변조 C 디 GMP가에서 시그널링 그건 작은 분자를 스크리닝하기위한 높은 처리량 설정 구축

이 절차의 전반적인 목표는 고효율 바이오 리포터 스크리닝을 통해 기회감염성 병원균인 Pseudomonas aeruginosa 내의 이차 전령인 cyclic-di-GMP의 세포 내 수준을 조절하는 소분자를 식별하는 것입니다. 이 방법은 cyclic-di-GMP 조절을 통해 Pseudomonas aeruginosa의 생체 정보 및 기타 입자들에 간섭하는 소분자를 찾아내는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 매우 견고하고 다재다능하여 48시간 이내에 3,500개 이상의 화합물을 스크리닝할 수 있다는 점입니다.

이 기술의 함의는 박테리아에 가해지는 선택적 압력을 낮추면서도, Pseudomonas aeruginosa를 면역 체계나 기존 항생제에 잠재적으로 감작시킬 수 있는 새로운 치료법 개발로 확장됩니다. P.aeruginosa 단일 콜로니를 5 mL의 lysogeny broth(또는 LB 배지)에 접종하고, 37 °C에서 200 rpm으로 진탕 배양합니다. 그 다음, 하룻밤 동안 배양한 배양액 2 mL를 1 L 플라스크에 담긴 200 mL의 신선한 LB 배지로 옮기고, 37 °C에서 200 rpm으로 진탕 배양합니다.

플라스크에서 1 milliliter 샘플을 취해 분광광도계로 측정함으로써 30분마다 600 nanometers에서의 광학 밀도(OD 600)를 모니터링합니다. OD 600이 0.3에서 0.5 사이에 도달하면, 배양액 40 millileters를 50 mililiter 원추형 원심분리관에 옮깁니다. 4 degrees Celsius에서 8000 rpm으로 10분 동안 원심분리하여 세포를 펠렛화합니다.

상층액을 버리고 세포를 40 milliliters의 얼음처럼 차가운 멸균 300 millimolar sucrose 용액에 재현탁합니다. 세포를 두 번째로 원심분리한 후, 20 milliliters의 얼음처럼 차가운 멸균 300 millimolar sucrose 용액에 재현탁합니다. 세포를 다시 원심분리하고 400 microliters의 300 millimolar sucrose 용액에 재현탁합니다. 세포를 얼음 위에서 30분 동안 냉각시키면 전기천공법(electroporation)을 수행할 준비가 됩니다.

다음으로, 얼음 위에서 미리 냉각시킨 1.5 milliliter 마이크로 원심분리 튜브에 준비된 P.Aeruginosa 전기 천공 유능 세포 40 microliters와 CdrA 프로모터 및 녹색 형광 단백질 인코딩 유전자가 포함된 plasmid 0.2 microgram per microliter 용액 1 microliter를 첨가합니다. 현탁액을 혼합한 후 미리 냉각시킨 2 millimeter 전극 간격의 전기 천공 큐벳으로 옮깁니다. 티슈로 큐벳 외부의 수분을 제거하고 큐벳을 전기 천공기의 샘플 챔버에 넣습니다.

2.5 kilovolts의 전압, 25 microfarad의 커패시턴스 및 200 ohms의 저항으로 용액에 펄스를 가합니다. 큐벳을 제거하고 LB medium 1 milliliter를 첨가합니다. 그런 다음, 세포를 멸균된 1.5 milliliter micro centrifuge tube로 옮기고 37 degrees Celsius에서 200 rpm으로 흔들어주며 2시간 동안 배양합니다.

배양 후, 배양액 10 µL, 50 µL, 100 µL 분주액을 Ampicillin이 첨가된 멸균 LB agar 플레이트에 도말하고 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 표준 GFP 채널을 갖춘 형광 현미경으로 플레이트를 관찰하여 GFP 발현을 확인합니다. 단일 콜로니를 선택하여 5 mL의 LB에 접종합니다. 하룻밤 배양 후, 2 mL 스크류 캡 튜브에 하룻밤 배양한 배양액 0.5 mL와 50% glycerol 0.5 mL를 혼합하여 -80 °C에서 보관합니다.

스크리닝 이틀 전, -80 °C 보관주에서 준비한 P.aeruginosa 균주를 멸균된 백금이를 사용하여 LB 한천 배지에 부드럽게 도말합니다. 배지를 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 스크리닝 전날 저녁, 배지에서 P.aeruginosa 단일 콜로니를 따서 튜브에 담긴 10 mL의 LB 배지에 접종합니다.

전배양액을 37°C에서 200 rpm으로 흔들어주며 하룻밤 동안 배양합니다. 스크리닝 당일에, 전배양액을 먼저 신선한 LB 배지로 희석하여 OD 600을 1.0으로 맞춘 후, 다시 5% LB로 희석하여 OD 600을 0.4로 맞추어 하위 배양액을 준비합니다. 용기에 멸균된 마그네틱 스터 바를 넣고, 마그네틱 교반기를 사용하여 실온에서 30분 동안 최소 속도로 배양액을 교반합니다.

이를 통해 박테리아가 384-well 플레이트에 분주되기 전 배지에 적응할 수 있습니다. 양성 대조군을 준비하려면, 준비된 하위 배양액 10 milliliters에 Tobramycin Sulfate 20 microliters를 첨가하고 부드럽게 혼합합니다. 양성 대조군 배양액 40 microliters를 A23번부터 P23번까지의 well에 피펫으로 분주합니다.

음성 대조군을 준비하려면, 준비된 하위 배양액 10 milliliters에 Dimethyl Sulfoxide 30 microliters를 첨가하고 부드럽게 혼합합니다. 음성 대조군 배양액 40 microliters를 A24에서 P24 웰까지 피펫으로 분주합니다. 저분자 화합물로 처리된 각 플레이트의 A1에서 P22 웰까지 희석된 하룻밤 배양액 40 microliters를 접종합니다.

플레이트를 공기 투과성 커버 씰로 밀봉하고 37 °C에서 6시간 동안 배양합니다. 결로 현상을 방지하기 위해 분광 광도 측정 약 30분 전에 플레이트 리더를 37 °C로 예열합니다. 측정 전 플레이트에서 공기 투과성 커버 씰을 조심스럽게 제거합니다.

그 다음, 웰당 10회 플래시 및 0.2초의 안정화 시간 설정으로 600nm 파장에서 광학 밀도를 측정합니다. 형광 측정 전, 음성 대조군인 A24 웰을 기준으로 자동 이득 및 초점 조절을 수행하고 이득 목표값을 75%로 설정합니다. 창 우측에서 초점 조절과 채널 A를 선택합니다. 웰당 10회 플래시 및 0.2초의 안정화 시간 설정으로, 들뜸 최대 파장 485nm 및 방출 최대 파장 520nm에서 GFP 리포터의 형광을 측정합니다.

검사한 모든 플레이트에서 데이터를 수집합니다. 데이터 판독값은 플레이트 리더 제어 소프트웨어에 의해 기본적으로 자동 저장됩니다. 데이터를 분석하려면 제어 소프트웨어 내의 Mars 아이콘을 클릭하여 통계 분석 패키지를 열고 판독값을 확인하십시오.

관심 있는 플레이트 번호를 더블 클릭하여 분석에 필요한 데이터를 검색합니다. 로버스트 Z-프라임(robust Z prime) 분석을 사용하여 분석법의 균일성과 재현성을 평가합니다. 그 후, 텍스트 프로토콜에 상세히 설명된 대로 성장 억제율(percent inhibition of growth)을 계산하고 세포 내 c-di-GMP 수준의 억제율을 평가합니다.

이 그림은 고효율 스크리닝의 OD 600 및 GFP에 대한 대표적인 원시 데이터를 나타냅니다. 웰 값에 대해 낮은 값에서 높은 값으로 갈수록 웜톤에서 쿨톤으로 변하는 색상 그라데이션 히트맵이 적용되었습니다. 생성된 데이터는 저해율(%)로 분석되었으며, 여기에는 OD 600과 GFP 판독값 모두에 대해 표시되었습니다.

성장 및 세포 내 c-di-GMP를 억제할 가능성이 있는 저분자 화합물은 녹색으로, 성장 및 세포 내 c-di-GMP 수치를 촉진할 가능성이 있는 저분자 화합물은 적색으로 표시되는 경향이 있습니다. 테스트한 각 저분자 화합물로부터 얻은 억제 백분율을 비교하기 위해 산점도가 활용됩니다. 각 저분자 화합물은 작은 점으로 표시되며, OD 600 및 GFP 판독값 각각에 대한 억제 백분율 분포가 나타나 있습니다.

히트(hit) 식별을 위해 ±50% 컷오프(cutoff)를 설정합니다. 잠재적인 히트는 빨간색으로 표시됩니다. 관심 화합물 각각에 대해 용량-반응 분석을 수행합니다.

본 실험에서는 확인된 두 가지 화합물을 최고 농도 2 mM 및 2배 희석 계열의 10개 농도 지점 용량-반응 분석(dose-response assay)으로 테스트합니다. 데이터를 4-매개변수 로지스틱 함수(four-parameter logistic function)에 피팅한 결과, 각 화합물의 반최대 억제 농도(half-maximal inhibitory concentration) 값은 각각 158 µM 및 193 µM로 나타났습니다. 이 기술을 숙달하면 48시간 이내에 3,500개 이상의 화합물을 스크리닝하는 데 사용할 수 있습니다.

이 영상을 시청한 후, 여러분은 cyclic-di-GMP 신호 전달을 방해하는 화합물을 찾기 위해 Pseudomonas aeruginosa를 견고하게 스크리닝하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 절차를 수행할 때, 여러 날에 걸쳐 스크리닝을 진행하는 경우 스크리닝 조건을 일정하게 유지하는 것이 중요합니다. 단일 농도 스크리닝(single-point screen) 이후 동일한 프로토콜을 사용하여 용량 반응 스크리닝(dose response screen)을 수행하면 히트 화합물(hits)을 검증할 수 있습니다.

이 기술은 Pseudomonas aeruginosa의 바이오필름 형성 및 항생제 내성을 방해하는 잠재적인 소분자를 식별할 수 있는 길을 연구자들에게 열어줍니다. 중요한 점은, 이 기술을 관심 있는 모든 박테리아에 맞게 조정하여 사용할 수 있으며, 박테리아 생존력에 미치는 영향과 같은 다른 출력 또는 입력 값을 조사하도록 수정할 수 있다는 것입니다. 마지막으로, Pseudomonas aeruginosa를 다루는 작업은 위험할 수 있음을 잊지 마십시오.

또한, 본 절차를 수행할 때는 항상 개인 보호 장구 착용과 같은 예방 조치를 취해야 합니다.