Name: 조건을 사용하여 쥐 소장에서 재생성 Paneth 세포의 역할을 분석하기위한 프로토콜 Cre 호텔-LOX 마우스 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: 학습하세요 쥐 소장 분리 및 고정 방법을 통해 장 상피 줄기세포와 Paneth 세포의 상호작용을 연구하는 기술입니다. 이 프로토콜은 장 재생 및 줄기세포 생물학 연구에 필수적입니다.

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저자는 Mark Bishop, Mathew Zverev, Victoria Marsh-Durban, Adam Blackwood 및 Sylvie Robine에게 감사를 표합니다. 이 연구는 영국 암 연구소(Cancer Research UK)의 프로그램 보조금으로 지원되었습니다.

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유전자와 세포의 기능을 해부 조건부 CRE-LOX 트랜스 제닉 마우스를 사용하는 것은 일반적으로 사용되는 접근 방법이다. 이 모델의 특성을 식별하고 줄기 세포를 2,4-6 질병 25에서의 역할을 이해하기 위해 소장에서 큰 성공으로 사용되어왔다. 이러한 모델을 충분히 활용하기 위해서는 올바르게 해석 할 데이터를 사용하는 시스템의 종합적인 특성을 요구한다. 이러한 시스템의 완전한 이해 인해 유전자 거의 독방 세포 유형 또는 위치, 생물학적 기술 및 Cre 호텔 발현을 유도하기 위해 사용되는 시스템의 비 효율성의 부족 특이성 없음으로 달성하기 어렵다. 여기에 설명 된 방법은 우리가 실험 설계 및 기존 지식의 응용 프로그램을 통해 이러한 문제를 극복하는 방법을 보여줍니다. 우리는 여기에 제시된 일반적인하고 Muri의 조사를 어떤 연구에 이용 될 수있는 기술 특정 연구 질문에 대답하기 위해 이러한 방법을 사용하지만NE 소장. 창자 조직의 준비 견고한 결과를 보장하기위한 중요한 단계는 엄격하게 부착 및 고정 적시 프로토콜에서 처리 될 필요가 조직의 수확 처리이다. 거의 모든 중요한 문제는 하류 티슈 건조 아웃 및 / 또는 불완전한 정착과 관련된 인공물에 기인 할 수있다. 타이밍은 조직 구조 및 / 또는 핵산 및 단백질의 분해를 방지하기 위해 매우 중요하다. 불완전하거나 지나치게 열성적인 고정은 조직 화학적 해상도의 손실이 발생할 수 있습니다. 시간이 부족하거나 정착 침투 IHC 분석에 따라 &quot;조류 마크&quot;로 관찰 할 수있는 장 지하실 내에서 해상도의 손실이 발생할 수 있도록 너무 두꺼운 부분으로 인해 불완전한 고정. 또한 그것은 핵 β-catenin이 바로 프로 않는 한 핵 밖으로 확산 될 수로 고정이 너무 오래 연장하지 않는 것이 중요합니다가공품의 수출입을 담 당하고과 포르말린 고정 다음 포함 된 왁스. ISC 틈새에서 Paneth 세포의 역할 여기에 제시된 데이터는 효과적으로 감소 ISC 다음 성인 부위에 토굴 재생성 Paneth 세포의 중요성을 보여준다. 그러나이 아 - CRE가 VIL-Cre 호텔 - 응급실 T2 대상 ISCS의 인구 여분 가능성을 유지했다. 티안 등. (26)은 우아 Lgr5 안녕하세요 ISCS는 Lgr5 싸다 예약 ISCS의 인구에 의해 대체되는 것을 보여 주었다. 지금이 ISCS 인해 예비 인구가 분비 세포 전구체 6,7로 확인 된에 AH-CRE 시스템에서 절약되는 것으로 보인다. ISC 상태로 복귀하는 데 필요한 때이 분비 세포 전구체를 지원하는 성숙한 Paneth 세포의 중요성은 대답 일이다. Paneth 세포를 구성하는 I로서SC 틈새 8 그들의 간호 기능을 자신의 전구체로 확장 할 가능성이 남아 칼로리 섭취량 (27)과 염증 28 ISC 반응을 조절하는 역할을한다. 새로운 접근 방식 및 기술을 효과적으로 모델 인간의 대장 암에 ISC의 발견은 지금 클라크 등의 검토에 의해 알 9 장 질환 및 생물학, 유전자 및 세포의 역할을 조사하는 새로운 마우스 모델을 생성하는 데 사용되는 유전자의 동정되었다. 이 기술에 대한 유일한 제한은 Cre 호텔 단백질을 발현하는 유전자를 확인한다. 현재 ISCS는 정기적으로 Lgr5 유전자 발현 패턴을 기반으로 조건부 형질 전환 마우스를 사용하여 조사하고 있습니다. Lgr5 프로모터로부터 발현 생쥐를 Cre 호텔은 APC, 가장 일반적으로 대장 암에서 돌연변이 된 유전자 (CRC를 제거하는데 사용되어왔다), 원점 (25)의 셀로서 ISC 시연. 선택적으로 삭제 이들 세포에서 다른 CRC 유전자는 질병의 진행에 대한 통찰력을 제공하고 확산된다 예. PTEN (29). ISC 기능에 추가 통찰력은 특히 절제 Lgr5 인간 디프테리아 독소 수용체를 사용하여 마우스의 세포를 발현에 의해 검색되고 (DTR) 유전자 Lgr5에 궤적 (26) 혔어요. 다른 전략이 돌연변이 단백질 (30)의 지속적인 가역 식을 수있는 구정-O 시스템을 사용합니다. 다른 셀 (31) 및 위치 (32, 33)의 유전자 (들)을 수정할 이러한 도구를 사용하는 것은 암이 시작하는 방법을 이해, 진보와 34 전이하는 데 사용됩니다. 또한 잠자는 아름다움 트랜스포존 시스템을 사용하여 돌연변이는 CRC의 새 드라이버를 식별한다. 마우스, 기술과 유전자 변형 전략의 지속적인 발전은 더 많은 환자 관련 모델 개발을 계속하고있다. 새로운 Methods는 장 상피와 ISCS의 특성을 위해 개발되었다. 유량을 이용하여 달성 될 수 상피 세포 유형의 비 특성화 계측법 렉틴과 CD24 (35)의 발현 차이에 기초. 잠재적으로 가장 큰 이해 ISC 생물학의 발전과 질병에서의 역할은 생체 organoid 문화 시스템 (36)을 사용하여 만들 수 있습니다. 이 시스템은 복제하고보다 생리 학적으로 중요한 방법으로 차별화 3D, 문화에 정상 및 악성 ISCS 수 있습니다. 이들 맞춤 의학 (37)에 대한 방법을 포장, 체외에서 환자 샘플에 약물을 직접 테스트를 가능하게 될 것으로 기대된다.

포유 동물의 창자 내강 표면이 돌기처럼 지하실과 손가락의 반복 단위 기능, 루멘 내로 돌출 융모를 불린다. 4 일 (1) -이 표면은 대략 매 3 완전한 자기 갱신을 거쳐 상피의 연속 시트입니다. 이 역동적 인 조직을 빠른 속도로 줄기 세포 순환의 인구에 의해 지원됩니다 (ISCS을, 또한 토굴베이스 원주 세포라고도 함) 처음 Lgr5 유전자 2,3의 발현에 의해 확인되었다. 이러한 세포 Lieberkuhn의 지하실 하단에 특화된 틈새에 존재한다. 처음 ISCS 빠르게 순환 하였다 발견 줄기 세포가 본질적으로 정지했다 지배적 아이디어와 불일치이다. 이 대기 라벨의 인구가 지하실의 기본에 대해 네 위치에서 세포를 유지하는 것으로 가정 된 Lgr5 + ISC의 식별에 이전, ISCS 1이었다. 최근 연구 시간지금처럼 주로 운명 이웃 4,5에 의해 조절되는 각각의 토굴에 효능이 동등 자전거 ISCS의 풀 (pool)이 있음을 보여줌으로써 이러한 관찰을 조정. 이벤트에서 그들은 이러한 일반적으로 분비 혈통에 최선을 다하고 있습니다 만 ISC 인구 6 손상된 경우 ISCS으로 되돌릴 수 있습니다 정지 세포에 의해 대체 될 수 있습니다 손실됩니다. ISC의 이웃 ISCS 또는 딸 세포가 될 수 있습니다. ISCS는 번성하는 선 장 루멘 (1) 상피 시트를 구성하는 특수 세포 유형으로 분화 순진한 딸 세포를 생성합니다. 잔, 장 내분비, 장 세포, 터프 트와 M 세포들이 다양한 흡 규제 기능을 제공 내강 표면을 위쪽으로 이동하지만, Paneth 세포들이 ISCS 섞여 존재 토굴의 바닥에 남아있다. 최근 몇 년 동안이 입증되었다 그 순진한 daught의 비율분비 혈통 향하는 어 세포는 손상 6,7에 ISC에 복귀 할 수있는 Lgr5 싸다 세포를 유지하는 대기 라벨입니다. 토굴에 의한 재생의 중요성에 순위가 ISCS과 이웃 특히 Paneth 세포 간의 상호 작용을 이해 넣었다. Paneth 세포 ISCS 8을 지원 틈새에 중요한 역할을한다. 살균 제품 이외에도 Paneth 세포는 ISC 갱신 또는 차별화를 지배하는 경로를 활성화 분자 신호를 생성한다. 이전의 연구들은 자신의 딸 Paneth 세포 (8)에 의해 제공되는 필수 틈새 신호를 경쟁 할 수있을 때 Lgr5 + ISCS는 존재할 수 있음을 보여 주었다. 이러한 연구는 정상 Lgr5 + ISCS과하지들이 손상 Lgr5 LO 인구에서의 보충을 필요로되는 상황에서 Paneth 세포의 역할을 조사 하였다. <p클래스 = &quot;jove_content은&quot;&gt; 우리는 형질 전환 마우스 모델 (9, 10)를 사용하여 세포 및 / 또는 유전자의 기능적 역할을 조사 장 생물학 및 모델 질병을 이해합니다. 자주 이러한 모델은 조건부 유전자 (들) 9,10을 수정 CRE-LOX 기술을 활용. Cre 호텔은 재조합 박테리오파지 (P1)에서 고립 된 인테그라 가족의 사이트 특이 적 재조합 효소이다 (재조합이되게합니다). Cre 호텔은 정의 (34) BP 사이에 위치 특이 적 재조합을 촉매로 &#39; 훈제 연어 P &#39;사이트 (크로스 오버 (P1)의 궤적 χ). 마우스는 유전자 Cre 호텔 재조합 효소의 발현에 절제되어 관심 지역의 측면에 loxP 사이트를 포함하도록 설계되었습니다. 세포 발달 또는 특정 프로모터 Cre 호텔 유전자의 발현을 연결하면 변경이 공간적 패션 9,10 이루어져야하는 경우,이 배아 치사 돌연변이를 극복하는데 특히 유용 할 수 있습니다. 또한 수용체 경로에 Cre 호텔 식을 연결하는,즉 인위적으로 활성화 될 수있는, 시간 변경을 허용한다. 이 기술을 이용하여, 우리는 장 상피에서 11 CatnB 유전자를 불 활성화. β 카테닌, CatnB 유전자 산물은 ISC 항상성에 적용되는 표준이 Wnt 신호 전달 경로의 조절 키이다. 이 전략을 사용하여 두 개의 이전 연구는 충돌하는 결과 12, 13을 생산했다. Fevr 등. (12)에 의한 연구는 줄기 세포와 장내 항상성의 손실을 보여 주었다. 아일랜드 외. 반면 14 연구 세포 생존율의 감소를 수행하는 것은 토굴-융모 축 CatnB 야생형 발현 세포에서의 증식을보고 하였다. 이 연구의 주요 차이점은 장내 상피 세포에 Cre 호텔을 표현하는 데 사용되는 발기인이었다. Fevr 등 알. 연구는 t를 투여함으로써 활성화 될 수있는 에스트로겐 수용체에 결합 villin 유전자 프로모터를 사용amoxifen (VIL-Cre 호텔 - 응급실 T2) (15, 16). 반면 아일랜드 등., 생체이 β-naphthoflavone (AH-CRE)에 대한 응답으로 Cre 호텔 식을 구동하기 위해 쥐 시토크롬 P450A1 (CYP1A1) 유전자의 프로모터 요소를 이용했다. 이러한 서로 다른 시스템의 특성은 서로 다른 관찰을 고려하여 두 가지 가설을 생성. CatnB보다 효율적하여 하위 레벨로 다시 채우기 ISCS의 수를 줄여, AH-CRE 비교 VIL-Cre 호텔 T2-ER의 시스템을 이용하여 ISC에서 삭제되는 제. 다른 방법으로는 분화 된 세포 인구에 CatnB 삭제 차동 예정이었다. VIL-Cre 호텔-ER T2 시스템 대상 AH-CRE 시스템 반면 crypt와 융모의 모든 상피 세포는 ISC 틈새과 토굴의 비 Paneth 세포를 대상으로합니다. 이러한 시스템은 검사 behav 이상적인 툴을 구비ISCS의 IOR과 Paneth 세포와의 상호 작용. 여기에서 우리는 우리가 Paneth 세포가 손상 17 장 반응을 중재에 중요한 역할을하는지 결정하기 위해이 시스템을 사용하는 방법에 따라 여러 가지 세부적인 프로토콜을 제시한다.

<table><tbody><tr><td>아세테이트 완충액</td><td>*</td><td>*</td><td>100ml 만들기: 4.8ml 0.2M 아세트산, 45.2ml 0.2M 아세트산나트륨 및 50ml 증류수</td></tr><tr><td>아세트산</td><td>Fisher Scientific</td><td>C/0400/PB17</td><td></td></tr><tr><td>무수아세트산</td><td>Sigma</td><td>A6404</td><td></td></tr><tr><td>무수아세트산 용액</td><td>*</td><td>*</td><td>0.1M 트리에탄올아민 염산염 Alcian Blue 중 2M 무수아세트산</td></tr><tr><td></td><td>시그마</td><td>A5268</td><td></td></tr><tr><td>알시안 블루 pH 2.5</td><td>*</td><td></td><td>*500ml 만들기: 아세트산 15ml, 알시안 블루 5g 및 485ml 증류수</td></tr><tr><td>항-디곡시제닌 알칼리 포스파타제 접합 항체</td><td>Abcam</td><td>ab119345</td><td></td></tr><tr><td>B(베타)-나프토플라본</td><td>Sigma</td><td>N3633</td><td>BNF, 화합물이 용액에서 떨어지므로 용액이 너무 많이 냉각되지 않도록 주입합니다. 솔루션은 재사용 할 수 있습니다. -20 &deg에서 보관하십시오. C 사용 사이에, 두 번 이상 재가열하지 마십시오.</td></tr><tr><td>Bloxall</td><td>Vector Labs</td><td>SP-6000</td><td></td></tr><tr><td>BM 보라색</td><td>Roche</td><td>11442074001</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A4503</td><td>소 혈청 알부민</td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>Fisher Scientific</td><td>C/4920/17</td><td></td></tr><tr><td>구연산염 완충액/항원 마스킹 해제 솔루션</td><td>Vector Labs</td><td>H-3300</td><td></td></tr><tr><td>옥수수 기름</td><td>Sigma</td><td>C8627</td><td></td></tr><tr><td>Demucifiying solution</td><td>*</td><td>*</td><td>500 ml의 경우: 50 ml 글리세롤, 50 ml Tris 0.1M pH8.8, 100 ml EtOH, 300 ml 식염수 (물 중 0.9% NaCl), DTT 1.7 g.&nbsp; Demucifying 해결책은 미리 만들어 저장할 수 있습니다, 그러나 DTT sholud는 배양 (340 mg/100 ml) 직전에 추가됩니다.</td></tr><tr><td>DEPC 처리수</td><td>Life Technologies</td><td>750023</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>101509944</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>O3690</td><td>0.5M</td></tr><tr><td>에탄올</td><td>Fisher Scientific</td><td>E/0650DF/17</td><td></td></tr><tr><td>여과지</td><td>Whatman</td><td>3000917</td><td></td></tr><tr><td>포름알데히드</td><td>Sigma</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>포르말린&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>SLBL11382V</td><td>중성 완충 포르말린</td></tr><tr><td>포름아미드</td><td>Sigma</td><td>F5786</td><td></td></tr><tr><td>글루타르알데히,</td><td>Sigma</td><td>G6257</td><td></td></tr><tr><td>H2O2</td><td>Sigma</td><td>216763</td><td></td></tr><tr><td>Haematoxylin</td><td>Raymond A Lamb</td><td>12698616</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14175-053</td><td>HBSS (-MgCl2+; -CaCl2)</td></tr><tr><td>혼성화 완충액</td><td>*</td><td>*</td><td>&nbsp; 5&타임스; SSC, 50% 포름아미드, 5% SDS, 헤파린 1mg/ml, 송아지 간 tRNA</td></tr><tr><td>1mg/ml 하이드로퀴논</td><td>시그마</td><td>H9003</td><td></td></tr><tr><td>ImmPACT DAB 과산화효소</td><td>Vector Labs</td><td>SK-4105</td><td></td></tr><tr><td>Immpress HRP 안티 마우스 IgG 키트</td><td>Vector Labs</td><td>MP-7402</td><td></td></tr><tr><td>Immpress HRP 안티 래빗 IgG 키트</td><td>Vector Labs</td><td>MP-7401</td><td></td></tr><tr><td>장 조직 분말</td><td>*</td><td>*</td><td>5 마리의 성체 마우스의 소장을 결합하고 얼음처럼 차가운 PBS의 최소 부피에서 균질화했습니다. 4 부피의 얼음처럼 차가운 아세톤을 균질화 된 장에 첨가하고, 철저히 혼합하고 30 분 동안 얼음에서 배양했다. 이것을 원심 분리하고 펠릿을 얼음처럼 차가운 아세톤을 사용하여 세척했습니다. 이를 추가로 원심분리하고 생성된 펠릿을 여과지에 펴고 건조시켰습니다. 완전히 건조되면 재료를 절굿공이와 모르타르를 사용하여 미세한 분말로 분쇄했습니다.</td></tr><tr><td>K-페리시아나이드</td><td>Sigma</td><td>P-3667</td><td></td></tr><tr><td>K-페로시아나이드</td><td>Sigma</td><td>P3289</td><td></td></tr><tr><td>레바미솔</td><td>L0380000</td><td></td><td></td></tr><tr><td>메타칸</td><td>*</td><td>*</td><td>60% 메탄올:30% 클로로포름:10% 아세트산</td></tr><tr><td>메탄올</td><td>Fisher Scientific</td><td>M/4000/17</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>일반 염소 혈청</td><td>Vector Labs</td><td>S-1012</td><td>NGS</td></tr><tr><td>일반 토끼 혈청</td><td>Dako</td><td>X0902</td><td>NRS</td></tr><tr><td>NTMT</td><td>*</td><td>*</td><td>100 mM NaCl, 100 mM Tris HCl, 50 mM MgCl2, 0.1% Tween20, 2 mM Levamisole</td></tr><tr><td>PAP 펜</td><td>벡터</td><td>H-400</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>시그마</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>PBT</td><td>*</td><td>*</td><td>0.5 M NaCl, 10 mM TrisHCL pH7.5, 0.1% 트윈 20</td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>100x 용해성.</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수 (10x)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP3994</td><td>증류수로 1:10 희석하여 1x</td></tr><tr><td>PLL 슬라이드</td><td>Sigma</td><td>P0425-72EA</td><td>Poly-L-lysine 현미경 슬라이드</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Sigma</td><td>P2308</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase k solution</td><td>*</td><td>*</td><td>Dilute Proteinase K at 200 &micro; 50mM 트리스, 5mM EDTA에서 g/ml.</td></tr><tr><td>Ralwax</td><td>BDH</td><td>36154 7N</td><td></td></tr><tr><td>리듀서 솔루션</td><td>*</td><td>*</td><td>100ml 만들기: 하이드로퀴논 1g, 아황산나트륨 5g 및 증류수</td></tr><tr><td>RnaseA</td><td>Sigma</td><td>R6148</td><td></td></tr><tr><td>식염수</td> <td>100ml</td>*<td>*</td><td>증류수 중 0.9% NaCl</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma</td><td>I3771</td><td></td></tr><tr><td>양 혈청</td><td>Sigma</td><td>S3772</td><td></td></tr><tr><td>질산은</td><td>Sigma</td><td>S/1240/46</td><td></td></tr><tr><td>은 용액</td><td>*</td><td>*</td><td>100ml 만들기: 아세테이트 완충액 10ml, 증류수 87ml, 1% 질산은 아</td></tr><tr><td>세트산나트륨</td> 3ml <td>Fisher Scientific</td><td>S/2120/53</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Sigma</td><td>S6753</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>아황산나트륨</td><td>시그마</td><td>239321</td><td></td></tr><tr><td>SSC</td><td>Sigma</td><td>93017</td><td>20x 식염수 구연산나트륨</td></tr><tr><td>수술 테이프</td><td>Fisher Scientific</td><td>12960495</td><td></td></tr><tr><td>Tamoxifen</td><td>Sigma</td><td>T5648</td><td>TAM은 화합물이 용액에서 떨어지므로 용액을 너무 많이 냉각시키지 않고 주입합니다. 솔루션은 재사용 할 수 있습니다. -20 &deg에서 보관하십시오. C 사용 사이에, 두 번 이상 재가열하지 마십시오.</td></tr><tr><td>TBS/T</td><td>세포 신호</td><td>#9997</td><td></td></tr><tr><td>트리에탄올아민 염산염</td><td>Sigma</td><td>T1502</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCL</td><td>Invitrogen</td><td>15567-027</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Sigma</td><td>TP9416</td><td></td></tr><tr><td>VectaMount</td><td>Vector Labs</td><td>H-5000</td><td></td></tr><tr><td>VectaShield DAPI</td><td>Vector Labs</td><td>H-1500</td><td>이 있는 하드셋 장착 매체</td></tr><tr><td>Vectastain ABC Kit</td><td>Vector Labs</td><td>PK-4001</td><td></td></tr><tr><td>X-gal</td><td>Promega</td><td>V3941</td><td></td></tr><tr><td>X-gal 고정제</td><td>*</td><td></td><td>*2% 포름알데히드, 0.1% 글루타르알데히드 1x PBS</td></tr><tr><td>X-gal 염색</td><td>*</td><td>*</td><td>X-gal 염색; 200 &#956; 50 ml 해결책 B (0.214 g MgCl2, 0.48 g K-페리시아나이드, 500 ml PBS에 있는 0.734 g K-ferrocyanide)에 있는 L X-gal (A). 용액 B는 미리 구성하여 4°C로 저장할 수 있습니다. C</td></tr><tr><td>자일렌</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>X/0200/21</td><td></td></tr></tbody></table>

조건을 사용하여 쥐 소장에서 재생성 paneth 세포의 역할을 분석하기위한 프로토콜<em&gt; cre 호텔-lox</em&gt; 마우스 모델

Protocols for Analyzing the Role of Paneth Cells in Regenerating the Murine Intestine using Conditional Cre-lox Mouse Models

칠일 - 포유류의 소장의 상피 표면은 매 3를 갱신 역동적 인 조직이다. 빠르게 Lgr5 유전자의 발현을 특징으로 장 줄기 세포 (ISCS)를 순환의 인구는이 갱신 프로세스를 발견 이해. 이러한 손상의 경우에 이들을 대체 할 수있는 BMI-1의 발현에 의해 표시 정지 줄기 세포 집단, 지원된다. 이러한 집단 사이의 상호 작용을 조사하는 질환과 암에 자신의 역할을 이해하는 데 매우 중요하다. ISCS는 장 표면에 지하실 내에 존재하는,이 틈새는 상피 세포를 보충에 ISC를 지원합니다. 것은 이미 Lgr5 ISC의 &#39;가 stemness&#39;밀접 그들의 이웃 Paneth 세포의 존재에 묶여 있다는 입증 된 바와 같이 활성 및 대기 ISCS 사이의 상호 작용 가능성, 틈새 내의 다른 분화 된 세포를 포함한다. 조건부 CRE-LOX 마우스를 사용하여모델 우리 Paneth 세포의 존재 또는 부재하에 활성 ISCS의 대부분을 삭제하는 효과를 시험 하였다. 여기에서 우리는 소장의 특성을하고 수행 기술과 분석은 Paneth 세포가 상당한 모욕 다음과 같은 복구를 돕기에 ISC 틈새 내에서 중요한 역할을한다는 것을 증명에 대해 설명합니다.

장 상피 줄기 세포 (ISCS)는 Paneth 셀과 혼합된다. 이러한 세포 ISCS을 지원 항균 보호를 제공 ISC의 자손을 차별화한다. 여기에서 우리는 우리가 Paneth 세포가 장 상피 세포를 유지하는데 중요한 역할을한다는 설정하는 형질 전환 조건부 마우스 모델을 사용하는 방법을 보여줍니다.

조건을 사용하여 쥐 소장에서 재생성 Paneth 세포의 역할을 분석하기위한 프로토콜<em&gt; Cre 호텔-LOX</em&gt; 마우스 모델

The epithelial surface of the mammalian intestine is a dynamic tissue that renews every 3 - 7 days. Understanding this renewal process identified a ...

이 해부 절차의 전반적인 목표는 후속 특성 분석 기술을 위해 마우스의 장을 분리하고 준비하는 방법을 보여주는 것입니다. 이 방법은 실험적 절차 이후 장 줄기세포가 장을 다시 채우는 능력을 조사하는 데 사용될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 모든 기술이나 절차 또는 유전자 조작 후에 사용할 수 있다는 점입니다. Cray locks 기술을 사용하여, 안락사시킨 성체 마우스를 배와 윗면이 위로 향하게 놓고 70% ethanol로 털을 적시는 것으로 시작하십시오.그 다음 가위를 사용하여 복강을 정중선을 따라 세로로 절개하고 핀셋으로 위를 고정합니다. 이어서 식도로 연결되는 부위를 절단하고 위를 부드럽게 당겨 충수까지의 소장을 제거합니다. 그런 다음 충수를 부드럽게 당겨 항문까지의 대장을 제거합니다.장 조직을 분리한 후, 맹장 부위의 위를 제거합니다. 끝이 뭉툭한 피펫 팁이 장착된 주사기를 사용하여 장 내부를 PBS로 세척한 직후, 장을 근위부, 중간부, 원위부의 세 가지 동일한 크기의 구역으로 절단합니다. 그런 다음 각 구역을 1cm 크기의 조각으로 자르고, 2x2cm 크기의 수술용 테이프 중앙에 조직 조각을 3~5개씩 배치합니다. 모든 조직이 부착되면 피라미드 형태로 테이프를 조각들 주변으로 세로 방향으로 밀봉하여 통나무 더미 모양으로 만듭니다.그 다음, 조직 부피의 최소 10배에 해당하는 중성 완충 포르말린 고정액이 담긴 바닥이 평평한 용기에 테이프를 넣고, 포매 및 절편 제작 전에 시료를 4°C에서 보관합니다. 고정 후, 세척 직후에 조직을 고정하기 위해 조직 부피의 최소 10배에 해당하는 70% ethanol이 담긴 바닥이 평평한 용기로 조직을 옮깁니다. 방금 시연한 것과 같이 장을 동일한 크기의 세 부분으로 절단합니다.그런 다음 각 단면을 15 by 15 cm 크기의 여과지에 나란히 배치하고, 모든 단면이 분리되면 스프링 가위를 사용하여 FOSS에서 단면들을 엽니다. 여과지를 갓 준비한 Metcon이 담긴 유리 접시에 옮겨 실온에서 3~24시간 동안 보관합니다. 고정이 끝나면 핀셋을 사용하여 각 장 조각의 끝부분을 하나씩 집어 올리고, 조직을 핀셋 주변으로 말아 개별적인 스위스 롤(Swiss roll) 형태로 만듭니다. 핀셋을 약간 벌려 조직을 통해 25 gauge 바늘을 삽입하여 각 롤을 고정합니다.그 후, 말아놓은 조직을 조직 부피의 최소 10배 이상의 중성 완충액과 고정액이 담긴 바닥이 평평한 용기에 넣고, 조직의 전체 마운트 락시(laxy) 시각화를 위한 처리 전 최소 1시간 동안 고정합니다. 미네랄 오일과 혼합된 용융 상태의 생왁스를 15cm 페트리 접시에 붓습니다. 그런 다음, 장을 얼음처럼 차가운 PBS로 세척한 직후에 25mL의 얼음처럼 차가운 ex cal 고정액으로 조직을 세척합니다.고정 후, 장을 3~5개의 동일한 구역으로 절단하여 각 구역을 냉각된 왁스 플레이트 위에 올립니다. 각 끝부분을 핀으로 고정하여 구역이 약간 늘어나게 하고 장간막선이 플레이트 상단에 오도록 합니다. 과도한 장간막은 제거합니다.그 다음, 스프링 가위를 사용하여 내장을 세로 방향으로 절개하고, 모든 구역의 핀 고정이 완료되면 절개된 상태 그대로 고정합니다. 4°C에서 최소 1시간이 지난 후, 모든 조직이 잠길 정도로 충분한 양의 xal 고정액을 플레이트에 채웁니다. 25 mL 피펫이나 주사기를 사용하여 고정액을 제거하고, 30 mL의 PBS로 조직을 한 번 세척합니다.그 다음, 절편들을 30 milliliters의 DTTD 통합 용액으로 덮고, 실온에서 쉐이커를 이용해 30분에서 60분 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 25 milliliter 피펫이나 주사기로 탈수 용액을 제거하고, 조직에 다른 30 milliliters의 PBS를 채워줍니다. 그 후 후면 피펫을 사용하여 세척 후의 PBS와 함께 점액을 제거합니다.PBS를 30 mL의 xal로 교체하고, 다음 날 아침까지 실온의 암소에서 로킹 플랫폼을 이용해 부드럽게 흔들어주며 하룻밤 동안 염색합니다. 절편에 청록색 염색이 나타나면 xal을 30 mL의 PBS로 교체하십시오. 3분간 부드럽게 흔들어준 후, 앞서 시연한 것과 같이 스위스 롤 형태로 만들고, 조직 부피의 최소 10배에 해당하는 적절한 고정액이 담긴 입구가 넓고 바닥이 평평한 용기에 넣어 포매 및 절편 제작 전 4°C에서 최소 24시간 동안 보관합니다.ROSA 26 R Laxy 조건부 리포터를 사용하여, 재조합된 조직에서 추출한 DNA를 통해 유도 3일 후 소장에서 100%의 재조합을 관찰할 수 있었습니다. 재조합 대립유전자에 대한 qPCR 분석 결과, VI crease 시스템 내에서의 재조합 증가는 유의미하지 않았으며, 이는 잠재적으로 Paneth 세포에서의 재조합이 관찰되지 않았기 때문일 수 있습니다. laxy 리포터를 이용한 ah crease 시스템의 경우, 두 시스템 모두 유도 3일 후에 재조합된 세포가 완전히 소실되었음을 보여주었습니다.유사분열 및 K crypt 세포 높이 데이터는 ah H Cree 시스템이 결합되지 않은 장 줄기세포의 재집단화 덕분에 회복될 수 있음을 나타냈습니다. 이와 극명하게 대조적으로, villain Cree는 상피 crypt 세포를 유지하고 있었음에도 불구하고 회복에 실패했습니다. 또한, vi Cree Cantin B flock mice의 crypt 세포는 증식하지 않았으며 장 줄기세포 마커의 발현이 결여되어 있었습니다.EM 4. ah cre 마우스의 crypt와는 달리, PTH 세포는 VI Cree 시스템 내에서만 Caden b 결실 후 세포 사멸이 일어났습니다. 이 기술을 숙달하면 약 10분 만에 완료할 수 있습니다.조직 분해를 방지하기 위해 지연 시간을 최소화하는 것이 중요합니다. 이 영상을 시청하고 나면, 후속 분석을 위해 마우스에서 소장을 적출하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 비디오에서는 마우스 근위 결장 루프 또는 pcLoop 세그먼트를 생성하는 수술 절차를 설명한 다음 장 상피 투과성을 연구하기 위해 세그먼트에 형광 마커를 내강 내 주입하는 방법을 설명합니다.

Mouse Proximal Colon loop Model의 생성: 내강내 주사 후 혈청 내 형광 마커를 검출하여 근위 결장 루프를 생성하고 장 투과성을 측정하는 수술 절차

정확한 식별 및 장 점막 안감을 따라 상피 세포의 위치는 다른 세포 계보를 정의하는 것이 필수적이다. 장 조직의 적절한 촬상 최대 해상도 단백질 발현 패턴을 식별하기 위해 중요하다. 이 연구는 처리 마우스 장 조직을위한 최적의 방법과 조건을 서술하는 것을 목표로하고있다.

면역 조직 화학적 및 면역 형광 분석을위한 창자 조직 준비를위한 향상된 스위스 압연 기술

투명 한 선 충 C. 소장"vivo에서 조직 챔버를" 다세포 tubulogenesis 동안 단일 세포 및 subcellular 수준 apicobasal 막과 루멘 속 공부에 대 한 될 수 있습니다. 이 프로토콜 표준 라벨을 결합 하는 방법을, RNAi/손실의 기능 유전자 및 분자 수준에서이 프로세스를 해 부 현미경 접근에 설명 합니다.

C. 선 충 장 한 모델으로 루멘 Morphogenesis 세포를 단일 세포 수준에서 Vivo에서 편광 막 속: 항 체 얼룩이 지기, RNAi 손실의 기능 분석 및 이미징 라벨

장 organoid 문화 전체 지하실에서 설정 되 고 셀 전용 패션에 자기 갱신과 차별화의 분석을 허용 하지 않습니다. 이 프로토콜에 설명 합니다 정렬 된 줄기 (Lgr5+)의 재구성, 틈새 (Paneth) 세포, 그들의 이전 생 화 확 및 유전 수정 및 기능 분석 하는 동안 organoids을 일으키.

장 줄기와 틈새 세포의 기능 분석을 위한 Organoid 재구성 분석 결과 (오 라)

인트라비티 현미경 검사를 활용하여, 여기에 제시된 방법은 살아있는 동물에서 장 상피 세포 흘림의 실시간 시각화를 가능하게 합니다. 따라서, 마취마우스의 국소 염색장 점막(acriflavine 및 rhodamineB-dextran)은 공초점 현미경검사를 이용하여 단일 세포 해상도까지 심화된다.

장 내 투과성 및 상피 세포 흘리기 성능을 평가하기 위한 인트라바이탈 현미경 기반 접근법

Dysregulated 장 상피 장벽 기능 및 면역 반응은 생리적인 모형의 부족 때문에 제대로 조사되지 않는 선동적인 장 질병의 특징입니다. 여기서는 생체 내 점막 투과성 및 백혈구 모집을 연구하기 위해 잘 혈관화되고 외부화된 장 세그먼트를 사용하는 마우스 장 루프 모델을 설명합니다.

표준화된 장 루프 모델을 사용하여 마우스에서 장 투과성 및 호중구 환전 이동의 기능 평가

이 프로토콜에서, 우리는 장 지하실에서 직접 뮤린 기본 상피 결장 단층층을 생성하는 방법을 설명합니다. 우리는 투과성 필터에 컨천단층을 생성하기 위한 실험적 접근법, 스크래치 상처 치유 및 생화학 연구를 위한 컨큐리 단층, 면역 형광 분석을 위한 희소및 응수 단층층을 제공합니다.

장 내 토굴에서 뮤린 기본 결장 상피 단층의 세대

이 프로토콜은 뮤린 소장 오가노이드를 확립하고, 뮤린 소장 라미나 프로프리아로부터 유형 1 선천성 림프성 세포를 분리하고, 장 상피 세포와 유형 1 선천성 림프 세포 간의 양방향 상호 작용을 연구하기 위해 두 세포 유형 간의 3 차원 (3D) 공동 배양을 수립하기위한 자세한 지침을 제공합니다.

뮤린 소장 상피 오가노이드와 선천적 림프성 세포의 공동 배양

위장관은 방사선 치료 암 치료 시 손상에 가장 민감한 기관 중 하나입니다. 그것은 동시에 그러한 모욕에 이어 가장 높은 재생 능력 중 하나를 가진 장기 시스템입니다. 제시된 프로토콜은 장 상피의 재생 능력을 연구하는 효율적인 방법을 설명합니다.

이온화 조사에 대한 반응으로 장 상피 재생

여기에서는 레이저로 인한 상처 시 장의 이미지를 얻는 방법을 제시합니다. 마우스 장을 다광자 레이저에 노출시킴으로써, 단일 또는 다중 crypt(들)의 손실이 국소적으로 유도된다. 수개월에 걸쳐 손상된 부위를 반복적으로 이미징하여 장 회복의 실시간 역학을 캡처합니다.

장 리모델링을 연구하기 위한 레이저 절제 및 생체 내 현미경 검사

우리는 3차원 결장류의 발달을 위한 쥐 결장 선와(miline colonic crypt)의 분리를 자세히 설명하는 프로토콜을 설명합니다. 확립된 콜로노이드는 염증성 챌린지를 받거나 상피 단층을 형성하도록 지시되기 전에 숙주 상피의 세포 구성을 반영하도록 최종적으로 분화될 수 있습니다.

확립된 쥐 콜로노이드에 대한 시험관 내 장 염증의 상피 효과 연구

학습하세요 쥐 소장 분리 및 고정 방법을 통해 장 상피 줄기세포와 Paneth 세포의 상호작용을 연구하는 기술입니다. 이 프로토콜은 장 재생 및 줄기세포 생물학 연구에 필수적입니다.

조건을 사용하여 쥐 소장에서 재생성 Paneth 세포의 역할을 분석하기위한 프로토콜

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