멀티 효소 높은 처리량 유전자 효소 검사 시스템을 사용하여 상영

이 방법론의 전반적인 목표는 단일 고처리량 스크리닝 시스템을 사용하여 여러 효소를 평가하는 것입니다. 이 방법은 미생물 및 생명공학 분야에서 메타유전체 스크리닝 및 효소 공학에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 우리는 페닐렌 화합물을 담당하는 MPL 돌연변이로 구성된 유전 효소 스크리닝 시스템과 다운스트림 GFP 리포터를 개발했습니다.

일단 어떤 메타게놈 유전자든지 제공된 기질과 반응해서 우리의 관심사의 효소 활동을 보여주면, 반응 산물의 페닐렌 화합물은 Dmp 돌연변이체를 활성화하고 형광 미터에 의해 쉽게 포획될 수 있는 GFP 리포터 표정을 방아쇠를 당깁니다. 이 기술의 주요 장점은 기존 스크리닝 기술과 달리 이 단일 방법은 적절한 기질을 사용하여 여러 유형의 서로 다른 효소를 스크리닝하는 데 적용할 수 있다는 것입니다. 이 절차를 시연하는 사람은 우리 연구실의 대학원생인 Kil Koang Kwon입니다.

fosmid library production kit를 사용하여 fosmid 벡터로 E.Coli에서 metagenomic library를 구축한 후, pGESS(E135K)DNA를 metagenomic library cells로 운반합니다. 그런 다음 형질전환된 라이브러리 셀을 섭씨 영하 70도와 20마이크로리터 분취액에서 보관합니다. 거짓 양성(false positive)을 제거하려면 먼저 균유전체학(metagenomic) 라이브러리 세포 부분 표본을 얼음 위에서 해동합니다.

그런 다음 암피실린과 클로람페니콜이 함유된 2밀리리터의 리소겐레이트 배지에 10마이크로리터의 세포를 14밀리리터 원형 바닥 튜브에 넣고 섭씨 37도, 200rpm에서 4시간 동안 접종합니다. 한편, 기본 FACS 소프트웨어에서 메타유전체학(metagenomic) 라이브러리 셀을 읽기 위해 FACS 기계에서 적절한 매개변수를 설정합니다. 배양이 끝나면 5 밀리리터의 둥근 바닥 튜브에서 5 마이크로 리터의 세포를 1 밀리리터의 PBS로 옮깁니다.

그런 다음 희석된 라이브러리 샘플을 로드하고 이벤트 속도를 초당 1000에서 1500개의 이벤트로 조정합니다. 글로벌 워크시트에서 로그 스케일의 전방 산점도와 로그 스케일의 측면 산포 영역 산점도를 생성하려면 점도표를 만들고 박테리아 집단을 포함하는 singlet 이벤트 주위에 폴리곤 게이트를 그립니다. 로그 스케일링 FITC 영역 히스토그램에 대한 셀 수를 플로팅하려면 히스토그램을 열고 종 모양 분포의 피크가 2개의 FITC 영역에 대해 10보다 작도록 FITC 전압을 조정합니다.

다음으로, 또 다른 점도표를 열어 로그 스케일링 전방 산란 영역 대 로그 FITC 영역 플롯을 만들고 분포 중심에서 셀의 플러스 5%와 마이너스 5% 사이에 R2 정렬 게이트를 설정합니다. 모든 게이트가 설정되면 1.2ml의 항생제가 보충된 용해성 육수가 들어 있는 수집 튜브를 FACS 기기 배출구에 놓고 게이트 세포의 10배에서 6분의 1을 육수로 분류합니다. 종류가 끝나면 수집 튜브를 덮고 세포를 부드럽게 소용돌이칩니다.

관심 있는 메타유전체 효소를 스크리닝하려면 OD600이 0.5에 도달할 때까지 분류된 세포를 섭씨 37도 및 200RPM에서 배양한 다음 1마이크로리터의 복제 유도 용액을 추가하여 세포 내 포스미드 복제 수를 증폭합니다. 섭씨 37도 및 250RPM에서 3시간 후 0.5밀리리터의 셀을 14밀리리터 둥근 바닥 튜브의 적절한 기질과 결합하여 100마이크로몰의 최종 농도를 얻습니다. 그런 다음 대조군 및 실험 샘플을 섭씨 37도 및 200RPM에서 다시 3시간 동안 배양합니다.

샘플이 흔들리는 동안 방금 설명한 대로 FACS 기계 매개변수를 설정합니다. 그런 다음 각 샘플에서 5마이크로리터의 세포를 1ml의 PBS가 들어 있는 개별 5ml 원형 바닥 튜브에 추가합니다. 다음으로, 샘플 셀을 로드하고 이벤트 속도를 초당 1000에서 3000 이벤트로 설정합니다.

로그 스케일된 전방 산란 영역과 로그 스케일된 측면 산란 영역 산점도를 생성하고 일중항 이벤트 박테리아 세포를 포함하도록 R1 산란 게이트를 조정합니다. 그런 다음 로그 스케일의 전방 산점도 대 로그 스케일의 FITC 면적 산점도를 생성하고 음수 셀이 0.1% 미만으로 검출되도록 R2 정렬 게이트를 설정합니다. 이제 샘플 튜브를 로드하고 필요에 따라 이벤트 속도를 초당 1000-3000 이벤트로 다시 조정합니다.

그런 다음 0.5ml의 lysogenate broth가 들어 있는 수집 튜브를 FACS 기기 배출구에 놓고 R1 및 R2 게이트 내에서 10-4번째 세포를 수집합니다. 모든 세포가 분리되면 수집 튜브를 덮고 세포를 부드럽게 소용돌이치게 합니다. 그런 다음 수집된 샘플 0.5ml를 항생제가 보충된 lysogenate 육수가 들어 있는 두 개의 90mm 한천 플레이트에 펴 바른 다음 섭씨 37도에서 밤새 플레이트를 배양합니다.

이 그림에서는 네거티브 정렬에 의한 거짓 긍정 제거와 R1 및 R2 정렬 게이트를 사용한 포지티브 히트 선택을 포함하여 입증된 스크리닝 프로토콜이 설명되어 있습니다. 그런 다음 기판이 있는 샘플과 없는 샘플 형광을 비교하여 히트를 평가할 수 있습니다. 이 대표적인 p-nitrophly acetate 매개 스크리닝에서 기질 처리된 세포의 형광률이 대조 세포의 형광보다 높았으며, 이 실험에서 5개의 리파아제 후보를 확인했습니다.

이 세 가지 셀룰로오스 후보의 광범위한 분포에도 불구하고 집단의 평균 FITC 강도에서 분명한 차이가 관찰됩니다. 이 4가지 phosphatase 후보는 또한 대조 세포에 비해 높은 형광 수준을 보여줍니다. 또한, orf 삽입 벡터의 알칼리성 인산가수분해효소 활성은 빈 플라스미드를 운반하는 세포보다 효소 히트에 대해 관찰된 더 강한 형광 신호로 유세포 분석으로 확인할 수 있습니다.

이 기술은 적절한 기질과 배급 농도를 선택하여 광범위한 효소의 스크리닝에 적용할 수 있다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 차세대 염기서열분석(next-generation sequencing)과 같은 다른 방법을 수행하여 고용량 방식으로 효소 후보 물질의 식별 및 특성화에 대한 추가 질문에 답할 수 있습니다. 개발 후, 이 고처리량 효소 스크리닝 기술은 효소 공학 분야의 연구자들이 효소 특이성 없이 다양한 메타게놈 효소를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

이 동영상을 시청한 후에는 광범위한 효소 표적에 대해 metogenic circuit-based high-throughput screening system을 사용하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.