Name: 탈 신경 외과 피부 : 피부 질환의 마우스 모델에서 신경에 대한 요구를 테스트하기위한 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: 배우세요 마우스 피부의 유전적 라벨링, 외과적 탈신경술, 생검 방법을 활용한 정상 및 병리학적 피부에서 신경 역할을 연구하는 기법입니다. 이 방법은 동일 동물의 신경 존재와 제거 상태를 비교하여 피부 생물학 및 질병 메커니즘을 심도 있게 이해하는 데 필수적입니다.

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저자는 쥐 사진 촬영에 도움을 준 Autumn Peterson, 쥐에 도움을 준 Daniel Thoresen, 외과적 탈신경에 도움을 준 Nicole Ward 박사와 Abdelmadjid Belkadi 박사에게 감사를 표합니다. 이 연구는 국립 관절염 및 근골격계 및 피부 질환 연구소(National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases)의 자금 지원(R00AR059796 및 R01AR065409 보조금)의 지원을 받았습니다. 미시간 대학교 피부과학과; 생물 과학 학자 프로그램; 유기 형성 센터(Center for Organogenesis); 미시간 대학교 종합 암 센터; John S. and Suzanne C. Munn 암 기금. S.C.P.는 미국 국립일반의학연구소(National Institute of General Medical Sciences)의 자금 지원을 받았습니다(보조금 T32 GM007315). 이 연구는 또한 국립 암 연구소(National Cancer Institute)의 암 연구 센터(Center for Cancer Research)의 NIH 교내 연구 프로그램(NIH Intramural Research Program)의 지원을 받았습니다.

이 프로토콜에 설명 된 모든 절차는 실험 동물 의학에 대한 미시간 단위의 대학 설립 규정에 따라 수행되었다. 1. 마우스의 유전자 재조합을 유도 참고 : Gli1 TM3 (CRE / ERT2) ALJ / J 마우스 변형 (Gli1-CreERT2) (13)는 상피를 TD하기 위해 타목시펜에 의한 유전자 재조합의 대상으로 할 수 있습니다. Gli1를 생성하는 B6.129S4-GT는 (ROSA) 26Sor tm1Sor / J 기자 마우스 (LacZ를) (22)이 변형 크로스, LacZ를 동물 전체 마운트 아래 염색에 의해 TD 세포를 시각화 할 수 있습니다. <ol><li> 옥수수 유 12.5 ㎎ / ㎖의 농도로 타목시펜 용액을 준비한다. <ol><li> 1.5 ML 튜브에서 결정 타목시펜의 20 ㎎, 옥수수 기름을 1 ml의까지 추가 할 수 있습니다. 타목시펜이 완전히 (2-4 시간)에 용해 될 때까지 단단히 같이 와류 믹서에 튜브 및 RT에서 가장 높은 설정에서 지속적으로 소용돌이를 테이프타목시펜 미립자의 부재에 대한 해부 현미경 튜브를 조사하여 확인 하였다. </li><li> 15 ㎖의 튜브에 용액을 옮기고 추가의 옥수수 오일 용액 12.5 밀리그램 / 최종 농도로 희석 타목시펜. 추가로 30 초 동안 점성 용액을 볼 텍싱하여 혼합한다. 어둠 속에서 4 ° C에서 최대 1 주일이 솔루션을 저장합니다. </li></ol></li><li> Gli1로 복강 타목시펜 용액을 주입, LacZ를 쥐, 마우스 체중 20g 당 200 ㎕의 부피로, 20g 마우스 체중 당 2.5 밀리그램의 유효 타목시펜 복용량. </li></ol> 2. 수확 피부 생검 참고 : 타목시펜 유도 후 주에 실험에 따라 수확 피부 생검 몇 일. 모든 수술를 들어, 멸균 장갑을 사용하여 수술 용 마스크 또는 머리 그물을 착용하고, 절차를 수행하는 동안 무균 수술 드레이프와 동물을 다루는 포함 설치류 수술을위한 표준 프로토콜을 따르십시오. <ol><li> 물에 90 ㎎ / ㎖ 케타민 6.5 ㎎ / ㎖ 자일 라진을 혼합하여 10 배 스톡 마취 솔루션을 준비합니다. 그냥 사용하기 전에 멸균 PBS로이 원액 1:10 희석하고, 최대 8 개월 동안 어둠 속에서 실온에서 보관하십시오. <ol><li> 또는, 완전 동물을 마취 산소와 4 %의 가스 농도를 시작으로 이소 플루 란 흡입에 의해 마우스를 마취하고 후속 절차 기간 동안 1 ~ 2 %이 저하. </li></ol></li><li> 20g의 마우스 체중 당 200 μL의 용량으로 복강 내 마취 용액을 주입한다. 동물이 발가락 핀치 분석에 의한 진정 작용의 적절한면에 도달 한 것을 확인하고, 그 마음을 확인하고 호흡 속도는 (각각 약 600 비트와 분당 160 호흡) 정상입니다. </li><li> , 지느러미 다시 피부에 생검의 사이트에서 머리를 제거하지 닉에주의하면서 또는 기본 피부를 손상 전기 클리퍼를 사용합니다. </li><li> 면도를 닦아 수술 부위를 준비Betadine과 알코올 잎사귀를 사용하여 전방 대 후방 방향으로 D 영역. 모든 머리를 잘라낸 사이트에서 제거해야합니다. </li><li> , 검은 색 마커를 사용하여 조직 검사 사이트 개요 무균 수술 영역에서 온난화 패드에 동물을 배치하고, 무균 수술 드레이프와 커버 (데모 목적을 위해, 무균 드레이프는 가시성을 높이기 위해 생략). 참고 : 모낭의 길이 방향의 부분을 얻기 위해 생검의 긴 가장자리에, 전방 - 후방 방향으로 parasagital를 (모낭의 방향에 평행)을 실행해야합니다 (가장자리가 ~ 1cm가, 조직학에 대한 구분한다) 지느러미 중간 선 (그림 1A). </li><li> 기본 근육의 근막을 손상시키지 않고 표시된 지역에 따라 전체 두께 절제술을 만들기 위해 멸균 # 11 메스를 사용합니다. 참고 : 적출 피부 조직은 표피, 진피, 피하 지방과 panniculus의 카르노 서스를 포함한다. 출혈은 일반적으로 최소이다. </li><li> t을 평평그는 마른 종이 타월에 피부 샘플을 적출, 진피, 아래로 옆 초과 종이 타월을 멀리 트림 및 기타 샘플을 수집해야 할 경우 최대 1 시간 동안 차가운 PBS에서 샘플을 저장합니다. 준비가되면 조직 검사를위한 샘플, 또는 전체 마운트 β - 갈 락토시다 제 (LacZ를) 염색을위한 4 단계를 처리하는 단계 3.1 또는 3.2로 진행합니다. </li><li> 봉합사는 약 3mm 이격 간단한 인터럽트 패턴에 6-0 나일론 봉합사를 사용하는 생검 부위를 닫는다. </li><li> 전체 복구 후까지 다른 동물과 같은 케이지에 수술을받은 쥐를 반환하지 않습니다. </li><li> 수술 영역은 일반적으로 일주일 내, 치유 될 때까지 그들은 매일 또한 의식을 되 찾을 때까지 즉시 수술 후 동물을 모니터링합니다. 마우스는 통증이나 고통의 흔적을 나타내는 경우 지정 기관 동물 관리 및 사용 지침에 따라 진통제를 사용합니다. 수술 후 7 ~ 10 일이 봉합사를 제거합니다. 주 : 필요한 경우, (50 ㎎ / ㎖ 스톡 오디오 솔루션 카프로 펜 희석하여 용액을 제조 진통이온) 1 : 멸균 100. 20g 체중 당 200 μL (5 ㎎ / ㎏의 마우스 체중)의 투여 량으로, 목 목덜미 근처 견갑골 사이의 용액을 피하 주사. </li></ol> 조직학 3. 프로세스 샘플 해결하려면 및 적출 조직을 처리, 응용 프로그램에 따라 아래의 방법 중 하나를 사용합니다. <ol><li> 파라핀 조직 학적 샘플을 생성하려면 최대 2 주 동안 70 % 에탄올에서 RT에서 PBS O / N에서 3.7 % 포르말린에 피부와 저장소를 수정합니다. 파라핀에 삽입하기 전에 종이 타월을 제거합니다. </li><li> 냉동 조직 학적 샘플을 생성하기 위해, PBS 차가운 4 % 파라 포름 알데히드에서 조직 잠수함 천천히 1 시간 동안 흔들어. 솔루션을 제거하고 PBS 3 변화, 약 5 분 각각에 샘플을 씻는다. 다음으로, ( &quot;크로스 침몰&quot;) 조직을 cryoprotect하는 PBS 30 % 수크로오스에서 샘플 잠수함. </li><li> 4 ° C에서 부드럽게 흔들어 O / N로 품어. 다음 날, 종이 견인을 제거EL은 피부의 진피 측으로부터 과량의 지방 조직을 잘라 내고. 직접 10월에 조직을 포함하고 -80 ° C에서 냉동 블록을 저장합니다. 참고 : 이전에 5,19을 설명한대로 절편 한 후, 파라핀 또는 냉동 샘플 중 하나는, TDs를, 메르켈 세포 각각 케라틴 17, 각질 8 신경 미세 섬유,에 대한 항체를 사용하여 신경을 식별하기 위해 면역 조직 화학 염색으로 염색 할 수 있습니다. </li></ol> 전체 마운트 LacZ를 염색 4. 시각화 샘플 <ol><li> X-여자의 염색 액을 준비합니다. <ol><li> 멸균 수 250 mL에 0.94 g의 인산 나트륨 일 염기, 2.6 g 인산 나트륨을 결합한다. 7.3의 pH를 조정합니다. 여기에, 1 M 염화 마그네슘 0.5 ㎖, 페로 시안화 칼륨 0.528 g의 칼륨 페리시 아나이드의 0.412 g을 추가한다. 옥틸 - 폴리에틸렌 글리콜 250 μL 및 데 옥시 콜레이트 125 mg을 추가합니다. 염기 용액을 어둠 속에서 최대 6 개월 동안 4 ℃에서 저장 될 수있다. </li><li> 50 배 재고 X-여자의 soluti 준비50 ㎎ / ㎖ 솔루션을 생성하기 위해 X-여자의 재고 병에 디메틸 포름 아미드를 추가하여합니다. 어둠 속에서 -20 ° C에서이 솔루션을 저장합니다. </li><li> 염색 솔루션을 생성하기 위해 X-여자 기반 솔루션에 재고의 X-여자 솔루션 1:50 희석 사용하기 직전에. 작은 생검 (&lt;1cm 2), 샘플 당 염색 액의 나누어지는 1-2 ml의하십시오. </li></ol></li><li> 부드럽게 진탕 얼음 30 분 동안 차가운 PBS로 2 % 파라 포름 알데히드 / 0.2 % 글루 타르 알데히드를 함유하는 용액의 단계 2.7에서 수집 된 피부 샘플을 고정한다. 작은 생검 (&lt;1cm 2)의 경우, 샘플 당 정착액 솔루션의 1-2 ml를 사용합니다. 참고 : 또는 만 2-4% 파라 포름 알데히드에 샘플을 수정, 또는 0.5 % 글루 타르 알데히드에서만. 최적의 정착 조건은 조직 LacZ를 발현 및 응용 정도에 의존한다. </li><li> 정착액 솔루션을 제거하고 실온에서 진탕에 PBS의 3 변경, 5 분마다로 샘플을 씻어. </li><li> 샘플 아래에 종이 타월을 제거하고 exces를 절단무딘 집게로 지방을 파지 및 해부 가위 트리밍에 의해 피부의 진피 측면에서 지방 조직을이야. </li><li> X-여자의 염색 액의 샘플 잠수함, 37 ° CO / N에 품어. LacZ를 발현은 해부 현미경 (그림 1B)에서 파란색 얼룩으로 표시됩니다. 주 : 신호 강도가 약한 경우에는 염색 액 다음날 교체 및 O / N 항온 처리를 반복한다. 백그라운드 염색이 너무 강한 경우에는, 염색의 시간을 줄이거 나, C ° 37 RT에서 샘플을 부화 대신. </li><li> 염색 액을 제거하고 PBS 부드럽게 RT 진탕, 약 5 분 동안 3 % DMSO를 포함하는 3 변경에 샘플을 씻는다. </li><li> 5 분 각 70 % 에탄올 2-3 변화 워시 샘플. 70 % 에탄올에 보관 샘플. </li></ol> 5. 수술 탈 신경 <ol><li> 단계 2.2에서와 같이 동물을 마취하고 전체 등쪽 피부를 면도. </li><li> 수술 영역 (을)를 준비Betadine 및 알코올 잎사귀 및 무균 수술 드레이프와 동물 다루 사용하여 다시 피부 F (데모 목적을 멸균 드레이프는 가시성을 높이기 위해 생략). 무균 수술 영역에서 작동하는 동안 가열 패드를 사용하여 동물을 따뜻하게 유지. </li><li> 꼬리 위의 약 0.5 cm에 목 기지에서 지느러미 중간 선을 따라 멸균 # 11 메스를 사용하여 절개를합니다. </li><li> 무딘 집게를 사용하여 부드럽게 단지 뒷다리 위에서 목 근처 견갑골 지방 패드의 하부 조직을 시각화 떨어진 측면에서 좌측 피부를 반영한​​다. 참고 : 지느러미 피부 신경 (그림 2) 날카로운 굴곡을 피부 아래에 느슨한 결합 조직에 들어가기 전에 트렁크 벽의 반투명 밴드를 통해 꼬리 쪽 여행으로 흰색 가닥 나타납니다. </li><li> 해부 현미경 하에서 광 초미립자 집게를 사용하여 애니 왼쪽에서 독점적 신경 제거어디에서 따 버릴에 의해 해부학 사이트 T3-12에 위치한 리터 피부에 입국 사이트에 트렁크 벽 세그먼트 벤드 (그림 2). <ol><li> 동양 집게 수직 및 스트레칭과 주변 조직 (- E 그림 2C)에서 분리 신경을 일으키는 원인이 자신의 굴곡 사이트 아래 약 0.5 cm를 잡고 위쪽으로 잡아 당겨 신경을 제거합니다. 인접한 혈관을 파열 않도록주의하십시오. </li><li> 피부에 트렁크 벽으로부터 연장 모든 신경이 제거 될 때까지 계속합니다. 트렁크 벽의 밀도 밴드 내에서 신경을 방해하지 마십시오. 주기적 멸균 0.9 % 식염수 용액의 방울을 적용하여 절차 내내 습윤 티슈 유지. </li><li> 또한, 집게와 트렁크 벽 근처에 자신의 근위 끝을 잡고 미세 가위로 자르는 것은에 의해 신경을 제거합니다. 그 후, 피부에 가까운 말단부를 절단 (도 2F - H). 마지막으로, INT를 제거ervening 신경 세그먼트 (그림 2I). </li></ol></li><li> 단계 5.4에 노출 된 피부 플랩에서 모든 신경을 제거합니다. 이 섬유는 등쪽 피부 신경의 말단 가지를 포함하고, 피부 플랩의 피부 측 (도 2J - K)에 결합 조직 내에서 산발적으로 위치한 흰색 분기 가닥으로 나타납니다. <ol><li> 이 좋은 지점을 제거하려면 미세 집게이 약은 피부 표면에 평행 신경을 파악하고 혈관을 방해하고 피부를 천공 방지하기 위해 위쪽으로 뽑아 놓습니다. 보이는 모든 신경이 제거 될 때까지 계속합니다. </li></ol></li><li> 무딘 절개를 사용 등쪽 정중선 절개 오른쪽의 피부를 반영하지만, 신경 제거되지 않는다. 이 반대측 가짜로 작동하는 제어 될 것입니다. </li><li> 간단한 중단 패턴에서 지느러미 중간 선을 따라 봉합은 절개를 닫습니다. 복구 및 사후 운영자 동안 동물을 모니터링atively로 이전 (단계 2.8-10) 보여 주었다. 수술 후 7 ~ 10 일이 봉합사를 제거합니다. </li><li> 기능적으로 수술 후 몇 주 안정 탈 신경을 위로 평가하기 위해, 전기 클리퍼를 사용하는 등의 피부에서 머리를 제거합니다. </li><li> 부드럽게 피하 주사 바늘을 사용하여 denervated 피부 영역을 찌를하고, 동물이 일반적으로 몸서리 또는 머리를 돌려, 응답 여부를 확인합니다. 피부 영역이 안정적 denervated 된 경우, 동물은 거의 또는 전혀 반응을 나타낼 것이다. </li><li> 검정색 마커를 사용하여, 반응의 영역뿐만 아니라, 반대측 모의 측 유사한 크기 및 위치의 영역을 설명합니다. </li><li> 단계 분석을위한 2.1-2.9에서 이러한 사이트에서 조직 검사를 수집합니다. 참고 : 또는 denervated 및 가짜로 작동하는 지역을 포함한 전체 지느러미 다시 피부를, 4 단계에 설명 된대로 유사한 전체 마운트 염색에 대한 한 장으로 제거 할 수 있습니다. </li></ol>

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신경은 감각에서뿐만 아니라 포유류의 장기 개발, 유지 보수 및 재생 13,24-27에서뿐만 아니라 중요한 기능을 제공합니다. 신경 최근 다양한 피부 질환에 연루되어있는 바와 같이, 여기에 설명 된 기술은 동물 질병 모델의 다양한 신경 분포에 대한 요구 사항을 연구하는데 사용될 수있다. 사실, 일방적 탈 신경 기술은 동일한 마우스에서 손상 또는 파괴 신경 중 하나와 피부의 직접적인 비교를 할 수 있습니다. 후속 데이터가 짝 t 검정을 활용하여 분석이 동물 대 동물 차이를 보상하기 위해 이상적인 내부 제어를 제공한다. 여기에 설명 된 절차를 크게 LacZ를 리포터 유전자를 이용할 수 있지만, 이러한 실험은 Gli1-CreERT2 대립 유전자는 TD에서 유전자 발현을 변경하기 위해 다른 형광 리포터 또는 조건부 대립 유전자와 결합되도록 구성 될 수있다. 예를 들면 Gli1-CreERT2 생쥐 교차 할 수있다타목시펜...

지난 몇 년 동안, 일반적으로 고전적인 신경병증1-4로 간주되지 않는 질병에 대한 신경의 영향에 대한 인식이 넓어지고 있습니다. 피부에서 최근의 실험적 증거는 감각 신경이 건선에서 암에 이르기까지 다양한 병리를 조절할 수 있음을 시사합니다5-9. 이것은 설치류의 외과적 탈신경 및 신경 기능의 약리학적 억제와 같은 기술을 사용하여 입증되었습니다. 건선의 경우, 이러한 연구는 신경 기능 상실 후 인간 건선 플라크가 퇴행하는 이유를 이해하기 위한 기계론적 틀을 제공했습니다7,10-12.
피부 신경은 유전자 발현에도 영향을 미칠 수 있으며(13,14) 정상 피부의 메카노센싱(mechanosense)에 결정적이다15. 특히, 터치 돔(TD) 상피는 1형(SA1) 신경 섬유를 천천히 적응시켜 신경내분비 메르켈 세포와 병치된 원주 표피 세포 패치로 구성됩니다16-18. TD는 가벼운 촉각 감각을 매개하고 고슴도치 경로 활동을 나타내는 것으로 나타났습니다5,19. TD 유지는 신경분포에 의존한다20,21, 신경은 정상적인 TD와 그와 관련된 메르켈 세포를 유지하기 위해 고슴도치 리간드를 분비하기 때문에19. 또한, 신경 분포는 TD 상피로부터 고슴도치 의존성 종양 형성을 촉진합니다5. 이러한 연구는 신경과 주변 세포 사이에서 발생하는 복잡한 분자 상호 작용이 정상적인 TD 생리학과 질병에 중요하다는 개념을 강화합니다.
이러한 상호 작용의 본질을 조사하기 위해 여기에서는 TD의 유전자 발현을 조작하고 계통 추적 후 TD 시각화를 위해 피부 생검을 수확하기 위한 일련의 생체 내 기술을 설명합니다. 마지막으로, 일방적인 외과적 탈신경술을 수행하는 절차를 설명하는데, 이는 쥐의 등쪽 피부의 한쪽에서 신경을 제거하고 반대쪽 쪽은 가짜 내부 대조군으로 그대로 두는 것입니다. 수술 후 몇 주 후, 신경을 절제할 때 발생하는 변화를 평가하기 위해 탈신경 대조 피부와 가짜 대조군 피부를 비교합니다. 이러한 기법은 정상적인 TD의 맥락에서 설명되지만, 탈신경 절차는 건선 6, 상처 치유13 및 종양 형성5의 마우스 모델에서 신경에 대한 요구 사항을 검사하는 데 사용되었습니다. 마지막으로, 피부는 반복적인 생검에 순응하기 때문에 표지된 세포의 장기적인 운명을 모니터링하거나 여러 시점에 걸쳐 질병 진행을 평가할 수 있는 기회를 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>알코올 준비 패드</td><td>PDI</td><td>B339</td><td></td></tr><tr><td>AnaSed (Xylazine)</td><td>Lloyd</td><td>NADA 139-236</td><td></td></tr><tr><td>항체, 항 케라틴 8</td><td>발달 연구 Hybridoma Bank</td><td>TROMA-I</td><td>쥐 항체, 1:500 농도에서 사용</td></tr><tr><td>항체, 항 케라틴 17</td><td>세포 신호 전달</td> <td># 4543</td><td>토끼 항체, 1 : 1,000 농도에서 사용</td></tr><tr><td>항체, 항 신경 필라멘트</td><td>세포 신호</td><td>C28E10</td><td>토끼 항체, 1:500 농도에서 사용</td></tr><tr><td>베타딘 준비 패드</td><td>Medline</td><td>MDS093917</td><td></td></tr><tr><td>Carprofen (Rimadyl)</td><td>Zoetis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>무선 충전식 클리퍼</td><td>Wahl</td><td>트리머 모델 8900</td><td></td></tr><tr><td>옥수수 기름</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8267</td><td></td></tr><tr><td>저온 유지 장치</td><td>Leica</td><td>CM1860</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D1306</td><td>1:1,000 농도에서 사용</td></tr><tr><td>데옥시콜레이트</td><td>시그마-알드리치</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>탈모 크림</td><td></td><td>Nair N/A</td><td></td></tr><tr><td>디메틸포라미드</td><td>시그마-알드리치</td><td>319937</td><td></td></tr><tr><td>디메틸 설폭사이드(DMSO)</td><td>시그마-알드리치</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>글루 타르 알데히드</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>ImmEdge 펜</td><td>벡터 연구소</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>케타민 HCl</td><td>Hospira</td><td>NDC 0409-2051-05</td><td></td></tr><tr><td>염화 마그네슘</td><td>시그마</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 커버 유리</td><td>VWR</td><td>48404-454</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 슬라이드</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>10% 중성 완충 포르말린</td><td>VWR</td><td>BDH0502-4LP</td><td></td></tr><tr><td>6-0 나일론 봉합사</td><td>DemeTECH</td><td>NL166012F4P</td><td></td></tr><tr><td>옥틸페닐-폴리에틸렌 글리콜</td><td>시그마-알드리치</td><td>I8896</td><td></td></tr><tr><td>OCT 화합물</td><td>사쿠라 티슈-텍</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>시그마-알드리치</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>포타슘 페로시아나이드</td><td>시그마-알드리치</td><td>P9387</td><td></td></tr><tr><td>포타슘 페리시아나이드</td><td>시그마-알드리치</td><td>702587</td><td></td></tr><tr><td>인산나트륨 일염기</td>성 <td>시그마-알드리치</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>인산나트륨 이염기</td><td>성 시그마-알드리치</td><td>S5136</td><td></td></tr><tr><td>자당</td><td>시그마-알드리치</td><td>84097</td><td></td></tr><tr><td>타목시펜</td><td>시그마-알드리치</td><td>T5648-1G</td><td></td></tr><tr><td>초미세 집게</td><td>Dumont</td><td>0103-5-PO</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H1000</td><td></td></tr><tr><td>X-gal</td><td>Roche</td><td>10 651 745 001</td><td>사용 전에 디메틸포라마이드에 용해시켜 50배 스톡 생성</td></tr></tbody></table>

탈 신경 외과 피부 : 피부 질환의 마우스 모델에서 신경에 대한 요구를 테스트하기위한 방법

Cutaneous Surgical Denervation:  A Method for Testing the Requirement for Nerves in Mouse Models of Skin Disease

피부 체성 감각 신경은 피부에 작용하는 다양한 자극을 감지하는 기능을 합니다. 신경은 감각적 역할을 하는 것 외에도 최근 연구에 따르면 신경은 아토피 피부염, 건선, 암을 포함한 피부 질환을 조절할 수도 있다고 합니다. 여기에서는 피부 기계감각 기관인 터치 돔(TD)을 유지하는 데 필요한 신경에 대한 요구 사항을 테스트하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 구체적으로, 전체 마운트 염색을 통해 TD를 유전적으로 라벨링, 수확 및 시각화하는 방법과 마우스의 등쪽 피부에 편측 외과적 탈신경을 수행하는 방법에 대해 논의합니다. 이러한 접근 방식을 함께 사용하여 동일한 동물의 탈신경성 피부와 가짜 수술 피부에서 TD 형태와 유전자 발현을 직접 비교할 수 있습니다. 이러한 방법은 또한 피부 병리학의 마우스 모델에서 신경에 대한 요구 사항을 검사하기 위해 쉽게 적용할 수 있습니다. 마지막으로, 피부를 반복적으로 샘플링할 수 있는 능력은 시작 후 다양한 단계와 시간에 질병 진행을 모니터링할 수 있는 기회를 제공합니다.

생성 타목시펜 - 유도 Gli1 CreERT2 - 발현 생쥐와 LacZ를 리포터 대립함으로써, TD 상피를 시각화하고 시간이 지남에 따라 이들 세포의 운명을 추적 할 수있다. 전체 탈 신경 절차는 통상적으로, 마우스 당 1 시간 내에 완료 될 수 있고, 동물에게 최소의 고통을 야기한다. 5,19 - 우리의 이전 연구는 신경이 정상 TDs를뿐만 아니라 관련 각질 8 + 메르켈 세포 (C도 3a)을 모두 유지하기위한 중요한 것을 나타낼. 신경도 TD (그림 3D)에 Gli1 식을 촉진하기위한 중요하다. 피부 (그림 1B)에 걸쳐 TD 클러스터의 비교적 드문 ...

이 기사에는 마우스 피부의 유전자 라벨링, 외과적 탈신경, 피부 생검 및 전체 마운트 β-갈락토시다아제 염색에 의한 라벨링된 상피 시각화에 대한 자세한 프로토콜이 포함되어 있습니다. 이러한 방법은 정상 및 병리학적 피부의 마우스 모델에서 신경에 대한 요구 사항을 테스트하는 데 사용할 수 있습니다.

Cutaneous somatosensory nerves function to detect diverse stimuli that act upon the skin. In addition to their established sensory roles, recent studies ...

이 절차의 전반적인 목표는 정상 및 병적 피부에 미치는 신경의 영향을 조사하는 것입니다. 이 방법은 피부 신경이 항상성과 질병에 영향을 미치는지와 같은 정상 피부 생물학의 핵심 질문에 답하는 데 사용될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 동일한 동물에서 온 온전한 피부 샘플과 신경이 제거된 피부 샘플을 비교할 수 있다는 점입니다.신경은 주변 조직에 가해지는 손상을 최소화하면서 인식하고 제거하기가 어려울 수 있으므로, 이 기술에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다. 먼저, 마우스를 마취하고 발가락 꼬집기(toe pinch)를 통해 적절한 진정 단계에 도달했는지 확인하십시오. 또한, 마우스의 호흡과 심박수가 정상인지 확인하십시오.이제 동물을 무균 수술 구역 내의 가온 패드 위에 올립니다. 전기 이발기를 사용하여 생검을 실시할 등 쪽의 털을 조심스럽게 제거합니다. 그다음 Betadyne과 알코올 솜을 사용하여 제모한 부위를 닦아냅니다.해당 부위에서 모든 깎인 털이 제거되었는지 확인하십시오. 이제 검은색 마커를 사용하여 생검 부위의 외곽선을 그립니다. 모낭의 종단면을 얻으려면, 생검 부위의 긴 가장자리가 등쪽 정중선과 평행하게 전후 방향으로 위치해야 합니다.메스를 사용하여 하부의 근막을 손상시키지 않도록 전층 절제를 수행합니다. 일반적으로 출혈은 최소 수준입니다. 생검 시료에는 표피, 진피, 피하 지방 및 판니쿨루스 카르노수스(panniculus carnosus)가 포함되어야 합니다.절제한 피부 샘플을 마른 종이 타월 위에 진피 쪽이 아래로 향하도록 하여 펴줍니다. 불필요한 종이 타월 부분을 잘라내고, 다른 샘플을 추가로 수집해야 하는 경우 샘플을 차가운 TBS에 담가 최대 1시간까지 보관합니다. 다시 생쥐로 돌아가, 생검 부위를 60 nylon 봉합사로 약 3 mm 간격으로 봉합합니다.그 후 마우스가 의식을 회복할 때까지 회복 케이지에서 관찰합니다. 지정된 기관 동물 관리 규정에 따라 진통제를 사용하고, 마우스가 고통스러워 보일 경우 해당 가이드라인을 따릅니다. 수술 후 7~10일 이내에 봉합사를 제거합니다.조직학적 분석 또는 전체 마운트 염색을 위해 생검 조직의 처리 과정을 진행합니다. 동물을 마취시키고, 등 전체의 털을 제모한 뒤 생검 절차와 유사하게 해당 부위를 세척합니다. 이제 멸균 메스를 사용하여 목 기저부부터 꼬리 위쪽으로 약 0.5 cm 지점까지 등 중앙선을 따라 절개합니다.멸균된 둔단 포셉을 사용하여 왼쪽 피부를 측면에서 부드럽게 젖혀, 목 근처의 견갑골 지방패드부터 뒷다리 바로 윗부분까지의 하부 조직을 시각화합니다. 이제 해부 현미경 하에서 등쪽 피부 신경을 식별합니다. 이 신경들은 흰색 가닥 형태로 나타나며, 몸통 벽의 반투명한 근막을 통해 꼬리 쪽으로 주행하다가 급격히 꺾여 피부 아래의 느슨한 결합 조직으로 들어갑니다.다음으로, 초미세 핀셋을 사용하여 해부학적 위치 T3에서 T12에 해당하는 동물의 왼쪽 신경만을 제거합니다. 신경 세그먼트가 몸통 벽에서 꺾이는 지점부터 피부로 들어가는 진입 지점까지 잡아당겨 제거합니다. 핀셋을 수직으로 세워 꺾이는 지점에서 약 0.5 cm 아래의 신경을 잡습니다. 잡은 후 위쪽으로 당겨 신경을 늘려 주변 조직과 분리하여 제거합니다.인접한 혈관이 손상되지 않도록 주의하십시오. 0.9% 생리식염수를 주기적으로 떨어뜨려 시술 과정 내내 조직이 촉촉하게 유지되도록 하십시오. 몸통 벽에서 피부로 뻗어 있는 모든 신경을 계속 제거하되, 몸통 벽의 조밀한 근막 내에 있는 신경은 손상시키지 마십시오.다음으로, 노출된 피부 플랩에서 신경을 제거합니다. 이 섬유들은 등쪽 피부 신경의 원위 분지들로, 피부 플랩의 진피 측 결합 조직 내에 산재한 흰색의 분지 형태로 나타납니다. 이러한 미세 분지들을 제거하려면 핀셋을 진피 표면과 거의 평행하게 배치하고, 신경을 잡아 위로 뽑아냅니다.이러한 방식으로 모든 가시적인 신경을 제거하십시오. 혈관과 피부를 천자하지 마십시오. 이 단계에서는 인접한 혈관이 파열되지 않도록 주의하는 것이 중요합니다.인접한 혈관이 있는 신경을 발견한 경우, 혈관이 없는 부위까지 계속 따라간 뒤 뽑아내어 제거하십시오. 이제 등쪽 중앙 절개선의 우측 피부를 느슨하게 하되, 신경은 제거하지 마십시오. 이 부위는 반대측 가짜 수술 대조군으로 사용됩니다.마지막으로 동물을 봉합하고 이전과 같이 수술 후 상태를 모니터링합니다. 이후 신경 손실이 안정적으로 유지되었는지 확인하기 위해, 수술 수주 후에 멸균 하이포더믹 바늘을 사용하여 신경이 제거된 부위를 가볍게 찌릅니다. 동물이 보통 몸을 떨거나 머리를 돌리는 방식으로 반응하는지 확인하십시오.피부 부위가 안정적으로 탈신경화되었다면, 동물은 반응이 거의 없거나 전혀 나타내지 않을 것입니다. 반응이 없는 부위와 반대편의 가짜 수술(sham) 부위에서 피부 생검 조직을 채취하여 각각 실험군 및 대조군 샘플로 매칭합니다. 생검 조직에서 여러 개의 조직 절편을 샘플링하여 가짜 수술 표본과 탈신경화 표본 간의 촉각 돔(touch dome) 풍부도 또는 형태의 잠재적 차이를 식별하는 것이 중요합니다.glebe one cree ERT2 마우스 계통을 이용하면 촉각돔 상피와 같이 hedgehog 경로 활성이 높은 피부 영역에 타목시펜 유도 유전자 재조합을 표적화할 수 있습니다. 이 마우스들을 induce abolaxi 리포터 마우스와 교배하여 촉각돔 상피를 시각화하였습니다. Node는 정상적인 촉각돔과 그와 연관된 메르켈 세포(Merkel cells) 모두를 유지하는 데 매우 중요합니다.이는 신경 절단 후 정상적인 촉각 돔(touch dome) 형태의 점진적인 소실뿐만 아니라 keratin 8이 침착된 세포의 소실을 통해 실험적으로 입증됩니다. 신경은 sham 및 신경 절단된 피부 모두에서 Glebe 1 cree ERE2 발현과 home-mount beta collective sided 염색으로 모니터링한 바와 같이, 촉각 돔 내 hedgehog 신호 전달을 촉진하는 데에도 필수적입니다. 이 영상을 시청하고 나면, 이러한 신경이 정상적인 피부 기능에 관여하는지 또는 질환을 조절하는지 테스트하기 위해 배측 피부 신경을 외과적으로 절제하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.이 기술을 숙달하면 동물에게 가해지는 스트레스를 최소화하면서 일상적이고 안정적으로 수행할 수 있습니다. 이 절차 이후에는 아미노 형광 염색과 같은 방법을 사용하여 신경이 피부에서 완전히 제거되었는지, 그리고 유전자 발현에 영향을 미치는지 확인할 수 있습니다.

cutaneous-surgical-denervation-method-for-testing-requirement-for

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

용서해주 신경 부상 동물 모델은 나머지 sural 신경은 그대로두고, tibial 및 일반 peroneal 신경 가지를 lesioning하여 좌골 신경의 부분 denervation 다음과 주변 neuropathic 고통의 마우스 모델로 여기에 설명되어 있습니다. 기계 allodynia 인한 행동 수정은 폰 프라이 필라멘트에 의해 계량입니다.

마우스에서 유도된 기계 Allodynia의 겪었던 신경 상해 (스니) 모델

이 비디오는 수술로 한쪽을 제거하고 다른 쪽은 대조군으로 남겨두어 마우스 모델의 감각 신경 기능을 테스트하는 방법을 보여줍니다. 기계적 자극에 대한 반응은 감각 신경의 역할을 확인시켜줍니다.

Testing Sensory Nerve Function in a Surgically Denervated Mouse 모델

경골 신경 절개 모델은 골격 근육 위축, 잘 용납 검증 및 재현성 모델입니다. 모델 수술 프로토콜은 C57Black6 마우스에 설명 설명된다.

경골 신경 절개 - 마우스의 탈 신경에 의한 골격근의 위축에 대한 표준 모델

신경 병증 성 통증은 체성 시스템에 영향을 미치는 장애 또는 질병의 결과이다. 생쥐의 신경 병증 성 통증의 "팔목 모델은"좌골 신경의 주요 지점 주위에 폴리에틸렌 커프스의 주입으로 구성되어 있습니다. 기계적 이질통은 본 프레이 필라멘트를 사용하여 테스트된다.

마우스의 신경 병증 성 통증의 좌골 신경의 바지를 접 모델

마우스의 안면 신경을 절개하거나 으깬 축삭 절개술을 수행하는 방법을 자세히 설명하는 수술 프로토콜을 제시합니다. 안면 신경 축삭 절개술은 신경 손상에 대한 생리적 반응을 연구하고 치료 기술을 테스트하는 데 사용할 수 있습니다.

마우스의 얼굴 신경 Axotomy : 부상으로 운동 신경 응답을 연구하는 모델

이 연구는 resiniferatoxin (RTX)와 순수한 작은 섬유 신경 병의 실험 모델을 설정합니다. RTX의 독특한 복용량 (50 µ g/k g)은 환자 특성을 모방 하는 작은 섬유 신경 모델을 개발 하기 위한 최적의 neuropathic 고통을 기본 nociceptive 분자 의미를 조사 하는 것을 도울 수 있었다.

일시적인 수용 체 잠재력 Vanilloid 타입-1의 Ultrapotent 주 작동 근의 순수한 작은 섬유 신경 병 마우스 모델 수립

수정된 수술은 생쥐 또는 쥐 보존 신경 손상 모델에 대한 단순화된 방법으로, 일반 비골 신경과 천성 신경을 모두 손상시키기 위해 한 번의 결찰과 한 번의 절개만으로 됩니다.

마우스의 신경병증성 통증에 대한 수정된 보존 신경 손상 수술 모델

부분 좌골 신경 결찰술은 열 및 기계적 자극에 대한 과장된 반응을 특징으로 하는 오래 지속되는 만성 신경병성 통증을 유발합니다. 이 신경병성 통증 마우스 모델은 일반적으로 통증 관리를 위한 혁신적인 치료법을 연구하는 데 사용됩니다. 이 기사에서는 표준화 및 재현성을 개선하기 위한 수술 절차에 대해 자세히 설명합니다.

부분 좌골 신경 결찰: 새로운 치료법의 항통각수용 효과를 연구하기 위한 만성 신경병성 통증의 마우스 모델

이 논문은 쥐에서 신경절 후 요추 교감신경 신경을 외과적으로 제거하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 절차는 원위 조직 표적에서 교감신경 분포의 역할을 조사하기 위한 다양한 연구를 용이하게 할 것입니다.

생쥐의 외과적 요추 교감신경 절제술

이 프로토콜은 인간 신경종 통증을 모방하고 외과적 치료를 평가하기 위해 감각 신경을 사용하는 재현 가능한 쥐 모델을 제시하여 중개 신경종 연구를 위한 귀중한 도구를 제공합니다.

복재 신경을 통한 표적 근육 재신경 분포를 사용하여 신경종 통증 치료 옵션을 연구하기 위한 새로운 외과적 설치류 모델

배우세요 마우스 피부의 유전적 라벨링, 외과적 탈신경술, 생검 방법을 활용한 정상 및 병리학적 피부에서 신경 역할을 연구하는 기법입니다. 이 방법은 동일 동물의 신경 존재와 제거 상태를 비교하여 피부 생물학 및 질병 메커니즘을 심도 있게 이해하는 데 필수적입니다.

탈 신경 외과 피부 : 피부 질환의 마우스 모델에서 신경에 대한 요구를 테스트하기위한 방법

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