높은 처리량, 높은 콘텐츠, 액체 기반의 C. 선 충 Pathosystem

이 방법은 다양한 독성 인자의 중요성 및 소분자가 발생과 함께 개선하는 능력과 같은 숙주 병원체 상호 작용 및 약물 발견에 대한 질문에 답할 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 소량의 액체 형식으로 수행된다는 것입니다. 먼저 BSL 2 생물 안전 캐비닛 내부에서 작업하는 동안 얼린 스톡에서 P.aeruginosa를 LB Agart 플레이트에 줄무늬로 만듭니다.

플레이트를 37°C에서 16-24시간 동안 배양한 다음 최대 1주일 동안 섭씨 4도에서 플레이트를 보관합니다. 분석 플레이트를 설정하기 2일 전에 플레이트의 단일 콜로니를 사용하여 3-5ml의 멸균 LB 육수를 접종합니다. 섭씨 37도에서 12-16시간 동안 배양합니다.

텍스트 프로토콜에 따라 슬로우 킬 또는 SK 배지를 준비한 후, 신선한 하룻밤 LB 배양에서 얻은 녹농균 350ml를 사용하여 각 10cm SK 플레이트를 파종합니다. 멸균 박테리아 스프레더를 사용하여 박테리아를 고르게 퍼뜨리고 플레이트가 생물 안전 캐비닛에서 건조되도록 합니다.

그런 다음 섭씨 37도에서 24시간 동안 플레이트를 배양합니다. 24웰 깊이의 웰 플레이트의 단일 웰에서 여러 RNAi 박테리아 균주를 병렬로 테스트하려면 이전에 준비된 RNAi 함유 박테리아의 각 클론에서 단일 콜로니를 4밀리리터의 카르베니실린 보충 LB에 접종합니다. 플레이트를 섭씨 37도, 950rpm의 멀티웰 플레이트에 최적화된 진탕 인큐베이터에 16시간 동안 넣은 다음 2, 000g에서 5분 동안 원심분리하여 박테리아를 수집합니다. 플레이트를 뒤집고 세게 흔들어 상층액을 디캔팅합니다.

100마이크로리터의 S Basal을 사용하여 RNAi 박테리아를 재현탁시킵니다. 재현탁 박테리아를 IPTG와 카르베니실린이 보충된 멀티웰 NGM 플레이트의 적절한 수의 웰에 피펫팅하고 플레이트를 건조시킵니다. 텍스트 프로토콜에 따라 L1 웜을 준비한 후, RNAi 또는 OP50 슈퍼푸드로 파종된 10cm 플레이트당 약 5, 000개의 웜을 피펫팅하여 기본 실험을 위한 플레이트를 준비합니다.

RNAi 스크리닝을 설정하려면 RNAi가 파종된 24웰 플레이트에 웰당 약 300개의 웜을 피펫팅합니다. 사용 중인 균주가 온도 멸균인 경우 약 16시간 동안 섭씨 15도에서 기생충을 배양한 다음 44시간 동안 섭씨 25도로 옮겨 발달을 완료하고 배발생을 방지합니다. 액체 사멸 분석을 수행하려면 세포 스크레이퍼를 사용하여 SK 플레이트에서 녹농균을 제거하고 약 5ml의 S.Basal에 박테리아를 재현탁시킵니다.

분광 광도계를 사용하여 박테리아 현탁액의 OD 600을 측정합니다. 09와 동일한 OD 600에서 S.Basal에 P.Aeruginosa의 희석된 스톡 24ml를 준비한 다음 21ml의 액체 SK 배지를 추가하고 멀티채널 피펫을 사용하여 45마이크로리터의 박테리아와 배지를 384웰 플레이트의 각 웰로 옮깁니다. 근원에서 벌레를 50ml 원뿔형 튜브로 씻고 중력에 의해 정착되도록 합니다.

상층액을 5ml로 흡인시킨 다음 총 50ml의 S.Basal을 사용하여 벌레를 재현탁시키고 세척을 두 번 더 반복합니다. 웜 분류기를 사용하여 텍스트 프로토콜에 따라 약 22개의 웜을 384웰 플레이트의 각 웰로 분류한 다음 가스 투과성 필름을 사용하여 플레이트를 밀봉하고 섭씨 25도에서 24-48시간 동안 배양합니다. 원하는 시간에 마이크로플레이트 세척기와 S.Basal을 사용하여 384웰 플레이트를 총 5회 세척합니다.

가장 쉬운 실수 중 하나는 웜이 완전히 가라앉기 전에 384웰 플레이트를 흡인하는 것입니다. 벌레가 완전히 정착했는지 정확하게 확인하려면 연습이 필요합니다. 최종 세척 후 상층액을 20마이크로리터까지 흡입합니다.

그런 다음 웰당 50마이크로리터의 98마이크로몰 핵산 염색을 추가하여 최종 농도 0.7마이크로몰을 만듭니다. 플레이트를 실온에서 12-16시간 동안 배양합니다. 원하는 배양 기간이 끝나면 마이크로플레이트 세척기를 사용하여 플레이트를 최소 3회 세척합니다.

데이터 수집의 경우 분광 광도계 또는 자동 현미경을 사용하여 투과광과 형광을 모두 이미지화하십시오. 웰당 300개의 웜이 들어 있는 24웰 플레이트의 웰당 1밀리리터의 S Basal을 추가합니다. 플레이트를 흔들어 벌레를 부드럽게 교반한 다음 벌레를 비어 있는 멸균 24 깊이의 웰 플레이트로 옮깁니다.

지렁이가 중력에 따라 약 5분 동안 정착하도록 합니다. 상등액을 흡입하고 웰당 약 1밀리리터를 남겨두고 각 웰에 7밀리리터의 S 기초를 추가합니다. 세척을 두 번 더 반복한 다음 최종 세척 후 약 400마이크로리터의 상층액을 제외한 모든 것을 흡인합니다.

굶주림을 피하기 위해 박테리아를 384웰 플레이트에 피펫팅한 후 웜 분류기의 리샘플러 기능을 사용하여 22개의 웜을 384웰 플레이트의 각 웰로 분류합니다. 마지막으로, 분류 후 작은 분자 또는 기타 실험 특정 재료를 추가합니다. 이 그래프에서 볼 수 있듯이, 이 비디오에 요약된 단계를 따를 때, 예쁜꼬마선충의 시간 의존적 살해는 녹농균이 있는 곳에서만 관찰될 것입니다.

대조적으로, 주요 박테리아 영양 보충제가 없는 경우 살해가 거의 또는 전혀 관찰되지 않습니다. 여기에서 볼 수 있듯이, 기존의 느린 사멸 분석에 중요하고 원래 액체 사멸에서 구현되었던 P.aeruginosa를 섭씨 37도와 섭씨 25도에서 2단계 배양하는 것은 이 분석에서 필수적입니다. 이 프로토콜은 0025와 같은 OD 600의 낮은 농도에서 광범위한 초기 박테리아 농도를 허용하며, 타이밍이 변경되기는 하지만 여전히 시간과 농도에 따른 사멸을 나타냅니다.

또한 4개의 우물만으로도 통계적으로 유의미한 데이터를 얻기에 충분한 경우가 많습니다. 처리 유용성의 예는 신호 대 잡음 비율이 높을 때 여기에 표시되며, 이 예에서와 같이 분석이 간단하고 양수 조건과 음수 조건을 구별하는 것이 간단합니다. 이러한 경우 약한 타격도 쉽게 식별할 수 있습니다.

이 기술을 마스터하면 분류를 포함하지 않고 384웰 플레이트당 약 60-75분 동안 수작업으로 수행할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 모든 구성 요소를 미디어에 추가해야 하며 그렇지 않으면 독성이 손상될 수 있음을 기억하는 것이 중요합니다. 이 분석은 숙주 병원체 연구에서 약물 발견에 대한 전체 유기체 표현형 기반 스크리닝의 적용을 단순화합니다.

이 동영상을 시청한 후에는 액체 기반 예쁜꼬마선충 발병 분석을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 절차는 녹농균(P.Aeruginosa)을 E.Faecalis로 대체하여 다른 박테리아 감염에 대한 치료법을 쉽게 찾을 수 있도록 다른 병원체로 대체하여 수정할 수 있습니다. 녹농균(P.Aeruginosa) 또는 E.파에칼리스(E.Faecalis)와 같은 감염성 박테리아와 함께 일하는 것은 위험할 수 있다는 것을 잊지 말자.

이 절차를 수행하는 동안 항상 적절한 교육, 우수한 개인 보호 장비 및 적절한 기술과 같은 적절한 예방 조치를 취해야 합니다.