변조 C 디 GMP가에서 시그널링 그건 작은 분자를 스크리닝하기위한 높은 처리량 설정 구축 녹농균

이 절차의 전반적인 목표는 고처리량 바이오 리포터 스크리닝을 통해 기회감염 병원균인 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)에서 두 번째 메신저인 cyclic-di-GMP의 세포 내 수준을 조절하는 작은 분자를 식별하는 것입니다. 이 방법은 cyclic-di-GMP 조절을 통해 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 생물 정보 및 기타 입자를 방해하는 작은 분자를 밝히는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 이점은 아주 튼튼하고 다재다능하다 이어, 3개의, 48 시간 내의 500의 화합물의 상향 검열을 허용

이 기술의 의미는 녹농균, 면역 체계 또는 기존 항생제에 잠재적으로 민감하게 만드는 동시에 박테리아에 대한 덜 선택적인 압력을 가하는 새로운 치료법을 개발하는 데까지 확장됩니다. 5밀리리터의 용해성 육수 또는 LB 배지를 섭씨 7도의 P.aeruginosa의 단일 콜로니로 200rpm에서 진탕하여 접종합니다. 그런 다음 하룻밤 배양 2밀리리터를 1리터 플라스크에 담긴 200밀리리터의 새로운 LB 배지로 옮기고 200rpm으로 진탕하면서 섭씨 37도에서 배양합니다.

플라스크에서 1밀리리터 샘플을 채취하고 분광 광도계를 사용하여 검사하여 30분마다 600나노미터 또는 OD 600에서 광학 밀도를 모니터링합니다. OD 600이 0.3에서 0.5 사이에 도달하면 40밀리리터의 배양물을 50밀리리터 원추형 원심분리기 튜브에 넣습니다. 섭씨 4도에서 10분 동안 8000rpm으로 원심분리하여 세포를 펠렛

상등액을 버리고 40ml의 얼음처럼 차가운 멸균 300밀리몰 자당 용액에 세포를 재현탁합니다. 세포를 두 번째로 원심분리한 후, 20ml의 얼음처럼 차가운 멸균 300밀리몰 자당 용액에 재현탁하고, 세포를 다시 원심분리하고, 300밀리몰 자당 용액 400마이크로리터에 재현탁합니다. 세포를 얼음 위에서 30분 동안 식힌 후 전기천공을 할 준비가 됩니다.

다음으로, 얼음 위에서 미리 냉각된 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브에 준비된 P.Aeruginosa 전기 적격 세포 40마이크로리터에 녹색 형광 단백질을 암호화하는 유전자에 CdrA 프로모터를 인코딩하는 플라스미드의 0.2마이크로그램 용액 1마이크로리터를 추가합니다. 현탁액을 혼합하여 미리 냉각된 2mm 전극 갭 전기천공레이션 큐벳으로 옮깁니다. 티슈 페이퍼로 큐벳 외부의 수분을 제거하고 큐벳을 전기천공기의 샘플 챔버에 넣습니다.

2.5kV의 전압, 25마이크로패럿의 커패시턴트 및 200옴의 저항으로 용액을 펄스합니다. 큐벳을 제거하고 LB 배지 1ml를 추가합니다. 그런 다음 세포를 멸균 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고 200rpm으로 진탕하면서 섭씨 37도에서 2시간 동안 배양합니다.

배양 후 배양액 10마이크로리터, 50마이크로리터 및 100마이크로리터 분취액을 암피실린이 공급된 멸균 LB 한천 플레이트에 펴고 플레이트를 섭씨 37도에서 밤새 배양합니다. 표준 GFP 채널이 있는 형광 현미경으로 플레이트를 검사하여 GFP 발현을 확인합니다. 단일 군체를 선택하고 5ml의 LB를 접종합니다. 하룻밤 배양 후 2 밀리리터 스크류 탑 튜브에 0.5 밀리리터의 하룻밤 배양액과 0.5 밀리리터의 50% 글리세롤을 혼합하고 섭씨 영하 80도에서 보관합니다.

스크리닝 이틀 전, 멸균 접종 루프를 사용하여 플레이트 위에 박테리아를 부드럽게 펴서 섭씨 영하 80도 스톡에서 준비된 녹농균 균주를 LB 한천 플레이트에 플레이트합니다. 섭씨 37도에서 밤새 접시를 배양합니다. 스크리닝 전날 저녁, 플레이트의 P.aeruginosa 단일 콜로니를 튜브의 LB 배지 10ml에 접종합니다.

섭씨 37도에서 200rpm으로 흔들면서 밤새 사전 배양을 배양합니다. 스크리닝 당일에는 먼저 신선한 LB 배지로 1.0의 OD 600으로 희석한 다음 5%LB로 04의 OD 600으로 더 희석하여 하룻밤 사전 배양에서 하위 배양을 준비합니다. 멸균 자석 교반 막대를 용기에 넣고 실온에서 30분 동안 자석 교반기에서 최소 속도로 배양물을 교반합니다.

이를 통해 박테리아는 384웰 플레이트에 분배되기 전에 배지에 순응할 수 있습니다. 양성 대조군을 준비하려면 20마이크로리터의 토브라마이신 설페이트를 준비된 하위 배양 10ml에 첨가하고 부드럽게 혼합합니다. 40 마이크로 리터의 양성 대조군 배양을 웰 A23에서 P23으로 피펫팅합니다.

음성 대조군을 준비하려면 30 마이크로 리터의 Dimethyl Sulfoxide를 준비된 하위 배양 10 밀리리터에 첨가하고 부드럽게 혼합한다. 40 마이크로 리터의 negative control 배양을 A24에서 P24까지의 웰로 피펫팅합니다. 작은 분자로 감쇠된 각 플레이트에 대해 40마이크로리터의 부피로 희석된 하룻밤 배양물을 웰 A1에서 P22까지 접종합니다.

공기 투과성 커버 씰로 플레이트를 밀봉하고 섭씨 37도에서 6시간 동안 배양합니다. 분광광도계 측정 약 30분 전에 응결을 방지하기 위해 플레이트 리더를 섭씨 37도로 예열합니다. 읽기 전에 플레이트에서 통기성 커버 씰을 부드럽게 제거하십시오.

그런 다음 600나노미터의 파장에서 웰당 10번의 플래시를 설정하고 0.2초의 안정화 시간을 측정하여 광학 밀도를 측정합니다. 형광을 측정하기 전에 네거티브 컨트롤 웰 A24를 기반으로 자동 게인 및 초점 조정을 수행하고 게인 목표 값을 75%로 설정합니다.창 오른쪽에서 초점 조정과 채널 A를 선택합니다. GFP 리포터의 형광을 최대 485나노미터의 여기와 최대 520나노미터의 방출로 측정하고 웰당 10회의 플래시 설정 및 0.2초의 안정화 시간을 측정합니다.

검사한 모든 플레이트에서 데이터를 수집합니다. 데이터 판독값은 플레이트 리더 제어 소프트웨어에 의해 기본값으로 자동 저장됩니다. 데이터를 분석하려면 제어 소프트웨어 내의 Mars 아이콘을 클릭하여 통계 분석 패키지를 열어 판독값을 확인하십시오.

관심 있는 플레이트 번호를 두 번 클릭하여 데이터를 검색하면 분석을 위한 데이터에 액세스할 수 있습니다. 강력한 Z 프라임 분석을 사용하여 분석의 균일성과 재현성을 평가합니다. 그런 다음 성장 억제 퍼센트를 계산하고 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 c-di-GMP의 세포 내 수준 억제 퍼센트를 평가합니다.

이 그림은 고처리량 스크린에서 OD 600 및 GFP에 대한 대표적인 원시 데이터를 설명합니다. 낮은 값에서 높은 값을 나타내는 hot to cool 색상이 있는 color gradient heat map이 well 값에 적용되었습니다. 생성된 데이터는 퍼센트 억제에 대해 분석되며 OD 600 및 GFP 판독 모두에 대해 여기에 표시됩니다.

잠재적으로 성장 및 세포 내 c-di-GMP를 억제하는 작은 분자는 녹색인 경향이 있는 반면, 잠재적으로 성장 및 세포 내 c-di-GMP 수준을 촉진할 수 있는 작은 분자는 빨간색인 경향이 있습니다. 산점도는 테스트된 각 소분자에서 얻은 억제율을 비교하는 데 사용됩니다. 각 작은 분자는 작은 점으로 표시되며 각 OD 600 및 GFP 판독값에 대한 퍼센트 억제 분포가 표시됩니다.

히트 식별을 위해 플러스 또는 마이너스 50% 컷오프가 선택됩니다. 잠재적 히트는 빨간색으로 강조 표시됩니다. 용량 반응 분석은 각 흥미로운 화합물에 대해 수행됩니다.

여기에서 식별된 두 가지 화합물은 최고 농도가 2밀리몰이고 2배 희석 시리즈로 10점 용량 반응 분석에서 테스트됩니다. 데이터에 4개의 매개변수 로지스틱 함수를 피팅하면 158마이크로몰과 193마이크로몰의 각 화합물에 대해 절반의 최대 억제 농도 값이 산출되었습니다. 일단 숙달되면, 이 기술은 3개, 48 시간 내의 500의 화합물의 정상을 검열하기 위하여 이용될 수 있다.

이 동영상을 시청한 후에는 cyclic-di-GMP 신호 전달을 방해하는 화합물에 대해 녹농균을 강력하게 스크리닝하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 절차를 시도하는 동안 며칠에 걸쳐 스크리닝할 때 스크리닝 조건을 비교할 수 있도록 유지하는 것이 중요합니다. 단일 포인트 화면에 이어 동일한 프로토콜을 사용하여 dirsk 응답 화면을 실행하면 적중을 검증할 수 있습니다.

이 기술은 연구자들이 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)의 이중 정보 및 항생제 내성을 방해하는 잠재적인 소분자를 식별할 수 있는 길을 열어줍니다. 중요한 것은 이 기술을 관심 있는 모든 박테리아에 사용하도록 조정할 수 있으며 박테리아 생존력에 미치는 영향과 같은 다른 출력 또는 입력을 검사하도록 수정할 수 있다는 것입니다. 마지막으로, 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)으로 작업하는 것은 위험할 수 있다는 것을 잊지 말자.

그리고 이 절차를 수행할 때는 항상 개인 보호 장비 착용과 같은 예방 조치를 취해야 합니다.