Name: 발광 생물 칼슘 표시 GFP - 쿼린을 기반으로 생체 기능성 뇌 영상의 접근 방식 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-08T15:00:01.000+00:00
Duration: 12 min 15 s
Description: 배우세요 GFP-쿼린 생체 발광 칼슘 영상 기법으로 Drosophila melanogaster 뇌 심층 구조의 장기 신경 활동을 관찰하는 방법을. 레이저 여기 없이 광표백과 독성을 피하며 수면 중 기저 뇌 활동을 연구할 수 있습니다.

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우리는 미국 Sciences Wares의 E. Karplus에게 소중하고 유용한 도움과 조언을 해준 것에 대해 빚을 지고 있습니다. 이 기술의 개발과 개선에 기여한 E. Carbognin, A. Avet-Rochex, M. Murmu, P. Pavot, D. Minocci, G. Vinatier, J. Stinnakre에게 감사드립니다. 또한 pJFRC65-13XLexAop2-IVS-G5A-BP 라인에 대해 미국 Ashburn, H.H.M.I.의 Janelia Farm에 근무하는 B. Pfeiffer와 G. Rubin에게도 감사드립니다. 이 작업은 샤토브리앙 펠로우십, 미국 워싱턴 주재 프랑스 대사관의 지원을 받아 A. Lark에게, 국립과학재단(IOS 1352882)의 지원을 받았으며, T. Kitamoto에게, 그리고 프랑스의 ANR(ANR-05-NEUR-009 Drosaequorin, 2005, FlyBrainImaging, 2011), Conseil Régional Ile-de France(NeRF 및 DIM), IFR-144, CNRS의 Physique-Chimie-Biologie Interface Program (2009)의 지원을 받았다. 그리고 CNRS에 의해, 프랑스에서 JR 마틴에게.

샘플 1. 준비 <ol><li> 솔루션의 준비 및 설정 <ol><li> 표준 음식 매체에 24 ° C에서 모든 초파리 라인을 유지한다. 후면과 유리 병에 낮은 밀도를 유지하는 표준화 된 크기와 파리의 무게를 생성합니다. <ol><li> 유리 병에 10 명의 남성과 10 명의 여성을 처녀 추가, 그들이 짝짓기를하게하고 신선한 유리 병에 2 일마다 전송할. 파리 eclose 시작하면을 10 일 후, 매일 파리를 수확. 파리의 나이에 대한 정확한 기록을 유지하고 좋은 상태로 보관하십시오. </li><li> 3 일에, 여성에서 남성을 분리하고 여성에게 유리 병 당 20 파리를 유지합니다. 4 오일 세에 파리를 기록합니다. </li></ol></li><li> 다음 농도의 링거액 조제 : 130 mM의 염화나트륨, 5 mM의 KCl을 2 밀리미터의 MgCl 2, 2 mM의 CaCl2를, 5 mM의 HEPES, 및 36 mM의 수크로오스를 정확하게 7.3으로 용액의 pH를 조정한다. 25 μ의 관류 솔루션을 준비; 링거액에 M 니코틴 100 밀리미터의 KCl. </li><li> 경사에 (팁의 끝에서 약 35 °)를 면도날 모양의 팁을 사용하여 끝에서 1 ½ 센티미터 이상 초과베이스를 제거 : 1,000 μL 피펫 팁을 준비합니다. </li><li> 배양하는 동안 시료의 저장 상자 (23cm X 17cm X 8.5 cm)를 준비합니다. 그 준비가 완료되는에 샘플을 배치하는 작은 랙 장치 아래의 [샘플 탈수를 방지하기] 바닥에 물과 포화 두 스폰지 (12cm X 8cm X 3cm)을 놓습니다. </li><li> 그들은 GFP - 애큐 오린의 발현을 드라이브에 GAL4 라인의 UAS-GFP - 애큐 오린의 적어도 1 부 및 사본을 포함하도록 파리 샘플을 준비합니다. OK107 GAL4 라인 (주로 버섯 몸의 라인 구동 식)이 준비 UAS-GFP - 쿼린 교차된다. 주 : 상자의 내부를 방수이어야하고 외부는 배양 중에 코 엘렌 테라의 열화를 방지하기 위해 박스 들어가는 빛을 차단한다. </li></ol></li><li> 예습샘플 aration <ol><li> 얼음은 유리 바이알에 전달함으로써 초파리 마취 및 피펫 팁에 위치시키는 냉장 페트리 접시로 이동되기 전에 2 분 동안 얼음에 보관. 해부 현미경으로 얼음에 100 ml의 페트리 접시에 약간 적신 여과지에 피펫 팁을 준비합니다. </li><li> 부드럽게 집게 장소에 피펫 팁의 내부에 비행. </li><li> 부드럽게 밀어 머리가 팁의 가장자리를지나 완전히와 지느러미 영역이 부분적으로 팁의 형성 (그림 2B) 중에 제거 섹션에 의해 노출되도록 비행을 정렬 브러시를 사용하여. </li><li> 치과 용 접착제의 두 성분의 작은 (약 3-4 μL) 부분을 결합한다. 피펫 팁의 가장자리 주위에 다시 아래로 머리와 목을 전면 주위에 조심스럽게 접착제를 적용하고 - 머리의 왕관을 피하는. 2 분 동안 접착제 건조하자. </li><li> 기록 챔버 (그림 2D) 및 세대의 구멍을 통해 접착 플라이 장소 피펫 팁TLY 장소에 고정 키를 누릅니다. </li><li> 실리콘 접착제 (약 3-4 μL)의 두 가지 구성 요소를 결합합니다. 챔버와 피펫 팁 만나는 링거액의 누출을 방지하기 위해 가장자리를 따라 챔버의 평평한면에 접착제를 적용합니다. 2 분 동안 접착제 건조하자. </li></ol></li><li> 해부 <ol><li> 관류 채널 짧은 가장자리 위에 테이프를 부착하고, 챔버의 후면으로 연장. </li><li> 형광 램프 현미경 회전에서 해부 블록에 비행과 챔버를 놓습니다. 챔버에 링거액 정확하게 취하여 1 ml의. </li><li> 표피를 제거하는 미세 수술 용 칼을 사용합니다. 더듬이 지역에 머리 뒤쪽에서 평행하게 절개를합니다. 그런 다음, 이전 절개 접속 안테나 상기 수직 절개를 눈의 가장자리를 따라 절단. 머리 뒤쪽에 해당하는 최종 절개 평행 만든다. 표피 (그림 2C)를 제거하는 미세 날카로운 집게를 사용합니다. </li><li> 부드럽게를 파악하는 좋은 날카로운 집게를 사용하여뇌와 [형광] 버섯 몸이 명확하게 가시화 될 때까지 떨어져 호흡기 조직을 노출 지워 거라고. </li><li> 조심스럽게 잡고 코 엘렌 테라의 침투를 허용하도록 뇌를 덮고 neuroepithelial 조직 끼지 매우 날카로운 집게를 사용합니다. 참고 : 또는 파파인 neuroepithelia 9 Permeabilize 하시려면하는 데 사용할 수 있습니다. </li><li> 피펫을 사용하여 어두운 상자에 해부 및 장소 샘플에서 이물질을 제거하는 링거액로 두 번 씻어. </li><li> 챔버 내로 5 μM 벤질 엘렌 테라 함유 링거액 정확하게 취하여 1 ml의. 2 시간의 최소 실온에서 코 엘렌 테라와 배양을 상자를 닫고 있습니다. </li></ol></li></ol> 2. 영상 <ol><li> 설정 <ol><li> 기록 시스템을 시작 : 25 ° C에 현미경, 컴퓨터, 카메라 및 배수 시스템과 설정 방에 환경 관리를 켭니다. </li><li> 열기 측정 및 컴퓨터의 자동화 탐색기 프로그램. 클릭 &amp;#8220, 디바이스와 인터페이스 NI 모션 장치 &quot;에 두 번 클릭&quot; &quot;와에 마지막으로 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭&quot;PCI-7334 &quot;하고&quot;장치를 초기화 &quot;. </li><li> 광자 이미 저를 엽니 다. 새 폴더와 이름, 제 1 기록 파일을 만듭니다. 시스템이 작동하기 전에 카메라는 -80 ° C에 도달해야합니다. </li><li> 설정 관류 시스템 - 저수지의 KCl, 니코틴, 그리고 링거액을 추가하고 2 ml / 분에서 그렇게 각 솔루션 방전을 조정합니다. 실험을 시작하기 전에 링거액과 함께 씻으십시오. </li></ol></li><li> 샘플을 준비 <ol><li> 장소의 영상은 5 배 배율 현미경 마운트에 블록 접시를 탑재하고 구멍을 통해 채널로 관류 관을 삽입합니다. </li><li> 형광등 모드로 설정 한 후 현미경 센터와 초점 버섯 몸 (MB들)을 가지고. 20X 재 중심과 초점을 조정합니다. </li><li> 팁이되도록 배수 풀 위에 위치 배수 장치는 단지 abov 배수 션트의 높이를 조정전자 수영장, 적절한 배수를 보장하기 위해 30 초 동안 링거액을 실행합니다. </li><li> 빛으로부터 장치를 봉쇄하기 위해 방패를 아래로 당깁니다. 광자 이미 저에서 자동화 된 시스템을 사용하여 초점을 미세 조정과 매크로 블럭의 기준 형광 화상을 받아. </li></ol></li><li> 녹음 <ol><li> 원하는 녹화 속도 (50 밀리 초에서 최대 1 초 또는 그 이상)에 광자의 속도를 조정합니다. 선택 광자 모드와 오픈 셔터. 로그 항목에 기록 유전자형, 성별, 연령, 시료 번호. 투자 수익 (ROI) 상자를 클릭하고 컨트롤을 누른 상태에서 드래그하여 위치 투자 수익 (ROI)의 꽃받침과 세포 기관 (CCB)를 통해 상자와 중간 엽을 조정합니다. </li><li> (필요에 따라) 약 5 ~ 10 분 녹음 기준. </li><li> 1 분 동안 니코틴을 적용합니다. 로그에 시작 / 중지합니다. 5 분 링거액과 함께 씻으십시오. </li><li> 복구를 위해 5 분을 기다린의 KCl에게 로그 항목 및 타이머를 준비합니다. </li><li> 1 분 동안의 KCl을 적용합니다. 로그에 시작 / 중지합니다. 1 분 링거액과 함께 씻으십시오. </li><li> 스위치형광등 모드로, 최종 형광 이미지를 촬영하고, 링거액을 끕니다. </li><li> 를 눌러 &quot;정지&quot;. 대화 상자가 시스템을 차단 요청합니다. &quot;아니오&quot;녹음을 계속 선택합니다. </li><li> 열기 방패, 이동 배수 시스템, 5 배에 스위치 렌즈 목적은, 관류 튜브를 제거합니다. 무대에서 샘플 / 기록 요리를 제거 세척과 물을 두 번 렌즈를 닦아 20X 렌즈를 청소합니다. </li><li> 다음 촬영을 시작 프로그램 창 상단에있는 흰색 재생 버튼을 누릅니다. </li></ol></li></ol> 3. 분석 및 비디오 제작 <ol><li> 광자 값을 추출 <ol><li> 광자 분석 프로그램을 엽니 다 (예를 들면, 광자 뷰어) 열린 첫 번째 샘플 스프레드 시트 파일. </li><li> 디스플레이 제어 탭을 선택합니다. 컨트롤을 누른 상태에서 지역을 클릭하여 투자 수익 (ROI)을 선택합니다. GFP 조명 CCB와 중간 엽을 포함하는 관심 지역의 크기, 방향 및 모양을 조정합니다. </li><li> 또한 추가및 클릭 &quot;투자 수익 (ROI)을 정의&quot;를 클릭하고 새로운 투자 수익 (ROI)을 만들 화면에 끌어 등 투자 수익 (ROI). </li><li> 광자 비디오를 재생할 수있는 &quot;동영상&quot;탭을 선택합니다. 원하는대로 &quot;초 폭&quot;과 &quot;초 단계&quot;를 조정합니다. 투자 수익 (ROI)의 배치가 필요에 따라 조정합니다. </li><li> GFP의 형광, 니코틴 반응과의 KCl 응답의 대표 스크린 샷을 선택합니다. 나중에 분석 및 비교를위한 프리젠 테이션 슬라이드에 자르기 스크린 샷 및 붙여 넣기 이미지. </li><li> &quot;초 폭&quot;과 초 기록 속도를 &quot;초 단계&quot;모두를 조정합니다. 자극 개시 전에 그냥 반응 종료 후 브래킷 영역으로 상단 패널에 회색 마커를 이동하여 분석의 길이를 선택합니다. </li><li> &quot;&gt; PLAY&quot;를 눌러 &quot;&lt;&lt; REW&quot;를 누르십시오 &quot;를 재생하는 동안보기를 일시 중단&quot;을 선택합니다. &quot;속도 차트를 계산&quot;원하는 라인의 색상이 투자 수익 (ROI)의 색상을 일치하도록 장치를 조정 탭을 선택합니다. </li><li> 분석이 완료되면키를 눌러 &quot;수출 속도 데이터를 계산합니다.&quot; 결합 기록의 CCB와 각 측면에서 관심의 중간 엽 영역의 선택 스크린 샷. 응답 이미지 슬라이드로 자르기 스크린 샷 및 붙여 넣기 이미지. 이 슬라이드는 나중에 최종 분석에 사용됩니다. </li></ol></li><li> 예 분석 : 세부 광자 추출 데이터의 분석을위한 하나의 방법 <ol><li> &quot;속도 수출 카운트&quot;폴더에 스프레드 시트 파일을 엽니 다. </li><li> 세포에게 시간과 분으로 시간을 표시하는 첫 번째 열에 표시된 시간을 포맷. </li><li> 샘플에 대한 해당 슬라이드를 참조. 시간과 두 대표의 ROI에 대한 열을 제외한 모든 값을 제거합니다. </li><li> 니코틴 자극 시작 시간을 결정 - 주에서 로그 항목 파일에서 사용할 수있는 시작하거나 하이라이트 값 이전에 추가 데이터를 제거 폴더 -. </li><li> CCB와 중간 엽과 마크 / 강조 모두 최고 / 최대 값을 찾습니다. </li><li> 모두에 대한 응답의 시작 및 종료 시간을 결정에서 시점을 사용하여 견적을 작성하여 CCB와 중간 엽 슬라이드에 응답을 그래프와이 점에 근접한 값의 변화에​​ 의해 실제 값을 선택 대응. CCB와 중간 엽 모두 이러한 점 사이의 영역을 강조 표시합니다. 또한, 9 매크로를 사용합니다. </li><li> 새 스프레드 시트에 한 실험군의 모든 샘플을 결합합니다. </li><li> 로우 값을 결정하여 피크에 맞추고 각 CCB 피크 값이다. 그 샘플 데이터를 다시 복사해야 대략 행 값을 결정하기 위해 가장 높은 로우 값에서 낮은 값을 뺀다. 모든 피크 값이 정렬되어 있는지 확인합니다. </li><li> 시트를 두 번 복사 한 중간 엽 열 또는 만 CCB 또는 중간 엽 값의 페이지를 만드는 CCB 열 중 하나를 삭제합니다. </li><li> 모든 CCB 응답이 끝난 후 데이터를 제거합니다. 4 행은 총 광자, 응답의 길이 (시간), 피크 진폭 및 응답 대기 시간을 표시 만듭니다. 복사하고 원본 아래에 다시 붙여 넣습니다. </li><li>응답 중 총 광자를 결정하기 위해 SUM 함수를 사용합니다. 응답의 길이를 결정하기 위해 COUNT 함수를 사용합니다. 복사 및 피크 진폭 값을 결정하는 가장 높은 값 셀을 연결합니다. COUNT 함수를 사용 - 응답의 시작 니코틴 관류의 선두로부터 선택 - 응답 대기 시간을 결정한다. </li><li> 초 단위로 속도를 기록하여 (모든 피크 진폭 제외) 다중 연결 기능을 사용하여 복사 값. </li><li> 그래서 (예 : 그림 5B, C, D)를 원하는 경우 바 / 박스 그래프 등 총 광자, 피크 진폭 및 응답의 길이로 계산 된 매개 변수에 대해 생성 될 수있다. </li><li> 원시 데이터 광자 응답 후 열에서 평균 함수를 이용하여 각 시점에 대한 원시 데이터 포인트의 평균. 평균 (SEM)의 표준 오차를 결정하는 단계와, 원하는 열 다음 시점에서 평균 광자 값의 각각에 대한 경우. </li><li> 평균 응답 PROFIL를 구성하는 평균 열을 사용CCB 샘플 그룹에 대한 전자 [그래프]. 이 x 축 값과 시간을 지정하는 열과 y 축으로서 평균 광자 값의 열을 선택하고 최종적 산점도 그래프 생성 도구를 선택 할까. </li><li> 중간 엽의 데이터로이 분석 절차를 반복합니다. </li></ol></li><li> 비디오 이미지 만들기 <ol><li> 열기 광자 뷰어. </li><li> 선택 디스플레이 제어 탭을 선택합니다. 선택 제거 및 / 또는 그것을 최소화하기 위해 컨트롤을 유지하면서 투자 수익 (ROI)을 클릭합니다. </li><li> &quot;초 폭&quot;각 프레임의 콘텐츠를 결정하기 위해 원하는대로 (축적 시간)를 수정한다. </li><li> 각 프레임의 오버랩을 정의하기 위해 &quot;초 공정&quot;수정한다. </li><li> 프레스 &quot;&lt;&lt; REW&quot;다음 &quot;재생하는 동안 수출 전망&quot;을 &quot;재생&gt;&quot;를 선택합니다. 비디오 이미지는 .PNG 파일의 일련의 &quot;보기 수출&quot;폴더에 수출됩니다. </li></ol></li><li> 비디오 C위한 하나의 방법 : 가상 신참을 사용하여 비디오를 만들려면자세한 reation <ol><li> 이미지를 포함하는 뷰 수출 폴더에 &quot;resultats&quot;라는 새 폴더를 만듭니다. </li><li> 이미지의 폴더에 스크립트 (renommer.VBS)를 준비한다. </li><li> renommer.VBS 두 번 클릭하여 실행합니다. </li><li> 이미지는 자동으로 숫자로 이름을 변경하고 &quot;resultats&quot;폴더에 복사됩니다. </li><li> 열기 VirtualDub.exe. </li><li> 열려있는 비디오 파일을 선택합니다 - (연속 된 이미지가 자동으로로드됩니다) 첫 번째 이미지를 선택합니다. </li><li> 선택 비디오 - 원하는대로 선택 프레임 속도 조정. </li><li> 선택 비디오 - 선택 압축 반경으로 Cinepak이 코덱을 선택합니다. </li><li> 파일에서 동영상이 자동으로 생성됩니다 AVI로 저장을 선택합니다. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Martin, J. -R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+brain+imaging%3A+fluorescence+or+bioluminescence%2C+which+to+choose%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurogenet%22%5BJournal%5D)">In vivo brain imaging: fluorescence or bioluminescence, which to choose.</a> J Neurogenet. 22 (3), 285-307 (2008).</li>
<li>Shimomura, O., Johnson, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxidized+coelenterazine%2C+the+active+group+in+the+photoprotein+aequorin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Peroxidized coelenterazine, the active group in the photoprotein aequorin.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 75 (6), 2611-2615 (1978).</li>
<li>Shimomura, O., Johnson, F. H., Saiga, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Further+data+on+the+bioluminescent+protein%2C+aequorin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Comp.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Further data on the bioluminescent protein, aequorin.</a> J. Cell. Comp. Physiol. 62 (1), 1-8 (1963).</li>
<li>Baubet, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+green+fluorescent+protein-aequorin+as+bioluminescent+Ca2%2B+reporters+at+the+single-cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Chimeric green fluorescent protein-aequorin as bioluminescent Ca2+ reporters at the single-cell level.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 97 (13), 7260-7265 (2000).</li>
<li>Cabrero, P., Richmond, L., Nitabach, M., Davies, S. A., Dow, J. A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+biogenic+amine+and+a+neuropeptide+act+identically%3A+tyramine+signals+through+calcium+in+Drosophila+tubule+stellate+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">A biogenic amine and a neuropeptide act identically: tyramine signals through calcium in Drosophila tubule stellate cells.</a> Proc. Biol. Sci. 280 (1757), 20122943(2013).</li>
<li>Leclerc, C., Webb, S. E., Daguzan, C., Moreau, M., Miller, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+patterns+of+calcium+transients+during+neural+induction+in+Xenopus+laevis+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Imaging patterns of calcium transients during neural induction in Xenopus laevis embryos.</a> J. Cell Sci. 113 (19), 3519-3529 (2000).</li>
<li>Martin, J. -R., Rogers, K. L., Chagneau, C., Brûlet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+bioluminescence+imaging+of+Ca2%2B+signalling+in+the+brain+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In vivo bioluminescence imaging of Ca2+ signalling in the brain of Drosophila.</a> PLoS One. 2 (3), e275(2007).</li>
<li>Murmu, M. S., Stinnakre, J., Martin, J. -R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+Ca2%2B+stores+contribute+to+odor-induced+responses+in+Drosophila+olfactory+receptor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Presynaptic Ca2+ stores contribute to odor-induced responses in Drosophila olfactory receptor neurons.</a> J. Exp. Biol. 213 (24), 4163-4173 (2010).</li>
<li>Murmu, M. S., Stinnakre, J., Réal, E., Martin, J. -R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-stores+mediate+adaptation+in+axon+terminals+of+Olfactory+Receptor+Neurons+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Calcium-stores mediate adaptation in axon terminals of Olfactory Receptor Neurons in Drosophila.</a> BMC Neurosci. 12, 105(2011).</li>
<li>Pavot, P., Carbognin, E., Martin, J. -R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PKA+and+cAMP%2FCNG+channels+independently+regulate+the+cholinergic+Ca2%2B-response+of+Drosophila+mushroom+body+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">PKA and cAMP/CNG channels independently regulate the cholinergic Ca2+-response of Drosophila mushroom body neurons.</a> eNeuro. 2 (2), 0054-0068 (2015).</li>
<li>Minocci, D., Carbognin, E., Murmu, M. S., Martin, J. -R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+functional+calcium+imaging+of+induced+or+spontaneous+activity+in+the+fly+brain+using+a+GFP-apoaequorin-based+bioluminescent+approach%5BTitle%5D)+AND+%22BBA-Mol+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">In vivo functional calcium imaging of induced or spontaneous activity in the fly brain using a GFP-apoaequorin-based bioluminescent approach.</a> BBA-Mol Cell Res. 1833 (7), 1632-1640 (2013).</li>
<li>Lima, S. Q., Miesenböck, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remote+control+of+behavior+through+genetically+targeted+photostimulation+of+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Remote control of behavior through genetically targeted photostimulation of neurons.</a> Cell. 121 (1), 141-152 (2005).</li>
<li>Shimomura, O., Musicki, B., Kishi, Y., Inouye, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-emitting+properties+of+recombinant+semisynthetic+aequorins+and+recombinant+fluorescein-conjugated+aequorin+for+measuring+cellular+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Light-emitting properties of recombinant semisynthetic aequorins and recombinant fluorescein-conjugated aequorin for measuring cellular calcium.</a> Cell Calcium. 14 (5), 373-378 (1993).</li>
<li>Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signalling%3A+dynamics%2C+homeostasis+and+remodelling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Bio%22%5BJournal%5D)">Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling.</a> Nat Rev Mol Cell Bio. 4 (7), 517-529 (2003).</li>
<li>Fiala, A., Spall, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+calcium+imaging+of+brain+activity+in+Drosophila+by+transgenic+cameleon+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+STKE%22%5BJournal%5D)">In vivo calcium imaging of brain activity in Drosophila by transgenic cameleon expression.</a> Sci STKE. 2003 (174), PL6(2003).</li>
<li>Wang, J. W., Wong, A. M., Flores, J., Vosshall, L. B., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+calcium+imaging+reveals+an+odor-evoked+map+of+activity+in+the+fly+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain.</a> Cell. 112 (2), 271-282 (2003).</li>
<li>Wilson, R. I., Turner, G. C., Laurent, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+Olfactory+Representations+in+the+Drosophila+Antennal+Lobe%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Transformation of Olfactory Representations in the Drosophila Antennal Lobe.</a> Science. 303 (5656), 366-370 (2004).</li>
</ol>

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Cabrero 등의 알에보고 여기에 제시된 최근에 개발 된 생물 발광 기반 GFP - 쿼린 접근 방식은 신장 별 모양의 세포와 같은 세포의 다른 종류뿐만 아니라 원하는 것처럼, 다른 신경 세포에 칼슘 -activity의 생체 내 기능을 녹음 할 수 있습니다. 2013 년 5. 수정, 문제점 해결, 추가 구성 요소, 그리고 중요한 단계 초파리 축산 GFP - 쿼린 유전자 (pG5A) (4)는 3 개의 독립적 인 형질 전환 라인 (6)을 만들 pUAST 벡터에 삽입 하였다. 모든 라인들은 생물 발광 시험을하고, 모든 생체 내 <s...

기본적인 패턴과 뇌와 분리 된 구조 내에서 활동의 기능은 긴 신경 과학 분야 내에서 강렬한 연구의 영역이었다. 아마도 이러한 문제를 해결하는 데 이른 성공적인 방법 중 일부는 전기적 활성도의 변화를 직접 생리적 측정 하였다 -에 추가 기능을 가져왔다 (활동 프록시와 같은) 전압의 pH 또는 칼슘 농도의 변화의 라이브 영상을 허용하지만 다른 방법은 신경 활동 1의 연구. 이미징 기술은 감소 된 침습성 및 뇌 전체 구조물 내에 활동을 모니터하는 등의 장점을 가지고 다양한. 또한 과일을 포함하여 다루기 쉬운 유전학과 동물에 초파리, 같은 카멜레온, GCaMPs 등과 같은 유전자 인코딩 칼슘 지표의 개발을 비행 한 단일 신경 세포, 신경 세포의 인구 및 전체 뇌를 모니터링하는 연구를 허용 한구조. 전통적인 형광 칼슘 이미징 방법 (칼 모듈 린에 융합 CFP와 YFP) (칼 모듈 린에 융합 GFP) 또는 FRET을 GCaMPs를​​ 사용하는 동안 좋은 공간 및 시간 해상도를 제공하는 유용한 기술을 입증 한 빛 여기의 기본 프로세스는 실험에 몇 가지 제한을 낳는다 응용 프로그램. 이에 의한 묘화 될 수 구조물의 깊이를 제한 불가피하게 생성되는 여기 광, 형광도, 광 표백제 및 광독성의 특성에, 녹화 시간뿐만 아니라 기록 실시간 연속성. 즉, 이러한 기록은 종종 바람직하지 않은 부작용을 방지하기 위해 간헐적으로 수행되어야한다. 이러한 어려움 때문에, 칼슘의 이미징 추가적인 다른 방법이 개발되었다. 가장 유망한 방법 중 하나는 칼슘 결합 후 효소 반응을 통해 제조 된 광 생물 발광 이미징에 의존한다. BioluminescenT 영상은 기존의 칼슘 이미징과 같은 문제가 발생하지 않습니다 결과적으로 빛 자극을 필요로하지 않습니다. 발광 생물 기자 쿼린 - 빅토리아 (Aequorea victoria)로부터 격리 λ (GFP는 isolated-되었던 같은 해파리는 세 EF 손 구조를 통해 칼슘을 결합하여 그 보조 인자의 코 엘렌 테라의 산화와 푸른 빛의 방출로 이어지는 구조적인 변화를 겪게 = 469 ㎚) 2,3. 에 쿼린은 거의 배경 잡음을 생성 및 세포 내 칼슘 버퍼링 시스템 (4)과 간섭하지 않기 때문에 칼슘 과도 모니터링 이상적 칼슘 (K의 D = 10 μM)에 대한 매우 낮은 친화도를 갖는다. 쿼린 나란히 Xenopus의 달걀 5 제조 비추어 신경 유도의 과정을 모니터링하는 데 사용되었지만, 신경 세포 활성도의 실시간 영상에 사용하기에 너무 희미하다. 이 도전 필립 브롬 및 해결하기위한 노력# 251; 파스퇴르 연구소의하자 동료들은 해파리 4에서 기본 상태를 모방, GFP 융합 유전자를 쿼린 유전자 구조를 만들었습니다. 이 융합 유전자 생성물은 GFP에 비방 에너지 전송 엘렌 테라, 산화 선도 형태 적 변화를 겪게 쿼린의 세 EF 손 구조를 통해 다시 칼슘을 결합한다. 대신 쿼린에서 푸른 빛의 GFP에서 녹색 빛 (λ = 509 ㎚)의 릴리스에서이 에너지 전달의 결과. GFP 및 쿼린의 융합은 혼자 4 쿼린보다 19-65 배 더 밝은 융합 단백질 생산 등을 돕는 큰 단백질의 안정성을 부여한다. 뇌 내의 생물 발광 방식을 사용하는 것은 연속적인 기록 기간 및 기록 할 수있다 뇌 내의 구조의 수의 관점에서 모두 칼슘 이미징 실험의 전류 프로그램을 확장한다. 대체로 기존 연구의 맥락에서 그것은 그 두 세계와 더 큰 의미뇌의 지역화 &quot;활동&quot;의 다양한 (칼슘 과도의 프록시를 통해) 모니터링 할 수 있습니다. 더 중요한 활성 용이 뇌 기저 함수의 완전한 이해를 추구라는 것으로 실시간으로 지속적에서는 이상을 감시 할 수있다. 지난 몇 년간, 본 연구실 및 다른 바이너리 발현 시스템의 통제하에 GFP-쿼린 (GAL4 / UAS-GFP-쿼린) -5,6- 발현 형질 전환 초파리을 개발 하였다. 우리는 직접 니코틴 응용 프로그램 (9)에 의해 아세틸 콜린 수용체 자극 다음 버섯 몸에 칼슘 -activity 변조 등의 향기 7, 8 등의 천연 자극뿐만 아니라 공부 세포 성분에 의해 생성 된 기록 활동에 GFP - 쿼린 생물 발광을 사용했습니다. 또한, 우리는 또한 장기간 같은 이전 해결 될 수 없었다 실험 질문들을 해결하기 위해 GFP-쿼린을 사용한자연 칼슘 과도 깊은 뇌 구조 (10)의 시각화의 영상. 더 최근에, 우리는 포유류 ATP 수용체 P2X 2 11 프로젝션 뉴런 양이온 채널 (PN 수)를 표현하는 GAL4 / UAS 시스템을 사용하고 (MB247-LEXA를 버섯 체에서 GFP-쿼린을 표현 LEXA 시스템을 사용한, 13XLexAop2-IVS-G5A-BP) (B. 파이퍼, Janelia 농장, 미국)의 의례. 이것은 우리가 같은 냄새 자극에 대한 반응으로 자연 조건을 모방 차례로 버섯 기관 (PN이의 다운 스트림 대상)를 활성화 ATP의 응용 프로그램에 의해 PN을 활성화 할 수있다. 전반적으로이 P2X이 결합 기술과 GFP - 쿼린은 실험 가능성을 확장합니다. 넓게는 다른 자극과 섭동 활동의 기저 패턴을 변경할 수있는 새로운 방법에 대한 연구를 시작,보다 뇌 활동의 패턴을 이해할 수있는 기회를 제공한다.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>시그마-알드리치</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Merck</td><td>1023911000</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>시그마-알드리치</td><td>7365-45-9</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>prolabo</td><td>26 764.298</td><td>normapur</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>prolabo</td><td>25 108.295</td><td>normapur</td></tr><tr><td>자당</td><td>시그마-알드리치</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>니코틴</td><td>시그마-알드리치</td><td>N3876</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>시그마-알드리치</td><td>A2383</td><td>아데노신 5&프라임;-트리포스페이트 디소듐 염 수화물</td></tr><tr><td>벤질-코엘렌테라진</td><td>프롤룸, 나노라이트&nbsp;</td><td>고양이 #301 Coelenterazine h</td><td>http://www.prolume.com/</td></tr> <tr><td>치과 접착제</td><td>3M ESPE&trade;</td><td>46954</td><td>Protemp IV</td></tr><tr><td>실리콘 접착제</td><td>3M ESPE&trade;</td><td>36958</td><td>Express 2 Regular Body Quick</td></tr><tr><td>tape</td><td>3M Scotch</td><td>122s</td><td>3M Scotch Magic Tape</td></tr><tr><td>피펫 팁</td><td>Corning Incorporated</td><td>4868</td><td>100-1,000 &micro; l Univesal 피펫 팁</td></tr><tr><td>챔버 및 홀더 (스테이지)</td><td></td><td></td> <td>수제</td></tr><tr><td>인큐베이션 박스</td><td></td><td></td><td>핸드 메이드</td></tr><tr><td>펜치 (No. 5)</td> <td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td>마이크로 해부 펜치</td></tr><tr><td>곡선 펜치</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4142</td><td>마이크로 해부 펜치</td></tr><tr><td>접착제 애플리케이터&nbsp;</td><td></td><td></td><td>수제&nbsp;</td></tr><tr><td>나이프</td><td>파인 사이언스 도구</td><td>10316-14</td><td>5mm 깊이 15도; 찌르기</td></tr><tr><td>EM-CCD 카메라&nbsp;</td><td>Andor</td><td>DU-897E-CS0-#BV</td><td>iXon (-80으로 냉각&deg; C)</td></tr><tr><td>현미경</td><td>Nikon</td><td></td><td>Eclipse-E800</td></tr><tr><td>몰입 대물 렌즈</td><td>Nikon</td><td></td><td>20X Fluor .5w</td></tr><tr><td>해부 현미경 형광</td><td>Leica MZ Fl III</td><td></td><td>라이카 해부 스코프 및 형광 램프</td></tr><tr><td>타이트 다크 박스</td><td>Science Wares</td><td></td><td>맞춤 제작 Science</td></tr><tr><td>Wares 연동 펌프&nbsp;</td><td>Gilson</td><td></td><td>Minipuls 2</td></tr><tr><td>튜빙</td><td>Fisher Scientific</td><td>은 두께에 따라</td><td>다릅니다 Tygon R3603, St-Gobain</td></tr><tr><td>관류 시스템</td><td>Warner</td><td>64-0135 &nbsp;( VC-66CS)</td> <td>관류 밸브 제어 시스템, 완전, 핀치 밸브, 6 채널</td></tr><tr><td>관류 조절기</td><td>Leventon</td><td>201108</td><td>Dosi-flow 3</td></tr><tr><td>측정 및 자동화 탐색기</td><td>과학 상품 및 내쇼날인스트루먼트</td> N<td>/A</td><td>소프트웨어</td></tr><tr><td>http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380 광자 이미저&nbsp;</td><td>과학 용품 & National Instruments</td><td>N/A</td><td>소프트웨어 http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380</td></tr><tr><td>광자 뷰어</td><td>Science Wares & National Instuments</td><td>N/A</td><td>소프트웨어 http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380</td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td>N/A</td><td>소프트웨어 https://www.microsoft.com</td></tr><tr><td>가상 더빙</td><td>오픈 액세스&nbsp;</td><td>N/A</td><td>소프트웨어 http://virtualdub.sourceforge.net/</td></tr> <tr><td>UAS-GA2</td><td>Martin et al., 2007, Ref. 1&nbsp;</td><td>N/A</td><td>{현재} 공개적으로 사용할 수 있는 주식 없음&nbsp;</td></tr><tr><td>pJFRC65-13XLexAop2-IVS-G5A-BP&nbsp; &nbsp;</td><td>B. 파이퍼, 자넬리아 농장, 미국 애슈번.&nbsp;</td><td>(재고 #1117340)</td><td>pfeifferb@janelia.hhmi.org</td></tr><tr><td>P2X2</td><td>Lima and Misenboeck, Ref. 11&nbsp;</td><td>N/A</td><td>{현재} 공개적으로 사용할 수 있는 주식 없음&nbsp;</td></tr><tr><td>OK107</td><td>블루밍턴 스톡 센터</td><td>854</td><td>http://flystocks.bio.indiana.edu/</td></tr></tbody></table>

발광 생물 칼슘 표시 gfp - 쿼린을 기반으로 생체 기능성 뇌 영상의 접근 방식

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

생체 내 이미징 기능은 기능과 뇌 세포와 관심의 구조의 생리를 연구 할 수있는 강력한 방법이되고있다. 최근 발광 생물-GFP 리포터 쿼린 (GA)을 사용 -imaging 칼슘의 새로운 방법이 개발되었다. 그 팩터 코 엘렌 테라의 첨가 - - 광자 수집기를 통해 모니터링 할 수 밝은 발광을이 새로운 기술은 칼슘과 결합 할 수있는 분자의 제조, 및 GFP 쿼린 유전자 융합에 의존한다. GFP-쿼린 유전자를 운반하는 형질 전환 계통은 마우스 및 초파리 모두에 대해 생성되었다. 초파리, GFP-쿼린 유전자는 뇌 내에서 표적 발현 및 이미징을 허용 GAL4 / UAS 진 발현 시스템의 통제하에 놓여있다. 이 방법은 연속적으로 검출 할 수있는 것으로 나타났습니다 모두 칼슘 안쪽 2+ -transients과 칼슘은 내 상점에서 -released. 가장 중요한 점은 연속 촬영, 뇌 내에서 더 깊이에서 영상에 더 큰 기간 동안 허용하고, (8.3 밀리 초까지) 높은 시간 해상도로 기록. 여기에서 우리는 기록하고 칼슘에게 버섯 기관 내에서 2 + -activity, 플라이 뇌의 학습과 기억의 중심 구조를 분석하는 생물 발광 영상을 사용하기위한 기본적인 방법을 제시한다.

쿼린에 GFP의 융합은 우리가 현미경 (그림 3A, 4A, 6A, 6E)에 형광 모드에서 GFP의 여기를 통해 이전에 생물 발광 영상에 관심이 우리 지역을 시각화 할 수 있습니다. 버섯 체를 자극하는 가장 간단한 방법 중 하나는 이온 성 니코틴 성 아세틸 콜린 수용체의 활성화를 통해서이다. 아세틸 콜린이 수용체의 내인성 리간드이지만 우리는 니코틴이 버섯 몸에 더 재현 반응을 생산하는 것으로 나타났습니다. 그들은 특히 니코틴 성 아세틸 콜린 수용체를 발현하고, 따라서 니코틴을 이용하여 우리가 다른 뇌에서 발현 무스 카린 성 아세틸 콜린 수용체의 활성화를 방지 할 수 있기 때문 부분이다. 더욱이, 니코틴 아세틸 콜린보다 안정적이고, 따라서,보다 효율적이고 신뢰성있는 자극 제어를 허용한다. 전형적인 응답은 (그림 4 참조 꽃받침, 세포 기관 (CCB)과 중간 엽 (ML) 모두의 빠른 활성화로 시작표지 이미지). 일반적 CCB 응답 길게 지속되고 응답 순차 패널에 도시 된 ...

여기서 우리는 발광 생물 기자를 사용하는 방법을 -imaging 소설 칼슘 2+ 제시한다. 이 방법은 칼슘 결합과 광 자극에 대한 필요성을 제거, 발광 구조물의 융합 GFP-쿼린을 이용한다. 중요한 것은이 방법은 깊은 뇌 구조와 높은 시간 해상도로 긴 연속 촬영, 접근을 허용한다.

발광 생물 칼슘 표시 GFP - 쿼린을 기반으로 생체 기능성 뇌 영상의 접근 방식

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

생물 발광 이미징의 전반적인 목표는 생체 내 기능성 칼슘 과도 현상, 활동의 대용물, 더 오랜 기간 동안, 그리고 뇌 심부 구조를 이미지화하는 것입니다. 이 방법은 수면 중 파리 뇌의 기초 활동이 어떻게 보이는지와 같은 신경 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 레이저를 사용하여 여기가 필요하지 않다는 것입니다.이를 통해 고전적인 칼슘 이미징에 비해 광표백 및 독성 없이 조직 깊숙한 곳까지 일시적인 칼슘을 이미지화할 수 있으며, 더 오랜 기간 동안 사용할 수 있습니다. 이 방법은 초파리의 기초 뇌 활동에 대한 통찰력을 제공할 수 있으며 마우스와 같은 다른 모델 유기체에도 사용할 수 있습니다. 시작하려면 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 관심 있는 drosophila melanogaster 라인과 실험 솔루션을 준비합니다.그런 다음 단일 초파리를 얼음 위의 유리 유리병에 2분 동안 옮겨 얼음 마취합니다. 다음으로, 파리를 식힌 페트리 접시로 옮기고 집게를 사용하여 팁이 약 35도의 각도가 되도록 다듬은 1000마이크로리터 피펫 팁 안에 파리를 부드럽게 놓습니다. 브러시를 사용하여 머리가 끝의 가장자리를 완전히 지나고 등쪽 영역이 부분적으로 노출되도록 각 파리를 부드럽게 밀고 정렬합니다.그런 다음 머리에서 피펫 끝 가장자리까지 준비된 치과용 접착제를 바르십시오. 정수리를 피하도록 각별히 주의하십시오. 머리를 올바른 위치에 고정하는 것이 성공적인 해부 및 이미징을 위해 필수적이기 때문에 머리를 접착하는 것이 중요합니다.또한 접착이 불량하면 링거 용액이 누출되고 이미징 전에 샘플이 사멸됩니다. 다음으로, 파리가 부착된 피펫 팁을 기록 챔버의 구멍을 통해 놓고 부드럽게 눌러 제자리에 고정합니다. 그런 다음 준비된 실리콘 접착제를 사용하여 누출을 방지하기 위해 피펫 팁과 만나는 챔버의 평평한 면을 고정합니다.풍성한 채널, 짧은 가장자리 및 챔버 뒤쪽까지 확장되는 탭 조각을 부착합니다. 다음으로, 파리가 있는 챔버를 현미경 아래에 놓고 형광등을 켭니다. 그런 다음 링거 용액 1ml를 챔버에 피펫으로 주입합니다.가는 수술용 칼을 사용하여 파리의 머리 뒤쪽에서 양쪽 앞부분까지 평행하게 절개합니다. 그런 다음 눈의 가장자리를 따라 자르고 이전 절개 부위를 연결하는 안테나 위에 수직 절개를 만듭니다. 머리 뒤쪽을 마지막으로 절개한 다음 가늘고 날카로운 집게를 사용하여 큐티클을 제거합니다.뇌와 형광을 발하는 버섯 몸체가 명확하게 보일 때까지 노출된 호흡기 조직을 부드럽게 잡고 제거합니다. 다음으로, 매우 날카로운 집게를 사용하여 뇌를 덮고 있는 신경 상피 조직을 조심스럽게 잡고 꼬집어 제거하여 코엘렌테라진이 침투할 수 있도록 합니다. 피펫을 사용하여 1ml의 링거 용액으로 조직을 두 번 세척하여 해부에서 남은 파편을 제거한 다음 샘플을 어두운 상자에 넣습니다.다음으로, 5마이크로몰의 벤질-코엘렌테라진(benzyl-coelenterazine)이 함유된 링거 용액 1ml를 챔버에 피펫으로 주입합니다. 상자를 닫고 샘플을 실온에서 최소 2시간 동안 배양합니다. 컴퓨터에서 현미경을 켜는 것으로 시작합니다.또한 카메라를 섭씨 영하 80도로 식히십시오. 그런 다음 배수 시스템을 설정하고 환경 제어 장치를 섭씨 20도로 조정합니다. 그런 다음 Photon Imager를 열고 새 폴더를 만든 다음 첫 번째 녹음의 이름을 지정합니다.그런 다음 염화칼륨, 니코틴 및 링거 용액을 각각의 저장소에 추가하여 풍량 시스템을 설정합니다. 각 용액이 분당 2밀리리터로 방전되도록 흐름을 조정합니다. 다음으로, 샘플을 현미경 아래의 마운트에 놓고 배율을 5X로 조정합니다.그런 다음 펑크를 통해 채널에 풍력 튜브를 삽입합니다. 현미경을 형광등 모드로 설정한 다음 버섯 몸체를 중앙에 놓고 초점을 맞춥니다. 버섯 몸체에 초점이 맞춰지면 배율을 20X로 변경합니다.이미지를 다시 중앙에 맞추고 초점을 조정합니다. 그런 다음 배수 장치를 배수 풀 위에 놓고 배수 션트의 높이를 조정하여 팁이 배수 풀 바로 위에 오도록 합니다. 그런 다음 링거 용액으로 샘플을 30초 동안 세척하여 적절한 배수 상태를 확인합니다.마지막으로 실드를 아래로 당겨 외부 조명으로부터 장치를 밀봉합니다. 광자 이미저 프로그램의 자동화 시스템을 사용하여 초점을 미세 조정하고 버섯 몸체의 참조 형광 이미지를 촬영합니다. 광자 속도를 원하는 기록 속도로 조정하며, 이는 50밀리초마다 하나의 이미지에서 초당 1개 또는 그 이상이어야 합니다.그런 다음 광자 모드를 선택하고 셔터를 엽니다. 그런 다음 로그 항목에 유전자형, 성별, 연령 및 샘플 번호를 입력합니다. 꽃받침, 세포체 및 내측 엽 위에 있는 관심 영역 상자의 위치를 조정하려면 상자를 클릭하고 컨트롤을 누른 상태에서 해당 위치로 드래그합니다.이제 약 5분에서 10분 동안 기준 값을 기록합니다. 그런 다음 스위치를 켜서 니코틴의 흐름을 시작합니다. 동시에 Enter 키를 누르고 니코틴의 흐름이 시작되었음을 나타내는 메모를 추가합니다.1분 후 흐름을 중지하고 흐름이 중지되었음을 나타내는 로그에 다른 메모를 만듭니다. 그런 다음 링거 용액으로 샘플을 5분 동안 세척합니다. 샘플이 회복되는 동안 세척을 끄고 타이머를 5분 더 설정한 다음 염화칼륨의 흐름을 시작할 준비를 합니다.시작할 준비가 되면 염화칼륨의 흐름을 시작하고 100밀리몰 염화칼륨 시작"을 샘플 로그에 입력합니다. 1분 후 흐름을 중지하고 염화칼륨 차단"을 샘플 로그에 입력합니다. 그런 다음 링거 용액으로 샘플을 1분 동안 세척하고 현미경을 형광 모드로 전환합니다.최종 형광 이미지를 촬영한 다음 링거 용액을 끄고 샘플을 제거합니다. 분석 프로그램에서 첫 번째 파일을 열고 디스플레이 컨트롤"탭을 선택한 다음 ROI를 클릭합니다. 그런 다음 control을 누른 상태에서 관심 영역을 선택합니다.다음으로, GFP 조명 꽃받침 및 세포체, 내측엽을 포함하도록 ROI의 크기, 방향 및 모양을 조정합니다. 모든 관심 영역이 추가되면 영화 "탭을 선택하여 Photon 비디오를 재생합니다. 두 번째 너비와 두 번째 단계를 원하는 대로 조정합니다.그런 다음 필요에 따라 ROI 배치를 다시 조정하여 비디오의 활성 영역 내에 유지되도록 합니다. GFP 형광, 니코틴 반응 및 염화칼륨 반응의 대표적인 스크린샷을 선택합니다. 그런 다음 스크린샷을 자르고 나중에 분석하고 비교할 수 있도록 대표 이미지를 프레젠테이션 슬라이드에 붙여넣습니다.두 번째 너비와 두 번째 단계를 모두 녹음 속도(초)로 조정합니다. 또한 상단 패널의 회색 마커를 괄호 안의 영역으로, 자극 시작 전과 반응이 끝난 직후로 이동하여 분석 길이를 선택합니다. 그런 다음 재생 중인 동안 일시 중단 보기를 선택한 다음 되감기 버튼을 눌러 비디오 재생을 처음으로 재설정한 다음 재생 버튼을 누릅니다.그런 다음 탭 수 비율 차트"를 선택하여 단위를 조정하고 관심 영역의 색상과 원하는 선 색상을 조정하십시오. 분석이 완료되면 카운트 비율 데이터 내보내기를 선택합니다. 그런 다음 꽃받침과 세포체의 결합된 기록과 각 측면의 내측 엽 영역의 기록을 선택하고 해당 이미지를 반응 이미지와 함께 슬라이드에 붙여넣습니다.버섯체를 자극하는 가장 간단한 방법 중 하나는 이온성 니코틴성 아세틸콜린 수용체를 활성화하는 것입니다. 여기에 표시된 25마이크로몰 니코틴에 대한 일반적인 반응은 꽃받침과 세포체, 내측엽의 빠른 활성화로 시작하여 칼슘에 결합하고 빛을 방출하는 융합된 GFP-aequorin 구조를 사용합니다. 일반적으로 꽃받침과 세포체의 반응은 더 오래 지속되며 반응의 순차적 패널에서 볼 수 있듯이 엽보다 더 큰 생물 발광 반응을 나타냅니다.시간 경과에 따른 니코틴 활성화에 대한 생물 발광 반응의 샘플 기록이 이 그래프로 설명되며, 여기서 꽃받침과 세포체를 포함하는 관심 영역의 광자 수는 검은색으로 그래프로 표시되고, 내측 엽 영역 내의 광자 수는 빨간색으로 표시됩니다. 이 그래프에서 응답의 길이, 응답 중 최대 광자 값, 각 곡선 아래의 총 면적을 모두 결정할 수 있습니다. 일단 숙달되면 준비 단계는 파리의 수에 따라 부화 2시간 전에 밖에 걸리지 않습니다.또한 각 녹음은 제대로 수행되면 20분 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 샘플 간의 재현성을 보장하기 위해 플라이 스톡을 적절하게 노화하고 보관하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 구조물의 활동이 특정 동작에 미치는 영향과 같은 추가 질문에 답하기 위해 추가 행동 테스트를 수행할 수 있습니다.이 기술의 개발은 신경생물학 분야의 연구자들이 초파리 뇌의 장기적인 신경 활동을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 파리 뇌에서 생물 발광 이미징을 위한 샘플을 준비하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 니코틴은 건강에 해로울 수 있다는 것을 잊지 마십시오.이 절차에서 용액을 준비하거나 청소할 때 장갑과 같은 예방 조치를 취해야 합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

의 연결을 네트워크를 개발 자발적인 활동은 칼슘에 민감한 지표 염료의 AM - 에스테르 양식을 사용하여 측정할 수 있습니다. 의 연결을 활성화를 나타내는 세포 내 칼슘의 변화는 하나 또는 두 개의 광자 이미징과 형광 표시기에 일시적 변화로 감지됩니다. 이 프로토콜은 발달 종속의 연결 네트워크의 범위에 대해 적용할 수...

두피 네트워크 개발에 기능성 칼슘 이미징

이 프로토콜에서는, 우리는 영상 칼슘의 최근 진행 상황을...

Hypothalamic 마우스 뇌 슬라이스의 GFP 태그 뉴런의 영상 칼슘 응답

출처: Lark, A. R., et. al., 생물 발광 칼슘 지표 GFP-aequorin을 기반으로 한 생체 내 기능적 뇌 이미징 접근 방식. J. Vis. Exp. (2016)이 비디오는 Green을 사용한 칼슘 역학의 실시간 이미징을 보여줍니다. 초파리 심부 뇌 구조에서의 형광 단백질-aequorin 생물 발광.

초파리 뇌 구조에서 칼슘 과도 현상을 연구하기 위한 생물 발광 이미징

작은 투명 몸, 잘 문서화 neuroanatomy 및 의무 유전자 기술과 시약의...

C.의 생체 Neuronal 칼슘 이미징에서 elegans

노화 시 세포 내 Ca2+ 리모델링은 흥분 독성 및 뉴런 손상에 기여할 수 있으며, 이는 Ca2+ 과부하에 의해 매개되는 과정입니다. 우리는 신경 노화 모델인 쥐 해마 뉴런의 장기 배양에서 세포질 및 미토콘드리아 Ca2+의 형광 및 생물 발광 이미징을 사용하여 노화 뇌의 Ca2+ 리모델링을 조사하는 것을 목표로 했습니다.

하는 세포 칼슘의 형광 및 생물 발광 영상<sup&gt; 2 +</sup&gt; 노인 해마 신경 세포에서

이 종이 초파리 뇌의 칼슘 이미징 비보 전 프로토콜을 설명합니다. 이 방법에서는, 천연 또는 합성 화합물은 뇌의 특정 신경 세포를 활성화 하는 능력을 테스트 하는 버퍼에 적용할 수 있습니다.

전 비보 내 분 비 신호 초파리 에 두뇌 응답을 시각화 칼슘 이미징

여기 이미지 칼슘 murine neuromuscular 접속점에 개별 셀 종류의 인구에 있는 신호 프로토콜 선물이.

전 비보 마우스 다이어 프 램의 같은 시 냅 스에서 신호 세포 특정 칼슘의 이미징

이 프로토콜은 다중 섬유 광도 측정 기록을 구현하고 수행하는 방법, 칼슘 독립적 인 아티팩트를 수정하는 방법 및 이중 색상 광도계 이미징에 대한 중요한 고려 사항을 자세히 설명합니다.

자유롭게 움직이는 동물의 신경 활동을 기록하는 다중 섬유 광도 측정법

이 프로토콜은 마취마우스에 있는 가까운 혈관에서 백혈구 및 혈류 데이터를 심신하는 두뇌에서 형광 칼슘 심상을 취득하고 분석하는 단계를 제시합니다. 이러한 기술은 벽화 세포 생리학의 연구에 유용하며 모든 세포 유형의 칼슘 과도를 조사하기 위해 적응 할 수 있습니다.

생체 내 트랜스제닉 마우스의 뇌 성 구체 칼슘 및 혈역학 이미징

시냅스 전달에 필요한 세포하 이벤트를 시각화하기 위해 두 가지 관련 방법이 설명된다. 이들 프로토콜은 시험관내 배양된 뉴런의 라이브 세포 이미징을 사용하여 시냅스 전 칼슘 유입 및 시냅스 소포막 융합의 역학의 실시간 모니터링을 가능하게 한다.

근위축성 측삭 경화증 모델에서 시냅스 기능의 실시간 형광 측정

여기에서는 컨포칼 현미경을 사용하여 GCaMP 칼슘 지표를 발현하는 형질전환 제브라피쉬의 뇌 영역에서 신경 활동을 조사하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다.

생체 내 부분적으로 구속된 유충 제브라피시에서 감각 자극에 의해 유도된 신경 활동의 공초점 형광 이미징

배우세요 GFP-쿼린 생체 발광 칼슘 영상 기법으로 Drosophila melanogaster 뇌 심층 구조의 장기 신경 활동을 관찰하는 방법을. 레이저 여기 없이 광표백과 독성을 피하며 수면 중 기저 뇌 활동을 연구할 수 있습니다.

발광 생물 칼슘 표시 GFP - 쿼린을 기반으로 생체 기능성 뇌 영상의 접근 방식

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