ECM 단백질 나노 섬유 및 나노 구조 엔지니어링 사용하여 표면 시작 회의

이 절차의 전반적인 목표는 표면 개시 조립법을 사용하여 단일 또는 다수의 세포외 기질 단백질로부터 자립형 나노 섬유, 나노 구조 및 2D 매트릭스를 제작하는 것입니다. 이는 먼저 PDMS 프리폴리머를 지형학적 패턴이 형성된 마스터 몰드에 붓고 경화시켜 폴리디메틸실록산(PDMS) 스탬프를 준비함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 경화된 PDMS 스탬프를 절단하고, 이를 원하는 세포외 기질 단백질이 포함된 용액으로 코팅하는 것입니다.

다음으로, 스탬프를 세척 및 건조한 후 poly N iso propyl acrylamide(PNIPAM)가 코팅된 유리 커버슬립 위에 마이크로 접촉 인쇄합니다. 마지막 단계로, 40 °C의 따뜻한 탈이온수로 커버슬립을 수화시킨 후 용액의 온도가 서서히 낮아지도록 둡니다. 온도가 약 32 °C 아래로 내려가면 열감응성 PNIPAM 층의 용해가 유도되어 조립된 단백질 나노섬유 또는 나노구조체가 방출됩니다.

결과적으로, 조립된 나노 섬유와 나노 구조체는 위상차 및 또는 형광 현미경으로 확인한 바와 같이 용액 내에서 자립형으로 존재하며, 조직 공학 지지체와 같은 추가적인 응용 분야에 사용될 수 있습니다. 이 기술이 상분리 또는 전기방사 등 기존 방법과 비교하여 갖는 주요 장점은 세포가 생체 내에서 ECM 섬유를 구축하는 방식을 실제로 모방한 기술을 사용하여 ECM 단백질 나노 섬유를 설계할 수 있다는 점입니다. 표면 개시 조립 기술은 단백질 조성, 섬유 형태 및 지지체 구조를 제어할 수 있는 능력을 포함하여 여러 가지 독특한 장점을 가지고 있습니다.

더불어, 다른 방식으로는 구현하기 어려웠던 피브리넥틴 라미닌 및 4형 콜라겐과 같은 세포외 기질 단백질로부터 ECM 단백질 나노 섬유를 제작할 수 있습니다. 이 방법은 연구자가 접착 및 분화와 같은 다양한 세포 행동을 유도하기 위해 구체적이고 명확하게 정의된 물리적, 화학적 신호를 갖춘 구조물을 개발할 수 있게 함으로써 조직 공학 분야의 핵심적인 질문들에 대한 해답을 찾는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술을 처음 접하신다면, 스탬프의 품질과 마이크로 컨택 프린팅 패턴의 충실도를 지속적으로 점검해야 함을 기억하십시오.

이는 ECM 나노 섬유와 나노 구조의 적절한 조립을 얻기 위해 필수적입니다. 이 절차를 시작하려면, 엘라스토머 베이스와 경화제를 10:1 무게 비율로 혼합하여 폴리디메틸실록산(PDMS) 프리폴리머를 준비하십시오. 일반적으로 마스터 몰드를 1cm 두께의 층으로 덮기에 충분한 양의 PDMS를 확보하기 위해 베이스 80g과 경화제 8g을 사용합니다. 원심 혼합기를 사용하여 PDMS를 혼합 및 탈포하며, 2000 RPM에서 2분간 혼합하고, 2000 RPM에서 2분간 탈포하십시오. 충분히 부으십시오.

마스터 몰드 위에 PDMS 프리폴리머를 도포하여 1 cm 두께의 층을 형성한 후, 65 °C에서 4시간 동안 가열하여 PDMS를 경화시킵니다. 경화가 완료되면 메스로 패턴이 포함된 영역을 잘라내어 PDMS 스탬프를 제작합니다. PDMS 스탬프의 패턴 면과 뒷면을 구분하십시오.

스탬프 뒷면의 모서리 중 하나를 V자 형태로 파냅니다. 먼저 지름 25 millimeter 유리 커버슬립을 세척하는 과정으로 시작하며, 커버슬립을 95% ethanol에서 1시간 동안 초음파 세척한 후 65 degrees celsius 오븐에서 건조합니다. 다음으로, poly 및 isopropyl acrylamide(piam) 용액을 준비하기 위해 piam을 1-butanol에 10% 농도로 용해합니다. 깨끗한 유리 커버슬립을 스핀 코터의 진공 척 중앙에 배치하고, piam 용액 200 microliters를 유리 표면에 피펫팅하여 표면 전체를 덮습니다.

커버슬립을 6,000 RPM에서 1분 동안 스핀 코팅합니다. PDMS 스탬프를 50% ethanol에서 30분 동안 초음파 세척한 후, 질소 가스 스트림으로 건조합니다. 세포와 함께 세포외 기질 또는 ECM 나노 구조를 사용하는 응용 분야의 경우, 멸균 상태를 유지하기 위해 이후의 모든 단계는 생물안전작업대 내에서 수행해야 합니다. 마이크로 접촉 인쇄 단계가 이 절차에서 가장 까다로운 부분입니다.

사용 전 PDMS 스탬프에 눈에 보이는 결함이 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 또한, 제조 후 2주가 지난 단백질 용액은 사용하지 마십시오. PIAM이 코팅된 커버 슬립을 닫힌 페트리 접시 안에 넣고 UV 노출을 통해 멸균하십시오.

생물안전작업대(biosafety cabinet) 내에서 UV 램프 아래에 45분 동안 두는 것으로 충분합니다. 각 PDMS 스탬프의 패턴 표면에 단백질 용액 200 µL를 도포합니다. 여기서는 멸균 증류수에 50 µg/mL 농도로 희석한 Fibronectin(또는 FN)을 사용합니다.

실온에서 1시간 동안 배양한 후, PDMS 스탬프를 증류수로 세척하여 과잉 단백질을 제거하고 질소 기류 하에서 완전히 건조시킵니다. 파이프의 조기 용해를 방지하기 위해 물기를 완전히 제거하는 것이 중요합니다. 커버슬립의 Pam 코팅 및 부적절한 단백질 전이.

필요한 경우, PDMS 스탬프의 패턴 면을 pipe PAM이 코팅된 커버 슬립에 접촉시켜 마이크로 콘택트 프린팅을 수행하십시오. 핀셋을 사용하여 스탬프 뒷면을 가볍게 두드려 기포를 제거하고, 5분 후에 균일하게 접촉되었는지 확인하십시오. 커버 슬립에서 PDMS 스탬프를 떼어내십시오.

이 단계에서, 연구 목적에 따라 추가적인 ECM 단백질을 패턴화하여 더 복잡하고 다성분으로 구성된 구조를 생성할 수 있습니다. ECM 패턴 인쇄가 완료되면, 패턴화된 pipe PAM 코팅 커버슬립을 35 millimeter 페트리 접시에 넣고 위상차 현미경을 사용하여 패턴의 충실도를 확인하십시오.

패턴에 따라 패턴의 특징을 구분하기 위해 CCD 카메라가 필요할 수 있습니다. ECM 단백질이 형광 표지된 경우라면 형광 현미경을 사용하여 패턴을 검사할 수도 있습니다. 패턴의 충실도를 확인한 후, 페트리 접시에 40 °C의 증류수 3 mL를 넣고 물이 서서히 식으면서 파이프가 용해되도록 합니다.

PAM 층과 ECM 단백질 패턴의 방출은 위상차 현미경을 사용하여 모니터링할 수 있습니다. 일반적으로 ECM 단백질 나노구조가 방출되었는지 확인하기 위해, 물을 pNIPAM의 하한 임계 용액 온도인 32 °C보다 훨씬 낮은 실온으로 냉각합니다. 광학적 기법을 사용할 수 없는 응용 분야의 경우, 용액 온도를 측정하여 방출 여부를 모니터링할 수 있습니다.

파이프 PAM 층이 분리되면 나노 섬유 및 기타 나노 구조체들이 물속에 떠 있게 됩니다. 추가적인 응용을 위해서는 나노 패브릭과 기타 나노 구조체들을 조작해야 하며, 구체적인 방법은 실험 목적에 따라 달라집니다. 여기서는 표면 개시 조립(surface initiated assembly, SIA)을 통해 섬유 크기를 정밀하게 제어하며 ECM 단백질 나노 섬유를 제작할 수 있음을 보여주는 대표적인 결과들을 제시합니다.

길이 50 µm, 너비 20 µm의 피브로넥틴 직사각형 배열을 piam 코팅된 커버슬립 위에 패턴화한 후, 40 °C의 DI water를 첨가하고 이어서 piam의 하한 임계 용액 온도 아래로 냉각시켰습니다. piam의 용해와 그에 따른 피브로인 나노 섬유의 방출이 유도되었습니다. 이 섬유들은 고유의 사전 응력(prestress) 상태에 있었기 때문에 수축되었습니다.

PIAM 표면에 패턴화되었을 때, 방출 전 피브로넥틴 나노섬유의 크기를 분석한 결과, 평균 길이 50.19 ± 0.49 µm, 평균 너비 19.98 ± 0.17 µm로 단분산 상태인 것으로 나타났습니다. 방출 후 나노섬유는 상당히 수축되었으나, 평균 길이 14.15 ± 0.92 µm, 평균 너비 2.65 ± 0.32 µm의 단분산 상태를 유지했습니다. 원자 힘 현미경(AFM)을 통해 SIA 방출 과정과 관련된 섬유 크기 변화를 더 높은 해상도로 관찰할 수 있었습니다.

특히, 방출 전 섬유는 약 5 nm의 균일한 두께를 가졌으나, 방출 후 섬유는 길이와 너비가 감소하면서 두께가 수백 nm 수준으로 증가했습니다. SIA 공정을 이용하면 크기, 모양 및 조성을 조절할 수 있는 다양한 ECM 단백질 나노구조를 설계하는 것이 가능합니다. 예를 들어, 초기 너비 20 µm, 길이 1 cm의 피브로넥틴 나노 섬유를 파이프 위에 패턴화했습니다.

냉각 및 파이핑 후 PAM이 코팅된 커버 슬립입니다. PAM이 용해되면서 나노 섬유가 방출되어 너비가 약 3 µm로 감소한 긴 가닥을 형성했습니다. 또한, 마이크로 컨택 프린팅에 사용된 PDMS 스탬프의 표면 지형에 의해 패턴이 정의되므로, 개념 증명으로서 복잡한 ECM 단백질 나노구조를 설계하는 것이 가능합니다.

다중 팔 구조의 피브로인 별 모양 구조체를 제작하였습니다. 열적 방출로 인해 팔 부분은 수축되었으나, 팔들이 결합된 별의 중심 영역은 수축되지 않았습니다. SIA는 라미닌(laminate) 또는 LN과 같은 다른 ECM 단백질에도 적용 가능하며, 여러 종류의 ECM 단백질을 동일한 구조체에 통합할 수 있습니다.

본 예시에서는 2D 나노 패브릭에 통합된 빨간색의 20 µm 너비 fibronectin 선과 초록색의 50 µm 너비 laminin 선이 직교하며 서로 연결된 형태로 패턴화되었습니다. 이후 이를 해제하자 두 종류의 나노 섬유 모두 수축하였으나, 전체적인 상호 연결성과 정사각형 격자 구조는 유지되었습니다. 이러한 결과는 SIA를 통해 다양한 조성과 구조를 가진 ECM 재료를 설계할 수 있음을 보여줍니다. 마지막으로, ECM 나노 섬유의 SIA가 실패한 몇 가지 사례를 보여줍니다.

한 가지 원인은 ECM 단백질이 piam 표면으로 제대로 전이되지 않아 불완전한 패턴이 부적절하게 탈착되었기 때문입니다. 마이크로 접촉 인쇄 과정에서 구멍, 불규칙한 가장자리 및 기타 결함이 존재하면, 탈착 시 부서지거나 파편화되기 쉬운 불완전한 나노 섬유 및 나노 구조가 생성됩니다. 또한 pipe PAM의 급격한 용해 역시 탈착 후의 패턴 충실도를 떨어뜨릴 수 있습니다.

예를 들어, 이미 하한 임계 용해 온도보다 낮은 20 °C의 물을 사용하면 piam의 온도가 낮아지면서 piam이 빠르게 팽창하고 용해됩니다. 이는 32번째 이미지에서 보여주는 것처럼 나노 섬유가 다시 튕겨 나가며 끊어지게 할 수 있으며, 52초 이미지에서 보여주는 것처럼 무작위하고 무질서한 구성으로 형성될 수 있습니다.

이 절차를 시작하기 전에 PDMS stem에 결함이 없는지 확인하고 모든 표면에 먼지가 없는지 확인하십시오. 그렇지 않으면 적절한 단백질 전이가 방해되어 ACM 구조의 조립 상태가 불량해질 수 있습니다. 이 절차를 통해 분리된 나노 섬유 또는 나노 구조는 단백질 섬유의 기계적 특성 분석이나 조직 공학용 지지체 등 다양한 용도로 사용될 수 있습니다.

이 영상을 시청한 후, 여러분은 조성, 기하학적 구조 및 아키텍처를 조절할 수 있는 ECM 단백질 나노 섬유와 나노 구조를 설계하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 구체적으로, 파이톤(python)이 코팅된 유리 커버슬립 위에 ECM 단백질 패턴을 마이크로 접촉 인쇄하고, 이후 표면의 용해를 열적으로 유도하여 ECM 구조를 조립하는 방법을 학습하게 됩니다.