내생의 면역 형광 분석 및 외인성 센트로 - 동원체 단백질

여기에서는 인간 세포에서 내인성 및 외인성 centromere-kinetochore 단백질을 검출하고 고정(파라포름알데히드, 아세톤 또는 메탄올 고정)을 통한 간접 면역형광 염색을 통해 centromeres-kinetochores에서 이러한 단백질 수준을 정량화하는 프로토콜을 보고합니다.

이 간접 면역형광 분석법의 전반적인 목표는 인간 세포에서 중심체세포 단백질 A 및 플래그 태그가 지정된 외인성 CENP-A 단백질을 포함한 내인성 및 외인성 중심체-키네토코어 단백질의 국소화 및 정량화를 최적화하는 것입니다. 이 방법은 중심체-키네토코어 단백질을 식별하고 정량화하는 방법에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 선택한 관심 anaphase에 따라 다양한 수준의 centromere-kinetochore 발현을 quanitfy하는 데 사용할 수 있다는 것입니다.

파종 후 18시간 후 배양된 세포를 PBS로 한 번 세척하고 6웰 폴리스티렌 배양판의 각 웰에 500마이크로리터의 환원된 혈청 배지를 첨가합니다. 다음으로, 각 웰의 세포를 갓 준비한 A 및 B 혼합물 용액으로 형질 주입하고 섭씨 37도와 5% 이산화탄소에서 배양물을 배양합니다. 4시간 30분 후, FBS와 항생제가 보충된 중혈당 DMEM을 고혈당으로 바꾸고 플레이트를 세포 배양 인큐베이터로 되돌립니다.

48-72시간 후, 세포 배양 배지를 흡인하고 PBS로 세포를 한 번 헹구고 세포를 방해하지 않도록 배양 웰 측면에 식염수를 추가합니다. 그런 다음 섭씨 4도에서 30분 동안 4% 파라포름알데히드로 셀을 고정합니다. 고정 기간이 끝나면 Kb2 버퍼로 세포를 두 번 헹구고 실온에서 30분 동안 Kb1 버퍼의 샘플을 투과시킵니다.

그런 다음 Kb2 버퍼로 셀을 한 번 헹구고 새로운 Kb2 버퍼를 추가하여 비특이적 결합을 차단합니다. 실온에서 5분 후 집게를 사용하여 각 웰에서 파종된 커버 유리를 제거하고 소수성 차단 펜을 사용하여 각 커버 유리 샘플 주위에 소수성 장벽을 그립니다. 커버 안경을 새로운 6웰 폴리스티렌 플레이트로 옮기고 샘플을 섭씨 37도에서 1시간 동안 적절한 1차 항체에 담급니다.

그런 다음 Kb2 완충액으로 세포를 세 번 헹구고 섭씨 37도에서 한 시간 동안 적절한 2차 항체로 표시합니다. 배양이 끝나면 Kb2 완충액에서 6분 동안 5회 세척하여 샘플을 헹굽니다. 그런 다음 실온에서 5분 동안 DapE가 포함된 Kb3 완충액으로 세포핵에 라벨을 붙인 다음 Kb2 완충액을 1-2회 세척하고 웰에 Kb2 완충액을 다시 채웁니다.

이제 세포의 각 커버 유리에 대한 하나의 현미경 슬라이드 중앙에 장착 매체 한 방울을 놓고 세포 샘플에서 액체를 제거합니다. 마지막으로, 각 샘플을 준비된 현미경 슬라이드 중 하나의 중앙에 조심스럽게 놓고 종이 타월로 여분의 장착 매체를 제거합니다. 이 대표적인 실험에서 관찰된 바와 같이, CUL4A siRNA 형질주입 세포의 총 세포 용해물에서 내인성 CENP-A 단백질 발현 수준은 Luciferase siRNA 형질주입 세포의 CENP-A 발현 수준과 유사했습니다.

또한, RBX1 siRNA 형질주입 세포의 총 세포 용해물에서 내인성 CENP-A의 단백질 수준은 Luciferase siRNA 형질주입 세포의 내인성 CENP-A 수준과 유사했으며, 이는 CUL4A RBX1 E3 리가아제가 CENP-A의 중심체로의 국소화에 필요하다는 것을 시사합니다. CENP-A 라이신 돌연변이는 중심체 내에서 국소화 능력을 잃는데, 이는 CENP-A K124 유비퀴틸화가 CENP-A의 중심체로의 국소화에 필수적임을 시사합니다. 중요한 것은 CENP-A 단백질의 외인성 모노유비퀴틴 융합이 비편재화 CENP-A K124R 돌연변이를 구출하여 단백질을 중심체 위치로 되돌렸다는 것입니다.

일단 숙달되면 세포 고정 및 면역형광 염색 절차가 적절하게 수행되면 5-6시간 내에 완료할 수 있습니다. 샘플을 헹구거나 담글 때 세포가 커버 유리에서 떨어지지 않도록 모든 용액을 웰 측면에 부드럽게 바르는 것을 잊지 마십시오. 환기가 잘 되는 방 밖에서 가열된 파라포름알데히드로 작업하거나 화기 근처에서 가연성 물질을 사용하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 항상 적절한 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.