발광 생물 칼슘 표시 GFP - 쿼린을 기반으로 생체 기능성 뇌 영상의 접근 방식

생물 발광 이미징의 전반적인 목표는 생체 내 기능성 칼슘 과도 현상, 활동의 대용물, 더 오랜 기간 동안, 그리고 뇌 심부 구조를 이미지화하는 것입니다. 이 방법은 수면 중 파리 뇌의 기초 활동이 어떻게 보이는지와 같은 신경 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 레이저를 사용하여 여기가 필요하지 않다는 것입니다.

이를 통해 고전적인 칼슘 이미징에 비해 광표백 및 독성 없이 조직 깊숙한 곳까지 일시적인 칼슘을 이미지화할 수 있으며, 더 오랜 기간 동안 사용할 수 있습니다. 이 방법은 초파리의 기초 뇌 활동에 대한 통찰력을 제공할 수 있으며 마우스와 같은 다른 모델 유기체에도 사용할 수 있습니다. 시작하려면 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 관심 있는 drosophila melanogaster 라인과 실험 솔루션을 준비합니다.

그런 다음 단일 초파리를 얼음 위의 유리 유리병에 2분 동안 옮겨 얼음 마취합니다. 다음으로, 파리를 식힌 페트리 접시로 옮기고 집게를 사용하여 팁이 약 35도의 각도가 되도록 다듬은 1000마이크로리터 피펫 팁 안에 파리를 부드럽게 놓습니다. 브러시를 사용하여 머리가 끝의 가장자리를 완전히 지나고 등쪽 영역이 부분적으로 노출되도록 각 파리를 부드럽게 밀고 정렬합니다.

그런 다음 머리에서 피펫 끝 가장자리까지 준비된 치과용 접착제를 바르십시오. 정수리를 피하도록 각별히 주의하십시오. 머리를 올바른 위치에 고정하는 것이 성공적인 해부 및 이미징을 위해 필수적이기 때문에 머리를 접착하는 것이 중요합니다.

또한 접착이 불량하면 링거 용액이 누출되고 이미징 전에 샘플이 사멸됩니다. 다음으로, 파리가 부착된 피펫 팁을 기록 챔버의 구멍을 통해 놓고 부드럽게 눌러 제자리에 고정합니다. 그런 다음 준비된 실리콘 접착제를 사용하여 누출을 방지하기 위해 피펫 팁과 만나는 챔버의 평평한 면을 고정합니다.

풍성한 채널, 짧은 가장자리 및 챔버 뒤쪽까지 확장되는 탭 조각을 부착합니다. 다음으로, 파리가 있는 챔버를 현미경 아래에 놓고 형광등을 켭니다. 그런 다음 링거 용액 1ml를 챔버에 피펫으로 주입합니다.

가는 수술용 칼을 사용하여 파리의 머리 뒤쪽에서 양쪽 앞부분까지 평행하게 절개합니다. 그런 다음 눈의 가장자리를 따라 자르고 이전 절개 부위를 연결하는 안테나 위에 수직 절개를 만듭니다. 머리 뒤쪽을 마지막으로 절개한 다음 가늘고 날카로운 집게를 사용하여 큐티클을 제거합니다.

뇌와 형광을 발하는 버섯 몸체가 명확하게 보일 때까지 노출된 호흡기 조직을 부드럽게 잡고 제거합니다. 다음으로, 매우 날카로운 집게를 사용하여 뇌를 덮고 있는 신경 상피 조직을 조심스럽게 잡고 꼬집어 제거하여 코엘렌테라진이 침투할 수 있도록 합니다. 피펫을 사용하여 1ml의 링거 용액으로 조직을 두 번 세척하여 해부에서 남은 파편을 제거한 다음 샘플을 어두운 상자에 넣습니다.

다음으로, 5마이크로몰의 벤질-코엘렌테라진(benzyl-coelenterazine)이 함유된 링거 용액 1ml를 챔버에 피펫으로 주입합니다. 상자를 닫고 샘플을 실온에서 최소 2시간 동안 배양합니다. 컴퓨터에서 현미경을 켜는 것으로 시작합니다.

또한 카메라를 섭씨 영하 80도로 식히십시오. 그런 다음 배수 시스템을 설정하고 환경 제어 장치를 섭씨 20도로 조정합니다. 그런 다음 Photon Imager를 열고 새 폴더를 만든 다음 첫 번째 녹음의 이름을 지정합니다.

그런 다음 염화칼륨, 니코틴 및 링거 용액을 각각의 저장소에 추가하여 풍량 시스템을 설정합니다. 각 용액이 분당 2밀리리터로 방전되도록 흐름을 조정합니다. 다음으로, 샘플을 현미경 아래의 마운트에 놓고 배율을 5X로 조정합니다.

그런 다음 펑크를 통해 채널에 풍력 튜브를 삽입합니다. 현미경을 형광등 모드로 설정한 다음 버섯 몸체를 중앙에 놓고 초점을 맞춥니다. 버섯 몸체에 초점이 맞춰지면 배율을 20X로 변경합니다.

이미지를 다시 중앙에 맞추고 초점을 조정합니다. 그런 다음 배수 장치를 배수 풀 위에 놓고 배수 션트의 높이를 조정하여 팁이 배수 풀 바로 위에 오도록 합니다. 그런 다음 링거 용액으로 샘플을 30초 동안 세척하여 적절한 배수 상태를 확인합니다.

마지막으로 실드를 아래로 당겨 외부 조명으로부터 장치를 밀봉합니다. 광자 이미저 프로그램의 자동화 시스템을 사용하여 초점을 미세 조정하고 버섯 몸체의 참조 형광 이미지를 촬영합니다. 광자 속도를 원하는 기록 속도로 조정하며, 이는 50밀리초마다 하나의 이미지에서 초당 1개 또는 그 이상이어야 합니다.

그런 다음 광자 모드를 선택하고 셔터를 엽니다. 그런 다음 로그 항목에 유전자형, 성별, 연령 및 샘플 번호를 입력합니다. 꽃받침, 세포체 및 내측 엽 위에 있는 관심 영역 상자의 위치를 조정하려면 상자를 클릭하고 컨트롤을 누른 상태에서 해당 위치로 드래그합니다.

이제 약 5분에서 10분 동안 기준 값을 기록합니다. 그런 다음 스위치를 켜서 니코틴의 흐름을 시작합니다. 동시에 Enter 키를 누르고 니코틴의 흐름이 시작되었음을 나타내는 메모를 추가합니다.

1분 후 흐름을 중지하고 흐름이 중지되었음을 나타내는 로그에 다른 메모를 만듭니다. 그런 다음 링거 용액으로 샘플을 5분 동안 세척합니다. 샘플이 회복되는 동안 세척을 끄고 타이머를 5분 더 설정한 다음 염화칼륨의 흐름을 시작할 준비를 합니다.

시작할 준비가 되면 염화칼륨의 흐름을 시작하고 100밀리몰 염화칼륨 시작"을 샘플 로그에 입력합니다. 1분 후 흐름을 중지하고 염화칼륨 차단"을 샘플 로그에 입력합니다. 그런 다음 링거 용액으로 샘플을 1분 동안 세척하고 현미경을 형광 모드로 전환합니다.

최종 형광 이미지를 촬영한 다음 링거 용액을 끄고 샘플을 제거합니다. 분석 프로그램에서 첫 번째 파일을 열고 디스플레이 컨트롤"탭을 선택한 다음 ROI를 클릭합니다. 그런 다음 control을 누른 상태에서 관심 영역을 선택합니다.

다음으로, GFP 조명 꽃받침 및 세포체, 내측엽을 포함하도록 ROI의 크기, 방향 및 모양을 조정합니다. 모든 관심 영역이 추가되면 영화 "탭을 선택하여 Photon 비디오를 재생합니다. 두 번째 너비와 두 번째 단계를 원하는 대로 조정합니다.

그런 다음 필요에 따라 ROI 배치를 다시 조정하여 비디오의 활성 영역 내에 유지되도록 합니다. GFP 형광, 니코틴 반응 및 염화칼륨 반응의 대표적인 스크린샷을 선택합니다. 그런 다음 스크린샷을 자르고 나중에 분석하고 비교할 수 있도록 대표 이미지를 프레젠테이션 슬라이드에 붙여넣습니다.

두 번째 너비와 두 번째 단계를 모두 녹음 속도(초)로 조정합니다. 또한 상단 패널의 회색 마커를 괄호 안의 영역으로, 자극 시작 전과 반응이 끝난 직후로 이동하여 분석 길이를 선택합니다. 그런 다음 재생 중인 동안 일시 중단 보기를 선택한 다음 되감기 버튼을 눌러 비디오 재생을 처음으로 재설정한 다음 재생 버튼을 누릅니다.

그런 다음 탭 수 비율 차트"를 선택하여 단위를 조정하고 관심 영역의 색상과 원하는 선 색상을 조정하십시오. 분석이 완료되면 카운트 비율 데이터 내보내기를 선택합니다. 그런 다음 꽃받침과 세포체의 결합된 기록과 각 측면의 내측 엽 영역의 기록을 선택하고 해당 이미지를 반응 이미지와 함께 슬라이드에 붙여넣습니다.

버섯체를 자극하는 가장 간단한 방법 중 하나는 이온성 니코틴성 아세틸콜린 수용체를 활성화하는 것입니다. 여기에 표시된 25마이크로몰 니코틴에 대한 일반적인 반응은 꽃받침과 세포체, 내측엽의 빠른 활성화로 시작하여 칼슘에 결합하고 빛을 방출하는 융합된 GFP-aequorin 구조를 사용합니다. 일반적으로 꽃받침과 세포체의 반응은 더 오래 지속되며 반응의 순차적 패널에서 볼 수 있듯이 엽보다 더 큰 생물 발광 반응을 나타냅니다.

시간 경과에 따른 니코틴 활성화에 대한 생물 발광 반응의 샘플 기록이 이 그래프로 설명되며, 여기서 꽃받침과 세포체를 포함하는 관심 영역의 광자 수는 검은색으로 그래프로 표시되고, 내측 엽 영역 내의 광자 수는 빨간색으로 표시됩니다. 이 그래프에서 응답의 길이, 응답 중 최대 광자 값, 각 곡선 아래의 총 면적을 모두 결정할 수 있습니다. 일단 숙달되면 준비 단계는 파리의 수에 따라 부화 2시간 전에 밖에 걸리지 않습니다.

또한 각 녹음은 제대로 수행되면 20분 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 샘플 간의 재현성을 보장하기 위해 플라이 스톡을 적절하게 노화하고 보관하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 구조물의 활동이 특정 동작에 미치는 영향과 같은 추가 질문에 답하기 위해 추가 행동 테스트를 수행할 수 있습니다.

이 기술의 개발은 신경생물학 분야의 연구자들이 초파리 뇌의 장기적인 신경 활동을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 파리 뇌에서 생물 발광 이미징을 위한 샘플을 준비하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 니코틴은 건강에 해로울 수 있다는 것을 잊지 마십시오.

이 절차에서 용액을 준비하거나 청소할 때 장갑과 같은 예방 조치를 취해야 합니다.