Name: ECM 단백질 나노 섬유 및 나노 구조 엔지니어링 사용하여 표면 시작 회의 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-17T16:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 33 s
Description: 배우세요 세포외기질 단백질 나노섬유 및 복잡한 나노구조를 표면 시작 조립으로 제작하는 방법을. PDMS 스탬프와 마이크로 접촉 프린팅 기술을 활용하여 조직 공학 및 바이오테크놀로지에 적합한 재료를 설계할 수 있습니다.

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금융 지원은 NIH 감독의 새로운 혁신 상 (1DP2HL117750)에서 다우드-ICES 교제 QJ과 AWF에, 재생 의학 T32 교육 프로그램 (2T32EB003392)에 NIH 역학에서 JMS에 제공되었다.

포토 리소그래피를 사용하여 마스터 몰드 1. 제작 <ol><li> ECM 단백질 나노 섬유, nanofabrics 및 제조 할 수있는 나노 구조는 첫 번째 (CAD) 소프트웨어를 컴퓨터 지원 설계를 사용하여 설계되었습니다. 이 CAD 파일은 그 다음, 포토 마스크로 전사된다. 포토 마스크의 분류는 특징의 해상도에 의존 할 것이다; 투명도 기반의 포토 마스크와 기능에 대한 충분한은 ~ 10 ㎛까지 크기. 작은 기능은 10 ㎛ 유리 포토 마스크에 크롬이 필요합니다 &lt;. 여기에 제시된 나노 섬유 및 나노 구조의 모든 투명도 기반의 포토 마스크를 이용하여 제조하고, 따라서 두께가 나노 미터 스케일했지만 횡되지 치수 하였다. 참고 : 그것은 (통과 자외선 방지) 포토 마스크의 영역이 어둡게되는 구분하는 것이 중요하고 투명하게되는이 같은 (UV 빛이 통과 할 수 있도록), 포토 레지스트의 종류에 따라 (양 또는 음) 마스터 몰드의 최종 지형을 지시 할 것이다. </li><li> 마스터 몰드의 제조를 시작하기 위해 15 분 동안 150 ° C의 설정, 핫 플레이트에 배치하여 4 &quot;실리콘 웨이퍼를 탈수. </li><li> 스핀 코터의 진공 척에 웨이퍼를 중앙. 웨이퍼의 중간에 SU8 2015 네가티브 포토 레지스트를 붓고 웨이퍼의 3 분의 2가 덮여 때까지 동심원 쏟아져 계속합니다. 참고 : 거품의 형성을 최소화하기 위해 붓는 때 웨이퍼 SU8 가까이의 병을 유지. </li><li> 다음과 같이 스핀 코터 프로그램 : <ul><li> 스프레드주기 : 10 초 동안 100 RPM / 초 가속 500 분당 회전 수. </li><li> 회전주기 : 30 초 동안 100 RPM / 초 가속 4,000 rpm으로. </li></ul> 주 :이 스핀 코팅 레시피 두께 ~ 10 ㎛ 인 포토 레지스트 층을 형성 할 것이다. 방사 속도 또는 SU8 제형을 변경함으로써, 두께가 조정될 수있다. </li><li> 소프트 3 분 동안 95 ° C로 설정 열판에 배치하여 웨이퍼를 굽는다. </li><li> 를 통해 자외선 웨이퍼를 노출140 엠제이 / cm 2의 총 투여 량을위한 포토 마스크. 참고 : SU8은 네가티브 포토 레지스트 그러므로 UV 광이 포토 마스크를 통과 할 수있는 영역은 현상 후에 남아 마스터 주형에 융기 형상이 될 것이다. </li><li> 4 분 동안 95 ° C의 설정 열판에 배치하여 웨이퍼 베이크 노출을 게시합니다. </li><li> 3 분 동안 SU8 개발자에 배치하여 웨이퍼를 개발한다. 3 분 후에, 이소 프로필 알코올로 웨이퍼를 헹군다. 흰색 막을 세정 중에 생성되는 경우, 웨이퍼는 완전히 개발되지 않고 다른 30 ​​초 동안 현상 제에 다시 배치되어야한다. 이소 프로필 알콜로 세척한다. 흰색 필름이 이소 프로필 알코올 세정하는 동안 형성하지 않을 때까지이 과정을 반복합니다. </li><li> 먼지로부터 보호하기 위해 150mm 페트리 접시에 질소와 장소의 흐름에 웨이퍼를 건조. </li></ol> 2. PDMS 스탬프 만들기 <ol><li> 탄성 중합체 기반을 결합하고있는 에이전트를 경화시켜 PDMS 예비 중합체를 준비10시 1분 w / w 비율. 일반적 기재 및 경화제 8g의 80g는 1cm 두꺼운 층에 마스터 주형을 커버하기에 충분한 PDMS가 있는지 확인하기 위해 사용된다. </li><li> 혼합하고 다음과 같이 설정 구심 믹서를 사용하여 PDMS를 드가 : <ul><li> 혼합 : 2 분 동안 2,000 rpm으로 </li><li> 드가 : 2 분 동안 2,000 rpm으로. </li></ul></li><li> 믹서를 사용할 수없는 경우 10 ㎖ 혈청 피펫을 사용하여 10 분 동안 손으로 PDMS를 섞는다. 기포를 제거하기 위해 30 분간 진공 건조기에 배치하여, 혼합물을 탈기. </li><li> 1cm 두께의 층을 형성하는 매스터 주형 (패터닝 된 실리콘 웨이퍼) 위에 충분한 PDMS의 예비 중합체를 붓는다. 48 시간 동안 4 시간 또는 실내 온도 65 ° C에서 소성하여 PDMS를 치료. </li><li> 일단 치료, 패턴을 포함하는 영역은 PDMS 스탬프를 형성하기 위해 절단 할 수 있습니다. PDMS 스탬프의 뒤편에서 기능면을 구분하기 위해 우표의 뒷면의 모서리 중 하나 밖으로 노치를 잘라. </li></ol> 3. 마이크로 콘택트 홍보ECM 패턴의 inting <ol><li> 1 시간과 65 ° C 오븐에서 건조 후 95 % 에탄올에서 초음파에 의해 청소 지름 25mm 유리 커버 슬립. </li><li> 10 %의 농도 (10 ml 중 V / w, 전형적 1g)에서 1 - 부탄올에 용해시켜 PIPAAm PIPAAm 용액을 준비한다. </li><li> 전체 유리 표면이 피복되도록 PIPAAm 용액의 스핀 코터 피펫 200 μL의 진공 척에 유리 커버 슬립을 가운데. </li><li> 1 분 동안 6,000 rpm에서 커버 슬립을 Spincoat. </li><li> 30 분 질소의 흐름에 따라 다음 건조 50 % 에탄올에서 초음파에 의해 PDMS 스탬프를 청소합니다. 참고 : 건조 및 후속 단계는 ECM 나노 구조가 세포로 사용될 어플리케이션을위한 무균을 유지하는 바이오 캐비닛에서 수행되어야한다. </li><li> 코트는 각 PDMS의 패턴 화 된 표면은 단백질 용액 200 μL, FN 멸균 증류수에 일반적으로 50 μg / ㎖와 스탬프. 실온에서 1 시간 동안 배양한다. 참고 : 목볼륨을 코팅하면 1.5 cm 2 PDMS 스탬프 용, PDMS 스탬프를 사용 ECM 단백질과 용액 ECM 단백질의 농도의 크기에 따라 조정해야한다. </li><li> 충분히 질소의 흐름에 따라 여분의 단백질과 건조를 제거하기 위해 증류수에 PDMS 스탬프를 씻으십시오. 참고 : 스탬프에 남아있는 모든 물이 커버 슬립에 PIPAAm 코팅의 조기 해산을 트리거하고 적절한 단백질 전송을 방지 할 수 있습니다. </li><li> 무균 제조를 들어, 폐쇄 배양 접시 안에 PIPAAm 코팅 커버 슬립을 배치하고 생물 안전 캐비닛에 자외선 노출, 자외선 아래에서 45 분을 사용하여 살균하면됩니다. 불임이 필요하지 않은 경우이 단계를 생략 할 수 있습니다. </li><li> PIPAAm 코팅 coverslip에 접촉 PDMS 스탬프의 기능 측면을 배치하여 미세 접촉 인쇄를 수행합니다. 필요한 경우, 공기 방울을 제거하고 균일 한 접촉을 보장하기 위해 우표의 뒷면에 가볍게 살짝 집게를 사용합니다. </li><li> 5 마일 후N, 커버 슬립에서 PDMS 스탬프를 벗긴다. </li><li> 이 단계에서, 부가적인 ECM 단백질은 더 복잡하고 다 성분 구조를 생성하도록 패터닝 될 수있다. 최대 3 인쇄용이 과정에서 작동하도록 확인 된, 더는 실현 될 수있다. </li></ol> ECM 나노 섬유 및 나노 구조 4. 출시 <ol><li> 35mm 페트리 접시에있는 패턴 PIPAAm 코팅 커버 슬립을 놓고 위상차 현미경을 사용하여 패턴 충실도를 검사합니다. 패턴에 따라, CCD 카메라는 패턴의 기능을 해결해야 할 수도 있습니다. 형광 현미경도 ECM 단백질은 형광 표지되어 제공된 패턴을 검사하는데 사용될 수있다. </li><li> 페트리 접시에 40 ° C의 증류수 3 mL를 넣고 물을 서서히 냉각 할 수 있습니다. </li><li> PIPAAm 층의 용해 및 ECM 단백질 패턴의 방출은 위상차 현미경을 사용하여 모니터링 할 수있다. 애플리케이션은 광 TEC의 사용을 허가하지 않는 경우hniques, 릴리스는 용액의 온도를 측정하여 모니터링 할 수 있습니다. 전형적으로, 물은 ECM 단백질 나노 구조가 릴리스 된 있도록 잘 PIPAAm (32 ℃)의 LCST 이하, 실온으로 냉각된다. </li><li> 출시 후, 나노 섬유, nanofabrics 및 기타 나노 구조는 물에 떠있다. 이를 사용하려면 추가 응용 프로그램들은 조작 할 필요가있다. 정확한 방법은 실험 목적에 따라 달라집니다하고, 다른 표면에 고정화 미세 조작기 시스템으로 이동하거나 하이드로 겔 삽입 등의 단계를 포함 할 수있다. </li></ol>

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</ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

SIA의 방법은 여기에서 모방 세포 매개 매트릭스 어셈블리를 제시하고 조정할 수있는 크기, 조직 및 구성과 ECM 단백질 나노 섬유 및 나노 구조의 설계를 가능하게한다. 세포 생성 ECM과 동일하지는 않지만, SIA는 기계적 변형 21 일 동안 전개 / 가역 접는를 받아야 세포 20을 바인딩 할 수 있습니다 나노 단백질 섬유 (20)로 구성 ECM을 만듭니다. 이것은 생체 내에서 발견 된 ECM의 여러 속성을 요점을 되풀이 ECM 단백질의 자료를 구축 할 수있는 독특한 기능을 제공합니다. 예를 들어, ECM 나노 파이버는 다른 기술과 불가능한 제어 레벨에 특정 길이로 제조 될 수있다. 우리는 단 분산 나노 섬유의 배열 길이의 정확한 제어와 폭 시험판 (그림 2C) 및 릴리스 후 (그림 2D)과 (그림 2)을 생성 할 수있는 기능을 보여줍니다. FN 나노 제조에 의해 입증 이러한 ECM 나노 섬...

조직의 세포 외 기질 (ECM)를 부착, 증식, 분화 및 세포 사멸 1-3 포함한 여러 세포 프로세스의 물리적, 화학적 조절에 관여 다기능 단백질로 구성되어있다. ECM은, 합성, 조립 및 세포 조직의 구성 단백질 섬유 조직의 종류와 발달 단계에 따라 달라 독특한 성분, 섬유의 크기, 형상 및 상호 연결된 구조를 가지고있다. 최근 작품은 ECM이 조성과 구조의 측면에서 ECM을 recapitulating하는 조직 공학 및 생명 공학 응용을위한 생체 모방 재료의 개발을 가능하게 할 수 있다고 제안, 설계 조직 4를 형성하는 세포를 안내하는 유익한 단서를 제공 할 수 있음을 보여 주었다. 제조 방법의 수는 조직에 ECM의 측면을 모방 할 중합체 골격을 설계하기 위해 개발되었다. 예를 들어, 전기 방사 및 위상 저전압 회로 차단기ATION 모두 다운 수십 마이크로 미터에서 나노 미터 5-7 수십에 이르는 직경 섬유의 다공성 매트릭스를 형성하는 능력을 증명하고있다. 두 가지 기술은 나노 섬유의 다공성 매트릭스는 발판 (8)에 세포 부착 및 침투를 지원할 수있는 것으로 나타났습니다. 그러나 이러한 접근 방식을 만들 수 있습니다 가능한 섬유 형상, 방향 및 3D 아키텍처에 제한됩니다. 상 분리가 무작위로 지향 섬유 지지체를 생산하는 반면 전기 방사는 일반적으로 무작위로 지향 또는 매우 정렬 된 하나 섬유 발판을 생산하고 있습니다. 재료에 대한 제한은 연구자 전형적 폴리이어서 세포 부착을 촉진하는 ECM 단백질로 코팅된다 (ε-카프로 락톤) (8) 및 폴리 (락트산 - 코 - 글리콜 산) (9)와 같은 합성 중합체를 사용하여도있다. 자연 생물 중합체는 또한, 콜라겐 타입 I (10), 젤라틴 (11), 피브리노겐 (12)을 포함하여 사용된다키토산 (13), 실크 (14) 만 네이티브 조직에서 발견되는 단백질의 일부만을 나타낸다. 대부분의 조직은 기존의 방법을 사용하여 나노 섬유를 제조하기가 어렵거나 불가능한 피브로넥틴 (FN), 라미닌 (LN), 콜라겐 IV 형과 히알루 론산 등의 ECM 단백질과 다당류의 더 큰 환경을 포함한다. 이 문제를 해결하기 위해, 우리는 세포가 조립하고 자신의 주변에서 ECM 단백질 섬유를 구성, 합성 방식을 흉내 낸에 대한 우리의 연구 노력을 집중했다. 특정 fibrillogenesis 프로세스가 상이한 ECM 단백질에 대해 다르​​지만, 일반적 ECM 단백질 분자의 입체 형태 변화가 애매한 자기 조립 사이트를 노출 효소 또는 수용체 매개의 상호 작용에 의해 트리거된다. 여기에서 우리는 더 fibrillogenesis 과정을 이해하는 모델 시스템으로 FN를 사용합니다. 간단히, FN 동종이 량체는 10 타입 II에서 RGD의 아미노산 서열을 통해 세포 표면의 수용체 인테그린에 결합나는 장치를 반복합니다. 일단 바인딩, 인테그린은 actomyosin 수축을 통해 떨어져 이동하고 암호화 된 자기 조립 사이트를 노출하는 FN 이량 체를 전개. 이 FN-FN 결합 부위의 노출은 바로 세포 표면 (15)에 불용성 브릴로 조립하는 FN 이합체 수 있습니다. 세포가없는 시스템에서 작업은 암호화 된 FN-FN 결합 부위가 공기 - 액체 - 고체 인터페이스 17-19에서 변성제 16 또는 표면 장력을 사용하여 전개를 통해 공개 될 수 있음을 보여 주었다. 그러나, 이들 기술에 의해 생성 된 FN 섬유는 특정 섬유 크기 및 형상에 제한되며, 일반적으로 표면에 결합된다. 여기에 우리가 독립 불용성 나노 섬유, nanofabrics (2D 시트) (그림 1 단일 또는 다중 ECM 단백질로 구성된 다른 나노 구조를 만드는 단백질 표면의 상호 작용을 이용하여 이러한 한계를 극복 할 방법이라면 시작한 어셈블리 (SIA) (20)를 설명 ). 이 P에서로웠은, ECM 단백질은 용액에서 소형, 구형 형태에서 흡착 부분적 패턴, 소수성 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 스탬프 상 (펼쳐진) 변성된다. ECM 단백질은 다음 22 인쇄 미세 접촉을 통해 열 감응성 폴리 (N-이소 프로필) (PIPAAm) 표면에이 상태로 전송됩니다. 40 ° C의 물에 수화 때 PIPAAm 고체 남아 있지만, 32 °의 C로 냉각 할 때 그것은 친수성이되는 낮은 임계 용액 온도 (LCST)를 통과, 물에 팽윤하고 용해 떨어져 조립 ECM 나노 구조를 해제 면. SIA 방법은 나노 미터 스케일의 정밀 치수 제어를 제공한다. 이러한 구성, 섬유 형상 및 구조와 같은 주요 파라미터를 제어함으로써, 생체 내에서 발견 된 ECM의 여러 속성을 요점을 되풀이하고, 조직 공학 및 생명 공학 응용을위한 고급 발판을 개발하는 것이 가능하다.

<table><tbody><tr><td>폴리(N-이소프로필아크릴아미드) / PIPAAm</td><td>Polysciences</td><td>21458-10</td><td>40,000 Mw</td></tr><tr><td>Sylgard 184 실리콘 키트(PDMS)</td><td>다우코닝</td><td></td><td>은 10개 부품 베이스와 1개 경화제를 혼합합니다.</td></tr><tr><td>부탄올</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>피브로넥틴</td><td>BD 생명과학</td><td>354008</td><td>인간, 1mg</td></tr><tr><td>라미닌</td><td>BD 생명과학</td><td>354239</td><td>초순수, 마우스, 1mg</td></tr><tr><td>음성 감광액</td><td>Microchem</td><td>SU8-2015</td><td></td></tr><tr><td>SU8 개발자</td><td>Microchem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonicator Branson M3510</td><td>Branson Ultrasonic Corporation</td><td>CPN-952-318</td><td></td></tr><tr><td>Thinky ARE-250 믹서</td><td>Thinky Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spincoater</td><td>특수 코팅 시스템</td><td>G3P-8</td><td></td></tr><tr><td>유리 커버 25mm 직경, No 1.5</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-86</td><td></td></tr></tbody></table>

ecm 단백질 나노 섬유 및 나노 구조 엔지니어링 사용하여 표면 시작 회의

ECM Protein Nanofibers and Nanostructures Engineered Using Surface-initiated Assembly

조직의 세포 외 기질 (ECM)의 합성과 밀접 규제 섬유 직경, 조성 및 조직 차원 섬유 성 단백질의 네트워크를 형성하기 위해 세포에 의해 조립된다. 구조적지지를 제공하는 것 외에도, ECM의 물리 화학적 특성은 접착 성, 분화 및 세포 사멸 등 다양한 세포 과정에 중요한 역할을한다. 생체, ECM은 단백질 내에서 암호화 된 자기 조립 (fibrillogenesis) 사이트를 노출시킴으로써 조립할 . 이 과정은 다른 단백질을 다양하지만, 피브로넥틴 (FN) fibrillogenesis 잘 특징입니다 세포 매개 ECM 조립을위한 모델 시스템 역할을합니다. 특히, 세포는 불용성 섬유로 어셈블리에 대한 바인딩 사이트를 펼치고 노출 FN 이량 체 및 actomyosin 생성 수축력을 바인딩하는 세포막에 인테그린 수용체를 사용합니다. 이 수용체 - 중재 과정은 조직 SCA에 세포에서 ECM을 조립하고 구성하는 세포 수레. 여기, 우리는 ECM 단백질을 전개하고 불용성 섬유로 그들을 조립하는 단백질 표면의 상호 작용을 이용하여 세포 매개 매트릭스 어셈블리를 되풀이되었습니다 방법이라면 시작한 어셈블리 (SIA)를 제시한다. 첫째, ECM 단백질들은 부분적으로 (펼치) 변성 및 암호화 된 바인딩 도메인을 노출 소수성 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 표면에 흡착된다. 펼쳐진 단백질은 다음 열 감응성 폴리 (N-이소 프로필) (PIPAAm) 표면에 미세 접촉 인쇄를 통해 잘 정의 된 마이크로 및 나노 패턴을에 전송됩니다. PIPAAm의 열 트리거 용해 최종 조립과 잘 정의 된 지오메트리와 불용성 ECM 단백질 나노 섬유 및 나노 구조의 릴리스로 연결됩니다. 복잡한 구조는 미세 접촉 인쇄에 사용되는 PDMS 스탬프에 엔지니어링 정의 된 패턴에 의해 가능하다. FN 이외에, SIA 프로세스는 라미닌, 피브리노겐으로 사용될 수 있고 콜라겐은 I 및 IV는 다 성분 ECM의 나노 구조를 만드는 입력뚜. 따라서, SIA는 생체 내에서 ECM의 구조와 구성을 다시 요약하기 위해 단백질 조성물, 섬유 형상 및 지지체 구조를 정확하게 제어하여 ECM 단백질 계 물질을 설계하는 데 사용될 수있다.

SIA는 섬유 치수를 정확하게 제어 엔지니어링의 ECM 단백질 나노 섬유의 할 수있다. 이 방법을 설명하기 위해 50 × 20 ㎛, 평면 치수 FN 나노 섬유의 배열은 PIPAAm 코팅 커버 슬립 (그림 2A)로 패턴 화 하였다. PIPAAm 표면 (그림 2B)에 패턴 때 그들이 고유의 사전 스트레스를 받고 있었기 때문에 릴리스에 따라, 섬유는 계약. FN 나노 섬유의 분석들은 50.19의 평균 길이가 단 분산 시험판했다 밝혀 ± 19.98 ± 0.17 ㎛, 0.49 ㎛의 폭 (그림 2C). 분명 계약에도 불구하고, FN 섬유는 출시 후 여전히 14.15의 평균 길이가 단 분산했다 ± 2.65 ± 0.32 μm의 (그림 2D)의 0.92 μm의 폭. 원자 힘 현미경은 SIA 분리 프로세스와 연관된 섬유 치수 변화의 높은 해상도 관점을 제공했다. 특히, 섬유는 시험판했다~ 5 nm의 (그림 2E...

단일 또는 다수의 세포 외 기질 단백질로부터 나노 섬유 및 나노 구조 복합체를 얻는 방법을 설명한다. 이 방법은 조직 공학 및 생명 공학 응용 프로그램의 다양한 사용을위한 조정 가능한 구성과 아키텍처 무료 서 단백질 계 물질을 생성하는 단백질 표면의 상호 작용을 사용합니다.

ECM 단백질 나노 섬유 및 나노 구조 엔지니어링 사용하여 표면 시작 회의

The extracellular matrix (ECM) in tissues is synthesized and assembled by cells to form a 3D fibrillar, protein network with tightly regulated fiber ...

이 절차의 전반적인 목표는 표면 개시 조립법을 사용하여 단일 또는 다수의 세포외 기질 단백질로부터 자립형 나노 섬유, 나노 구조 및 2D 매트릭스를 제작하는 것입니다. 이는 먼저 PDMS 프리폴리머를 지형학적 패턴이 형성된 마스터 몰드에 붓고 경화시켜 폴리디메틸실록산(PDMS) 스탬프를 준비함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 경화된 PDMS 스탬프를 절단하고, 이를 원하는 세포외 기질 단백질이 포함된 용액으로 코팅하는 것입니다.다음으로, 스탬프를 세척 및 건조한 후 poly N iso propyl acrylamide(PNIPAM)가 코팅된 유리 커버슬립 위에 마이크로 접촉 인쇄합니다. 마지막 단계로, 40 °C의 따뜻한 탈이온수로 커버슬립을 수화시킨 후 용액의 온도가 서서히 낮아지도록 둡니다. 온도가 약 32 °C 아래로 내려가면 열감응성 PNIPAM 층의 용해가 유도되어 조립된 단백질 나노섬유 또는 나노구조체가 방출됩니다.결과적으로, 조립된 나노 섬유와 나노 구조체는 위상차 및 또는 형광 현미경으로 확인한 바와 같이 용액 내에서 자립형으로 존재하며, 조직 공학 지지체와 같은 추가적인 응용 분야에 사용될 수 있습니다. 이 기술이 상분리 또는 전기방사 등 기존 방법과 비교하여 갖는 주요 장점은 세포가 생체 내에서 ECM 섬유를 구축하는 방식을 실제로 모방한 기술을 사용하여 ECM 단백질 나노 섬유를 설계할 수 있다는 점입니다. 표면 개시 조립 기술은 단백질 조성, 섬유 형태 및 지지체 구조를 제어할 수 있는 능력을 포함하여 여러 가지 독특한 장점을 가지고 있습니다.더불어, 다른 방식으로는 구현하기 어려웠던 피브리넥틴 라미닌 및 4형 콜라겐과 같은 세포외 기질 단백질로부터 ECM 단백질 나노 섬유를 제작할 수 있습니다. 이 방법은 연구자가 접착 및 분화와 같은 다양한 세포 행동을 유도하기 위해 구체적이고 명확하게 정의된 물리적, 화학적 신호를 갖춘 구조물을 개발할 수 있게 함으로써 조직 공학 분야의 핵심적인 질문들에 대한 해답을 찾는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술을 처음 접하신다면, 스탬프의 품질과 마이크로 컨택 프린팅 패턴의 충실도를 지속적으로 점검해야 함을 기억하십시오.이는 ECM 나노 섬유와 나노 구조의 적절한 조립을 얻기 위해 필수적입니다. 이 절차를 시작하려면, 엘라스토머 베이스와 경화제를 10:1 무게 비율로 혼합하여 폴리디메틸실록산(PDMS) 프리폴리머를 준비하십시오. 일반적으로 마스터 몰드를 1cm 두께의 층으로 덮기에 충분한 양의 PDMS를 확보하기 위해 베이스 80g과 경화제 8g을 사용합니다. 원심 혼합기를 사용하여 PDMS를 혼합 및 탈포하며, 2000 RPM에서 2분간 혼합하고, 2000 RPM에서 2분간 탈포하십시오. 충분히 부으십시오.마스터 몰드 위에 PDMS 프리폴리머를 도포하여 1 cm 두께의 층을 형성한 후, 65 °C에서 4시간 동안 가열하여 PDMS를 경화시킵니다. 경화가 완료되면 메스로 패턴이 포함된 영역을 잘라내어 PDMS 스탬프를 제작합니다. PDMS 스탬프의 패턴 면과 뒷면을 구분하십시오.스탬프 뒷면의 모서리 중 하나를 V자 형태로 파냅니다. 먼저 지름 25 millimeter 유리 커버슬립을 세척하는 과정으로 시작하며, 커버슬립을 95% ethanol에서 1시간 동안 초음파 세척한 후 65 degrees celsius 오븐에서 건조합니다. 다음으로, poly 및 isopropyl acrylamide(piam) 용액을 준비하기 위해 piam을 1-butanol에 10% 농도로 용해합니다. 깨끗한 유리 커버슬립을 스핀 코터의 진공 척 중앙에 배치하고, piam 용액 200 microliters를 유리 표면에 피펫팅하여 표면 전체를 덮습니다.커버슬립을 6,000 RPM에서 1분 동안 스핀 코팅합니다. PDMS 스탬프를 50% ethanol에서 30분 동안 초음파 세척한 후, 질소 가스 스트림으로 건조합니다. 세포와 함께 세포외 기질 또는 ECM 나노 구조를 사용하는 응용 분야의 경우, 멸균 상태를 유지하기 위해 이후의 모든 단계는 생물안전작업대 내에서 수행해야 합니다. 마이크로 접촉 인쇄 단계가 이 절차에서 가장 까다로운 부분입니다.사용 전 PDMS 스탬프에 눈에 보이는 결함이 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 또한, 제조 후 2주가 지난 단백질 용액은 사용하지 마십시오. PIAM이 코팅된 커버 슬립을 닫힌 페트리 접시 안에 넣고 UV 노출을 통해 멸균하십시오.생물안전작업대(biosafety cabinet) 내에서 UV 램프 아래에 45분 동안 두는 것으로 충분합니다. 각 PDMS 스탬프의 패턴 표면에 단백질 용액 200 µL를 도포합니다. 여기서는 멸균 증류수에 50 µg/mL 농도로 희석한 Fibronectin(또는 FN)을 사용합니다.실온에서 1시간 동안 배양한 후, PDMS 스탬프를 증류수로 세척하여 과잉 단백질을 제거하고 질소 기류 하에서 완전히 건조시킵니다. 파이프의 조기 용해를 방지하기 위해 물기를 완전히 제거하는 것이 중요합니다. 커버슬립의 Pam 코팅 및 부적절한 단백질 전이.필요한 경우, PDMS 스탬프의 패턴 면을 pipe PAM이 코팅된 커버 슬립에 접촉시켜 마이크로 콘택트 프린팅을 수행하십시오. 핀셋을 사용하여 스탬프 뒷면을 가볍게 두드려 기포를 제거하고, 5분 후에 균일하게 접촉되었는지 확인하십시오. 커버 슬립에서 PDMS 스탬프를 떼어내십시오.이 단계에서, 연구 목적에 따라 추가적인 ECM 단백질을 패턴화하여 더 복잡하고 다성분으로 구성된 구조를 생성할 수 있습니다. ECM 패턴 인쇄가 완료되면, 패턴화된 pipe PAM 코팅 커버슬립을 35 millimeter 페트리 접시에 넣고 위상차 현미경을 사용하여 패턴의 충실도를 확인하십시오.패턴에 따라 패턴의 특징을 구분하기 위해 CCD 카메라가 필요할 수 있습니다. ECM 단백질이 형광 표지된 경우라면 형광 현미경을 사용하여 패턴을 검사할 수도 있습니다. 패턴의 충실도를 확인한 후, 페트리 접시에 40 °C의 증류수 3 mL를 넣고 물이 서서히 식으면서 파이프가 용해되도록 합니다.PAM 층과 ECM 단백질 패턴의 방출은 위상차 현미경을 사용하여 모니터링할 수 있습니다. 일반적으로 ECM 단백질 나노구조가 방출되었는지 확인하기 위해, 물을 pNIPAM의 하한 임계 용액 온도인 32 °C보다 훨씬 낮은 실온으로 냉각합니다. 광학적 기법을 사용할 수 없는 응용 분야의 경우, 용액 온도를 측정하여 방출 여부를 모니터링할 수 있습니다.파이프 PAM 층이 분리되면 나노 섬유 및 기타 나노 구조체들이 물속에 떠 있게 됩니다. 추가적인 응용을 위해서는 나노 패브릭과 기타 나노 구조체들을 조작해야 하며, 구체적인 방법은 실험 목적에 따라 달라집니다. 여기서는 표면 개시 조립(surface initiated assembly, SIA)을 통해 섬유 크기를 정밀하게 제어하며 ECM 단백질 나노 섬유를 제작할 수 있음을 보여주는 대표적인 결과들을 제시합니다.길이 50 µm, 너비 20 µm의 피브로넥틴 직사각형 배열을 piam 코팅된 커버슬립 위에 패턴화한 후, 40 °C의 DI water를 첨가하고 이어서 piam의 하한 임계 용액 온도 아래로 냉각시켰습니다. piam의 용해와 그에 따른 피브로인 나노 섬유의 방출이 유도되었습니다. 이 섬유들은 고유의 사전 응력(prestress) 상태에 있었기 때문에 수축되었습니다.PIAM 표면에 패턴화되었을 때, 방출 전 피브로넥틴 나노섬유의 크기를 분석한 결과, 평균 길이 50.19 ± 0.49 µm, 평균 너비 19.98 ± 0.17 µm로 단분산 상태인 것으로 나타났습니다. 방출 후 나노섬유는 상당히 수축되었으나, 평균 길이 14.15 ± 0.92 µm, 평균 너비 2.65 ± 0.32 µm의 단분산 상태를 유지했습니다. 원자 힘 현미경(AFM)을 통해 SIA 방출 과정과 관련된 섬유 크기 변화를 더 높은 해상도로 관찰할 수 있었습니다.특히, 방출 전 섬유는 약 5 nm의 균일한 두께를 가졌으나, 방출 후 섬유는 길이와 너비가 감소하면서 두께가 수백 nm 수준으로 증가했습니다. SIA 공정을 이용하면 크기, 모양 및 조성을 조절할 수 있는 다양한 ECM 단백질 나노구조를 설계하는 것이 가능합니다. 예를 들어, 초기 너비 20 µm, 길이 1 cm의 피브로넥틴 나노 섬유를 파이프 위에 패턴화했습니다.냉각 및 파이핑 후 PAM이 코팅된 커버 슬립입니다. PAM이 용해되면서 나노 섬유가 방출되어 너비가 약 3 µm로 감소한 긴 가닥을 형성했습니다. 또한, 마이크로 컨택 프린팅에 사용된 PDMS 스탬프의 표면 지형에 의해 패턴이 정의되므로, 개념 증명으로서 복잡한 ECM 단백질 나노구조를 설계하는 것이 가능합니다.다중 팔 구조의 피브로인 별 모양 구조체를 제작하였습니다. 열적 방출로 인해 팔 부분은 수축되었으나, 팔들이 결합된 별의 중심 영역은 수축되지 않았습니다. SIA는 라미닌(laminate) 또는 LN과 같은 다른 ECM 단백질에도 적용 가능하며, 여러 종류의 ECM 단백질을 동일한 구조체에 통합할 수 있습니다.본 예시에서는 2D 나노 패브릭에 통합된 빨간색의 20 µm 너비 fibronectin 선과 초록색의 50 µm 너비 laminin 선이 직교하며 서로 연결된 형태로 패턴화되었습니다. 이후 이를 해제하자 두 종류의 나노 섬유 모두 수축하였으나, 전체적인 상호 연결성과 정사각형 격자 구조는 유지되었습니다. 이러한 결과는 SIA를 통해 다양한 조성과 구조를 가진 ECM 재료를 설계할 수 있음을 보여줍니다. 마지막으로, ECM 나노 섬유의 SIA가 실패한 몇 가지 사례를 보여줍니다.한 가지 원인은 ECM 단백질이 piam 표면으로 제대로 전이되지 않아 불완전한 패턴이 부적절하게 탈착되었기 때문입니다. 마이크로 접촉 인쇄 과정에서 구멍, 불규칙한 가장자리 및 기타 결함이 존재하면, 탈착 시 부서지거나 파편화되기 쉬운 불완전한 나노 섬유 및 나노 구조가 생성됩니다. 또한 pipe PAM의 급격한 용해 역시 탈착 후의 패턴 충실도를 떨어뜨릴 수 있습니다.예를 들어, 이미 하한 임계 용해 온도보다 낮은 20 °C의 물을 사용하면 piam의 온도가 낮아지면서 piam이 빠르게 팽창하고 용해됩니다. 이는 32번째 이미지에서 보여주는 것처럼 나노 섬유가 다시 튕겨 나가며 끊어지게 할 수 있으며, 52초 이미지에서 보여주는 것처럼 무작위하고 무질서한 구성으로 형성될 수 있습니다.이 절차를 시작하기 전에 PDMS stem에 결함이 없는지 확인하고 모든 표면에 먼지가 없는지 확인하십시오. 그렇지 않으면 적절한 단백질 전이가 방해되어 ACM 구조의 조립 상태가 불량해질 수 있습니다. 이 절차를 통해 분리된 나노 섬유 또는 나노 구조는 단백질 섬유의 기계적 특성 분석이나 조직 공학용 지지체 등 다양한 용도로 사용될 수 있습니다.이 영상을 시청한 후, 여러분은 조성, 기하학적 구조 및 아키텍처를 조절할 수 있는 ECM 단백질 나노 섬유와 나노 구조를 설계하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 구체적으로, 파이톤(python)이 코팅된 유리 커버슬립 위에 ECM 단백질 패턴을 마이크로 접촉 인쇄하고, 이후 표면의 용해를 열적으로 유도하여 ECM 구조를 조립하는 방법을 학습하게 됩니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

특히 단백질과 상호 작용 할 수있는 기능 그룹으로 장식 nanofibers을 준비하기위한 효율적인 접근 방법이 설명되어 있습니다. 방법은 먼저 해당 기능 그룹과 기능화 폴리머의 준비가 필요합니다. 기능 고분자는 electrospinning에 의해 nanofibers로 제조된다. 단백질과 nanofibers의 바인딩의 효과는 공 촛점 현미경으로 연구하고 있습니다.

Biofunctional Nanofibers를 제조 절차

우리는 2 차원 (2D) 전구체의 패턴과 재구성 입자의 합성 실험 내용을 설명합니다. 이 방법론은 polyhedra과 마이크로에서 센티미터 규모에 이르기까지 다양한 길이의 비늘에서 붙잡는 장치를 포함하여 모양의 다양한 입자를 생성하는 데 사용할 수 있습니다.

종이 접기 고취 패턴 및 재구성 입자의 자기 조립

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초단파 자기조립 펩타이드 매트릭스에서 SW1222 세포주의 대장암 오가노이드 제조 및 특성화

플라스틱 멤브레인이 있는 조직 배양 삽입물은 세포 배양 실험실에서 세포층과 장벽 조직 모델을 확립하기 위한 투과성 지지체로서 황금 표준입니다. 여기에서, 우리는 플라스틱 멤브레인을 재조합 기능화된 거미줄 단백질로부터 만들어진 생물학적으로 더 관련성이 높은 멤브레인으로 대체하는 간단한 방법을 제시한다.

맞춤형 조직 배양 인서트에 재조합 기능성 거미줄로 만든 Nanofibrillar 기저막 모방

다음 프로토콜은 광범위한 조직 공학 응용 분야에 적용할 수 있는 나노 스케일 패턴의 섬유소를 가진 콜라겐 하이드로겔 제조를 위한 전단 기반 압출 방법을 제시합니다.

조직공학을 위한 Nanofibrillar Patterned Collagen 생산

배우세요 세포외기질 단백질 나노섬유 및 복잡한 나노구조를 표면 시작 조립으로 제작하는 방법을. PDMS 스탬프와 마이크로 접촉 프린팅 기술을 활용하여 조직 공학 및 바이오테크놀로지에 적합한 재료를 설계할 수 있습니다.

ECM 단백질 나노 섬유 및 나노 구조 엔지니어링 사용하여 표면 시작 회의

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