Name: 컴퓨터 원호 비디오 및 디지털 이미지 분석을 사용하여 수성 구리의 급성 노출에 대한 응답에 물고기가 수영 동작을 정량화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 21 s
Description: 학습하세요 백색 철갑상어(Acipenser transmontanus)의 수영 행동을 영상 기술로 정량화하여 수성 구리 노출의 생태독성 영향을 평가하는 방법을. 이 프로토콜은 수생 생물 보전과 조기 독성 지표 확인에 활용됩니다.

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기술 및 분석 지원을 제공해 주신 미국 지질조사국(U.S. Geological Survey), 컬럼비아 환경 연구 센터(Columbia Environmental Research Center)의 생태학 분과, 독성학 분과 및 환경 화학 분과 직원들에게 감사드립니다. 미국 환경 보호국(USEPA) 지역 10과의 계약을 통해 Teck American Incorporated가 부분적으로 제공한 자금과 USEPA가 Department of Interior Central Hazmat Fund를 통해 USGS(US Geological Survey)에 제공한 자금.

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무역, 회사 또는 제품 이름의 사용은 설명 목적으로만 사용되며 미국 정부의 보증을 의미하지 않습니다.

때문에 오염 물질에 노출 행동의 변화는 종종 서브 치명적인 독성에 대한 엔드 포인트로 사용되지만 측정하기 어려울 수 있습니다. 일반적으로, 동작 응답을 처리하기 위해 많은 시간을 필요로 육안 관찰과 수동 데이터 분석에 의해 측정된다. 그러나 기술 발전으로 정량화 수영 활동 방법은 처리 및 분석 시간을 단축 촬용 18 움직임 분석 또는 디지털 추적 소프트웨어를 사용하는 방법에 초점을 맞추고있다. 영상 분석 동안 너무 철갑 수영 동작을 분석 더욱 효과적이고 효율적인 방법을 제공하는 비디오 데이터 기록 및 물고기 추적 소프트웨어의 사용을 소모 수동 매우 시간했을 수영 변수 정량화 데이터를 캡처. 절차는 간단 수정을 요구 양서류 및 수생 무척추 동물 등의 생물에 대한 정의, 물고기의 행동을 수영 강조하지만. 어떤 행동 endpoin에 따라TS는 실험 설계 및 카메라 시스템은 거의 모든 시판 추적 소프트웨어 패키지와 함께 사용하기 위해 개발 될 수있다, 해결되고있다. 이 방법은 용해 된 구리를 이용하여 증명하지만, 다른 수성 오염이나 온도, 산소 농도 등의 특성에 적용 할 수있다. 이 논문에서 개발되게 프로토콜 기록 장치로서 간단한 디지털 비디오 카메라를 이용했다. 디지털 파일 쉽게 컴퓨터로 전송 및 움직임 분석 소프트웨어에 업로드된다. 방법은 지속적으로 수정 및 정량화 프로세스를 간소화하기 위해 정제되고있다. 비디오 품질 추적 각 물고기를 식별 분석 소프트웨어 위해서는 고해상도 인 것이 필수적이다. 데이터 파일을 처리하는 경우 물고기 대조하지 않는 백그라운드 문제를 일으킬 것이다. 두 차원 영상 추적의 또 다른 일반적인 문제는 식별 개인이다수영 경로가 교차 할 때. 이 경로를 횡단하는 동안 각각의 물고기 식별 소프트웨어 내 경로 세그먼트를 연결하여 수동으로 보정 할 수있다. 대안 적으로, 전체 활성은 그룹 평균 각 복제에 챔버로부터 결정될 수있다. 한 물고기를 포함하는 각 하나에 여러 개별 실 개별 물고기의 움직임을 계산하는보기의 동일한 필드에서 촬영 할 수 있습니다. 현재 우리가 고화질 디지털 비디오 기록 장치 (HD-DVR)에 연결되어 노출 된 상기 챔버 헤드 감시 카메라의 시리즈를 사용하여 업그레이드. 그러나, 고화질 MPEG-4 비디오를 촬영할 수있는 카메라 시스템의 사용 일 것이다. HD-DVR은 지정된 시간에 레코드로 설정하고 최대 7 일 동안 프로그래밍 될 수있다. 접근 방식을 자동화이 손을 놓은 물고기의 행동을 손상시킬 수있는 외부 교란을 최소화하면서 일관성을 유지하는 동시에 여러 동영상의 캡처를 할 수 있습니다. HD-DVR의 정기적 복용단말이 내부 네트워크에 연결하기 때문에 파일의 전송은 비교적 간단하다. 자동 카메라 시스템 수영 동작을 정량화 더욱 향상된 기술이지만, 여전히 독성 시험 동안 행동 장애 문서화와 같은 추가적인 지원 정보를 제공하는 시각적 관찰을 수행하는 것이 유익하다. 1960 년대 초 19,20,21로 거슬러 올라가는 금속에 노출로 인한 문학 문서화 변경 물고기의 행동의 오랜 역사이있다. 구리는 이러한 송어 22 hypoactivity 등의 활동 수준의 변화를 야기하는 것으로 나타났다 (인 Lepomis macrochirus rafinesque)과 전위의 변화와 민물 송어 (23)의 먹이 활동 (Salvelinus fontinalis). 적어도 일부 청소년 물고기 감지하고 포식자를 피하고, 구리 유도 화학 감각 부족이 검출 경보 화학 물질 24,25,26를 관련 행동에 영향을 미칠 수있는 위해 냄새의 감각에 의존 </sup&gt;. 후각 상피 인해함으로써, 방향 감각 상실, 행동 적 회피, 감소 공급 및 후각 (27)에 의해 유도되는 다른 행동을 초래할 수 감각 메커니즘에 영향을 미치는 구리 노출로 손상되었습니다. 이러한 변경 행동은 노출 동안 관찰 된 것과 일치했다. 흰 철갑 상어의 수영 동작은 크게 이러한 결과는 행동이 구리의 치사 농도에 영향을 독성 스트레스의 지표로 사용하는 방법을 설명 .. 수성 구리 농도 치사 노출시 영향을 하였다. 비디오 기반의 분석은 수영 동작을 정량화 효과가 입증 또한 구리에 노출 철갑 상어에 심각한 영향의 질적 시각적 문서 역임했다. 분석 소프트웨어는 각종 행동 끝점을 정량화 할 수있다. 목록은 표 1을 참조하십시오. 노광 시스템은 각각의 포인트를 해결하기 위해 변형 될 수있다실시간 모드가 우려 각종 오염물에 대한 노출과 연관된 동작의 차이를 정량화 할 수있다. 수생 독성 연구 행동 엔드 포인트의 이용은 점점 더 채용 적응 행동 함수 환경 손상 (9)의 판정에 결정적이기 때문에 오염의 효과를 평가할 때 고려되어야한다. 물고기의 행동에 환경 오염 물질의 영향은 종종 주관적 및 표준 방법의 부재 치사 엔드 포인트를 다룰 때 특히 도전이다 .. 엄밀하게 모니터링 할 수있는 이러한 방법을 사용하여 정량화 활성 수영 유기체 최소 응력 비파괴 및 반복 될 수있다. 동작 수영 표준 독성 시험 (5)의 감도를 확장 테스트 프로토콜에 포함되어야 치사 독성 유효 일관된 인덱스이다.

오염 물질 노출이 행동에 영향을 미칠 수있는 방법을 이해하는 것은 시간에 매우 도전적이고 주관적이다. 동작은 전형적으로는 중추 신경계를 통해 작동하고, 생존, 성장 및 재생하도록 유기체있게 명백한, 관찰, 전신 활동의 시리즈로서 정의된다. 생존 1에 비해 인한 독성 물질에 노출 행동의 변화는 환경 스트레스 종종 10 ~ 100 사이 배 더 민감의 가장 민감한 지표 중입니다. 이러한 연구의 대부분은 활동, 환기 수영, 물고기 2,3,4의 행동을 구하고 조사했다. 활동을 수영 독성 시험 (5)에 오염 물질에 대한 응답으로 행동 변화를 결정하는 가장 자주 사용 치사 엔드 포인트입니다. 수영 변수는 주파수와 여행 운동 속도와 거리의 지속 시간, 빈도와 회전 각도, 위치 물 열에서 수영의 패턴을 포함한다. 실내 활동은수영 동작의 효과 측정 수생 독성의 책을 기본으로 랜드 (6)에 의해 제 9 장에서 제안 된 기준에 따라 독성 물질에 대한 민감도를 평가. 이 논문은 초기 개발의 여러 단계에서 초기 생활 단계 흰 철갑 상어 구리의 독성 (인 Acipenser transmontanus) 물 전용 수영 동작을 평가 하였다 철갑 상어에 대해 익스포저 방법의 예로서 독성 학적 연구를 제시하고 수영을 정량화하는 방법을 보여줍니다 행동. 이전의 연구에서, 이상 행동 반응은 구리에 대한 급성 및 만성 노출의 처음 몇 일 동안 조기 발병에 분명했다 및 노출 시간과 농도 7, 8, 9를 통해 점진적으로 더 심각했다. 이러한 크기 및 행동 반응의 개시의 타이밍은 장기 생존율을 제한하기에 충분한 가능성이있어 recrui 대한 영향 주어진 관심있는tment 실패 10. 정확하게 금속 노광 방법 및 절차에이 감도의 의미를 해석하기 위해, 구리의 농도에 대하여 행동 장애의 시간 경과와 정도를 정량화하기 위해 개발되었다. 행동 기능과 개발을위한 시험 프로토콜이 노출 챔버에서 철갑 상어의 오버 헤드 비디오 샘플을 분석하여 설립되었다. 비디오 샘플의 노출 기간에 걸쳐 구리 처리 구간 발전 기능 질적 평가를 제공 하였다. 행동과 쉼터 추구 활동에 영향을하고 조정, 균형, 호흡 수영, 쉼터 추구, 무기력에 영향을 미치는 손상의 시간적 순서를 특성화하는 시간을 결정하는 수성 구리 농도에 노출시 평가 하였다. 또한, 비디오 녹화 정량적 문서화 자발 수영 ACTI의 목적으로 복제 각각으로부터 서브 샘플링 철갑 만들어졌다vity. 이 엔드 포인트는 시간 측정치를 포함하거나 시간은 속도 및 거리가 시판 디지털 영상 분석 소프트웨어 패키지를 사용 5,11 여행 수영 이동 보냈다. 이 소프트웨어는 시야 내의 각 화상의 윤곽선을 정의하고, 이로부터 각 화상의 중심을 정의한다. 소프트웨어는 이동 경로를 결정하기 위해 프레임 연속하여 프레임의 각 중심의 위치를​​ 추적 할 수있다. 동물 복지법 규정 (9 CFR)의 최종 규칙의 모든 해당 섹션으로 문화와 실험 기간 동안 시험 생물의 인도적인 처리를위한 모든 제도적 가이드 라인을 준수이 연구. 연구 종료되면, 모든 물고기는 미국 지질 조사를위한 기관 동물 관리 및 사용위원회, 컬럼비아 환경 연구 센터에 의해 승인 된 적절한 가이드 라인에 따라 안락사시켰다.

<table><tbody><tr><td>구리 II 황산염 오수화물</td><td>시그마 - 알드리치</td><td></td><td>오염 물질 주</td></tr><tr><td>사기 디스펜서</td><td>해밀턴 MicroLab 600 시리즈</td><td></td><td>장치 스파이크 화학 물질</td></tr><tr><td>2L 부피 플라스크</td><td></td><td></td><td>용기 저장 용액</td></tr><tr><td>24-1.5 L 유리 항아리</td><td></td><td></td><td>테스트 챔버 2 dph 철갑 상어</td></tr><tr><td>비디오 카메라</td><td>소니 핸디캠 HDR-CX550V</td><td></td><td></td></tr><tr><td>디지털 추적 소프트웨어</td><td>Noldus Ethovision</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-17" 평면 스크린 모니터</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>24개의 감시 카메라</td><td>모델 CL101</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-16 채널 디지털 기록 장치</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DO 미터</td><td>YSI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH 미터</td><td>Orion 940</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PH 프로브</td><td>오리온&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>암모니아 미터</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>암모니아 프로브</td><td>오리온</td><td></td><td></td></tr><tr><td>냉각기 장치</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>재순환 워터 펌프</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

컴퓨터 원호 비디오 및 디지털 이미지 분석을 사용하여 수성 구리의 급성 노출에 대한 응답에 물고기가 수영 동작을 정량화

Quantifying Fish Swimming Behavior in Response to Acute Exposure of Aqueous Copper Using Computer Assisted Video and Digital Image Analysis

환경 오염 물질에 대한 수생 생물의 행동 반응은 생존, 성장 또는 번식과 같은 다른 효과의 전조가 될 수 있습니다. 그러나 이러한 반응은 미묘할 수 있으며 측정이 어려울 수 있습니다. 이 논문은 구리에 노출된 어린 흰철갑상어(Acipenser transmontanus)를 사용하여 컴퓨터 지원 비디오 및 디지털 이미지 분석을 사용하여 행동 반응을 정량화하는 데 사용되는 기술을 보여줍니다. 이전 연구에서는 구리에 급성 및 만성 노출되는 동안 초기 생애 단계의 흰 철갑상어에서 수영 행동의 심각한 손상이 관찰되었습니다. 철갑상어의 행동은 급격히 손상되었고, 물고기가 하류로 휩쓸리거나 포식자에게 쉽게 포획되기 때문에 들판에서의 생존이 위태로워질 정도였습니다. 이 조사의 목적은 일련의 급성 구리 노출 동안 수영 활동을 정량화하여 초기 생애 발달 기간 동안 영향을 받는 시간을 결정하고 이러한 취약한 초기 생애 단계 물고기의 생존과 관련하여 이러한 반응의 중요성을 이해하는 프로토콜을 설명하는 것이었습니다. 사망률은 시간 연속체에 있기 때문에 구리가 수영 능력에 처음 영향을 미치는 시점을 결정하는 것은 개체군 수준 효과에 대한 의미를 이해하는 데 도움이 됩니다. 사용된 기술은 다른 유기체 및 스트레스 요인을 사용한 실험 설계에 쉽게 적용할 수 있습니다.

수동으로 처리 시각 관측 자료 2 일 후 부화 (DPH) 철갑 상어 (그림 2)와 함께 시작 노출의 단지 72 시간 후 증가 구리 농도가 증가 퍼센트 이상을 보여 주었다. 비디오 샘플 철갑 유영에 구리 노출 극단적 충격 (영상 2)를 설명하고 그 결과 행동 장애를 정의하는데 도움. 또 다른 예에서, 30 DPH에서 철갑 상어는 사망률 만에 기초하여 40.3 μg의 / L의 96 시간 평균 치명적인 영향 농도 (LC50) 구리 노출에 민감 입증했다. 그러나, 평형 및 고정 손실의 치사 행동 엔드 포인트가 사망와 함께 포함될 때 2.4에서 5.0 μg의 / L에 이르기까지 약 96 시간 평균 효과 농도 (EC50)와 민감도 증가한다. 기록 된 행동 이상의 비디오 문서 이러한 치사 효과를 포착하고 추가 검증 인간의 관찰노출시. 수영 활동을 분석 할 때 디지털 추적 소프트웨어의 사용은 현저하게 후 처리 시간을 감소시켰다. 물고기 속도, 이동 소요 시간과 거리를 모두 현저히 증가하는 구리 농도 (도 3) 감소 여행. 수영 경로도 증가 구리 농도 (그림 4) 감소했다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53477/53477fig1.jpg" /> 그림 1 :.. 시험 원액의 농도를 목표 농도에 따라 스프레드 시트 템플릿을 사용하여 측정 하였다 희석 독성 시험을위한 화학 재고 준비를 결정하는 데 사용 스프레드 시트 템플릿의 컴퓨터 스크린 샷 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53477/53477fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 그림 2 :. 희석 설정 및 실험 설계 흰 철갑 상어의 다양한 삶의 단계는 구리에 노출되었다. 노광에 사용되는 희석의 크기는 물고기의 크기에 기초하여 선택 하였다. () 초기 생활 단계 철갑 상어는 큰 희석 설정을 사용하여 노출 된 작은 희석 설정 및 (b) 이전의 생활 단계 철갑 상어를 사용하여 노출되었다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/53477/53477fig3.jpg" /> 그림 3 : (30 일 후 부화 [DPH] 물고기로 시작하는) 초기 생활 단계 흰 철갑 상어 (인 Acipenser transmontanus) 72 시간 구리 노출 수영 행동의 결과. 흰 철갑 상어 DPH (30) 사이에 운동의 수영 활동 엔드 포인트의 (a) 기간; (b)는 수영의 속도; 및 (c </이동 강한&gt;) 거리를 96 시간 동안 노출 흰 철갑 상어 중 구리 농도가 증가함에 따라 감소 하였다. 별표가 컨트롤에서 유의 한 차이를 나타내고, 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/53477/53477fig4.jpg" /> 그림 4 :. 초기 생활 단계 흰 철갑 상어 (인 Acipenser transmontanus) 96 시간 동 노출의 결과는 72 시간 후 평형과 고정의 손실을 나타내는 2 DPH 흰 철갑 상어에서 살아 남기 (2 일 후 부화 [DPH] 물고기로 시작) 구리 농도가 증가함에 따라 96 시간 노출. 별표가 컨트롤에서 유의 한 차이를 나타내고, 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/53477/53477fig5.jpg" /> 그림 5 : 초기 생활 단계 흰 철갑 상어의 예 수영 경로 결과 (인 Acipenser transmontanus) 96 시간 동 노출 (30 일 후 부화 [DPH] 물고기)으로 쳐다보고. 철갑 상어의 수영 경로 (N = 5 물고기)와 (b) 높은 치료에서 (50의 (a) 제어 복제에서 디지털 추적 소프트웨어를 사용하여 디지털화 96 시간 노출 후 μg의 / L) 복제 (N = 3 물고기). 일부 물고기의 비활성 있었기 때문에 실 물고기 본의 수를 나타내지 않는 수영 경로의 수를 유의하십시오. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53477/53477fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> 정량화 할 수있는 매개 변수 </td><td> 관측 매개 변수 </td></tr><tr><td> 속도 </td><td> 혼수 / 과잉 행동 </td></tr><tr><td> 거리 이동 </td><td> 평형의 손실 </td></tr><tr><td> 시간의 지속 시간 영역에서 소비 </td><td> 경련 / 진동 / 상승하위 </td></tr><tr><td> 선택 영역 사이의 시간 생물 이동의 영역 전환 번호 </td><td> 물 열에 위치 </td></tr><tr><td> 에 제목 관심 지점을 향해 동물의 경로의 편차를 점 계산 </td><td> 호흡 (고속 / 저속) </td></tr><tr><td> 제목은 선택한 몸 포인트의 제목을 계산 </td><td> 천연색 </td></tr><tr><td> 두 샘플 사이에 호에 각도 차이를 돌립니다 </td><td> 숨김 </td></tr><tr><td> 각속도 계산 샘플 간격으로 회전 각도를 분할하여 </td><td></td></tr><tr><td> 이동 거리만큼 회전 각도를 분할하여 앤더 계산. 다른 속도로 움직이는 동물에서 선회 비교하는 데 사용 </td><td></td></tr><tr><td> 시간 이동 소요 </td><td></td></tr><tr><td> 모바일도 센트가있는 경우, 전체 면적은 동물이 변화로 감지하는 기간을 상태-계산어 포인트는 동일하게 유지 </td><td></td></tr><tr><td> 선택된 신체 점 360 °의 누적 회전 각도를 갖는 경우 회전 한 회전이 완료된다. 무시되는 문턱 미만의 반대 방향으로 회전. </td><td></td></tr><tr><td> 이동성 중심점이 동일하게 유지 되더라도, 검출 된 동물의 전체 영역에 대한 이동도의 비율을 연속 계산한다. </td><td></td></tr><tr><td> 사이의 거리 모든 배우와 선택된 수신기 사이의 거리를 과목-계산 </td><td></td></tr><tr><td> 배우 또는 수신기 근방에 있지 않은 시간을 계산하여 근접 - </td><td></td></tr><tr><td> 상대 운동 </td><td></td></tr><tr><td> 그들 사이의 거리에 의해 가중 순 가중 이동 - (양극)에 배우의 움직임으로부터 (네거티브) 수신기 </td><td></td></tr><tr><td> 가중 이동에서-MoveMe를<html> 그들 사이의 거리에 의해 가중 수신기로부터 배우의 NT. </td><td></td></tr><tr><td> 그들 사이의 거리에 의해 가중 수신기 배우의 이동 대 가중 운동 </td><td></td></tr><tr><td> 두 시험 제어 요소의 행사, 또는 요소 내의 사이 시험 관리 상태 - 기간 </td><td></td></tr><tr><td> 요소 내의 이벤트는 시험 관리에 정의 된 시험 제어 이벤트 순간이 발생합니다. </td><td></td></tr></tbody></table> 표 1 :. 디지털 추적 소프트웨어를 통해 정량화 행동 엔드 포인트는 이러한 엔드 포인트는 개인이나 그룹에 사용되며 노출시 행동 장애의 시각적 관찰 검사에 대한 목록이 될 수 있습니다. <img alt="비디오 1" src="/files/ftp_upload/53477/53477movie1.jpg" /> &quot;/www.jove.com/files/ftp_upload/53477/53477video1.avi&gt; 비디오 1 :. 영향을받는 화이트 철갑 상어에 의해 나타나는 비정상적인 행동의 시각 정의는 매일 관찰 체크리스트는 이상을 기록하는 데 사용되었다 (마우스 오른쪽 클릭하여 다운로드)를. 평형 및 고정의 손실은 노출. Calfee 등으로부터 수정시 관찰되는 가장 일반적인 이상이었다. (7) <img alt="비디오 2" src="/files/ftp_upload/53477/53477movie2.jpg" /> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53477/53477video2.avi">비디오 2 : 화이트 ​​철갑 상어 수영 동작의 예를 강조 비주얼 설명서를 참조하십시오. (마우스 오른쪽 클릭하여 다운로드)</a> 화이트 철갑 상어 수영 활동이 크게 증가 구리 농도에 노출 감소 하였다. 동영상에 도시 철갑 상어 제​​어, 낮은 중간 및 96 시간 수성 구리 끝에 높은 처리 출신노출. 흰 철갑 상어가 여전히 살아 있지만 물고기가 크게 컨트롤에 비해 치료에 장애했다 분명하다. Calfee 등의 수정. (7)

물고기의 행동에 환경 오염 물질의 영향을 측정하는 것은 종종 주관적이고 치사 엔드 포인트를 다룰 때 특히 도전이다. 우리는 동안 구리 다양한 농도의 96 시간 급성 노출 후 초기 생활 단계 흰 철갑 상어 (인 Acipenser transmontanus)의 수영 동작을 정량화하는 비디오 기술을 포함하는 방법을 설명합니다.

Behavioral responses of aquatic organisms to environmental contaminants can be precursors of other effects such as survival, growth, or reproduction.  ...

이 절차의 전반적인 목적은 수성 구리에 대한 아치사량 노출 시 흰sturgeon의 행동 반응을 정량화하는 방법을 시연하는 것입니다. 이 방법은 오염 물질에 대한 아치사량 노출이 물고기의 수영 행동에 어떤 영향을 미치는지와 같이 생태독성학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 또한, 이 방법은 흰sturgeon 보존을 위한 중요한 정보를 제공할 수 있습니다.이 방법은 다른 어종, 양서류 및 무척추동물에도 쉽게 적용할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 반응이 매우 민감하고, 독성을 조기에 나타내며, 생물체의 생존과 관련이 있다는 점입니다. 행동 측정법에 익숙하지 않은 개인에게는 처음에 이 방법이 어려울 수 있습니다.본 프로토콜은 공동 저자인 Holly Puglis가 시연하겠습니다. 먼저, 2L의 수성 시약급 황산구리(II) 오수화물을 준비하십시오. 그다음, 희석 시스템과 노출 탱크의 평형을 맞추십시오.자동 시린지 디스펜서의 흡입 튜브를 스톡 솔루션 플라스크에 넣으십시오. 그 다음, 자동 펌프의 스파이크 부피를 1 mL로 설정하고 희석기를 켜십시오. 시스템은 5가지 농도의 50% 희석 시리즈와 대조군을 생성합니다.4방향 분배기를 통해 이러한 용액들이 4개의 반복 노출 챔버로 전달됩니다. 다음으로, 수조 온도를 15 °C로 유지하도록 설정된 칠러의 펌프를 켭니다. 이제 희석기의 자동 타이머를 사용하여 30분마다 주기적으로 작동하도록 설정합니다.수조의 수위는 스탠드 파이프 배수관을 통해 유지됩니다. 측면에 4cm 크기의 구멍을 뚫고, 해당 구멍을 30 µm 스테인리스 스틸 메쉬로 덮어 노출 챔버를 준비하십시오. 노출 챔버는 물고기 10g당 최소 1L의 물을 수용할 수 있는 크기로 선택해야 합니다.예를 들어, 생후 89일 된 화이트 스터전은 무게가 약 373 milligrams이며, 따라서 28 centimeter x 13.5 centimeter x 25 centimeter 크기의 정방형 챔버에서 테스트할 수 있습니다. 실험 시작 시점, 중간 시점 및 종료 시점에 화학 분석을 위해 24 milliliter의 테스트 용액 하위 샘플을 수집하십시오. 이때 플라스틱 주사기에 연결된 시퍼 스트로우(sipper straws)를 사용하십시오.시퍼 스트로를 0.45 µm 폴리에테르설폰 필터로 교체하고, 테스트 용수 4 mL를 필터에 통과시켜 분주합니다. 이 물은 폐기하십시오. 그 다음, 나머지 20 mL의 물을 산 세척된 폴리에틸렌 병에 필터링하여 담습니다.16 M 질산으로 샘플을 v/v 1%가 되도록 산성화합니다. 이렇게 준비된 샘플은 최대 3개월까지 보관할 수 있습니다. 테스트 노출 조건이 확정되면, 챔버 리터당 약 172 mg의 물고기가 되도록 각 반복 테스트 챔버에 철갑상어 3마리씩을 넣습니다.마모되지 않는 그물을 사용하여 철갑상어를 수집하고 작은 양동이로 옮깁니다. 6가지 테스트 용액의 데이터를 수집하기 위해 총 144마리의 물고기가 필요합니다. 96시간의 노출 기간 동안 물고기에게 먹이를 주지 마십시오.폐사 및 비정상적 행동을 점수화하기 위해 매일 일관된 관찰을 수행해야 합니다. 오전 시간이 관찰에 가장 적합하며, 이상적으로는 관찰자가 테스트 조건을 알지 못하는 블라인드 상태여야 합니다. 평형 감각 상실은 물기둥 내에서 물고기가 직립 자세를 유지하지 못하는 상태로 정의합니다.부동성은 물고기가 자극을 받지 않는 한 움직이거나 헤엄치지 못하는 상태로 정의됩니다. 또한 무기력증, 과잉 활동, 호흡 증가 또는 감소, 색상 변화, 떨림, 경련, 복부 팽만, 수중 위치 및 기타 비정상적인 유영 패턴과 같은 다른 이상 징후를 모두 기록하십시오. 죽은 물고기는 항상 즉시 제거해야 합니다.매일 휴대용 측정기로 두 개의 수중 샘플에서 용존 산소 수치를 측정하십시오. 96시간 노출이 끝난 후, 유영 행동 분석을 위한 영상을 촬영하십시오. 노출 탱크 내에 테스트 아레나를 배치하십시오.물고기가 자유롭게 헤엄칠 수 있도록 충분히 큰 테스트 아레나를 선택하십시오. 각 테스트 아레나 바로 위에 삼각대를 사용하여 휴대용 비디오 카메라를 설치합니다. 이제 처치된 물고기 중에서 생존한 개체를 최대 3마리까지 무작위로 선택하십시오.작은 메쉬 네트를 사용하여 세 마리를 테스트 아레나로 옮깁니다. 물고기가 아레나에 약 30분 동안 적응하도록 둡니다. 물고기가 적응하는 동안 이미지를 초점으로 맞추고, 움직이는 물로 인한 눈부심 왜곡을 최소화하며, 물고기가 배경과 대비되어 가장 잘 보이도록 대조를 최대화하고 물고기가 가려지지 않도록 뷰를 조정합니다.어류의 순응이 완료되면 녹화를 시작하여 2분 동안 비디오 데이터를 수집합니다. 비디오 촬영 후, 어류를 안락사시켜 폐기합니다. 비디오 파일을 디지털 분석 소프트웨어에 필요한 형식으로 변환한 후, 트래킹 소프트웨어를 열고 메인 화면의 '새 실험 생성(create a new experiment)' 옵션에서 '새 기본 실험(new default experiment)'을 선택합니다.프롬프트를 입력한 후, 확인을 누릅니다. 그런 다음, 설정(set up)의 실험 설정(experiment settings) 옵션으로 이동하여 비디오 소스(video source)에서 비디오 파일(video file)을 선택합니다. 아레나(arena) 수를 1개로 설정합니다.아레나당 피험체 수를 3으로 설정하십시오. 다음으로, 추적 기능(tracked features)에서 중심점 검출(center point detection)을 선택하고 원하는 단위를 선택하십시오. 이제 설정(set up)에서 시험 목록(trial list) 옵션을 선택하고 화면 상단의 동영상 추가(add videos)를 클릭하십시오.대화 상자에서 알파벳 순서를 선택하십시오. 찾아보기(browse)를 클릭하십시오. 비디오가 위치한 폴더로 이동하여 해당 파일들을 강조 표시한 후 열기(open)를 클릭하십시오.비디오 파일 선택이 완료되었으므로, 소프트웨어에서 실험 범위를 정의하십시오. 먼저 화면 상단의 변수 추가(add variable)를 클릭하고 레이블 상자에 concentration을 입력하십시오. 설명 상자에는 리터당 마이크로그램 단위의 구리 농도(copper concentration in micrograms per liter)를 입력하십시오.다음으로, 유형 드롭다운 목록에서 numerical을 선택하십시오. pre-defined values 상자를 클릭하고, 대화 상자에서 define individual values 옵션을 선택하십시오. 각 숫자를 추가할 때마다 add를 클릭하여 실험에 사용된 농도를 입력하십시오.그런 다음, '다른 값 허용' 옵션의 체크를 해제하고 확인을 클릭하십시오. 범위 상자의 드롭다운 메뉴에서 '시행(trial)'을 선택하십시오. 제공된 상자에 각 시행에 적절한 농도를 입력하십시오.화면 상단의 변수 추가(add variable)를 클릭하십시오. 레이블 상자에 replicate를 입력하십시오. 설명 상자에 replicate number를 입력하십시오.유형의 드롭다운 목록에서 numerical을 선택하십시오. 다음으로, pre-defined values 상자를 클릭하고 대화 상자에서 define individual values 옵션을 선택하십시오. 1, 2, 3, 4를 입력하고 allow other values 옵션의 체크를 해제하십시오.그 다음, 확인을 클릭합니다. 이제 범위 상자의 드롭다운 메뉴에서 시험 옵션을 선택하십시오. 각 시험에 적합한 반복 횟수를 입력하십시오.다음 작업은 아레나 공간을 설정하는 것입니다. 설정(set up) 탭에서 아레나 설정을 선택하고, 첫 번째 설정의 이름을 'trial one'으로 지정하며 시작하십시오. 대화 상자에서 배경 이미지 가져오기(grab background image) 옵션을 선택하고 찾아보기(browse)를 클릭하십시오.첫 번째 실험의 비디오 파일을 찾아 열기를 클릭하십시오. 비디오가 나타나면 배경 이미지 캡처 대화 상자에서 캡처를 클릭하십시오. 다음으로, 화면 상단 arena settings 아래에 있는 흰색 원형 아이콘을 클릭하고, 나타나는 원을 조절하여 수영 구역을 둘러싸도록 설정하십시오.그런 다음, 아레나 설정 아래의 보정 척도 아이콘을 클릭합니다. 클릭 후 누른 채로 드래그하여 아레나 공간을 선택하십시오. 이제 보정 거리의 실제 거리 상자에 10.5를 입력합니다.그 다음, 확인(okay)을 클릭합니다. 필요한 경우, 보정선이 원형 아레나의 전체 직경을 가로지르도록 조정하십시오. 아레나 설정 상자의 아레나 설정 검증(validate arena settings) 옵션을 클릭하고, 검증되지 않은 설정상의 모든 문제를 해결하십시오.이제 모든 시도에 대해 모든 구역이 정의될 때까지 이 과정을 반복합니다. 다음으로, 물고기 검출 파라미터를 설정합니다. 먼저 화면 왼쪽의 실험 탐색 툴바에서 설정 옵션 아래의 검출 설정을 선택하십시오.그런 다음, 검출 설정(detection settings) 대화 상자의 방법(method) 드롭다운 메뉴에서 동적 감산(dynamic subtraction)을 선택하십시오. 또한, 대화 상자의 피험자 식별(subject identification) 항목에서 각 피험자에 대한 채우기 색상을 선택하십시오. 다음으로, 비디오 선택(select video)을 클릭하여 첫 번째 시험의 비디오를 찾으십시오.검출 설정 1 대화 상자의 비디오 항목에 있는 샘플 레이트 상자에 5.9941을 입력하십시오. 동일한 상자의 검출 항목 아래에 있는 참조 이미지 옵션의 설정을 클릭하십시오. 그런 다음, 참조 이미지 대화 상자에서 참조 학습 시작(start learning C) 옵션을 클릭하십시오.참조 이미지 대화 상자에 동물이 없는 이미지가 나타나면, 대화 상자 내의 획득 설정(acquisition settings)에서 '동적 참조 이미지 사용(use dynamic reference image)'을 클릭하고 이 대화 상자를 닫으십시오. 이제 탐지 설정 1(detection settings one) 대화 상자의 탐지(detection) 항목 아래에 있는 대상(subject) 드롭다운 메뉴에서 '더 어두운 것(darker)'을 선택하십시오. 탐지 하위의 어두운 대비(dark contrast) 설정에서 작은 숫자는 33으로, 큰 숫자는 153으로 설정하십시오.그런 다음, 오른쪽 하단의 변경 사항 저장(save changes)을 클릭하십시오. 이제 소프트웨어가 그림자나 잔해물이 아닌 동물을 성공적으로 추적하고 있는지 확인하십시오. 재생 제어 대화 상자의 재생 버튼을 클릭하고 필요에 따라 암부 대비(dark contrast) 수치를 조정하십시오.수정한 모든 내용을 반드시 저장하십시오. 이제 소프트웨어가 비디오에서 데이터를 수집하도록 설정되었으므로, 다음 단계는 각 실험 회차에서 물고기를 추적하는 것입니다. 먼저 화면 왼쪽에 있는 실험 탐색기 도구 모음의 설정 옵션에서 데이터 수집(acquisition)을 선택하십시오.다음으로, 데이터 수집 설정 대화 상자에서 'track next planned trial'을 클릭하고, 해당 대화 상자의 설정 항목 아래에 올바른 트라이얼, 비디오 및 아레나 설정이 모두 표시되는지 확인합니다. 그런 다음, 데이터 수집 제어 대화 상자에서 'detection determines speed' 옵션을 체크합니다. 흰색 사각형 안에 녹색 원이 그려진 버튼을 클릭하여 데이터 수집 과정을 시작합니다.모든 실험군에 대한 추적이 완료될 때까지 이 과정을 반복합니다. 이제 추적된 대상인 물고기를 분석할 수 있습니다. 먼저, 화면 왼쪽의 실험 탐색기(experiment explorer) 툴바에서 분석(analysis) 옵션 아래의 데이터 프로필(data profiles)을 클릭하십시오.그런 다음, 컴포넌트 툴바의 네스팅 옵션에서 time을 선택합니다. 시간 대화 상자의 select track time interval 설정에서 to 값을 2분으로 조정하고 확인을 클릭합니다. 그런 다음, 화면 우측의 데이터 프로파일 영역에서 nest 상자를 start 상자와 result one 상자 사이에 드래그합니다.화면 왼쪽의 실험 탐색기 도구 모음에서 분석 옵션을 찾아 분석 프로필을 클릭하십시오. 그런 다음 종속 변수 도구 모음의 거리 및 시간 항목에서 속도를 클릭하십시오. 추가를 클릭한 후, 종속 변수 도구 모음의 거리 및 시간 항목에서 이동 거리를 클릭하십시오.그런 다음, 이동 거리(distance moved) 대화 상자에서 추가(add)를 클릭하고, 종속 변수 툴바의 개별 행동(individual behavior) 항목 아래에서 이동(movement)을 클릭하십시오. 이동 대화 상자의 이상치 필터(outlier filter) 항목에서 평균화 간격(averaging interval)을 1로 조정하십시오. 그런 다음 임계값(threshold) 항목 아래에서 시작 속도(start velocity)를 2.00으로 조정하고 정지 속도(stop velocity)를 1.75로 조정하십시오.통계 계산(calculate statistics) 항목 아래에서 이동(moving)과 비이동(not moving) 체크박스를 모두 선택하십시오. 그런 다음 추가(add)를 클릭하고, 화면 왼쪽의 실험 탐색기(experiment explorer) 툴바에 있는 결과 옵션에서 분석 출력(analysis output)을 클릭하십시오. 이제 계산(calculate)을 클릭하십시오.종속 변수 계산이 완료되면 화면 상단의 export를 클릭하십시오. 내보내기 분석 결과(export analysis output) 대화 상자에서 대상 폴더를 선택하고, 파일 유형 드롭다운 메뉴에서 Excel을 선택하십시오. 그런 다음 okay를 클릭하십시오.마지막으로 화면 상단의 파일 탭에서 실험 저장(save experiment)을 클릭하십시오. 디지털 트래킹 소프트웨어를 종료합니다. 데이터를 스프레드시트 파일로 가져온 후, 상용 통계 분석 소프트웨어 패키지를 사용하여 분석하십시오.다양한 구리 농도에 단 72시간 동안 노출시킨 후, 부화 후 2일 된 철갑상어에서 많은 관찰 가능한 이상 징후가 나타났습니다. 수영 행동에 분명한 영향이 있었으며, 비디오 데이터를 통해 이러한 행동 장애를 정의할 수 있었습니다.추가 실험에서 부화 후 30일 된 철갑상어는 96시간의 구리 노출에 민감한 것으로 나타났다. 구리 농도가 증가함에 따라 유영 속도, 이동 시간 및 이동 거리가 모두 유의하게 감소했다. 유영 경로 또한 구리 농도가 증가함에 따라 감소했다.이 영상을 시청한 후, 독성 시험에서 행동을 정량화하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 기술은 환경 관리자가 행동적으로 정의된 기준을 사용하여 환경적 피해를 기록하고 복원을 안내하는 수단을 제공할 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때는 행동 관찰 내용을 기록할 때 일관성을 유지하는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오.급식 및 공격성과 같은 다른 행동들은 오염 물질 노출이 생존에 미치는 장기적 영향에 관한 추가적인 질문에 답하기 위해 본 절차를 따라 정량화할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

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여기 면역 - modulatory의 bioactives의 식별을 목표로 소설 높은 콘텐츠를 화학적으로 유도된 염증 분석을 설명합니다. 우리는 성공적으로 염증 반응뿐만 아니라 추가로 데이터 처리, 분석, 마이닝, 그리고 저장 장치의 자동 부량을 활성화하는 사용자 정의 개발 소프트웨어의 스크립트와 자동화된 현미경을 결합했습니다.

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이 비디오는 제브라피시 유충의 회피 및 도둑 모타시스 분석을 설명합니다. 이 비디오는 시각적 혐오 자극에 반응하는 제브라피시 유충의 행동을 조사합니다.

제브라피시 회피 및 티그모타시스 분석: 혐오스러운 시각적 자극에 대한 반응으로 유충의 행동을 조사하는 고처리량 방법

우리는 자유롭게 기적 감각 내부 특별히 설계된 수조의 모두 정확하고 안정적​​으로 동물의 전기 기관 방전 타이밍, 상체 위치 자세를 측정함으로써, 장기간에 걸쳐 약하게 전기 물고기 수영의 자발적 행동을 연구하기위한 기술의 집합을 설명 격리 실.

자유롭게 수영 약하게 전기 생선의 장기 행동 추적

얼룩말은 근육 기능과 질병을 연구하는 훌륭한 모델입니다. 초기 배발생 동안 제브라피쉬는 규칙적인 근육 수축을 시작하여 리드미컬한 수영 행동을 일으키며, 이는 근육이 파괴될 때 변경됩니다. 여기에서는 근육 기능의 척도로서 수영 성능을 조사하기 위해 촉각 유발 반응 및 운동 분석에 대해 설명합니다.

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이 작품에서는, 우리는 청록색 송사리 Nothobranchius furzeri에 단일 및 결합 된 스트레스의 효과 공부 하는 급성, 만성 및 대가족제 검정을 설명 합니다. 이 프로토콜은 생활 역사 특색 (사망률, 성장, 통치, 무게)와 중요 한 열 최대 공부 하도록 설계 되었습니다.

급성 및 만성 Ecotoxicity 청록색 송사리 Nothobranchius furzeri 의 테스트에 대 한 프로토콜

여기, 선물이 애벌레 zebrafish fathead 미노 운동 활동 및 photomotor 응답 (PMR) 자동된 추적 소프트웨어를 사용 하 여 검사 하는 프로토콜. 공통 통합 독성 생물 검정, 이러한 행동의 분석 화학 bioactivity를 검사 하는 진단 도구를 제공 합니다. 이 프로토콜은 카페인, 모델 neurostimulant를 사용 하 여 설명 합니다.

애벌레에서 행동 응답 프로필을 조사 하기 위한 실험 프로토콜: 신경 흥분 제 카페인에 응용

여기, 선물이 멕시코 cavefish의 일련의 높은 처리량 연구 방법 행동 및 mechanosensory 시스템의 중요 한 얼룩. 이러한 방법 사용 무료 소프트웨어 및 맞춤 스크립트, 행동의 연구에 대 한 실용적이 고 비용 효율적인 방법을 제공 하.

행동 추적 및 멕시코 Cavefish의 Neuromast 이미징

척수 손상 후 기능적 회복이 가능한 성인 제브라피쉬는 신경 재생의 선천적 메커니즘을 밝히는 최고의 모델 시스템입니다. 여기에서는 수영 지구력과 수영 행동 분석을 척수 재생의 기능적 판독으로 설명합니다.

성인 제브라 피쉬의 수영 지구력 및 수영 행동 평가

설치류에서 제브라피시까지 다방 사회적 선호 과제가 적용되어 모델 생물의 사회적 행동 연구를 용이하게 합니다. 이 프로토콜은 웹캠과 오픈소스 소프트웨어를 활용한 저비용 3챔버 오픈 탱크 작업을 검증하여 제브라피시의 사회적 선호도를 측정하여 학부 연구와 교육에 접근성을 높입니다.

3개 방 개방형 수조 자유수영 과제를 이용한 제브라피시(Danio rerio)의 사회적 선호를 조사하는 저비용 대안

학습하세요 백색 철갑상어(Acipenser transmontanus)의 수영 행동을 영상 기술로 정량화하여 수성 구리 노출의 생태독성 영향을 평가하는 방법을. 이 프로토콜은 수생 생물 보전과 조기 독성 지표 확인에 활용됩니다.

컴퓨터 원호 비디오 및 디지털 이미지 분석을 사용하여 수성 구리의 급성 노출에 대한 응답에 물고기가 수영 동작을 정량화

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