조건을 사용하여 쥐 소장에서 재생성 Paneth 세포의 역할을 분석하기위한 프로토콜 Cre 호텔-LOX 마우스 모델

이 해부 절차의 전반적인 목표는 후속 특성 분석 기술을 위해 마우스 장을 분리하고 준비하는 방법을 보여주는 것입니다. 이 방법은 실험적 절차에 따라 장 줄기 세포가 장을 다시 증식하는 능력을 조사하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 모든 기술이나 절차 또는 유전자 조작 후에 사용할 수 있다는 것입니다 : 크레이 잠금 기술 사용 안락사 된 성인 마우스를 누운 자세로 놓고 털을 70 % 에탄올로 적시는 것으로 시작합니다.

그런 다음 가위를 사용하여 정중선을 따라 복강내강을 세로로 열고 겸자로 위를 고정합니다. 다음으로 식도와의 연결을 끊고 위를 부드럽게 당겨 맹장까지의 소장을 제거합니다. 그런 다음 맹장을 부드럽게 당겨 항문까지 대장을 제거합니다.

장이 분리되면 맹장에서 위를 제거하고 끝이 뭉툭한 피펫 팁이 장착된 주사기를 사용하여 PBS로 장을 씻어냅니다.플러시 직후 장을 3개의 동일한 크기, 근위부, 중간부, 원위부로 자릅니다. 그런 다음 각 부분을 1cm 조각으로 자르고 3-5개의 조직 조각을 2x2cm 크기의 수술용 테이프 중간에 놓습니다. 피라미드 형성에서 모든 조직이 부착되면 조각을 세로로 테이프로 밀봉하여 통나무 더미를 만듭니다.

그런 다음 조직 부피의 10배 이상의 중성, 완충, 형성 및 고정성 부피를 포함하는 바닥이 평평한 용기에 테이프를 넣고 포매 및 절편 전에 샘플을 섭씨 4도에서 보관합니다. 고정 후 조직 부피의 10배 이상을 포함하는 평평한 바닥 용기로 조직을 옮긴 후 조직 부피의 70% 에탄올 부피를 포함하여 세척 직후 Metcon에 조직을 고정합니다. 방금 보여준 것처럼 장을 같은 크기의 세 부분으로 자릅니다.

그런 다음 15 x 15cm 여과지에 각 섹션을 나란히 놓고 모든 섹션이 분할되었을 때 스프링 보우 가위를 사용하여 FOSS의 섹션을 엽니다. 고정이 끝나면 갓 준비한 Metcon이 들어 있는 유리 접시에 여과지를 옮기고 집게를 사용하여 각 장 조각의 끝을 한 번에 하나씩 집고 집게 주위에 조직을 감아 개별 스위스 롤을 만듭니다. 집게를 약간 열고 조직을 통해 25게이지 바늘을 삽입하여 각 롤을 고정합니다.

그런 다음 말린 조직을 바닥이 평평한 용기에 넣고 중성 완충 포뮬러 부피의 최소 10배를 함유하고 조직과 같은 고정제를 최소 1시간 동안 넣은 후 조직 파열의 전체 Mount 느슨한 시각화를 처리합니다. 미네랄 오일과 혼합 된 용융 생 왁스를 15cm 페트리 접시에 붓습니다. 그런 다음 얼음처럼 차가운 PBS로 장을 씻어낸 직후 25ml의 얼음 차가운 ex cal 고정제로 조직을 씻어냅니다.

고정 후 장을 3-5개의 동일한 부분으로 자르고 각 섹션을 냉각된 왁스 플레이트 중 하나에 놓습니다. 각 끝을 고정하여 섹션이 플레이트 상단의 장간막 선으로 약간 늘어나도록 합니다. 과도한 장간막을 다듬습니다.

그런 다음 봄 활 가위를 사용하여 모든 섹션이 고정되었을 때 열릴 때 세로로 고정되는 내장을 자릅니다. 섭씨 4도에서 최소 한 시간 후에 모든 조직을 덮을 수 있을 만큼 충분한 xal 고정제로 플레이트를 가득 채웁니다. 25ml 피펫 또는 주사기를 사용하여 고정제를 제거하고 30ml의 PBS로 조직을 한 번 씻습니다.

그런 다음 30ml의 DTTD 통합 용액으로 섹션을 덮어 흔들림과 함께 실온에서 30-60분 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 25 밀리리터 피펫 또는 주사기로 신화 용액을 제거하고 30 밀리리터의 PBS로 조직을 가득 채웁니다. 그런 다음 세척 후 후방 피펫을 사용하여 PBS로 점액을 제거합니다.

PBS를 30ml의 xal로 교체하여 다음날 아침 흔들 플랫폼에서 부드럽게 교반하여 어둠 속에서 실온에서 밤새 얼룩을 묻힙니다. 절편에 청록색 얼룩이 생기면 xal을 30ml의 PBS로 교체하십시오. 3분 동안 부드럽게 교반한 후, 방금 시연한 대로 스위스 롤을 만들고 조직을 포매 및 절편 전 최소 24시간 동안 섭씨 4도에서 조직 부피의 10배 이상의 적절한 고정액을 포함하는 입이 넓고 바닥이 평평한 용기에 조직을 놓습니다.

ROSA 26 R Laxy 조건부 리포터를 사용하면 재조합된 요람에서 추출한 DNA를 사용하여 소장에서 유도 3일 후 100% 재조합을 관찰할 수 있습니다. 재조합된 대립유전자에 대한 QPCR은 VI 주름 시스템 내에서 재조합의 유의미하지 않은 증가를 보여주었는데, 이는 잠재적으로 관찰되지 않은 paneth 세포의 재조합으로 인한 것입니다. laxy reporter를 사용하는 ah crease 시스템을 사용하여 두 시스템 모두 유도 후 3일 후에 재결합된 세포의 완전한 소실을 보여주었습니다.

유사분열 및 K crypt 세포 높이 데이터는 ah H Cree 시스템이 아마도 결합되지 않은 장 줄기 세포에 의한 재증식으로 인해 회복될 수 있음을 나타냅니다. 이와는 극명한 대조를 이루는 악당 크리는 상피샘 세포를 유지하고 있음에도 불구하고 회복하지 못했습니다. 또한, vi Cree Cantin B 무리 마우스의 소낭선 세포는 증식하지 않았고 장 줄기 세포 마커의 발현이 부족했습니다.

엠 포. 마찬가지로 ah cre 마우스의 crypts와 달리, PTH 세포는 VI Cree 시스템 내에서만 Caden b 결실 후 세포사멸을 겪었습니다. 이 기술을 마스터하면 약 10분 안에 완료할 수 있습니다.

조직 분해를 방지하기 위해 지연을 최소화하는 것이 중요합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 다운스트림 분석을 위해 마우스에서 장을 제거하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.