컴퓨터 원호 비디오 및 디지털 이미지 분석을 사용하여 수성 구리의 급성 노출에 대한 응답에 물고기가 수영 동작을 정량화

물고기의 행동에 환경 오염 물질의 영향을 측정하는 것은 종종 주관적이고 치사 엔드 포인트를 다룰 때 특히 도전이다. 우리는 동안 구리 다양한 농도의 96 시간 급성 노출 후 초기 생활 단계 흰 철갑 상어 (인 Acipenser transmontanus)의 수영 동작을 정량화하는 비디오 기술을 포함하는 방법을 설명합니다.

이 절차의 전반적인 목표는 수성 구리에 대한 치명적이지 않은 노출에 대한 흰 철갑상어의 행동 반응을 정량화하는 방법을 보여주는 것입니다. 이 방법은 오염 물질에 대한 치명적이지 않은 노출이 물고기의 수영 행동에 미치는 영향과 같은 생태 독성학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법은 흰 철갑상어 보존에 중요한 정보를 제공할 수 있습니다.

또한 다른 어종, 양서류 및 무척추 동물에도 쉽게 적용할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 반응이 매우 민감하고 독성에 대한 조기 징후를 제공하며 유기체 생존과 관련이 있다는 것입니다. 처음에 이 방법은 개인이 행동 측정에 익숙하지 않은 경우 어려울 수 있습니다.

프로토콜을 시연하는 것은 저의 공동 저자인 Holly Puglis가 맡을 것입니다. 먼저 2리터의 수성 시약 등급 구리 2개의 황산염 5수화물을 준비합니다. 다음으로, 희석기 시스템과 노출 탱크를 평형화합니다.

자동 주사기 디스펜서의 흡입 튜브를 스톡 용액 플라스크에 넣습니다. 그런 다음 자동 펌프 스파이크 부피를 1ml로 설정하고 희석기를 켭니다. 이 시스템은 5가지 농도와 대조군으로 구성된 50% 희석 시리즈를 만듭니다.

4방향 스플리터를 통해 이러한 용액은 4개의 복제 노출 챔버로 전달됩니다. 다음으로, 수조를 섭씨 15도로 유지하도록 설정된 냉각기의 펌프를 켭니다. 이제 희석기의 자동 타이머를 사용하여 30분마다 순환하도록 설정합니다.

탱크의 수위는 스탠드 파이프 배수구에 의해 유지됩니다. 측면에 4cm 구멍을 뚫고 30미크론 스테인리스 스틸 메쉬로 구멍을 덮어 노출 챔버를 준비합니다. 물고기 10g당 최소 1리터의 물을 담을 수 있는 노출 챔버를 선택하십시오.

예를 들어, 89 일 된 흰 철갑 상어의 무게는 약 373 밀리그램이므로 28cm x 13 포인트 5 센티미터 x 25 센티미터 정사각형 챔버에서 테스트 할 수 있습니다. 실험 시작, 중간 지점 및 종료 시 화학 분석을 위해 24mL 테스트 용액 하위 샘플을 수집합니다. 플라스틱 주사기에 부착된 빨대를 사용하십시오.

시퍼 빨대를 영점 4 5 미크론 폴리에테르설폰 필터로 교체하고 필터를 통해 4ml의 테스트 물을 분배합니다. 이 물을 버리십시오. 그런 다음 남은 물 20ml를 산성 세척 폴리에틸렌 병에 걸러냅니다.

16 몰 질산으로 샘플을 1 % 부피로 산성화합니다. 그런 다음 이 샘플은 최대 3개월 동안 보관할 수 있습니다. 테스트 노출이 확인되면 각 복제 테스트 챔버에 3마리의 철갑상어를 비축하여 챔버 리터당 약 172mg의 물고기를 비축합니다.

비연마성 그물을 사용하여 철갑상어를 모아 작은 양동이에 옮깁니다. 6개의 테스트 솔루션에서 데이터를 수집하려면 총 144마리의 물고기가 필요합니다. 96시간 노출 중에는 물고기에게 먹이를 주지 마십시오.

사망률과 비정상적인 행동에 대한 점수를 매기기 위해 매일 일관된 관찰을 해야 합니다. 아침은 하루 중 이 작업을 수행하기에 가장 좋은 시간이며 이상적으로는 관찰자가 테스트 조건을 알지 못합니다. 평형 상실은 물고기가 물기둥 내에서 직립 자세를 유지할 수 없는 것으로 정의됩니다.

부동성은 물고기가 찌르지 않으면 움직이거나 수영할 수 없는 것으로 정의됩니다. 또한 무기력, 과잉 행동, 호흡 증가 또는 감소, 색 변화, 떨림, 경련, 복부 팽만감, 물기둥에서의 위치 및 기타 비정상적인 수영 패턴과 같은 다른 이상을 기록하십시오. 죽은 물고기는 항상 즉시 제거해야 합니다.

매일 두 개의 물 샘플에서 휴대용 측정기로 용존 산소 수준을 측정하십시오. 96시간 노출이 끝나면 수영 행동 분석을 위한 비디오를 만듭니다. 노출 탱크 내에 테스트 경기장을 배치합니다.

물고기가 자유롭게 수영할 수 있을 만큼 충분히 큰 테스트 경기장을 선택하십시오. 각 테스트 경기장 바로 위에 삼각대에 휴대용 비디오 카메라를 설치합니다. 이제 처리된 물고기 중에서 최대 3명의 생존자를 무작위로 선택합니다.

작은 그물망을 사용하여 3명을 테스트 경기장으로 옮깁니다. 물고기가 약 30분 동안 경기장에 적응할 때까지 기다립니다. 물고기가 적응하는 동안 이미지에 초점을 맞추고, 움직이는 물로 인한 눈부심 왜곡을 최소화하고, 배경에 대한 물고기의 대비를 최대화하여 물고기가 가려지지 않도록 뷰를 조정합니다.

물고기가 적응하면 녹음을 시작하고 2분 분량의 비디오 데이터를 수집합니다. 동영상을 촬영한 후 물고기를 안락사시켜 처분합니다. 비디오 파일을 디지털 분석 소프트웨어에 필요한 형식으로 변환한 후 추적 소프트웨어를 열고 메인 화면의 새 실험 만들기 옵션에서 새 기본 실험을 선택합니다.

프롬프트를 입력하고 확인을 누릅니다. 그런 다음 설정 아래의 실험 설정 옵션으로 이동하여 비디오 소스 아래의 비디오 파일에서 선택합니다. 경기장 수를 1로 설정합니다.

경기장당 피험자 수를 3으로 설정합니다. 다음으로, 추적된 피처에서 중심점 감지를 선택하고 원하는 단위를 선택합니다. 이제 설정에서 평가판 목록 옵션을 선택하고 화면 상단의 동영상 추가를 클릭합니다.

대화 상자에서 알파벳 순서를 선택합니다. 찾아보기를 클릭합니다. 비디오가 있는 폴더로 이동하여 관련 파일을 강조 표시하고 열기를 클릭합니다.

이제 비디오 파일을 선택했으므로 소프트웨어에서 실험 범위를 정의하십시오. 먼저 화면 상단의 변수 추가를 클릭하고 라벨 상자에 농도를 입력합니다. 구리 농도를 리터당 마이크로그램 단위로 설명 상자에 입력합니다.

그런 다음 유형에 대한 드롭다운 목록에서 숫자를 선택합니다. 사전 정의된 값(pre-defined values) 상자를 클릭하고 대화 상자에서 개별 값 정의(define individual values) 옵션을 선택합니다. 실험에 사용된 농도를 입력하고 각 숫자 덧셈 사이에 추가를 클릭합니다.

그런 다음 allow other values(다른 값 허용) 옵션의 선택을 취소하고 OK(확인)를 클릭합니다. 스코프 박스의 드롭다운 메뉴에서 체험판을 선택합니다. 제공된 상자에 각 시도에 대한 적절한 농도를 입력합니다.

화면 맨 위에 있는 변수 추가를 클릭합니다. 레이블 상자에 replicate를 입력합니다. 설명 상자에 복제 번호를 입력합니다.

유형에 대한 드롭다운 목록에서 숫자를 선택합니다. 그런 다음 사전 정의된 값 상자를 클릭하고 대화 상자에서 개별 값 정의 옵션을 선택합니다. 1, 2, 3, 4를 입력하고 다른 값 허용 옵션의 선택을 취소합니다.

그런 다음 확인을 클릭합니다. 이제 스코프 박스의 드롭다운 메뉴에서 평가판 옵션을 선택합니다. 각 시도에 대한 적절한 반복 횟수를 입력합니다.

다음 작업은 경기장 공간을 설정하는 것입니다. 설정 탭에서 경기장 설정을 선택하는 것으로 시작하고 첫 번째 설정의 이름을 평가판 설정으로 지정합니다. 대화 상자에서 배경 이미지 가져오기 옵션을 선택하고 찾아보기를 클릭합니다.

평가판 1용 비디오 파일을 찾아 열기를 클릭합니다. 비디오가 나타나면 배경 이미지 가져오기 대화 상자에서 가져오기를 클릭합니다. 그런 다음 경기장 설정 아래의 화면 상단 근처에 있는 흰색 원 아이콘을 클릭하고 수영 구역을 둘러싸고 있는 것처럼 보이는 원을 조작합니다.

그런 다음 경기장 설정에서 보정 스케일 아이콘을 클릭합니다. 클릭-길게 드래그 모션을 사용하여 경기장 공간을 선택합니다. 이제 보정 거리의 실제 거리 상자 아래에 10 포인트 5를 입력합니다.

그런 다음 확인을 클릭합니다. 필요한 경우 원형 경기장의 전체 직경에 걸쳐 있도록 보정 라인을 조정합니다. 경기장 설정 상자에서 경기장 설정 유효성 검사 옵션을 클릭하고 검증되지 않은 설정의 문제를 해결합니다.

이제 각 평가판에 대한 모든 경기장이 정의될 때까지 이 프로세스를 반복합니다. 다음으로 물고기 감지 매개변수를 설정합니다. 먼저 화면 왼쪽의 실험 탐색 도구 모음에서 설정 옵션에서 감지 설정을 선택합니다.

그런 다음 감지 설정 하나 대화 상자의 방법 아래에 있는 드롭다운 메뉴에서 동적 빼기를 선택합니다. 또한 대화 상자의 주제 식별(subject identification)에서 각 피사체에 대한 채우기 색상을 선택합니다. 그런 다음 비디오 선택을 선택하고 평가판용 비디오를 찾습니다.

감지 설정 하나의 대화 상자에서 비디오 아래의 샘플 속도 상자를 5 포인트 9 9 4 1로 채웁니다. 동일한 상자에서 detection(감지) 아래의 참조 이미지(reference image) 옵션에 대한 설정을 클릭합니다. 그런 다음 참조 이미지 대화 상자에서 학습 C 시작 옵션을 클릭합니다.

참조 이미지(Reference Image) 대화 상자의 이미지가 동물 없이 나타나면 대화 상자 내의 획득 설정(Acquisition Settings)에서 동적 참조 이미지 사용(Use Dynamic Reference Image)을 클릭하고 이 대화 상자를 닫습니다. 이제 감지 설정 하나의 대화 상자에서 피사체가 감지 중임을 나타내는 드롭다운 메뉴에서 더 어둡게를 선택합니다. 감지되는 어두운 대비의 경우 작은 숫자를 33으로 설정하고 큰 숫자를 153으로 설정합니다.

그런 다음 오른쪽 하단의 변경 사항 저장을 클릭합니다. 이제 소프트웨어가 그림자나 파편이 아닌 동물을 성공적으로 추적하고 있는지 확인합니다. 재생 제어 대화 상자에서 재생 버튼을 클릭하고 필요에 따라 어두운 대비에 맞게 숫자를 조정합니다.

모든 조정 사항을 저장해야 합니다. 이제 소프트웨어가 비디오에서 데이터를 수집하도록 설정되었으므로 다음 작업은 각 시도에서 물고기를 추적하는 것입니다. 먼저 화면 왼쪽에 있는 실험 탐색기 도구 모음의 설정 옵션에서 획득을 선택합니다.

그런 다음 획득 설정 대화 상자에서 계획된 다음 평가판 추적을 클릭하고 올바른 평가판, 비디오 및 경기장 설정이 모두 획득 설정 대화 상자의 설정 아래에 표시되는지 확인합니다. 그런 다음 Acquisition Control 대화 상자에서 Detection determines speed 옵션을 확인합니다. 흰색 사각형으로 둘러싸인 녹색 원이 있는 버튼을 클릭하여 획득 프로세스를 시작합니다.

모든 시도가 추적될 때까지 이 프로세스를 반복합니다. 이제 물고기인 추적된 개체를 분석할 수 있습니다. 먼저 화면 왼쪽의 실험 탐색기 도구 모음에서 분석 옵션 아래의 데이터 프로필을 클릭합니다.

그런 다음 구성 요소 도구 모음의 중첩 옵션에서 시간을 선택합니다. 시간 대화 상자의 트랙 시간 간격 선택 설정에서 to 값을 2분으로 조정하고 확인을 클릭합니다. 그런 다음 시작 상자와 결과 상자 사이의 중첩 상자를 화면 오른쪽의 데이터 프로필 영역으로 끕니다.

화면 왼쪽의 실험 탐색기 도구 모음에서 분석 옵션 아래를 보고 분석 프로필을 클릭합니다. 그런 다음 종속 변수 도구 모음의 거리 및 시간 제목 아래에서 속도를 클릭합니다. 추가를 클릭하고 종속 변수 도구 모음의 거리 및 시간 제목 아래에서 이동한 거리를 클릭합니다.

그런 다음 distance moved 대화 상자에서 add(추가)를 클릭하고 종속 변수 도구 모음의 개별 동작 제목 아래에서 movement(이동)를 클릭합니다. 이동 대화 상자에서 이상값 필터 제목 아래를 보고 평균 간격을 1로 조정합니다. 그런 다음 임계값 제목 아래에서 시작 속도를 2점 0 0으로 조정하고 정지 속도를 1점 7 5로 조정합니다.

Calculate statistics for heading(제목에 대한 통계 계산)에서 moving 및 not moving(이동하지 않음)에 대한 두 확인란을 모두 선택합니다. 그런 다음 추가를 클릭하고 화면 왼쪽의 실험 탐색기 도구 모음에 있는 결과 옵션에서 분석 출력을 클릭합니다. 이제 계산을 클릭합니다.

종속변수가 계산되면 화면 맨 위에 있는 내보내기를 클릭합니다. 분석 출력 내보내기 대화 상자에서 대상 폴더를 선택하고 파일 형식 드롭다운 메뉴에서 Excel을 선택합니다. 그런 다음 확인을 클릭합니다.

마지막으로 화면 상단의 파일 탭에서 실험 저장을 클릭합니다. 디지털 추적 소프트웨어를 닫습니다. 데이터를 스프레드시트 파일로 가져오고 상용 통계 분석 소프트웨어 패키지를 사용하여 분석합니다.

다양한 구리 농도에 노출된 지 불과 72시간 후, 부화 후 이틀 동안 철갑상어는 관찰 가능한 많은 이상을 보였습니다. 수영 행동에 명백한 영향이 있었습니다. 비디오 데이터는 이러한 행동 장애를 정의하는 데 도움이 되었습니다.

추가 테스트에서 부화 후 30일의 철갑상어는 96시간 구리 노출에 민감한 것으로 판명되었습니다. 수영 속도, 이동하는 데 소요된 시간, 이동 거리는 모두 구리 농도가 증가함에 따라 크게 감소했습니다. 구리 농도가 증가함에 따라 수영 경로도 줄어들었습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 독성 테스트에서 행동을 정량화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 기술은 환경 관리자에게 환경 피해를 문서화하고 복원을 안내하기 위해 행동적으로 정의된 기준을 사용할 수 있는 수단을 제공할 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때 행동 관찰을 기록할 때 일관성을 유지하는 것이 중요합니다.

섭식 및 공격성과 같은 다른 행동은 오염 물질 노출이 생존에 미치는 장기적 영향에 대한 추가 질문에 답하기 위해 이 절차에 따라 정량화할 수 있습니다.