ECM 단백질 나노 섬유 및 나노 구조 엔지니어링 사용하여 표면 시작 회의

이 절차의 전반적인 목표는 표면 개시 어셈블리를 사용하여 단일 또는 다중 세포 외 기질 단백질에서 독립형 나노 섬유, 나노 구조 및 2D 매트릭스를 엔지니어링하는 것입니다. 이는 먼저 PDMS 프리 폴리머를 지형적으로 패턴화된 마스터 몰드에 붓고 경화시켜 폴리 디메틸 소안 또는 PDMS 스탬프를 준비함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 경화된 PDMS 스탬프를 잘라내고 원하는 세포외 기질 단백질을 함유한 용액으로 코팅

다음으로, 스탬프를 세척, 건조 및 폴리 N iso 프로필 아크릴아미드 또는 파이프 PAM 코팅 유리 커버 슬립에 마이크로 접촉으로 인쇄합니다. 마지막 단계는 섭씨 40도의 따뜻한 탈이온수로 커버 슬립을 수화하고 용액을 서서히 냉각시키는 것입니다. 약 섭씨 32도 이하의 온도는 열에 민감한 파이프 PAM 층의 용해와 조립된 단백질 나노 섬유 또는 나노 구조의 방출을 유발합니다.

궁극적으로, 조립된 나노 섬유와 나노 구조는 위상차 및/또는 형광 현미경으로 확인된 바와 같이 용액에 독립되어 있으며 조직 공학 지지체와 같은 추가 응용 분야에 사용할 수 있습니다. 얼굴 분리 또는 전기 방사와 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 세포가 일반적으로 생체 내에서 ECM 섬유를 구축하는 방식을 실제로 모방하는 기술을 사용하여 ECM 단백질 나노 섬유를 엔지니어링할 수 있다는 것입니다. 표면 개시 조립 기술은 단백질 구성, 섬유 형태 및 골격 구조를 제어하는 기능을 포함하여 여러 가지 고유한 이점이 있습니다.

또한, 섬유 닌 라미네이트 및 콜라겐 유형 4와 같은 세포 외 기질 단백질에서 ECM 단백질 나노 섬유를 엔지니어링할 수 있지만, 이는 다른 유형의 방법을 사용하여 어려운 것으로 입증되었습니다. 이 방법은 연구자들이 접착 및 분화와 같은 다양한 세포 거동을 지시하기 위해 구체적이고 잘 정의된 물리적 및 화학적 단서를 가진 구조를 개발할 수 있도록 함으로써 조직 공학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술을 처음 사용하는 경우 스템의 품질과 마이크로 접촉 인쇄 패턴의 충실도를 지속적으로 검사해야 한다는 것을 기억해야 합니다.

이는 ECM 나노 섬유 및 나노 구조의 적절한 조립을 얻는 데 필수적입니다. 이 절차를 시작하기 위해, 엘라스토머 베이스와 경화제를 중량당 10:1 중량 비율로 결합하여 폴리 디메틸 소안 또는 PDMS 프리 폴리머를 준비하고, 일반적으로 80g의 베이스와 8g의 경화제를 사용하여 1cm 두께의 층 혼합물로 마스터 몰드를 덮을 수 있는 충분한 PDMS가 있는지 확인하고 다음 혼합물로 설정된 구심성 믹서를 사용하여 PDMS를 DGA합니다. 2분 동안 2000RPM, 2분 동안 2000RPM에서 DGA. 충분히 불쌍합니다.

PDMS 프리 폴리머를 마스터 몰드 위에 1cm 두께의 층을 형성하고, PDMS는 섭씨 65도에서 4시간 동안 베이킹합니다. 경화되면 메스를 사용하여 패턴이 포함된 영역을 잘라내어 PDMS 스탬프를 형성합니다. PDMS 스탬프의 뒷면과 피쳐 측면을 구별합니다.

우표 뒷면의 모서리 중 하나를 노치로 잘라냅니다. 직경 25mm의 유리 커버 슬립을 청소하고 커버 슬립을 95% 에탄올로 1시간 동안 초음파 처리한 다음 섭씨 65도의 오븐에서 건조시켜 이 절차를 시작합니다. 다음으로, 폴리프로필아크릴아미드 및 이소프로필 아크릴아미드 또는 piam 용액을 10%의 농도로 하나의 부탄올에 용해시키고, 깨끗한 유리 덮개를 스핀 코어의 진공 척에 밀어 넣고 파이프 Pam 용액 200마이크로리터를 유리 표면에 피펫팅하여 표면을 완전히 덮습니다.

스핀 코팅은 6, 000 RPM에서 1 분 동안 슬립됩니다. PDMS 스탬프를 50 % 에탄올에서 30 분 동안 초음파 처리하여 세척 한 다음 질소 건조 흐름으로 건조시키고 모든 후속 단계를 생물 안전 캐비닛에서 수행하여 세포 외 매트릭스 또는 ECM 나노 구조가 세포와 함께 사용되는 응용 분야의 무균 상태를 유지해야합니다. 마이크로 접촉 인쇄 단계는 이 절차에서 가장 어려운 부분입니다.

사용하기 전에 PDMS 스탬프에 눈에 보이는 결함이 있는지 검사하는 것이 중요합니다. 또한 2주일이 지난 단백질 용액은 사용하지 마십시오. PIAM 코팅 커버는 밀폐된 페트리 접시 안으로 들어가 UV 노출을 사용하여 살균합니다.

생물 안전 캐비닛에서 자외선 아래에서 45분이면 충분합니다. 각 PDMS 스탬프의 패턴 표면을 200마이크로리터의 단백질 용액으로 코팅합니다. 피브로넥틴 또는 FN은 멸균 증류수에서 밀리리터당 50마이크로그램의 농도로 여기에 사용됩니다.

실온에서 1시간 동안 배양한 후 PDMS 스탬프와 증류수를 세척하여 과도한 단백질을 제거하고 질소 흐름에서 완전히 건조시킵니다. 파이프의 조기 용해를 방지하기 위해 물을 완전히 제거하는 것이 중요합니다. 커버 슬립의 팸 코팅과 부적절한 단백질 전달.

필요한 경우 PDMS 스탬프의 특징면을 파이프 PAM 코팅 커버 슬립과 접촉시켜 마이크로 접촉 인쇄를 수행합니다. 집게를 사용하여 스탬프 뒷면을 가볍게 두드려 기포를 제거하고 5분 후에 균일하게 접촉하도록 합니다. 커버 슬립에서 PDMS 스탬프를 떼어냅니다.

이 단계에서. 연구에 따라 추가 ECM 단백질을 패턴화하여 더 복잡하고 다성분 구조를 만들 수 있습니다. ECM 패턴이 인쇄되면 패턴이 있는 파이프 PAM 코팅 커버 슬립을 35mm 페트리 접시에 넣고 위상차 현미경을 사용하여 패턴 충실도를 검사합니다.

패턴에 따라 패턴의 특징을 해결하기 위해 CCD 카메라가 필요할 수 있습니다. 형광 현미경 검사는 ECM 단백질이 형광 표지된 경우 패턴을 검사하는 데에도 사용할 수 있습니다. 패턴 충실도를 확인한 후 페트리 접시에 섭씨 40도의 증류수 3ml를 넣고 물이 서서히 냉각되도록 하여 파이프가 용해되도록 합니다.

PAM 층과 ECM 단백질 패턴의 방출은 위상차 현미경을 사용하여 모니터링할 수 있습니다. 일반적으로 ECM 단백질 나노 구조가 방출되었는지 확인하기 위해 물은 파이프의 낮은 임계 용액 온도인 pam(섭씨 32도)보다 훨씬 낮은 실온으로 냉각됩니다. 응용 프로그램이 광학 기술의 사용을 허용하지 않는 경우 용액 온도를 측정하여 방출을 모니터링할 수 있습니다.

나노 섬유 및 기타 나노 구조는 파이프 PAM 층이 방출된 후 물에 떠 있을 것입니다. 추가 응용 분야를 위해 나노 직물 및 기타 나노 구조를 조작해야 하지만 정확한 접근 방식은 실험 목적에 따라 다릅니다. 표면 개시 조립(Surface Initiated Assembly, SIA)이 섬유 치수를 정밀하게 제어하면서 ECM 단백질 나노 섬유를 엔지니어링할 수 있음을 입증하기 위해 대표적인 결과가 여기에 제시되어 있습니다.

길이 50마이크로미터, 너비 20마이크로미터의 피브로넥틴 직사각형 배열을 섭씨 40도의 DI 물을 첨가한 piam 코팅된 커버 슬립에 패턴화하고 이후 임계 하수 이하로 냉각시켰습니다. piam의 온도는 piam의 용해와 방출 시 피브로인 나노 섬유의 방출을 유발했습니다. 섬유는 내재된 프리스트레스 하에 있었기 때문에 수축했습니다.

피브로넥틴 나노섬유 치수에 대한 Alice 분석을 통해 피브로넥틴 나노섬유 치수를 시험해 본 결과, 평균 길이는 50.19 플러스 마이너스 0.49 마이크로미터, 평균 너비는 19.98 플러스 마이너스 0.17 마이크로미터인 모노 분산으로 나타났습니다. 방출 시 나노 섬유는 눈에 띄게 수축했지만 평균 길이는 14.15, 플러스 또는 마이너스 0.92 마이크로미터, 평균 너비는 2.65 플러스 마이너스 0.32 마이크로미터로 모노 분산을 유지했습니다. 원자력 현미경은 SIA 방출 공정과 관련된 섬유 치수 변화에 대한 더 높은 해상도의 관점을 제공했습니다.

특히 방출 전 섬유는 약 5나노미터의 균일한 두께를 가졌던 반면, 방출 후 섬유는 두께가 수백 나노미터 정도인 반면 길이와 너비는 감소했습니다. SIA 공정을 사용하면 조정 가능한 크기, 모양 및 구성을 가진 다양한 ECM 단백질 나노 구조를 설계할 수 있습니다. 예를 들어, 처음에는 너비가 20마이크로미터, 길이가 1센티미터인 피브로넥틴 나노 섬유를 파이프에 패턴화했습니다.

PAM 코팅 커버는 냉각 및 파이프시 미끄러집니다. 팸 용해, 나노 섬유를 방출하여 약 3 마이크로 미터의 감소 된 너비로 긴 실을 형성했다. 또한, 패턴은 마이크로 접촉 인쇄에 사용되는 PDMS 스탬프의 표면 지형에 의해 정의되기 때문에 복잡한 ECM 단백질 나노 구조를 개념 증명으로 엔지니어링할 수 있습니다.

여러 개의 팔을 가진 피브로인 별이 만들어졌습니다. 열 방출은 팔의 수축을 초래했지만, 팔이 함께 결합된 별의 중심 영역은 수축하지 않았습니다. SIA는 라미네이트 또는 LN과 같은 다른 ECM 단백질과도 함께 작용하며, 여러 ECM 단백질을 동일한 구조에 통합할 수 있습니다.

이 예에서는 직교 상호 연결, 빨간색으로 표시된 20마이크로미터 너비의 피브로넥틴 라인과 2D 나노 패브릭에 통합된 녹색으로 표시된 50마이크로미터 너비의 라미닌 라인이 패턴화된 다음 방출 시 방출 시 두 가지 유형의 나노 섬유가 모두 수축했지만 전체 상호 연결성과 정사각형 격자 구조는 유지되었습니다. 이러한 결과는 SIA가 다양한 조성 및 구조를 가진 ECM 재료를 엔지니어링하는 데 사용될 수 있음을 보여줍니다. 마지막으로, ECM 나노 파이버의 SIA 실패의 일부 사례가 표시됩니다.

한 가지 원인은 ECM 단백질이 piam 표면으로 전달되지 않아 불완전한 패턴이 부적절하게 방출되는 것입니다. 마이크로 접촉 인쇄 중에 구멍, 불규칙한 가장자리 및 기타 결함이 있으면 불완전하고 방출 시 파손 및 파편화되기 쉬운 나노 섬유 및 나노 구조가 생성됩니다. 파이프 PAM의 빠른 용해는 또한 릴리스 후 패턴 충실도 저하를 유발할 수 있습니다.

예를 들어, 섭씨 20도의 물을 사용하면 온도가 이미 임계 하한보다 낮습니다. piam의 온도는 piam을 빠르게 팽창시키고 용해시킵니다. 이로 인해 나노 섬유가 32번째 이미지에 예시된 것처럼 뒤로 스냅 및 파손되고 52초 이미지에 예시된 바와 같이 임의의 비조직화 구성을 형성할 수 있습니다.

이 절차를 시작하기 전에 PDMS의 상태에 결함이 있는지 확인하고 모든 표면에 먼지가 없는지 확인합니다. 그렇지 않으면 적절한 단백질 전달을 방해하고 A CM 구조의 조립이 불량하게 됩니다. 따라서 이 절차에 따라 방출 나노 섬유 또는 나노 구조는 단백질 섬유의 기계적 특성을 분석하는 것과 같은 여러 가지 작업을 수행하는 데 사용되거나 조직 공학을 위한 골격으로 사용될 수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 조정 가능한 구성, 기하학 및 아키텍처로 ECM 단백질 나노 섬유 및 나노 구조를 엔지니어링하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 특히, ECM 단백질의 인쇄 패턴을 파이썬 코팅된 유리 커버 슬립에 마이크로 접촉한 다음 ECM 구조를 조립하기 위해 표면의 용해를 열적으로 트리거하는 방법을 이해해야 합니다.