다.이 기술의 활용 범위는 상처 치료 및 조직 재생을 위한 약물 전달까지 확장됩니다. 이 방법은 전기방사 나노섬유 사용의 장점에 대한 통찰을 제공할 뿐만 아니라, 조직 재생과 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법이 처음인 사용자는 나노섬유를 생성할 수 있는 폴리머 물질을 만드는 것이 어렵기 때문에 초기 단계에서 어려움을 겪을 수 있습니다.화학적 처리나 변형이 되지 않은 인체 모발 절삭물 약 20g을 준비합니다. 모발의 길이는 제한이 없습니다. 따뜻한 물과 비누를 사용하여 모발을 손으로 깨끗이 세척합니다.최종 헹굼에는 탈이온수를 사용하십시오. 모발을 600 mL 비커 두 개에 넣고 80 °C 오븐에서 1시간 동안 건조합니다. 건조가 완료되면 건조된 모발을 600 mL 비커에 균등하게 나누어, 각 비커에 모발 10 g씩 넣습니다.모발이 500 milliliters 이상 차지하지 않도록 합니다. 다음으로, 모발 전체가 잠기도록 각 비커에 500 milliliters의 과초산 용액(peracetic acid solution, PAS)을 붓습니다. 비커를 Parafilm으로 덮고 12시간 동안 보관합니다.500 micron 체를 사용하여 PAS로부터 모발을 분리하고, 폐 PAS는 별도의 용기에 수집합니다. 탈이온수로 모발을 충분히 헹구어 남아있는 PAS를 제거합니다. 헹군 모발을 500 milliliter 플라스크에 넣은 후, 모발이 충분히 잠기도록 100 millimolar Tris Base 용액(TBS) 400 milliliters를 플라스크에 붓습니다.그 다음, 플라스크를 38°C, 65 RPM으로 설정된 진탕 목욕조에 넣고 1시간 동안 유지합니다. 1시간 후, 진탕 목욕조에서 플라스크를 꺼냅니다. 약 400 mL의 케라틴 추출 용액(KES) 액체를 1000 mL 비커에 붓습니다.모발이 들어 있는 플라스크에 탈이온수 400 milliliters를 부어 모발이 완전히 잠기게 한 다음, 플라스크를 다시 진탕 수조에 넣고 1시간 동안 유지합니다. 진탕 수조에서 플라스크를 꺼내고, 남은 KES 400 milliliters를 이전에 수집한 KES가 담긴 1000 milliliter 비커에 붓습니다. 모발은 더 이상 필요하지 않으므로 가장 가까운 쓰레기통에 폐기해도 좋습니다.텍스트 프로토콜에 설명된 대로 수집된 KES를 중화시킨 후, 용액을 500 mL 둥근 바닥 플라스크에 약 4분의 1 정도 찰 때까지 붓습니다. 플라스크가 단단히 연결되었는지 확인하고, 제조사의 프로토콜에 따라 증류기를 1.25시간 동안 가동합니다. 모든 KES가 증류될 때까지 이 과정을 반복합니다.증류된 KES 용액을 12개의 개별적인 14 milliliter 원추형 튜브에 동일하게 나누어 붓습니다. 튜브를 1,050 ×g에서 10분 동안 원심분리합니다. 원심분리된 KES를 깨끗한 비커에 붓되, 수집된 찌꺼기가 들어가지 않도록 주의하여 붓습니다.모든 KES의 원심분리가 완료될 때까지 이 과정을 반복합니다. 다음으로, 투석 튜브 셀룰로오스 막을 24인치 길이로 자르고 튜브의 한쪽 끝을 집게로 집어 닫습니다. 투석 튜브 셀룰로오스 막의 반대쪽 열린 끝을 통해 원심분리된 KES 용액 60 milliliters를 천천히 붓습니다.다른 클립을 사용하여 튜브의 이쪽 끝을 닫습니다. 투석 튜브를 2,000 milliliter의 탈이온수가 담긴 실린더에 넣고 24시간 동안 둡니다. 이때 실린더의 탈이온수는 3~4시간마다 교체하십시오. 그런 다음, 투석된 KES 용액을 뚜껑이 있는 병에 옮겨 담되, 상단에 여유 공간을 남겨두십시오.뚜껑을 닫은 병들을 -20 °C 냉동고에 24시간 동안 보관합니다. 24시간의 냉동 기간 후, 병의 뚜껑을 열고 내용물을 동결 건조 앰플에 옮깁니다. 앰플을 밀봉하고 노브를 돌려 0.133 millibar의 진공 압력을 형성합니다.모든 수분이 제거될 때까지 샘플을 약 48시간 동안 동결 건조합니다. 10wt% PCL 용액에 10wt% 케라틴 용액을 방울 단위로 첨가하여 PCL 대비 케라틴 비율이 90:10, 80:20, 70:30, 60:40인 10mL 용액을 각각 준비하여 PCL 케라틴 용액을 제조합니다. 볼텍싱한 PCL/케라틴 용액 약 8mL를 0.5mm 직경의 플라스틱 튜브가 장착된 10mL 일회용 주사기에 넣습니다.유속을 2.5 milliliters per hour로 설정한 시린지 펌프에 시린지를 장착합니다. 튜브와 연결된 바늘 끝에 전압을 가합니다. 튜브에 19 내지 22 kilovolt의 전압을 가하고 수집 드럼을 약 200 RPM으로 회전시킵니다.섬유를 16 square millimeter 크기의 샘플로 자릅니다. 생체 적합성 실리콘 기반 접착제를 사용하여 각 샘플을 직경 12 millimeter의 커버슬립에 고정합니다. 섬유 샘플의 한쪽 끝을 커버슬립 뒷면에 접착하고, 샘플을 커버슬립 주변으로 감쌉니다.그 다음, 샘플의 자유단을 커버 슬립의 뒷면에도 접착하여, 슬립의 윗부분에는 섬유 샘플만 덮이도록 합니다. 섬유 샘플들을 24웰 플레이트에 넣습니다. 샘플들을 80% ethanol에 1시간 동안 담가 멸균합니다.탈이온수를 사용하여 샘플에서 에탄올을 헹궈냅니다. 그 후, 기초 배지 2 milliliters를 샘플에 피펫팅하고 5분 동안 샘플 전체가 충분히 잠기도록 합니다. fibroblast 3T3 세포를 사용하여 섬유 샘플에 세포를 파종합니다.항생제와 10% 태아 송아지 혈청(fetal bovine serum)이 보충된 DMEM에 세포를 부유시켜, DMEM 1mL당 제곱센티미터당 약 62,000개의 세포가 되도록 합니다. 각 웰 플레이트에 3T3 세포가 포함된 DMEM 용액 1mL를 떨어뜨려, 각 섬유 시료가 제곱센티미터당 약 62,000개의 세포로 덮이도록 합니다. 웰 플레이트를 37°C, 5% 이산화탄소 조건에서 24시간 동안 배양합니다.건조된 PCL/케라틴 나노섬유 막을 절단한 후, 900 mm² 크기의 시료를 80% 알코올로 10분 동안 처리하여 멸균합니다. 그 다음, 탈이온수로 막을 충분히 세척합니다. 이어서, 시료를 15 mL의 PBS(pH 7.5)에 넣고 37 °C에서 배양하며, 3일마다 버퍼를 교체해 줍니다.지정된 간격인 1주 및 7주 후에 용액에서 막을 꺼냅니다. 탈이온수로 헹굽니다. 막 시료를 동결 건조기 앰플에 넣습니다.앰플에 밀봉재를 덮고 진공 상태를 만들어 샘플이 완전히 건조될 때까지 24시간 동안 동결 건조합니다. 그다음, 구리 테이프를 사용하여 건조된 샘플을 주사 전자 현미경(SEM) 스테이지에 부착합니다. 스테이지를 스퍼터 코터 내부에 넣고 15 milliamps에서 1분 30초 동안 금으로 코팅합니다.시료를 SEM 챔버에 넣습니다. 가속 전압 1.5 kilovolts 및 전류 5 microamps 조건에서 섬유 시료를 관찰합니다. PCL/keratin 비율이 70:30, 80:20, 90:10인 용액에서 성공적으로 전기방사된 PCL/keratin 기반 나노섬유의 대표 이미지가 여기에 제시되어 있습니다.전기방사된 섬유의 영률(Young's modulus)은 천연 조직의 영률과 유사한 것으로 나타났습니다. 케라틴 비율이 증가함에 따라 영률은 감소하였습니다. 해당 그림은 PCL/케라틴 비율에 따른 영률 변화의 그래프 추이를 보여줍니다.여기에 제시된 푸리에 변환 적외선 분광법(FTIR) 스펙트럼은 PCL과 케라틴의 결합을 확인시켜 줍니다. 1,722 cm⁻¹에서 측정된 주요 피크는 PCL 흡수 대역의 표준 기본 측정값과 일치하며 모든 스펙트럼에서 관찰됩니다. PCL 케라틴 섬유 상의 세포 부착 및 증식은 해당 섬유가 독성이 없으며 세포 성장을 위한 지지체 역할을 한다는 것을 확인시켜 줍니다.나노섬유를 따라 성장한 필로포디아(filopodia)는 섬유아세포와 PCL/케라틴 섬유 사이의 유리한 상호작용을 나타냅니다. 숙련되면 이 나노섬유 합성 기술은 적절하게 수행될 경우 24시간 이내에 완료할 수 있습니다. 전기방사 절차를 시도할 때는 고분자 용액의 점도, 용액의 유량, 인가 전압, 회전 드럼의 속도 및 섬유아세포 배양 단계를 기억하는 것이 중요합니다.이 영상을 시청하신 후, PCL/케라틴 기반 나노섬유를 합성하는 방법과 이것이 생체의학 공학 분야에서 갖는 중요성에 대해 충분히 이해하시게 될 것입니다. 이 절차를 통해 세포 생존능 및 생체 내 분해 테스트와 같은 다른 방법들을 수행함으로써 조직에 대한 독성 반응, 조직 성장 및 섬유의 분해에 관한 추가적인 질문들에 대한 답을 얻을 수 있습니다. 이 기술의 개발 이후, 재생 공학 분야의 연구자들은 피부 재생, 상처 치유 및 약물 전달과 같은 분야를 탐구할 수 있는 길을 열게 되었습니다.TFE와 같은 유기 용매 및 고전압을 사용하는 작업은 매우 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안 항상 보안경, 실험복, 장갑을 착용하고 용매를 적절하게 폐기하는 등의 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.

synthesis-of-keratin-based-nanofiber-for-biomedical-engineering

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

특히 단백질과 상호 작용 할 수있는 기능 그룹으로 장식 nanofibers을 준비하기위한 효율적인 접근 방법이 설명되어 있습니다. 방법은 먼저 해당 기능 그룹과 기능화 폴리머의 준비가 필요합니다. 기능 고분자는 electrospinning에 의해 nanofibers로 제조된다. 단백질과 nanofibers의 바인딩의 효과는 공 촛점 현미경으로 연구하고 있습니다.

Biofunctional Nanofibers를 제조 절차

Electrospun의 공사장 공중 발판은 조직 공학 응용 프로그램을위한 포스트 프로덕션을 처리할 수 있습니다. 여기 불임 (무균 생산 또는 멸균 포스트 생산)을 달성하기 위해하고 적절한 biomechanical 속성을 달성위한 두꺼운 공사장 공중 발판을 (멀티 layering이 열을 사용하거나 증기가 풀림으로) 제작을 위해, 복잡한 공사장 공중 발판을 (연속 회전으로) 회전하는 방법을 설명합니다.

조직 공학을위한 Electrospun의 Fibres의 Postproduction 처리

단일 또는 다수의 세포 외 기질 단백질로부터 나노 섬유 및 나노 구조 복합체를 얻는 방법을 설명한다. 이 방법은 조직 공학 및 생명 공학 응용 프로그램의 다양한 사용을위한 조정 가능한 구성과 아키텍처 무료 서 단백질 계 물질을 생성하는 단백질 표면의 상호 작용을 사용합니다.

ECM 단백질 나노 섬유 및 나노 구조 엔지니어링 사용하여 표면 시작 회의

폴리 (글리세롤 도데)라는 이름의 새로운 생분해 성 고분자에서 새로운 디자인의 컬렉터를 통해 더 큰 예금 영역에 걸쳐 전기 방사 장 섬유 (PGD)의 합성 및 제조가보고되었다. 마우스 섬유는 다 능성 줄기 세포로부터 유도 된 세포의 성장을지지 할 수 있었다.

마우스 배아 줄기 세포에서 신경 조직 공학을위한 폴리의 전기 방사 섬유 발판 (글리세롤 dodecanedioate)

여기서 우리는 섬유의 계조 조직과 전기 방사 나노 섬유 지지체를 제작하고 세포 형태 / 방향을 조절하는 응용 프로그램을 탐구하는 프로토콜을 제시한다. 나노 섬유 지지체의 물리 화학적 특성에 관한 그라디언트는 생물 의학 분야에서 다양한 응용 프로그램을 제공합니다.

섬유 조직의 그라데이션으로 전기 방사 나노 섬유 공사장 공중 발판

2차원 및 3차원 초소수성 고분자 재료는 유사한 조성의 더 낮은 표면 에너지 중합체와 혼합된 생분해성 중합체를 전기 방사 또는 전기 분무하여 제조됩니다.

바이오 메디컬 응용 프로그램에 대한 초 소수성 고분자 재료를 제조

이 원고 조작 하 고 인간 면역 결핍 바이러스 1 형 감염에 대 한 강력한 접착제 및 항 바이러스 활동을 보여 주는 Griffithsin 수정 폴 리 유산 공동 glycolic acid () electrospun 섬유를 특성화 하는 절차를 설명 합니다. 생체 외에서. 합성 하는 데 사용 하는 방법 표면 수정, 결과 형태, 활용, 특성 및 표면 수정 섬유에서 Griffithsin의 탈 착에 설명 되어 있습니다.

감염 성병 제조 및 방지를 위한 Griffithsin 수정 섬유 장비의 특성

이 프로토콜의 목표는 야누스 염기 나노튜브(JBNT)와 섬유네틴(FN)을 가진 생물미메틱 나노매트릭스(NM)의 조립을 보여주는 것이다. 인간 중간엽 줄기 세포(hMSC)와 공동 배양할 때, NM은 hMSCs 접착을 장려하는 우수한 생체 활성을 나타낸다.

야누스 베이스 나노튜브와 줄기 세포 접착을 위한 섬유네틴을 갖춘 바이오미메틱 나노 매트릭스의 제조

플라스틱 멤브레인이 있는 조직 배양 삽입물은 세포 배양 실험실에서 세포층과 장벽 조직 모델을 확립하기 위한 투과성 지지체로서 황금 표준입니다. 여기에서, 우리는 플라스틱 멤브레인을 재조합 기능화된 거미줄 단백질로부터 만들어진 생물학적으로 더 관련성이 높은 멤브레인으로 대체하는 간단한 방법을 제시한다.

맞춤형 조직 배양 인서트에 재조합 기능성 거미줄로 만든 Nanofibrillar 기저막 모방

다음 프로토콜은 광범위한 조직 공학 응용 분야에 적용할 수 있는 나노 스케일 패턴의 섬유소를 가진 콜라겐 하이드로겔 제조를 위한 전단 기반 압출 방법을 제시합니다.

조직공학을 위한 Nanofibrillar Patterned Collagen 생산

배우세요 전기방사 기법을 이용한 각질/PCL 나노섬유 합성 및 특성 분석 방법을. 이 기술은 조직 공학, 상처 치유 및 약물 전달을 위한 생의학적 응용에 활용됩니다.

의 생명 공학에 대한 각질 기반의 나노 섬유의 합성

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