Name: 내생의 면역 형광 분석 및 외인성 센트로 - 동원체 단백질 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 35 s
Description: 학습하세요 인간 세포에서 간접 면역형광법을 이용한 내생성 및 외인성 센트로미어-키네토코어 단백질의 정량화와 국소화 최적화 방법을. 이 기법은 세포 분열 단계별 단백질 발현 수준을 정밀하게 분석할 수 있습니다.

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이 작품은 NIH 부여 GM68418에 의해 지원되었다.

저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.

최근 몇 년 동안 많은 연구가 고정 된 세포에 대해 서로 다른 양적 현미경 분석법을 개발 하였다. (42) 진행을 센트로 - 동원체 생물학에 자주 세포 내 공간 - 시간 규제의 변화하는 기능을 반영하고있는 단백질의 센트로 별 또는 동원체 특정 기능에 대한 이해가 필요 세포주기 중에 이러한 단백질. 따라서, 우리가 IIF 염색 구체적으로 다르​​게 취급 샘플에 적용 할 수있는 내인성 및 외인성 CENP-A 단백질의 상대적인 수준을 분석하는 정량적 IIF 분석 방법을 개발했다. 현재 우리는이 연구에서 프로토콜 2를 사용하여 내생 CENP-I, CENP-H, KNL1, Hec1 및 Ska1의 성공적인 IIF 염색을 달성 (. Niikura 등 (24)와 데이터가 표시되지 참조; 재료 / 장비의 목록을 항체의 내용) . 미래에는, 하나의 (상이한 센트로-동원체 단백질의 수준을 정량화하기 endog을 모두 동일한 방법을 적용 할 수있다특정 항체를 선택) enous 및 외래 단백질을...

&quot;중심절은&quot;고전적인 유전학 억제 감수 재조합의 영역으로 정의하고 나중에 유사 분열시 정확한 염색체 분리에 필수적인 역할을한다 유사 분열 염색체의 주요 수축으로 인식되었다. &quot;Kinetochores&quot;은 전자 현미경에 의해 계시 된, 중심절의 표면에 미세 소관 결합 다층 구조로서 기술 하였다; &quot;kinetochores은&quot;나중에 유사 분열 염색체의 동원체에 지역화 거대 분자 복합체로 정의 하였다. 척추 사이 센트로 DNA 서열의 극적인 차이에도 불구하고, 구조 및 동원체 조성물은 고도로 보존된다. 스핀들 미세 소관과 동원체 사이의 역동적 인 상호 작용은 유사 분열시 염색체의 충실한 분리에 필요한 및 센트로 - 동원체 기능 리드의 결함 이수성하여 암이다. 대부분의 진핵 생물의 센트로어떠한 정의 된 DNA 서열이 없지만 171 bp의 α 위성 DNA로 이루어진 반복 alphoid DNA의 큰 배열 (0.3-5 MB)로 구성된다. 효모 신진 제외 센트로 ID가없는 DNA 서열이 아니라 히스톤 H3 변이체 CenH3 포함 특수 뉴 클레오 좀의 존재에 의해 달성된다 (센트로 단백질을 [CENP-A] 인간). 5 CENP-A의 뉴 클레오는에 지역화 171-bp의 α-위성 DNA에 포유류 kinetochores 7 바인드의 내부 플레이트. 활성 중심절이 필요 CENP-A 함유 함께 스핀들 체크 포인트를 통해 유사 분열 스핀들 및 후속주기 진행에 염색체의 부착을 조절하는 구성 적 센트로 관련 네트워크 (CCAN)과 동원체 단백질의 모집을 지시하는 뉴 클레오합니다. 상기 증거 비추어 CENP-A는 센트로 8 후성 마크 것으로 제안되었다; 그러나, 처리되는 CENP-A는 I을 인용NTO 센트로이 DNA 결합을 담당하는 요소가 아직 특징 화되지 않았다. 짧은 센트로 타겟팅 도메인 (CATD)는 CENP-A의 영역을 배 히스톤에 상주하고 CATD와 H3의 해당 영역의 교체가 센트로에 직접 H3에 충분하다. 9 몇몇 연구는 번역 후를위한 기능적 역할을 제안 수정 CENP-A 12-16의 (PTM) 그러나, 중심절에 모집에서 CENP-A의 이러한 PTMS의 분자 메커니즘은 아직 밝혀지지 않았다. 우리는 이전에 CUL4A-RBX1 - COPS8 E3 리가 활동이 동원체에 CENP-A의 CENP-A K124의 ubiquitylation 및 지역화를 위해 필요하다고보고했다. (17) 동원체 단백질의 발견 및 특성화 염색체 분리에 관한 새로운 통찰력을 주도하고있다. 18 개의 100보다 동원체 성분을 다양한 방법으로 척추 동물 세포에서 확인되었다. (19, 20) 아래형광 현미경에 kinetochores는 조립과 기능 또한 세포 내의 각 센트로 - 동원체 단백질과 단백질 - 단백질 네트워크의 세포 기능의 특성에서 오는 방법의 서. (19) 직접 시각화 및 고급 이미징 방법은 센트로 - 동원체 구성 요소의 놀라운 해상도를 제공 할 수 중심절과 kinetochores의 특정 분자 구성 요소의 직접 관찰. 또한, 특이 적 항체를 이용하여 간접 면역 형광 방법 (IIF) 염색이 관찰에 중요하다. 그러나, 특정 센트로 - 동원체 단백질의 세부 문제를 논의 IIF 프로토콜, 몇 가지에 대한 수많은 보고서에도 불구하고. 1-4 따라서, 개발하고 특히 각 센트로 - 동원체 단백질을 분석하는 IIF 염색 및 정량 IIF 분석의 방법을보고하는 것은 매우 중요합니다. IIF 염색에서, 하나의 관심 단백질의 손실을 방지하기 위해 염색 프로토콜을 진행해야하거나셀의 나머지. 그러나 고정 가끔 항원 사이트를 파괴하고, 다른 항체 - 항원 조합은 하나의 정착과 함께 제대로 작동하지만 아주 잘 다른, 21, 정착액의 선택에 크게 관심의 단백질 (들)에 따라 달라집니다. 따라서, 다른 정착 방법은 센트로 - 동원체 단백질의 IIF 염색에서 중요하다. 간접 면역 형광 (IIF) 염색 및 CENP-A와 국기 태그가 외생 CENP-A 단백질, 인간 세포에서이 단백질의 정량을 포함하여 내인성 센트로 - 동원체 단백질의 현지화를 해결하기 위해 분석의 여기에 최적화 된 방법이 개발되었다. 이러한 방법은 다른 종 센트로-동원체 단백질의 분석에 적용될 수있다.

<table><tbody><tr><td>Lipofectamin 2000</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>11668</td><td>형질주입 시약 I</td></tr><tr><td>Lipofectamin RNAiMAX</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>13778</td><td>형질주입 시약 II</td></tr><tr><td>Opti-MEM I</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>31985</td><td>감소된 혈청 배지, 37°C에서 따뜻함; C 사용 전 수조</td></tr><tr><td>고포도당 DMEM(Dulbecco' s 변형 된 독수리' s 매체)</td><td>Life Technologies/BioWhittaker</td><td>12-604</td><td>고포도당 DMEM, 37°C에서 따뜻하게; 사용 전 C 수조</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, 인증, 열 비활성화, US origin</td><td>Life Technologies/Gibco</td><td>10082</td><td>FBS (태아 소 혈청)</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine SOLUTION</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>P 8920</td><td>Poly-L-Lysine, 0.1% w/v, 물 내</td></tr><tr><td>UltraPure Distilled Water</td><td>Life Technologies/Invitrogen/Gibco</td><td>10977</td><td>멸균 조직 배양 등급 물&nbsp;</td></tr><tr><td>마이크로 커버 유리(22mm x 22mm)&nbsp;</td><td>Surgipath</td><td>105</td><td>커버 유리(22mm x 22mm)&nbsp;</td></tr><tr><td>6웰 세포 배양 클러스터</td><td>Fisher/Corning Incorporated</td><td>07-200-83</td><td>6웰 폴리스티렌 플레이트&nbsp;</td></tr><tr><td>페니실린, 스트렙토마이신; Liquid</td><td>Fisher/Gibco</td><td>15-140</td><td>페니실린-스트렙토마이신</td></tr><tr><td>PAP PEN&nbsp;</td><td>결합 부위</td><td>AD100.1</td><td>소수성 장벽 펜(면역형광 염색 시 발수 장벽용)</td></tr><tr><td>파클리탁셀(탁솔)</td><td>유사분열 세포 분석용</td> <td>SIGMA-SLDRICH</td><td>T7402</td> 탁솔</tr><tr><td>, TN-16, 미세소관 억제제(TN16)</td><td>엔조 생명과학</td><td>BML-T120</td><td>TN16 유사분열 세포 분석용 BSA</td></tr><tr><td>(소 혈청 알부민)</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>A7906</td><td>차단 시약</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>T8787</td><td>투과 화 용 세제</td></tr><tr><td>파라 포름 알데히드</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>P6148</td><td>고정 reagant</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>D9542</td><td>핵 염색</td></tr><tr><td>용 p- 페닐 렌 디아민</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>P6001</td><td>매체 장착 용</td></tr><tr><td>VWR 마이크로 슬라이드, Frosted</td><td>VWR International</td><td>48312-013</td><td>마이크로 슬라이드&nbsp;</td></tr><tr><td>항-CENP-A 항체</td><td>Stressgen/Enzo Life Sciences</td><td>KAM-CC006</td><td>마우스 단클론 항체; 1:100 (IIF), 1:5000 (WB)</td></tr><tr><td>항-CENP-B 항체</td><td>Novus Biologicals</td><td>H00001059-B01P</td><td>마우스 단클론 항체; 1:200 (IIF, 메탄올/아세톤 고정)-1:400 (IIF, 파라포름알데히드 고정)</td></tr><tr><td>항-CENP-B 항체의</td> 희석 비율;<td>abcam</td><td>ab25734</td><td>토끼 다클론 항체; 1:200 (IIF, 메탄올/아세톤 고정)-1:400 (IIF, 파라포름알데히드 고정)</td></tr><tr><td>항중심체 항체 (ACA)</td><td>Fitzgerald Industries International, Inc.</td><td>90C-CS1058</td><td>인간 중심체 항혈청; 1:2000 (IIF)</td></tr><tr><td>Anti-CENP-H 항체</td><td>Bethyl Laboratories</td><td>BL1112 (A400-007A)</td><td>토끼 다클론 항체; 1:200 (IIF)</td></tr><tr><td>Anti-CENP-H 항체</td><td>BD</td><td>612142</td><td>Mouse monoclonal 항체; 1:200 (IIF)</td></tr><tr><td>Anti-CENP-I 항체</td><td>N/A, Dr. Katusmi Kitagawa N/A, Dr. Katusmi Kitagawa</td><td></td><td>토끼 다클론 항체; 1:1000 (IIF)의 희석 비율; Niikura et al., Oncogene, 4133-4146 (2006)</td></tr><tr><td>Anti-KNL1 항체</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP1-89223</td><td>토끼 다클론 항체; 1:100 (IIF)</td></tr><tr><td>Anti-Hec1 항체</td>의 희석 비율 <td>Novus Biologicals / GeneTex</td><td>NB 100-338 / GTX70268</td><td>Mouse monoclonal antibody; 1:100 (IIF)</td></tr><tr><td>Anti-Hec1 항체</td><td>GeneTex</td><td>GTX110735</td><td>Rabbit polyclonal 항체; 희석 비율 1:100 (IIF)</td></tr><tr><td>Anti-Ska1 항체</td><td>abcam</td><td>ab46826</td><td>Rabbit polyclonal 항체; 1:100 (IIF)</td></tr><tr><td>Anti-Flag 항체</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>F3165</td><td>Mouse monoclonal 항체의 희석 비율; 1:1000 (IIF), 1:5000 (WB)</td></tr><tr><td>Anti-Flag 항체</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>F7425</td><td>Rabbit polyclonal 항체; 희석 비율 1:1000 (IIF), 1:5000 (WB)</td></tr><tr><td>Anti-CUL4A 항체</td><td>N/A, Dr. Pradip Raychaudhuri</td><td>N/A, Dr. Pradip Raychaudhuri</td><td>Rabbit 다클론 항체;1:3000의 희석 비율 (WB); Shiyanov et al., The Journal of biological chemistry, 35309-35312 (1999)</td></tr><tr><td>Anti-RBX1 antibody</td><td>Cell Signaling</td><td>4397</td><td>Rabbit polyclonal antibody; 1:2000 (WB)</td></tr><tr><td>Anti-GAPDH antibody</td><td>Chemicon</td><td>MAB374</td><td>Mouse monoclonal antibody; dilution ratio of 1:5000 (WB)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>A11001</td><td>fluorophore-conjugated secondary 항체 (Affinity-purified secondary antibody)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>A11005</td><td>fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>A11008</td><td>fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rabbit IgG</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>A11012</td><td>fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody)</td></tr><tr><td>Non fat powdered milk (approved substitutetion for carnation powdered milk)Fisher</td> <td>Scientific</td><td>NC9255871 (Reorder No. 190915; Lot# 90629)</td><td>탈지 우유</td></tr><tr><td>Leica DM IRE2 전동 형광 현미경&nbsp;</td><td>Leica</td><td></td><td>전동 형광 현미경&nbsp;</td></tr><tr><td>HCX PL APO 63x 오일 이멀젼 렌즈</td><td>라이카</td><td>LEICA HCX PL APO NA 1.40 오일 PH 3 CS</td><td>63X 오일 이멀젼 렌즈</td></tr><tr><td>HCX PL APO 100x 오일 이멀젼 렌즈</td><td>라이카</td><td>LEICA HCX PL APO NA 1.40 오일 PHE</td><td>100X 오일 이멀젼 렌즈</td></tr><tr><td>라이카 EL6000 컴팩트 광원</td><td>라이카</td><td></td><td>형광 여기용 외부 컴팩트 광원</td></tr><tr><td>ORCA-R2 디지털 CCD 카메라&nbsp;</td><td>하마마츠</td><td>C10600-10B</td><td>디지털 CCD 카메라&nbsp;</td></tr><tr><td>Openlab 버전 5.5.2 과학 이미징 소프트웨어&nbsp;</td><td>Perkin Elmer/Improvision</td><td></td><td>이미지 관찰, 획득, 정량화 및 분석용</td></tr><tr><td>Velocity 버전 6.1.1 3D 이미지 분석 소프트웨어&nbsp;</td><td>Perkin Elmer/Improvision</td><td></td><td>이미지 관찰, 획득, 정량화 및 분석을 위한</td></tr><tr><td>완전한 EDTA-free 프로테아제 억제제 칵테일</td><td>Roche</td><td>11873580001/11836170001</td><td>프로테아제 억제제 칵테일 정제</td></tr><tr><td>PlusOne 2-D Quant Kit</td><td>Amersham Biosciences</td><td>80-6483-56</td><td>단백질 농도 측정을 위한 상용 단백질 분석 시약 I(2% SDS와 호환 가능)</td></tr><tr><td>Bio-Rad 단백질 분석</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0006</td><td>단백질 농도 측정을 위한 상용 단백질 분석 시약 II(0.1% SDS와 호환 가능)</td></tr><tr><td>Immobilon-FL</td><td>EMD Millipore</td><td>IPFL00010</td> IRDye 800CW 전달용 Millipore <td>PVDF 멤브레인</td></tr><tr><td>IgG</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>926-32210</td><td>IR 형광 염료 접합 2차 항체(Affinity-purified 2차 항체); 희석 비율 1:20000 (IIF)</td></tr><tr><td>IRDye 680 Goat Anti-Rabbit IgG</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>926-32221</td><td>IR 형광 염료 접합 2차 항체 (Affinity-purified secondary 항체); 1:20000 (IIF)</td></tr><tr><td>Goat anti-Mouse IgG DyLight 549</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI35507</td><td>DyLight-conjugated secondary antibodyIR 형광 염료 접합 2차 항체 (Affinity-purified secondary antibody); 1:20000의 희석 비율 (IIF)</td></tr><tr><td>Goat anti-Rabbit DyLight 649</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI35565</td><td>DyLight-conjugated secondary antibodyIR 형광 염료 접합 2차 항체 (Affinity-purified secondary antibody); 1:20000 (IIF)의 희석 비율</td></tr>염소 <tr><td>anti-mouse IgG-HRP</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-2005</td><td>HRP-conjugated secondary antibodyDyLight conjugated secondary antibodyIR 형광 염료 접합 2차 항체 (Affinity-purified secondary antibody) 항체); 1:10000 (IIF)</td></tr><tr><td>염소 항토끼 IgG-HRP</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-2004</td><td>HRP-conjugated secondary antibodyDyLight-conjugated secondary antibodyIR 형광 염료-conjugated secondary 항체 (Affinity-purified secondary antibody); 1:10000 (IIF)의 희석 비율</td></tr><tr><td>Openlab version 5.5.2. 과학 이미징 소프트웨어&nbsp;</td><td>Improvision/PerkinElmer</td><td></td><td>소프트웨어 A</td></tr><tr><td>Volocity 버전 6.3 3D 이미지 분석 소프트웨어(Volocity Acquisition)</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>소프트웨어 B1</td></tr><tr><td>Volocity 버전 6.3 3D 이미지 분석 소프트웨어(Volocity Quantification)</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>소프트웨어 B2</td></tr><tr><td>Branson SONIFIER 450</td><td></td><td></td><td>Sonicator</td></tr><tr><td>Branson Ultrasonics Sonicator Microtip Step, Solid, 스레드 9.5mm</td><td>VWR Scientific Products Inc.</td><td>&nbsp; 33995-325</td><td>초음파 처리 용 디스럽터 혼</td></tr><tr><td>Branson 초음파 초음파 발생기 Microtip 테이퍼 6.5mm</td><td>VWR Scientific Products Inc.</td><td>&nbsp; 33996-185</td><td>초음파 처리를 위한 마이크로팁</td></tr><tr><td>Odyssey CLx 적외선 이미징 시스템&nbsp;</td><td>LI-COR Biosciences</td><td></td><td>면역 얼룩 감지를 위한 적외선 이미징 시스템</td></tr><tr><td>Image Studio 분석 소프트웨어 버전 4.0&nbsp;</td><td>LI-COR Biosciences</td><td></td><td>소프트웨어 C</td></tr><tr><td>분자 이미저 Versadoc MP4000 시스템&nbsp;</td>면역 블롯 검출을 위한 <td>Bio-Rad</td><td></td><td>화학발광 이미저</td></tr><tr><td>Quantity One 1-D 분석 소프트웨어&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Software D</td></tr><tr><td>SuperSignal West Femto 최대 감도 기판</td><td>Thermo</td><td>34095</td><td>초고감도 강화 화학발광(ECL) 기판</td></tr></tbody></table>

내생의 면역 형광 분석 및 외인성 센트로 - 동원체 단백질

 Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins

Centromeres"와 "kinetochores"는 세포 분열 중에 염색체가 방추체와 결합하는 부위를 나타냅니다. 세포주기 동안 centromere-kinetochore 단백질의 직접 시각화는 이러한 단백질의 메커니즘을 조사하는 데 기본적인 도구로 남아 있습니다. 형광 현미경 검사의 고급 이미징 방법은 centromere-kinetochore 구성 요소의 놀라운 해상도를 제공하고 centromeres 및 kinetochores의 특정 분자 구성 요소를 직접 관찰할 수 있습니다. 또한 특정 항체를 사용한 간접 면역형광(IIF) 염색 방법이 이러한 관찰에 매우 중요합니다. 그러나 IIF 프로토콜에 대한 수많은 보고에도 불구하고 특정 중심체-키네토코어 단백질의 문제를 자세히 논의한 사례는 거의 없었습니다. 1-4 여기에서는 파라포름알데히드 고정 및 IIF 염색을 사용하여 인간 세포의 내인성 중심체-키네토코어 단백질을 염색하기 위한 최적화된 프로토콜을 보고합니다. 또한, 아세톤 또는 메탄올 고정을 받은 인간 세포에서 Flag 태그가 지정된 외인성 CENP-A 단백질을 검출하기 위한 프로토콜을 보고합니다. 이러한 방법은 인간 세포를 포함하여 내인성 centromere-kinetochore 단백질 및 Flag 태그가 지정된 CENP-A 단백질을 검출하고 정량화하는 데 유용합니다.

내생 CENP-A의 면역 형광 분석 CUL4A-E3 리가 아제가 동원체에 CENP-A의 현지화에 필요한 가설을 지원합니다 우리의 최근의 연구는 CUL4A-RBX1 - COPS8 E3 리가 활동이 CENP-A와 동원체에 CENP-A의 현지화에 라이신 124 (K124)의 ubiquitylation 필요하다는 것을 보여 주었다. (17) 처음에는 계면-센트로 단지 (ICEN가)에 의해 분리 하였다 안티 CENP-A : 기본 염색질 면역, 32-34는 ICEN 단백질의 일부 중심절에 CENP-A 지역화에서 중요한 역할을 할 수 있다고 가정하고있다. 따라서, siRNA를 녹다운 실험은 그 부재 발현 중심절 17 CENP-A의 비편 재화를 유발하는 단백질을 선별하도록 수행되었다 (데이터는 미도시) 비동기 성장 HeLa 세포는 회 Cullin 4A (CUL4A)의 siRNA 또는...

여기에서는 인간 세포에서 내인성 및 외인성 centromere-kinetochore 단백질을 검출하고 고정(파라포름알데히드, 아세톤 또는 메탄올 고정)을 통한 간접 면역형광 염색을 통해 centromeres-kinetochores에서 이러한 단백질 수준을 정량화하는 프로토콜을 보고합니다.

"Centromeres" and "kinetochores" refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of ...

본 간접 면역형광 분석법의 전반적인 목표는 인간 세포 내의 centromere protein A 및 flag-tagged 외인성 CENP-A 단백질을 포함하여, 내인성 및 외인성 중심체-동원체 단백질의 국소화와 정량화를 최적화하는 것입니다. 이 방법은 중심체-동원체 단백질을 식별하고 정량화하는 방법에 대한 핵심적인 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 관심 있는 후기(anaphase) 단계의 선택에 따라 중심체-동원체 발현의 서로 다른 수준을 정량화하는 데 사용할 수 있다는 점입니다.세포 파종 18시간 후, 배양된 세포를 PBS로 1회 세척하고 6-웰 폴리스티렌 배양 플레이트의 각 웰에 저혈청 배지 500 µL를 첨가합니다. 다음으로, 각 웰의 세포에 갓 조제한 A 및 B 혼합 용액을 트랜스펙션하고 37 °C, 5% CO2 조건에서 배양합니다. 4시간 30분 후, 배지를 FBS와 항생제가 첨가된 고농도 포도당 DMEM으로 교체하고 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 다시 넣습니다.48~72시간 후, 세포 배양액을 흡입하여 제거하고 PBS로 세포를 1회 세척하며, 이때 세포가 손상되지 않도록 배양 웰의 벽면을 따라 식염수를 첨가합니다. 그 다음 4% paraformaldehyde를 사용하여 4 °C에서 30분 동안 세포를 고정합니다. 고정 단계가 끝나면 Kb2 버퍼로 세포를 2회 세척하고, Kb1 버퍼를 사용하여 실온에서 30분 동안 시료를 투과화합니다.그런 다음 세포를 Kb2 버퍼로 한 번 헹구고, 새로운 Kb2 버퍼를 첨가하여 비특이적 결합을 차단합니다. 상온에서 5분 후, 핀셋을 사용하여 각 웰에서 세포가 도말된 커버 글라스를 제거하고, 소수성 배리어 펜을 사용하여 각 커버 글라스 샘플 주위에 소수성 배리어를 그립니다. 커버 글라스를 새로운 6-웰 폴리스티렌 플레이트로 옮기고, 37 °C에서 1시간 동안 적절한 1차 항체에 샘플을 침전시킵니다.그 다음 세포를 Kb2 버퍼로 3회 헹구고, 적절한 2차 항체로 37°C에서 1시간 동안 더 염색합니다. 배양이 끝나면 Kb2 버퍼를 사용하여 6분씩 5회 샘플을 세척합니다. 이어서 DapE가 포함된 Kb3 버퍼로 실온에서 5분 동안 세포핵을 염색한 후, Kb2 버퍼로 1~2회 세척하고 웰을 Kb2 버퍼로 다시 채웁니다.이제 각 세포 커버글라스에 대응하는 현미경 슬라이드 중앙에 봉입제 한 방울을 떨어뜨리고, 세포 샘플에서 액체를 제거합니다. 마지막으로, 각 샘플을 준비된 현미경 슬라이드의 중앙에 조심스럽게 올린 후, 여분의 봉입제는 페이퍼 타월로 닦아냅니다. 본 대표 실험에서 관찰된 바와 같이, CUL4A siRNA가 형질전환된 세포의 전체 세포 용해물 내 내인성 CENP-A 단백질 발현 수준은 Luciferase siRNA가 형질전환된 세포의 CENP-A 발현 수준과 유사했습니다.또한, RBX1 siRNA를 트랜스펙션한 세포의 전체 세포 용해물 내 내인성 CENP-A 단백질 수준은 Luciferase siRNA를 트랜스펙션한 세포의 내인성 CENP-A 수준과 유사했으며, 이는 CUL4A RBX1 E3 리가아제가 CENP-A의 중심절 localization에 필요함을 시사합니다. CENP-A 라이신 돌연변이체는 중심절 내에 localization하는 능력을 상실하며, 이는 CENP-A K124 유비퀴틴화가 CENP-A의 중심절 localization에 필수적임을 시사합니다. 중요한 점은, 외인성 모노유비퀴틴 융합 CENP-A 단백질이 delocalization된 CENP-A K124R 돌연변이체를 회복시켜 단백질을 다시 중심절 위치로 되돌렸다는 것입니다.세포 고정 및 면역형광 염색 절차를 완전히 숙달하고 적절하게 수행한다면 5~6시간 이내에 완료할 수 있습니다. 세척이나 시료 침전 시 세포가 커버글라스에서 떨어지지 않도록 모든 용액을 웰의 벽면을 따라 조심스럽게 가해 주십시오. 환기 시설이 없는 곳에서 가열된 파라포름알데히드를 사용하거나 화기 근처에 가연성 물질을 두는 것은 매우 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안 항상 적절한 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

여기 3D 현미경 및 분석 (3D immuno-DNA의 물고기)에 의해 다음 DNA 생선의 immunofluorescence와 DNA 시퀀스에 의한 히스톤 수정의 동시 검출을위한 프로토콜을 설명합니다.

3D 원자력기구의 변화를 공부하기 위해 3D 보존 된 계면 핵에 결합 Immunofluorescence와 DNA의 물고기

초파리의 정자 중 centrosomal 단백질의 영상은 중심체 생물학에 중요한 새로운 단백질을 식별 할뿐만 아니라이 과정에서 알려진 선수의 특정 기능을 명료하게하는 강력한 방법입니다.

비행 고환에있는 영상 중심체

여기에서는 단백질의 형광 강도를 적절한 내부 표준물질의 농도로 정규화하여 중심체에서 단백질의 수준 변화를 측정하기 위해 새로운 정량적 형광 분석법이 개발되었습니다.

정량 면역 형광 분석은 중심체에서 단백질 수준의 변화를 측정하기 위해

 종속 키 1 (Cdk1) 세포 주기의 g 2 단계에서 활성화 되 고 많은 세포 경로 조절. 여기, Cdk1, Cdk1-특정 한 인 산화 위치의 식별이 중요 한 키의 셀룰러 목표 설정에 대 한 수와 함께 체 외에 니 분석 결과 대 한 프로토콜 선물이.

 종속 키 1의 시험관에서 키에 의해 인 산화 특정 사이트 분석 결과

우리 정화 하 여 슈퍼 해상도 현미경 및 단일 입자 평균에 대 한 의무가 다른 방향에서 centrioles 많은 이미지 전략을 개발 했습니다.

절연 및 Chlamydomonas Centrioles의 단일 입자 재건을 위한 형광 이미징

CENP-A 유비쿼터스는 세포 분열 사이의 분화를 통해 계승되고 세포 생존가능성에 필수적입니다. 여기서 우리는 EYFP 태그CENP-A (EYFP-CENP-A) 단백질의 유비쿼터션을 확인하기 위해 질량 분광분석 분석을 설명합니다.

EYFP 태그CENP-A(EYFP-CENP-A)의 유비쿼터션을 식별하기 위한 질량 분광분석

DNA 손상에 따라 인간 세포는 게놈의 무결성을 회복하기 위해 필수적인 수리 경로를 활성화합니다. 여기서, 우리는 DNA 복구 단백질을 검출하고, 그들의 공간 및 측두모집을 분석하고, DNA 손상의 사이트에서 단백질 단백질 상호 작용을 심문하는 것을 돕는 수단으로 간접적인 면역 형광의 방법을 기술합니다.

면역형광에 의한 DNA 수리 단백질 상호작용의 시각화

여기에 제출된 것은 손상되지 않은 조직에서 초해상도 라이브 세포 이미징을 위한 프로토콜입니다. 우리는 그것의 네이티브 조직 환경에 있는 높게 민감한 성인 줄기 세포 인구를 화상 진찰을 위한 조건을 표준화했습니다. 이 기술은 살아있는 조직에서 생물학적 현상의 직접적인 관찰을 허용하는 시간적 및 공간 해상도의 균형을 포함한다.

세포 전 형 구조의 슈퍼 해상도 라이브 세포 이미징

염색체 분리의 오류는 난 모세포에서 공통적 인 특징입니다. 따라서 스핀들 어셈블리 체크 포인트를 연구하면 건강한 알을 생산하는 데 필요한 메커니즘에 대한 중요한 단서를 얻을 수 있습니다. 본 프로토콜은 마우스 난모세포에서 스핀들 어셈블리 체크포인트 무결성을 평가하기 위한 세 가지 보완 분석을 설명합니다.

마우스 난 모세포의 스핀들 어셈블리 체크 포인트 무결성 평가

타임 랩스 현미경은 신진 효모에서 감수 분열을 연구하는 데 유용한 도구입니다. 이 프로토콜은 세포 주기 동기화, 타임랩스 현미경 검사 및 표적 단백질의 조건부 고갈을 결합하여 감수 분열 염색체 분리 동안 특정 단백질의 기능을 연구하는 방법을 설명하는 방법을 설명합니다.

S. cerevisiae에서 감수 분열을 연구하기 위해 타임 랩스 현미경 및 단백질의 단계 별 핵 고갈 사용

감수 분열 전기 동안의 염색체 이동은 포자 형성의 기본이 되는 잘 이해되지 않는 현상입니다. 이 프로토콜은 애기장대 탈리아나 수컷 감수 모수세포에서 감수 분열 전기 동안 중심체 움직임을 획득, 분석 및 정량화하는 방법을 설명합니다.

애기장대 의 수컷 감수 분열 전기 동안 중심체 움직임의 라이브 이미징 특성화

학습하세요 인간 세포에서 간접 면역형광법을 이용한 내생성 및 외인성 센트로미어-키네토코어 단백질의 정량화와 국소화 최적화 방법을. 이 기법은 세포 분열 단계별 단백질 발현 수준을 정밀하게 분석할 수 있습니다.

내생의 면역 형광 분석 및 외인성 센트로 - 동원체 단백질

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