Name: 높은 처리량, 높은 콘텐츠, 액체 기반의 C. 선 충 Pathosystem (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: 배우세요 C. elegans를 이용한 액체 기반 고처리량 병원체-숙주 상호작용 분석법을. P. aeruginosa 감염 모델로 약물 발굴 및 독성인자 연구에 활용할 수 있는 효율적인 스크리닝 기법입니다.

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이 연구는 국립 연구소의 건강 K22 AI110552 NVK에 게 수 여 및 암 예방 연구 텍사스 연구소 (CPRIT) 수상 RR150044, 웰 치 재단 연구 그랜트 C-1930 년에 의해 지원 되었다. Funders 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 결정 게시 또는 원고의 준비에 전혀 역할을 했다.

주의: 피 녹 농 균 과 E. faecalis 는 Biosafety 수준 2 병원 체, 그리고 우연한 감염을 방지 하 고 표면 오염 최소화 하기 위해 적절 한 안전 조치는가지고 야 한다. 모든 미디어 자료와 병원 균에 접촉 해야 합니다 수 소독 및/또는 삭제. 추가 지침 CDC 간행물 Biosafety Microbiological 및 생물 의학 실험실 (BMBL), 5 판에서에서 사용할 수 있습니다.
1. 준비 및 피 녹 농 균 의 유지 보수
<ol><li>파운드 (Lysogeny 국물) 한 천 배지 위에 냉동된 재고에서 행진 P. 녹 농 균 37 ℃에서 16 ~ 24 h를 품 어 참고: BSL-2 생물 안전 캐비닛 무 균을 보장 하기 위해 내부 P. 농 균 실험을 수행 합니다. 병원 성 감염 또는 오염 가능성을 최소화 하기 위해 적절 한 안전 조치를 사용 합니다.</li>
	<li>4 ° c.에이 접시를 전송 이 접시 4 ° C에서 유지 고 1 주일 문화를 예방 하는 데 사용 될 수 있습니다. 1 주일 후 오염을 제거 하 고 접시를 버리고 새로운 파운드 조 흔 격판덮개를 만들. 참고: 피 녹 농 균 독성 장기간된 보관 후 감소합니다.</li>
	<li>분석 결과 접시를 설정 하기 전에 2 일 1.1에서 만든 접시에서 피 녹 농 균 에의 한 식민지와 살 균 파운드 국물의 3-5 mL 접종. 12 ~ 16 h 37 ° C에서 품 어. 참고: 16 h 이상 품 어 하지 마십시오. 풍부한 액체 문화에서 P. 농 균 PA14 lyse 하기 시작 합니다.</li>
	<li>천천히 죽 일 미디어와 함께 살 균 10 cm 접시를 준비 (3 세대 NaCl, 3.5 g 펩, 1mm CaCl2, 1 mM MgSO4, 인산 염 버퍼의 25 mL (리터 당 금액: 132 mL K2HPO4 (1 M)의 고 KH2포4 (1 M)의 868 mL)와 18 g 천/L). 참고: 미리 접시를 준비 합니다. 그들은 최대 3 주까지 4 ° c.에 밀폐 용기에 저장할 수 있습니다.</li>
	<li>각 10 cm 느린 죽 플레이트 (SK 판) P. 녹 농 균 의 신선한 하룻밤 파운드 문화에서 350 μ와 씨앗 살 균 세균 분산기를 사용 하 여 미디어의 표면에 걸쳐 균일 하 게 박테리아를 확산 하 고 BSL-2 생물 안전 캐비닛에 건조를 허용 합니다.</li>
	<li>24 h에 대 한 37 ° C에서 접시를 품 어.</li>
</ol>2입니다. RNAi 박테리아의 준비
<ol><li>밖으로 행진 또는 냉동된 재고에서 적절 한 항생제 (100 µ g/mL에서 carbenicillin) 및 Ahringer와 비 달 라이브러리 15 µ g/mL에서 항생물질을 포함 하는 파운드 한 접시에 RNAi를 포함 하는 박테리아의 핀 전송 원하는 변종. 참고: nonpathogenic 박테리아를 작업할 때 사용 하거나 BSL-2 A / B 생물 안전 캐비닛 또는 BSL-1 층 류 후드 문화의 무 균을 보장 하 고 라이브러리의 교차 오염의 가능성을 최소화 하기 위해.</li>
	<li>37 ° c.에 24 h에 대 한 번호판을 품 어</li>
	<li>2 주 동안 4 ° C에서 접시를 저장.<ol>
<li>2 주 후 번호판을 삭제 하 고 갓 만든 번호판 교체.</li>
	</ol>
</li>
	<li>24 잘 깊은 잘 격판덮개의 단일에서 파운드 carbenicillin 보충의 4 mL 또는 멸 균 시험관에 각 복제에서 단일 식민지를 개별적으로 접종 하 여 동시에 여러 RNAi 긴장을 테스트 합니다. 참고: 항생물질은 RNAi의 효율성을 감소 시키기 위하여 알려졌다. 이 미디어에 그것을 사용 하지 마십시오.</li>
	<li>24 잘 깊은 잘 격판덮개 multiwell 격판덮개를 위한 최적화 된 떨고 인큐베이터에 배치 하 고 950 rpm에서 떨고 있는 동안 16 h 37 ° C에서 품 어. 참고: 그것은 기존의 떨고 인큐베이터를 사용 하 여 multiwell 격판덮개에 균일 한 박테리아의 성장을 얻기 어렵다입니다. 떨고 인큐베이터에서 제대로 성장 하는 문화에 대 한 순서로 750 rpm의 최소 흔들 수 있이 필요가 있다. 특수 셰이 커의 부재에서 개별 튜브에서 각 문화를 성장 가능 하다. 원하는 경우 문화 그 후, 원심 분리에 대 한 24-잘 접시로 옮겨질 수 있다.</li>
	<li>2000 x g에서 5 분간 centrifuging 여 박테리아를 수집 합니다.</li>
	<li>접시를 반전 하 고 적극적으로 흔들어 하 여 상쾌한을 가만히 따르다. RNAi 박테리아의 S 기저 (5.85 g NaCl, 1 g K2HPO4, 6 g KH2포4 초순 물 1 L에 녹이 고 압력솥에 의해 소독) 100 µ L resuspend</li>
	<li>NGM multiwell 격판덮개의 우물의 적절 한 수로 resuspended 박테리아를 플라스틱 (선 충 류 성장 매체, 3 세대 NaCl, 2.5 g 펩, 1mm CaCl2, 1 mM MgSO4, 인산 염 버퍼의 25 mL (리터 당 금액: 132 mL K2HPO4 (1 M) 그리고 KH2포4 (1 M)의 868 mL), 및 물의 리터 당 18 g 천) IPTG (1mm 최종 농도)와 carbenicillin (100 μ g/mL 최종 농도) 보충.<ol>
<li>6 잘 플레이트, 24-잘 접시의 우물 당 1 mL 또는 96 잘 접시의 당 150 µ L의 당 NGM 미디어의 3.5 mL를 사용 합니다.</li>
		<li>6 잘 플레이트;에 대 한 박테리아의 100 μ/잘 사용 50 μ/잘 24-잘; 또는 96 잘 접시 20 μ/잘. 건조를 허용 합니다. 참고: 건조 신속, 균일 한 건조를 촉진 하는 살 균 흐름 후드에서 정상적으로 수행 됩니다. 균일 건조 하는 것은 매우 중요 하다입니다. 벌레의 소리를 내는 agar에 균열 촉진으로 지나치게 건조 하지 마십시오. 웜 및 액체 처리 시스템의 잠재적인 막힘을이 끈다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>준비 된 접시를 사용 하 여 즉시 또는 나중에 사용에 대 한 최대 2 주 동안 그들을 4 ° C에서 저장. 참고: 접시 밖으로 건조 하지 않도록, 그들은 수 수 파라핀 플라스틱 필름으로 밀봉 또는 젖은 종이 타월로 단단히-밀폐 된 용기에 배치.</li>
</ol>3. 유지 보수 및 C. 선 충 의 준비
참고: 실험을 시작 하기 전에 생성 벗, 성인 자웅 동체 벌레의 동기화 된 인구 다음과 같습니다.
<ol><li>세척 벗 성인 (즉, 여러 개의 배아 생식 내 표시와 함께) 4-6-10cm NGM 번호판 플레이트, 부드럽게, 소용돌이 그리고 다음 15 mL 원뿔 튜브에 붓는 S 기저의 4 mL를 추가 하 여 15 mL 원뿔 튜브로에서.</li>
	<li>30 초 동안 1000 x g에서 원심 분리를 통해 웜 작은</li>
	<li>Aspirate 상쾌한, 웜 펠 렛을 방해 하지 않도록 주의 복용</li>
	<li>웜 표 백제 솔루션의 3.5 mL을 추가 (최종 농도 0.5 M NaOH, 살 균 물에 1% 염소) 웜 펠 릿을 1 분에 대 한 반전에 의해 혼합.</li>
	<li>짧게 소용돌이 고 30 초 동안 1000 x g에서 원심 분리기.</li>
	<li>발음 또는 웜 펠 렛을 방해 하지 않도록 주의 복용 상쾌한 가만히 따르다.</li>
	<li>웜 펠 릿에 신선한 웜 표 백제 솔루션의 3.5 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>적극적으로 혼합 표 백제 솔루션에서 벌레. 주기적으로 (약 매 10 초) 육안으로 직접 검사 해 현미경 벌레. 계란을 풀어 휴식, 웜 손톱에 대 한 감시. 성인 벌레의 대부분 해산된 (~ 95%) 되어, 일단 S 기저 막을 소화와 15 mL에 표 백제를 희석. 참고: 달걀 껍질은 성인 조직 보다 표 백제에 저항 하지만 그들은 장기간된 노출 시 녹을 수 있다. 계란 해체를 방지 하려면 표 백제 솔루션 7 분 이상 벌레 계란을 노출 하지 마십시오. 달걀 껍질은 과도 하 게 손상 된 경우, 태아 죽을 것 이다.</li>
	<li>30 초 동안 1000 x g에서 배아를 작은 발음 또는 배아의 펠 릿을 제거 하지 않고는 상쾌한 가만히 따르다.</li>
	<li>나머지 표 백제 솔루션을 희석을 S 15 mL의 최종 볼륨을 기저에 벌레를 resuspend.</li>
	<li>4 연속 세척의 총에 대 한 세척 단계 (3.9-3.10) 3 번 이상 반복 합니다.</li>
	<li>4 세척 후 상쾌한 발음 하 고 15 mL 원뿔 튜브로 살 균 S 기저의 5 또는 6 mL 추가 합니다. 목표는 배아 µ L 당 50 ~ 벌레의 농도를 resuspend 것입니다. 참고: S 기저의 금액; 계란 펠 릿의 크기에 따라 달라 집니다. 큰 펠 릿 더 S 기저는 필요 합니다.</li>
	<li>하룻밤 실 온에서 테이블 탑 회전 또는 15 ° c.에서 48 h에 원뿔 튜브를 품 어 애벌레는 부 화 하지만 애벌레 개발 L1 단계 (L1 diapause) 영양소 부족 때문에 체포 됩니다.</li>
	<li>그들의 대부분 부 화 하 고 개발의 L1 단계에서 체포는 확인 해 현미경 배아를 검사 합니다.</li>
	<li>웜 준비의 20 µ L S 기저의 80 µ L와 희석 함으로써 웜 수를 결정 합니다. 빈 NGM 접시에 직접 희석된 웜 솔루션의 10 µ L 플라스틱 2 번 더 반복 합니다.<ol>
<li>각 자리에 애벌레를 계산 하 고 평균 수를 결정 합니다. 이 평균 웜 준비 µ L 당 벌레의 대략적인 개수를 2로 나눕니다. 웜 preps 전파 격판덮개 또는 실험에 대 한 사용할 수 있습니다. 참고: 4-5 일 후 굶 어 애벌레 시작 됩니다 죽을; 이 시점에서 준비를 삭제 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>변형 전파, L1 웜 (5000-6000) 3-4 10-cm NGM 접시에 적절 한 수와 함께 발견 하는 피 펫 OP50 대장균- "superfood" 집중 (대장균 OP50 25 X 농도에서 발견 (즉, 1 L 1 박 OP50의 LB에서 성장 하는 문화 수익률 25 X OP50 superfood의 40 mL); 이 집중된 세균 현 탁 액 2 mL 각 10 cm NGM 접시에 발견).</li>
	<li>실험에 대 한 접시를 준비 하려면 ("기본 프로토콜" 사용 3.17.1 설치, "RNAi 스크린 설정" 사용 단계 3.17.2-적절 한 3.17.4에 대 한)에 대 한 다음 중 하나를 수행 합니다.<ol>
<li>피 펫 ~ 5000 웜/10 c m 플레이트 RNAi 또는 OP50 superfood로 시드.</li>
		<li>피 펫 ~ 500 웜/잘 6 잘 플레이트 RNAi와 시드.</li>
		<li>피 펫 ~ 300 웜/잘 24-잘 접시에에서 RNAi와 시드.</li>
		<li>피 펫 ~ 100 웜/잘 96 잘 접시에에서 RNAi와 시드. 참고: RNAi는 시드 방법에 대 한 지침을 참조 하십시오 단계 2.7-2.9 RNAi 박테리아의 준비에서.</li>
	</ol>
</li>
	<li>벌레의 비옥한 변형 사용 되 고, 품 어 벌레 ~ 44-48 h. 사용에 대 한 25 ° C에서이 벌레 가능한 한 빨리 후 인구는 적절 한 나이 도달 했습니다. 이 분석 결과 중 벌레 내에서 부 화 계란의 영향을 최소화 합니다.</li>
	<li>변형 사용 하는 경우는 살 균 온도 (예: fer-15(b26); fem-1(hc17) 또는 glp-4(bn2)), 벌레 ~ 16 h 15 ° C에서 품 어와 다음 44 h 개발을 완료 하 고 embryogenesis를 방지를 위한 25 ° C에 전송.</li>
</ol>4. 액체 분석 결과 설치 (기본 프로토콜)을 죽이
참고: 이것은 하나의 박테리아 스트레인과 벌레의 한 소스에 대 한 프로토콜입니다.
<ol><li>셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여 SK 접시에서 피 녹 농 균 을 제거 하 고에 resuspend ~ S 기저의 5 mL. 필요한 경우 규모. (OD600) 분 광 광도 계를 사용 하 여 세균 현 탁 액의 광학 밀도 측정</li>
	<li>S 기저 OD600 ≈ 0.09에 (3 배 최종 농도)에 피 녹 농 균 의 희석된 증권의 24 mL를 준비 합니다. 잘, 당 최종 콘텐츠 4.6.2 참조 하 고 따라 세균 희석의 볼륨을 확장할.</li>
	<li>액체 느린 죽 미디어 (3 g의 NaCl, 펩/L CaCl2 와 1 m m의 최종 농도에 MgSO4 보완의 3.5 g) 21 mL를 추가 합니다. 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여, 박테리아와 미디어의 45 µ L 384-잘 접시의 각 잘 전송.</li>
	<li>50 mL 원뿔 관으로 (즉, 단계 3.17.1) 그들의 소스에서 벌레를 세척 하 고 벌레를 중력 아래 정착을 허용. 5 mL에 상쾌한 발음 Resuspend 50 mL S의 총 기초</li>
	<li>4.4 단계를 두 번 반복 합니다.</li>
	<li>웜 정렬을 사용 하 여, 약 22 웜 384-잘 접시의 각 음에 정렬 합니다. 참고: 설치 ~1.1 µ L의 액체에서 각 벌레를 삭제합니다. 22 벌레 25 µ L, 총 분석 결과 볼륨 70 µ L/잘 데리고 도달할 것 이다.<ol>
<li>각 잘의 최종 구성 구성 70 µ L. 45이이 볼륨의 µ L 세균성 매체로 추가 (24 µ L S 기초, 및 21 µ L SK에서에서 0.03 OD600 박테리아 CaCl2 와 MgSO4보충). 다른 25 µ L 22 벌레와 함께 추가 됩니다.</li>
		<li>정렬 사용 하는 경우 여기 ( 재료의 표참조)는 사용할 수 없습니다, 웜 웜 1 µ S 기저 에/L pipetted 25 µ L/잘 사용 하 여 멀티 채널 피 펫의 최종 농도에 희석 수 있습니다. 그러나, 결과 증가 다양성을 전시할 지도 모른다. 또는, 양조위와 동료19에 설명 된 대로 연동 액체 디스펜서를 사용 하 여 가능 하다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>벌레 384-잘 접시에 정렬 되었습니다, 후 가스 투과성 필름으로 접시를 봉인 하 고 24-48 h 25 ° C에서 번호판을 품 어.</li>
	<li>원하는 시간에 사용 하 여 microplate 세탁기 S 기저와 384-잘 접시 세척 5 회 총.<ol>
<li>두 번째 세척 후 발음 미디어의 대부분, 격판덮개 우물의 아래에서 어떤 파편 든 지를 풀고 30 초 이상 microplate vortexer를 사용 하 여 흔들 ~ 20 µ L. 적극적으로 떠나).</li>
	</ol>
</li>
	<li>최종 세척, 20 µ L. 추가 50 µ L 0.98 µ M 핵 산의 아래 aspirate 상쾌한 얼룩 ( 재료의 표참조) 후 / 384-잘 접시 0.7 µ M의 최종 농도 대 한의.</li>
	<li>12-16 h에 대 한 실 온에서 품 어. 이 염료는 죽은 벌레를 얼룩만 것 이다. 원하는 잠복기, 후 microplate 세탁기를 사용 하 여 어떤 과잉을 제거 하는 세척 접시 (최소 3 세척) 얼룩.</li>
	<li>데이터 수집을 위한 이미지 전송된 빛과 형광 (531 nm 여기 및 593 방출) 하는 분 광 광도 계 또는 자동화 된 현미경을 사용 합니다.<ol>
<li>낮은 배율 목표를 사용 하 여 이미지 캡처 전체 잘 수 있도록.</li>
		<li>또는, 흐름 vermimetry를 사용 합니다. 이 기술은 크기와 강하게 cytometry 비슷한 패션에 (즉, C. 선 충) 모든 생물의 형광 측정 웜 fluorimeter 대형 개체 흐름 cytometer를 사용 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>자동된 이미지 분석 소프트웨어 (예: CellProfiler, MatLab <a href="http://cellprofiler.org/">http://cellprofiler.org/</a>에 따라 무료 이미지 분석 스튜디오)을 사용 하 여 형광 및 총 웜 지역 편견된 패션에 잘 당 계산 하. 참고:이 숫자의 지 수 각 잘 분수 죽음을 나타냅니다. 하나 잘 했다면 7 스테인드 20 개 벌레 총, 0.35 또는 35%를 구성 하는 분수 죽음 다음.<ol>
<li>처음 사용 전에 수동 채 점 하 여 자동된 이미지 처리 파이프라인의 유효성을 검사 해야 합니다. 이것은 자동화 된 파이프라인에서 점수 시각 이미지를 검사 하 고 그들 각각의 죽은 벌레의 분수를 기록 하 여 얻은 결과 비교 하 여 이루어집니다. 유효성 검사 프로세스 보장 자동된 이미징 처리에 대 한 매개 변수가 정확 하 고 올바르게 데이터를 표현 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 여러 심사 C. 선 충 종자 또는 Knockdowns (RNAi 스크린 설치)에 대 한 적응
참고: 이것은 24-잘 접시 설치에 대 한 설명 하는 RNAi 스크린입니다.
<ol><li>24-잘 접시의 당 S 기저의 1 mL를 추가 (하십시오 단계 3.17.3 참조). 부드럽게 접시를 떨고 하 여 벌레를 선동 한 다음 웜 빈, 살 균 24 깊은 잘 격판덮개 전송. 웜 (~ 5 분)가 정착을 허용 합니다.</li>
	<li>약 1 mL을 떠나 상쾌한 발음 각 우물에 S 기초의 7 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>5.1-5.2 최소 2 번의 단계를 반복 합니다. 최종 세척 후 상쾌한 약 400 µ L를 떠나 발음.</li>
	<li>웜 분류 리샘플러 함수를 사용 하 여, 384-잘 접시 (384-잘 접시의 24-잘 접시 수익률 8-12 우물의 각 잘)의 각 음에 24-잘 플레이트 웜 정지에서 22 웜 정렬.<ol>
<li>정렬 전에 기아, 384-잘 접시 (OP50, 같은 음식, 전적으로 긴장 또는 병원 성 긴장)으로 피 펫 박테리아 방지를 위해. 참고: 병원 균은 2.3-2.5 또는 6.4 6.5 다음 단계 및 음식 소스 박테리아 그리고 희석 수 피 녹 농 균에 대해서 동일한 체계에 따라 추가 추가할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>후 웜 384-잘 접시에 정렬 되었습니다, 작은 분자 또는 다른 실험 관련 자료를 추가 합니다.</li>
</ol>6입니다. E. faecalis 에 대 한 적응
참고: 피 녹 농 균 분석 결과에서 차이만 설명 합니다.
<ol><li>BHI (두뇌 심 혼 주입) 한 천 배지 위에 냉동된 재고에서 박테리아를 질주 하 고 37 ° c.에 16 ~ 24 시간 배양 하 여 E. faecalis 의 신선한 소스 준비 참고: BSL-2 생물 안전 캐비닛 무 균을 보장 하기 위해 내부 E. faecalis 실험을 수행 합니다. 병원 성 감염 또는 오염 가능성을 최소화 하기 위해 적절 한 안전 조치를 사용 합니다.</li>
	<li>플레이트 4 ° C에서 최대 1 주일까지 저장할 수 있습니다. 이 기간 후 신선한 접시를 바꿉니다.</li>
	<li>웜, 정렬 하기 전에 밤 접종 3-5 mL의 단일 식민지와 살 균 BHI E. faecalis. 동요와 함께 37 ° C에서 12-16 h를 품 어.</li>
	<li>P. 녹 농 균 (3 x 박테리아에 S 기초, OD600≈0.09)에 관해서는 우물에 박테리아를 추가 합니다. 참고: E. faecalis, 최종 잘 구성입니다: E. faecalis (OD600≈0.03), BHI = 10 %v / v, 나머지 볼륨 S 기저의 구성. 기억 25 µ L S 기저의 벌레와 함께 전달 될 것 이다. 참고: E. faecalis 흐린된 이미지를 일으키는 형광 얼룩을 흡수 하는 두꺼운 biofilms를 생성 합니다. 광범위 한 세척이이 biofilm를 제거 하는 데 충분 하지 수 있습니다. 이 경우 웜 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 빈 접시를 전송할 수 있습니다. 촉진 하기 위해 전송, 트윈 20 0.1% (v/v) 트윈 20 S 기저에 최종 농도에 S 기저에 추가할 수 있습니다. 이 biofilm에서 벌레를 제거에 원조.</li>
</ol>

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<li>Beanan, M. J., Strome, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+germ-line+proliferation+mutation+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Characterization of a germ-line proliferation mutation in C. elegans.</a> Development. 116 (3), 755-766 (1992).</li>
</ol>

저자 들은 공개 관심 없음 충돌 선언 합니다.

이 분석 결과 (또는 다른 병원 체 피 농 균 또는 E. faecalis대체 됩니다 유사한 분석 실험)는 다양 한 약물 발견을 포함 하 여 목적에 대 한 유용 합니다. 그것은 또한 독성 요인, 호스트 방어 통로의 설명을 식별 하 고 호스트 병원 체 상호 작용에 관련 된 규제 기계를 확인 하 여 근본적인 생물학 질문을 해결 하는 데 유용.
P. 농 균 액체 죽이 분석 결과 강력한, 실패의 기회를 최소화 하기 위해 주의 지불 한다 어디 몇 가지 포인트가 있다. 첫째, 앞에서 언급 했 듯이, 피 녹 농 균 예방 접종에 대 한 세균 소스 접시 박테리아 독성, 파운드에서 하룻밤 성장에도 불구 하 고 분실 하지 않도록 신선한, 유지 되어야 합니다. 둘째, 칼슘 및 마그네슘 P. 농 균 죽이 분석에 추가 다는 것을 확인 하는 키입니다. 그것 없이, 독성은 크게 손상 될 것입니다. 마지막으로, 그것은 (RNAi 기...

식별 및 효과적인, 넓 스펙트럼 항생제의 개발 지금 거의 한 세기 전, 공중 보건에 분수령에 지도 되었다 대폭적인 신념 그 전염 성 질병 과거의 채찍 질 될 것 이라고. 짧은 몇 십년 내이 낙관론 병원 체 병원 체 개발이 한번 기적 치료 제한 저항 메커니즘 후로 지 러 지기 시작 했다. 몇 시간 동안, 약 발견 노력와 병원 체 사이 군비 경쟁 균형 잡힌 듯. 그러나, 항균의 오용은 최근 불러 팬-약물 내성 변종의 Klebsiella 균, Acinetobacter baumanii, Serratia marcescens및 피 농 균1의 출현 2,,34.
P. 녹 농 균 은 편의적, 그램 네거티브, 멀티 호스트 병원 체 사람 immunocompromised, 또는 낭 성 섬유 증가지고 심한 화상 환자에 게 심각한 위협입니다. 그것은 또한 점점 더 심한 병원내 감염, 특히 항균 성 저항의 지속적인 인수 때문에 원인이 되는 대리인으로 식별 됩니다. 이 위협을 해결 하기 위해 시작, 우리는 문서화 C. 선 충-P. 녹 농 균 감염 시스템5를 사용 했습니다. 연구소는 호스트6죽 일 하는 병원 체의 기능을 제한 하는 새로운 화합물을 식별 하는 액체-기반, 높은 처리량, 높은 콘텐츠 심사 플랫폼을 개발 하는 것이 시스템을 활용 했다. 글에,이 화합물 제7 과 독성 억제제8을 포함 하 여 적어도 3 개의 일반적인 범주에 속하는 것 같다. C. 선 충 에서 다른 높은 콘텐츠 약물 발견 분석 진 균 tuberculosum, 클 라 미디 아 속 trachomatis, Yersinia pestis, Listeria monocytogenes, Francisella tularensis, 황색 포도상구균, 칸디 다 albicans, 보고 되었습니다 및 Enterococcus faecalis, 다른 사람의 사이에서9,10,11,12,13,14,,1516. 분석 실험의이 유형은 몇 가지 잘 인식된 장점이, 호스트와 병원 체, 화학 스크린과 넘어 안타를 식별 하는 기능에 비해 생체 이용률의 증가 가능성에 독성이 있을 수 있습니다 거짓 긍정적인 조회 수 제한 등 단순히 안티-virulents, 면역 물질로 분자, 또는 그렇지 않으면 전 찬성 호스트 병원 체 상호 작용의 균형을 기울일 화합물 등 미생물 성장을 제한. 또한,이 화면에서 발견 된 화합물은 종종 포유류 호스트에 효과적입니다.
그것은 적어도 두 개의 다른 분석 실험17,18 액체에서 C. 선 충 에서 높은 처리량 화면 수행 수 있습니다 지적 가치가 있다. 그러나,이 분석 실험은 원형 장 식민지 분석 결과, 액체에서 느린-살인로 알려진 있도록 수정 처리량을 증가 하 고 더 쉽게 상영 하는 화합물을 수 있도록. 주의 특성화는 결정적으로 세균 독성의 기계 장치는 이러한 분석 및 우리의 액체 기반의 화면7사이 설명 했다. 이후 두 가지 유형의 독성 포유류 시스템에서 관찰 된다, 그것은 어떤 독성 결정은 분석 결과 선택 이전 실험의 관심사에 대 한 가장 관련성이 높은 고려 하는 것이 중요.
여기 우리가 액체 기반으로 최적화 된 버전을 보여 농 균 선 충-P. C. 분석 결과. 우리는 또한 그람 양성 세균성 병원 체에 맞게 우리의 액체 기반의 분석 방법의 적응을 보고 Enterococcus faecalis. P. 녹 농 균, 같은 E. faecalis 점점 항균 성 저항 경로1의 성장 군비와 심각한 병원내 위협으로 식별 됩니다. E. faecalis 의 높은 처리량 검열에 대 한 이전 방법14존재, preinfection는 절차 복잡 하 고 COPAS FlowSort 같은 장비를 오염 하는 가능성을 증가 병원 체와 함께 필요 합니다. 우리의 프로토콜 안전 프로필 개선 사전 감염에 대 한 필요가 없다. 마지막으로, 우리는 이러한 분석 중 결합 될 수 있다 먹이의 설립에 있는 역할을 할 호스트 요소에 대 한 검색 사용자 수 있도록 RNAi 또는 감염에 저항 하는 수단을 보고 합니다.

<table><tbody><tr><td>COPAS FP BioSorter</td><td>Union Biometrica</td><td></td><td>대형 객체 유세포 분석기/웜 분류기</td></tr><tr><td>Cytation 5</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EL406 워셔 디스펜서</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multitron Pro</td><td>Infors HT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>24 Deep-Well RB Block</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>CS15124</td><td></td></tr><tr><td>384-Well plate</td><td>Greiner Bio-One</td><td>MPG-781091</td><td></td></tr><tr><td>선충 성장 매체(NGM)</td><td></td><td></td>리터<td>당 양: 한천 18g, NaCl 3g, 펩톤 2.5g, CaCl 1mL2(1M), 1mL MgSO4(1M), 25mL 인산염 완충액 및 milli-Q water</td></tr><tr><td>SK(Slow Killing) 플레이트</td><td></td><td></td> <td>973mL리터당 양: 한천 18g, NaCl 3g, 펩톤 3.5g, CaCl 1mL2(1M), 1mL MgSO4(1M), 25mL 인산염 완충액 및 973mL의 milli-Q water</td></tr><tr><td>Slow Killing(SK) 매체</td><td></td><td></td><td>리터당 양:&nbsp; NaCl 3g, 펩톤 3.5g, CaCl2 (1M), 1mL MgSO4(1M), 25mL 인산염 완충액 및 milli-Q 물</td></tr><tr><td>용원 육수(LB)</td> <td>973mLUSBiological Life Sciences</td><td>L1520</td><td></td></tr><tr><td>Brian Heart Infusion Broth(BHI)</td><td>Research Products International Corp</td><td>50-488-526</td><td></td></tr><tr><td>웜 표백제 용액</td><td></td><td></td><td>100mL당 양: 5M NaOH 용액 10mL, 5% 차아염소산나트륨 용액 20mL, 멸균수 S 70mL</td></tr><tr><td>S 리터당 기본</td><td></td><td></td><td>양: NaCl 5.85g, KH2PO4 1g, K2HPO4 1g, 및 1리터의 milli-Q 물</td></tr><tr><td>한천</td><td>USBiological Life Sciences</td><td>A0930</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>USBiological Life Sciences</td><td>S5000</td><td></td></tr><tr><td>Peptone</td><td>USBiological Life Sciences</td><td>P3300</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>USBiological Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>M63-500</td><td></td></tr><tr>리터당 <td>인산염 완충액</td><td></td><td></td><td>양: K2HPO4 132mL(1M) 및 KH2PO4(1M) 868mL</td></tr> <tr><td>KH2PO4</td><td>Acros Organics</td><td>7778-77-0</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>USBiological Life Sciences</td><td>P5100</td><td></td></tr><tr><td>5% 차아염소산나트륨 용액</td><td>BICCA</td><td>7495.5-32</td><td></td></tr><tr><td>NaOH 솔루션</td><td>Fisher Scientific</td><td>SS255-1</td><td></td></tr><tr><td>호흡이 쉬운</td><td>다양한 생명 공학</td><td>BEM-1</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX 오렌지 핵산 염색</td><td>Fisher Scientific</td><td>S11368</td><td></td></tr><tr><td><강한>박테리아 균주</강한></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P. 녹농균 (PA14)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>E. faecalis(OG1RF)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>E. coli superfood (OP50)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>E. coli RNAi 발현 박테리아 (HT115)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Worm Strains </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>glp-4(bn2) (Beanan and Strome, 1992, PMID: 1289064)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PINK-1::GFP 리포터 (Kang et al., 2018, PMID: 29532717)</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

높은 처리량, 높은 콘텐츠, 액체 기반의 c. 선 충 pathosystem

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

식별 하는 새로운 약물의 수에 의해 전통, 생체 외에서 스크린 쇠퇴 하고있다, 여러 약물 저항에 대처 하기 위해 새로운 무기에 대 한 검색에이 접근의 성공을 감소. 이 연구원은 새로운 약물을 찾는 데만 필요 하지 않습니다 하지만 또한 그들을 찾는 새로운 방법을 개발 해야 결론을 주도하 고 있다. 가장 유망한 후보자 사이 메서드는 전체 유기 체, vivo에서 분석 실험을 사용 하 여 높은 처리량, phenotypic 판독 Danio rerio 꼬마 선 충 에서 그 범위를 호스팅합니다. 이러한 호스트는 호스트 또는 biounavailable 독성 화합물을 일반적으로 비용이 많이 드는 따라 하기 전에 초기 화면에서 삭제 됩니다 거짓 긍정적인 안타에서 극적인 절감 등 여러 가지 강력한 이점이 있다.
여기에 우리가 어떻게 우리의 분석 결과 문서화 C. 선 충에서 호스트 변화를 심문 하는 데 사용 되었습니다 표시-녹 농 균 죽이 액체 pathosystem. 우리는 또한 잘 밖으로 일이 기술의 몇 가지 확장을 보여 줍니다. 예, 우리이 호스트 병원 체 상호 작용에서 쿼리 호스트 요인 플레이트 형식 높은 처리량 유전 스크린 24 또는 96 잘 RNAi를 사용 하 여 수행할 수 있습니다. 이 분석 결과 사용 하 여, 불과 몇 개월만에, 극적으로 힘 드는 생물 정화 방법에 대 한 필요 없이 잠재적으로 약물 표적을 식별 하는 작업을 단순화 수 있는 전체 게놈 스크린을 완료할 수 있습니다.
우리 또한 그람 양성 박테리아 Enterococcus faecalis 그람 음성 병원 체 피 녹 농 균에 대 한 대체 하는 우리의 방법의 변형 여기 보고 합니다. 많은 경우 처럼 피 녹 농 균에 대 한, E. faecalis 에 의해 죽이 시간 종속적입니다. 이전 선 충 C.달리-E. faecalis 분석 실험, 우리의 분석 결과 E. faecalis 팬 들은 preinfection의 정보 필요로 하지 않습니다, 그것의 안전 단면도 개선 및 액체 처리 장비를 오염 하는의 가능성을 감소. 분석 결과 매우 강력 하 고, ~ 95% 사망률 96 h 포스트 감염을 보여주는.

분석 결과 성능에 대 한 중요 한 매개 변수
이 분석 결과 기본 생물학에 대 한 적절 한 이해는 문제 해결 및 분석 결과 최적화 필요 합니다. 이 위해, 우리 몇 가지 주요 논문 elucidating P. 녹 농 균의 pathogenesis의 메커니즘에 먼저 참조-죽이 액체7,20중재. 위에서 설명 하는 단계 (분석 결과 프로토콜의 회로도 그림 1 참조) 뒤에 C. 선 충 의 시간에 따라 살해 병원 체 (그림 2A)의 존재만 관찰 됩니다. 반면, 주요 영양 보조 제 (예를 들어, 는 펩은 미...

여기 우리는 적응, 전체 호스트, 호스트 병원 체 상호 작용을 공부 하 고 신약 사용을 활용할 수 있는 도구를 높은 콘텐츠 심사 하는 프로토콜을 설명 합니다.

높은 처리량, 높은 콘텐츠, 액체 기반의 C. 선 충 Pathosystem

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to ...

이 방법은 다양한 독성 인자의 중요성 및 소분자가 발생과 함께 개선하는 능력과 같은 숙주 병원체 상호 작용 및 약물 발견에 대한 질문에 답할 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 소량의 액체 형식으로 수행된다는 것입니다. 먼저 BSL 2 생물 안전 캐비닛 내부에서 작업하는 동안 얼린 스톡에서 P.aeruginosa를 LB Agart 플레이트에 줄무늬로 만듭니다.플레이트를 37°C에서 16-24시간 동안 배양한 다음 최대 1주일 동안 섭씨 4도에서 플레이트를 보관합니다. 분석 플레이트를 설정하기 2일 전에 플레이트의 단일 콜로니를 사용하여 3-5ml의 멸균 LB 육수를 접종합니다. 섭씨 37도에서 12-16시간 동안 배양합니다.텍스트 프로토콜에 따라 슬로우 킬 또는 SK 배지를 준비한 후, 신선한 하룻밤 LB 배양에서 얻은 녹농균 350ml를 사용하여 각 10cm SK 플레이트를 파종합니다. 멸균 박테리아 스프레더를 사용하여 박테리아를 고르게 퍼뜨리고 플레이트가 생물 안전 캐비닛에서 건조되도록 합니다.그런 다음 섭씨 37도에서 24시간 동안 플레이트를 배양합니다. 24웰 깊이의 웰 플레이트의 단일 웰에서 여러 RNAi 박테리아 균주를 병렬로 테스트하려면 이전에 준비된 RNAi 함유 박테리아의 각 클론에서 단일 콜로니를 4밀리리터의 카르베니실린 보충 LB에 접종합니다. 플레이트를 섭씨 37도, 950rpm의 멀티웰 플레이트에 최적화된 진탕 인큐베이터에 16시간 동안 넣은 다음 2, 000g에서 5분 동안 원심분리하여 박테리아를 수집합니다. 플레이트를 뒤집고 세게 흔들어 상층액을 디캔팅합니다.100마이크로리터의 S Basal을 사용하여 RNAi 박테리아를 재현탁시킵니다. 재현탁 박테리아를 IPTG와 카르베니실린이 보충된 멀티웰 NGM 플레이트의 적절한 수의 웰에 피펫팅하고 플레이트를 건조시킵니다. 텍스트 프로토콜에 따라 L1 웜을 준비한 후, RNAi 또는 OP50 슈퍼푸드로 파종된 10cm 플레이트당 약 5, 000개의 웜을 피펫팅하여 기본 실험을 위한 플레이트를 준비합니다.RNAi 스크리닝을 설정하려면 RNAi가 파종된 24웰 플레이트에 웰당 약 300개의 웜을 피펫팅합니다. 사용 중인 균주가 온도 멸균인 경우 약 16시간 동안 섭씨 15도에서 기생충을 배양한 다음 44시간 동안 섭씨 25도로 옮겨 발달을 완료하고 배발생을 방지합니다. 액체 사멸 분석을 수행하려면 세포 스크레이퍼를 사용하여 SK 플레이트에서

a-high-throughput-high-content-liquid-based-c-elegans-pathosystem

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

의 액체 기반 culturing 및 분배를위한...

형광등과 높은 처리량 검사 및 Biosensing C. 엘레간스 레인스

우리가 사용하는 프로토콜을...

의 정량 및 자동화된 고속 처리량 게놈 전체의 RNAi 화면 C. elegans</em

연구원들은 벌레가 감지하고 반응하는 전기장을 적용하여 예쁜꼬마선충에서 주문형 움직임을 유발할 수 있습니다. 이 비디오는 전기 전술 거동을 소개하고 미세 유체 장치에서 수행되는 샘플 프로토콜을 보여줍니다.

Electrotaxis Assay: 예쁜꼬마선충(C. elegans)의 이동을 관찰하는 방법

이 기사는 유충의 이동을 모니터링하여 독성 화합물에 대한 제브라피쉬의 행동 반응을 설명합니다. 이 프로토콜은 환경 오염 물질에 대한 제브라피시 유충의 반응 예를 더 자세히 살펴봅니다.

Larval Locomotion Assay: 제브라피시 유충에서 화합물의 신경행동 독성을 연구하기 위한 고처리량 방법

출처: Anderson, Q. L. et al. 고처리량, 고함량, 액체 기반 C. elegans 병리 시스템. J. Vis. 경험. (2018년)이 비디오는 숙주-병원체 상호 작용 중 유전자 녹다운을 연구하기 위해 Caenorhabditis elegans 를 사용하는 고처리량 스크리닝 방법을 보여줍니다. 녹다운 웜을 준비하고 이를 분석 플레이트로 옮겨 병원체 유발 웜 사멸의 효과를 평가하는 절차를 간략하게 설명합니다.

C. elegans 녹다운 스크리닝을 위한 멀티웰 액체 기반 분석

출처: Anderson, Q. L., et al. 고처리량, 고함량, 액체 기반 C. elegans 병리 시스템. J. Vis. 경험. (2018년)이 비디오는 유전자 변형 C. elegans 유충이 마이크로플레이트에서 병원성 박테리아에 노출되는 액체 기반 분석을 보여줍니다. 배지에 분비된 박테리아 독소는 숙주 스트레스와 사멸을 유도합니다. 형광 염료는 죽은 벌레를 염색하여 이미징 기반 사망률 정량화를 통해 유전적 감수성 또는 내성을 평가할 수 있습니다.

C. elegans 유충의 병원성 박테리아 유발 사망률 평가

우리는 생식계열 독성을 평가하는 데 사용되는 선충 Caenorhabditis elegans에서 고처리량 화학 분석의 세부 단계를 설명합니다. 이 분석법에서는 화학 물질 노출에 따른 생식세포 기능의 중단을 이수성 배아에 특이적인 형광 리포터를 사용하여 모니터링합니다.

선충을 사용하여 생식선 화학 독성의 종합 평가<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em

여기에서 우리는 생활 C 에서 고해상도 현미경, 전산 도구 및 단일 세포 라벨링을 사용 하 여 조합 접근법을 제시 합니다. 신경 발달 중에 단일 세포 역학을 이해 하는.

등방성 라이트 시트 현미경 검사 및 자동 세포 계보 분석을 통해 아닌 간 분해능을 통한 배아 발생 발생

이 작품은 한 번의 하룻밤 실행에 80-100 C. 예쁜 꼬마 배아에서 배아의 동시 3D 시간 경과 영상을 허용하는 반 높은 처리량 프로토콜을 설명합니다. 또한 데이터 분석을 간소화하기 위해 이미지 처리 및 시각화 도구가 포함되어 있습니다. 사용자 정의 리포터 균주와 이러한 방법의 조합은 배아 발생의 상세한 모니터링을 가능하게.

C. elegans 배아 개발을 분석하는 세미 고처리량 이미징 방법 및 데이터 시각화 툴킷

이 프로토콜은 배아 후 발달 전반에 걸친 미세유체 기반 예쁜꼬마선충(C. elegans ) 타임랩스 이미징을 설명합니다.

모든 유충 단계에서 이미징하는 고해상도 C. elegans

여기에서는 ImageJ와 같은 이미지 분석 소프트웨어에서 후속 사용을 위해 광시야 현미경 이미지에서 개별 웜의 자동 분할을 위해 개발한 딥 러닝 시스템인 SegElegans를 효과적으로 활용하는 방법에 대한 지침을 제공합니다. 온라인과 오프라인 모두에서 시스템을 사용할 수 있는 방법을 제공합니다.

SegElegans를 사용한 C. elegans 형광 이미지의 자동 분석

배우세요 C. elegans를 이용한 액체 기반 고처리량 병원체-숙주 상호작용 분석법을. P. aeruginosa 감염 모델로 약물 발굴 및 독성인자 연구에 활용할 수 있는 효율적인 스크리닝 기법입니다.

높은 처리량, 높은 콘텐츠, 액체 기반의 C. 선 충 Pathosystem

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