Name: 멀티 효소 높은 처리량 유전자 효소 검사 시스템을 사용하여 상영 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: 학습하세요 다중 효소 고처리량 스크리닝 방법을 유전자 효소 스크리닝 시스템과 GFP 리포터를 사용하여. 이 기술은 리파아제, 셀룰라아제, 알칼리성 포스파타아제 등 다양한 효소를 식별하여 효소 공학 및 메타게놈 연구의 효율성을 크게 향상시킵니다.

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본 연구는 Global Frontier Project 지능형 합성생물학센터(2011-0031944), Next-Generation Biogreen 21 Program(PJ009524), NRF-2015M3D3A1A01064875 및 KRIBB Research Initiative Program의 지원으로 진행되었습니다.

1. PNP-GESS와 군 유전체학 라이브러리를 준비 <ol><li> E.에서 군 유전체학 라이브러리를 구축 대장균은 fosmid 벡터를 제조자의 프로토콜에 따른 5 fosmid 라이브러리 제조 키트를 사용. </li><li> 분취 군 유전체학 라이브러리 세포의 원천의 -70 ° C에서 저장 라이브러리 100 ㎕. 주 :이 라이브러리 스톡을 600 nm의 (OD 600)의 파장에서 측정 한 시료의 흡광도는 약 100이다. </li><li> 얼음 재고 군 유전체학 라이브러리 100 μl를 해동하고 50 ㎖ 루리아 - 베르 타니 (LB)과 2 시간 동안 37 ℃에서 인큐베이션 12.5 μg의 / ㎖의 클로람페니콜을 함유하는 500 ㎖의 플라스크에 접종. </li><li> 4 ℃에서 20 분 동안 1,000 XG에서 원심 분리하여 50 ML 원뿔 튜브에 세포를 수확. </li><li> 다시 4 ° C에서 20 분 동안 1,000 XG에 50 ml의 얼음처럼 차가운 증류수 (DW) 및 원심 분리기에 신속하게 펠렛을 재현 탁. </li><li> 해상도10 % (v / v) 글리세롤 50 μl의 빙냉 DW에서 펠릿 uspend. 전기에 대해이 셀 나누어지는 50 μl를 사용합니다. </li><li> 얼음처럼 차가운 전기 큐벳과 electroporate (1.8 kV의 / cm, 25 μF) 혼합물에 electrocompetent 세포를 50 μL 및 pGESS (E135K) 5 DNA (는 100 ng)의 혼합물을 놓습니다. </li><li> 신속 catabolite 억압 (SOC) 매체와 슈퍼 최적의 국물 1 ml에 추가하고 부드럽게 세포를 재현 탁. </li><li> 피펫을 사용하여 14 ml의 둥근 바닥 튜브에 세포를 전송하고 1 시간 동안 37 ° C에서 품어. </li><li> 12.5 ㎍ / ml 클로르 암 페니 콜 및 50 μg의 / ㎖의 앰피 실린을 함유하는 LB 20 × 20cm 사각 접시에 회수 된 세포 500 μl를 확산. 12 시간 동안 30 ° C에서 접시를 품어. </li><li> 셀 스크레이퍼를 사용하여 콜로니를 긁어 빙냉 셀 저장 매체를 이용하여 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 세포를 수집한다. </li><li> 4 ℃에서 20 분 동안 1,000 XG에 원심 분리기. 10 mL의 빙냉 셀 저장 매체 내에 펠렛을 재현 탁OD 100의 600에 도달합니다. </li><li> 분취 액을 -70 ℃에서 저장 셀 20 μL. </li></ol> 2. 군 유전체학 라이브러리에서 오판을 제거 <ol><li> 얼음에 군 유전체학 DNA의 fosmid 및 pGESS (E135K)를 포함한다 (단계 1.13)에서 주식 군 유전체학 라이브러리 세포를 해동. </li><li> 14 mL의 둥근 바닥 튜브를 50㎍ / ㎖의 앰피 실린과 12.5 μg의 / ㎖의 클로람페니콜을 함유하는 2 ml의 LB 내의 셀의 10 μl를 접종한다. 4 시간 동안 200 rpm으로 진탕하면서 37 ℃에서 인큐베이션. </li><li> 한편, FACS 기계를 켜고 기본 FACS 소프트웨어를 엽니 다. 다음 설정을 사용하여 노즐 팁 직경 70 μm의; 순방향 분산 영역 (FSC-A)의 감도, 300 V 대수 증폭; 사이드 분산 영역 (SSC-A) 감도 350 V 대수 증폭; 형광 염료 영역 (FITC-A) 감도 450 V 대수 증폭; 임계 값 매개 변수, FSC-A 값 5. 참고 : 일반 설정이 제공됩니다재료의 표에 언급 FACS 장치. 다른 FACS 장치에 대한 설정을 조정합니다. </li><li> 1 ㎖의 PBS를 함유하는 5 ㎖의 둥근 바닥 튜브에 시료 5 μl를 첨가하여 단​​계 2.2에서 군 유전체학 라이브러리 세포를 희석. </li><li> FACS 악기의로드 포트에 희석 된 라이브러리 샘플을 놓고 FACS 소프트웨어의 취득 대시 보드에로드 버튼을 클릭합니다. </li><li> 클릭하고 대시 보드의 유량 버튼을 제어하여 / 초 1500 이벤트 - 1,000 이벤트 속도를 조정합니다. </li><li> 로그 도구 모음에서 도트 플롯 버튼을 클릭하여 글로벌 워크 시트에 SSC-A 산점도를 확장 대 로그를 만들기 FSC-A를 조정. 도구 모음에서 다각형 게이트 버튼을 사용하여 단일 이벤트 (세균 집단)를 포함하는 분산 형 게이트 R1을 조정합니다. </li><li> 로그 히스토그램 버튼을 클릭하여 워크 시트에 FITC-A를 확장 대 세포 수와 히스토그램 플롯. 그리고, Cytome에서 FITC 전압을 조정종 모양의 분포의 피크가 FITC-A의 10이되도록 검사기 컨트롤 창에 터 설정 탭을 클릭합니다. </li><li> 대 로그 스케일 FSC-A를 만듭니다. 로그 FITC-A 글로벌 워크 시트의 도트 플롯 버튼을 클릭하여 플롯. 게이트가 bell-의 피크 주위에 분포의 중심 (총 10 %의 세포에서 + 5 % -5 % 세포 사이에 위치되도록 도구 모음에서 다각형 게이트 버튼을 사용하여 플롯에 정렬 게이트 R2를 설정 모양의 곡선). </li><li> 1.2 ml의 LB는 FACS 악기의 출구에 50 μg의 / ㎖ 암피실린 및 12.5 μg의 / ㎖ 클로람페니콜을 포함하고 R1과 R2 게이트 모두를 만족 밖으로 정렬 10 6 세포를 포함한 컬렉션 튜브를 놓습니다. </li><li> 포집 관, 모자​​, 부드럽게 소용돌이를 제거합니다. </li></ol> 3. 군 유전체학 효소 검사 <ol><li> (600)이 0.5에 도달 OD 때까지 200 rpm으로 진탕 37 ° C에서 (단계 2.11)에서 정렬 된 세포를 품어. </li><li> 1 μL가 세포 내 fosmid 사본 번호를 증폭 유도 솔루션을 복사 추가합니다. 250 rpm으로 흔들면서 37 ℃에서 추가 3 시간 동안 세포를 인큐베이션. </li><li> 최종 농도 14 mL의 둥근 바닥 튜브에 0.5 배양 세포 ㎖의 적절한 기판 (p의 -nitrophenyl 아세테이트, P의 -nitrophenyl-β-D-cellobioside 또는 페닐 포스페이트)를 추가, 정렬 셀을 제조 100 μM의. <ol><li> 제어 샘플의 경우, 14 ml의 둥근 바닥 튜브에 단계 3.2에서 배양 된 세포 0.5 ㎖에 추가 할 수 있습니다. 단계 3.3에 기재 볼륨으로 PBS 동량을 추가한다. </li></ol></li><li> 3 시간 동안 200 rpm으로 진탕하면서 37 ℃에서 두 샘플을 인큐베이션. </li><li> 한편, 단계 2.3과 동일한 구성으로 FACS 기계를 준비​​합니다. </li><li> 각각 1 ml의 PBS를 포함하는 두 개의 5 ml의 둥근 바닥 튜브에 (정렬) 세포 및 제어 세포의 5 μl를 추가합니다. </li><li> 대조군 세포 t 상에 포함 된 튜브를 배치그는 FACS의 포트를로드하고 FACS 소프트웨어의 취득 대시 보드에로드 버튼을 클릭합니다. 대시 보드에 유량 버튼을 제어하여 / 초 3000 이벤트 - 1,000 이벤트 비율을 조정합니다. </li><li> 로그 소프트웨어의 글로벌 워크 시트에 도트 플롯 버튼을 클릭하고 단일 이벤트를 포함하는 (세균 집단)를 캐터 게이트 R1을 조정에 다각형 게이트 단추를 사용하여 SSC-A 산점도를 확장 대 만들기 로그 FSC-A를 조정 도구 모음. </li><li> 로그 도구 모음에서 다각형 게이트 버튼을 사용하여 플롯에 정렬 게이트 R2를 워크 시트에 도트 플롯 버튼을 클릭하고 설정하여 FITC-A 산점도를 확장 대 만들기 로그 FSC-A를 확장되도록의 0.1 % 음성 세포는 R2 게이트 내에서 검출된다. </li><li> 정렬 샘플 튜브와 제어 샘플 튜브를 교체하고 1000 이벤트 속도를 조정 - 대시 보드의 유량 버튼을 제어하여 / 초 3000 이벤트. </li><li> 0.5을 포함하는 포집 관을 배치mL 씩을 FACS기구의 출구와 LB 모두 R1 및 R2 게이트 만족 정렬 밖으로 104 세포. 참고 : 정렬 기준은 R2 게이트에 FITC-A의에서 최고 0.1 %로 5 % 범위 일 수있다. 이 프로토콜에서, 상위 1 %의 세포가 양성으로 수집 하였다. </li><li> 포집 관, 모자​​, 부드럽게 소용돌이를 제거합니다. </li><li> LB, 50 μg의 / ㎖ 암피실린, 12.5 μg의 / ㎖의 클로람페니콜을 포함하는 두 한천 플레이트 (90mm 배양 접시)에 0.5 ml의에게 수집 된 샘플을 확산하고 밤새 37 ° C에서 접시를 품어. </li><li> 필요한 경우, 단계 3.1-3.14를 반복하여 FITC-A 농축에 대한 정렬의 추가 라운드를 수행합니다. </li></ol> 4. 히트 선택 및 효소 활동 확인 <ol><li> 분석 유동 세포 계측법 <ol><li> 단계 3.14에서 배양 접시에서하는 LED 조명의 488 nm 파장의 관찰 아래 식민지 선택기를 사용하여 형광을 보여주는 식민지를 선택합니다. </li><li> 14 ml의 소유주에 선택한 식민지 접종싶게 바닥이 ml의 LB (600)가 0.5에 도달 할 때까지의 OD 200 rpm으로 진탕하면서 37 ℃에서 50 μg의 / ㎖의 암피실린 및 12.5 μg의 / ㎖의 클로람페니콜을 함유하는 함유하는 튜브. </li><li> 2 μL가 세포 내 fosmid 사본 번호를 증폭 유도 솔루션을 복사 추가합니다. 250 rpm으로 흔들면서 37 ℃에서 추가 3 시간 동안 세포를 인큐베이션. </li><li> 14 ㎖의 둥근 바닥 튜브를 준비하고 배양 된 세포 (단계 4.1.3) 1 ㎖를 추가합니다. 100 μM의 최종 농도로 적당한 기판 (p의 -nitrophenyl 아세테이트, P -nitrophenyl- β-D- cellobioside 또는 페닐 포스페이트)를 추가한다. <ol><li> 제어를 들어, 14 ml의 둥근 바닥 튜브에 단계 4.1.3에서 1 ml의를 배양 된 세포를 추가하고 단계 4.1.4에서 기판 볼륨으로 PBS의 동일한 볼륨을 추가합니다. </li></ol></li><li> 3 시간 동안 200 rpm으로 진탕하면서 37 ℃에서 두 샘플을 인큐베이션. </li><li> 한편, 단계 2.3과 동일한 구성으로 FACS 기계를 준비. </li><li> 각각 1 ml의 PBS를 포함하는 5 ㎖의 둥근 바닥 튜브 제어 및 기판 처리 된 세포의 5 μl를 추가합니다. </li><li> FACS 장치의로드 포트에 튜브를 포함하는 제어 세포를 놓고 FACS 소프트웨어의 취득 대시 보드에로드 버튼을 클릭합니다. 대시 보드에 유량 버튼을 사용하여 3000 이벤트 / 초 - 1000 이벤트 속도를 조정합니다. </li><li> FITC-A를 측정하기 위해 취득 버튼을 클릭합니다. </li><li> 기판 처리 샘플 튜브와 제어 샘플 튜브를 교체합니다. 대시 보드에 유량 버튼을 사용하여 3000 이벤트 / 초 - 1000 이벤트 속도를 조정합니다. </li><li> FITC-A를 측정하기 위해 취득 버튼을 클릭합니다. </li><li> 로그 FITC-A 스케일링 대 세포 수의 히스토그램을 플로팅함으로써 세포의 두 그룹의 형광을 비교한다. </li></ol></li><li> 다른 분석은 효소 활성을 확인 <ol><li> 선택한 효소 후보의 추가 식별을 위해, 표준 추출 프로를 사용하여 fosmid DNA를 추출상용 추출 키트에서 cedures하고 염기 서열을 분석하거나, 시험 관내 효소 활성을 테스트 -6,7-. </li></ol></li></ol>

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생체 촉매의 생산 효율을 증가시키는 것은 가장 좋은 천연 효소 소스로 간주됩니다 산업 9 metagenome 기반 바이오 화학의 성공을위한 열쇠입니다. 이러한 의미에서, 그것은 유전자 원의 대부분이 10 탐험되지 않은 metagenome에서 새로운 효소를 선별하는 것이 필수적입니다. 몇몇 선별 방법은 직접 전사 활성화 제 11, 12를 사용하여 효소 제품을 검출하는 개발되어 있지만, 이들 기술은 특정 대사 응답 전사 시스템을 필요로한다. 한편, GESS 페놀 또는 PNP가 기판 태그의 용도에 따라 광범위하게 적용될 수있다. BRENDA 데이터베이스 (이 작업의 세 가지 예를 포함) (표 1), 페놀 또는 PNP 화합물을 제조보고 효소 대부분 가수 분해에 속해 있지만 (EC 번호 3) 분류 효소는 다양 페놀 기판 탐색 및 심지어 인공 설계 기판에 실시천연 기질 대안 크게 스크리닝 시스템의 적용 가능성을 확장 할 수 있기 때문에, 효소 활성을...

최근에 개발 된 높은 처리량 단일 세포 분석 기법은 신규 효소는 기능적 활동을 기반으로 한 대규모 유전자 라이브러리로부터 스크리닝 될 수있다. 단일 세포 수준에서 전사 조절 단백질을 표적 효소 활성의 결과로 생산되는 작은 분자를 감​​지하여 리포터 유전자의 발현을 유발하기 위해 사용된다. 초기의 방법은 상기 기판은 리포터 단백질이 발현을 유도하는 (SIGEX) 메소드를 스크리닝 기판 - 유도 유전자 발현을 사용 Ralstonia eutropha E2로부터 페놀 분해 오페론의 분리를 포함했다. 슈도모나스 푸티 다 (Pseudomonas putida)의 NhaR은 알데하이드 탈수소 효소 (3)을 선택하기 위해 사용하고, 코리 네 박테 리움 글루 타미 쿰에서 LysG은 다양한 돌연변이 라이브러리 (4)로부터 새로운 L- 라이신 생산 균주의 고 처리량 스크리닝에 이용 하였다. 이전에는 유전 적 효소 screeniNG 시스템 (GESS)는 일반적으로 적용 선별 ​​플랫폼 (5)로 제안되었다. 이 시스템의 P., DmpR을 페놀 인식 디메틸 레귤레이터를 사용 푸티 다. DmpR (E135K) 및 DmpR의 돌연변이는 또한 P의 니트로 페놀 (PNP)의 검출 GESS (PNP-GESS)에 사용될 수있다. 페놀 성 화합물의 제조 표적 효소의 존재에 GESS E. 대장균 세포는 형광 활성화 된 세포 분류기 (FACS)를 사용하여 단일 세포의 신속한 분리를 가능하게하는 형광 신호를 방출한다. 그러나 군 유전체학 효소의 발현은 통상적 인 재조합 효소보다 약한 것으로 보인다; 따라서 GESS 최적의 운전 조건과 함께 5 리보솜 결합 부위 (RBS) 및 종료 서열의 조합을 조사하여 최대 감도와 페놀 성 화합물을 검출하도록 설계되었다. GESS의 기본적인 장점 중 하나는이 하나의 방법은 이론적으로 오븐의 심사를 수 있다는 것입니다BRENDA 데이터베이스에있는 효소의 어 200 다양한 유형 (표 1에 http : // www.brenda-enzymes.info, 2013.7) 단순히 다른 기판을 사용함으로써. 그것은 그 셀룰라 제, 리파제를 도시하고, 메틸 파라티온 가수 분해 효소 (MPH)의 P의 -nitrophenyl 부티레이트, P의 -nitrophenyl-cellotrioside, 메틸 파라티온, 각각 5 적절한 기질 PNP-GESS을 이용하여 검출 될 수있다. 최근에는 PNP-GESS를 사용하여 식별 소설 효소의 하나 인 알칼리성 포스파타제 (AP)가, 추위 적응 해양 metagenomes 6에서 발견 된 첫 번째 thermolabile의 AP는 것을 입증했다. 여기서, 검사 공정의 상세 PNP-GESS는 5,6- 군 유전체학 라이브러리로부터 새로운 후보 효소를 빠르게 식별 enzymes- 리파아제, 셀룰라아제, 알칼리 포스파타제의 세 가지 유형의 활동을 검출 -and되게된다. 프로세스는 metagenome PNP-GESS로 전처리 및 FL을 운영 포함세포 계측법 분류기를 흐름. 얻은 히트 더 식별 순서가 될 필요가 있지만,이 프로토콜은 유동 세포 계측법 사용하여 효소 활성을 확인하는 단계까지의 절차를 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>CopyControl</td><td>진원지</td><td>CCFOS110</td><td>Fosmid 라이브러리 제작 키트&nbsp;</td></tr><tr><td>CopyControl 유도 솔루션</td><td>진원지</td><td>CCIS125</td><td>Fosmid 복제 유도 솔루션</td></tr><tr><td>EPI300</td><td>진원지</td><td>EC300110</td><td>전기 역량 세포</td></tr><tr><td>pCC1FOS</td><td>진원지</td><td>CCFOS110</td><td>Fosmid 벡터</td></tr><tr><td>유전자 펄서 Mxcell</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Electroporation 큐벳 및 전기 천공물 시스템</td></tr><tr><td>FACSAria III</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td>유세포 분석(FACS 기계)</td></tr><tr><td>AZ100M</td><td>Nikon</td><td></td><td>현미경&nbsp;</td></tr><tr><td>울트라슬림&nbsp;</td><td>Maestrogen</td><td></td><td>LED 조명기</td></tr><tr><td>50-ml 원뿔형 튜브</td><td>BD Falcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>14-ml 라운드-바텀 튜브&nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5-ml 라운드 바텀 튜브</td><td>BD Falcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>p-니트로페닐 포스페이</td>트 <td>Sigma-Aldrich</td><td>N7653</td><td>Substrate</td></tr><tr><td>p-nitrophenyl &beta;-D-cellobioside</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N5759</td><td>Substrate</td></tr><tr><td>p-nitrophenyl butylate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N9876& 주의;</td><td>기판</td></tr><tr><td>Luria-Bertani (LB)</td><td>BD Difco</td><td>244620</td><td>트립톤 10 g/L, 효모 추출물 5 g/L, 염화나트륨 10 g/L</td></tr><tr><td>Super Optimal broth (SOB)</td><td>BD Difco</td><td>244310</td><td>Tryptone 20 g/L, 효모 추출물 5 g/L, 염화나트륨 0.5 g/L, 황산마그네슘 2.4 g/L, 염화칼륨 186 mg/L</td></tr><tr><td>Catabolite 억제 (SOC)</td><td></td>가 있는 Super Optimal 육수<td>, 0.4 % 포도</td><td></td></tr>당 <tr><td>2x 효모 추출물 트립톤(2xYT)</td><td>BD Difco</td><td>244020</td><td>카제인 16 g/L, 효모 추출물 10 g/L, 효모 추출물 5 g/L의 췌장 분해</td></tr>물 <tr><td>세포 저장 매체</td><td></td><td></td><td>2x YT 육수, 15% 글리세롤, 2% 포도당</td></tr><tr><td>pGESS(E135K)</td><td></td><td></td><td>dmpR, egfp 유전자와 적절한 프로모터, RBS 및 종결자를 포함하는 DNA 벡터입니다. 에 대한 원고의 참고 문헌 5를 참조하십시오. 자세한 내용은.</td></tr><tr><td>클로람페니콜</td><td>시그마</td><td>C0378</td><td></td></tr><tr><td>암피실린</td><td>시그마</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td>유세포 분석 소프트웨어 버전 7.0</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>70011-044</td><td>0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.0144% Na2HPO4, 0.024% KH2OP4, pH 7.4</td></tr></tbody></table>

멀티 효소 높은 처리량 유전자 효소 검사 시스템을 사용하여 상영

Multi-enzyme Screening Using a High-throughput Genetic Enzyme Screening System

최근 고처리량 단세포 분석 기술의 개발로 대규모 메타유전체학(metagenomic) 라이브러리1의 기능적 활성을 기반으로 하는 새로운 효소를 스크리닝할 수 있게 되었습니다. 우리는 이전에 페놀 또는 p-니트로페놀에 의해 활성화되는 디메틸페놀 조절제를 사용하는 유전자 효소 스크리닝 시스템(GESS)을 제안했습니다. 방대한 양의 자연 효소 반응이 페놀 유래 기질에서 이러한 페놀 화합물을 생성하기 때문에 이 단일 유전자 스크리닝 시스템은 BRENDA 데이터베이스에서 200개 이상의 서로 다른 효소를 스크리닝하는 데 이론적으로 적용될 수 있습니다. GESS의 일반적인 적용 가능성에도 불구하고 스크리닝 프로세스를 적용하려면 최대 유세포 분석 신호에 도달하기 위한 특정 절차가 필요합니다. 여기에서는 GESS를 사용한 메타게놈 전처리 및 유세포 분석 분류기의 작동을 포함하는 개발된 스크리닝 프로세스에 대해 자세히 설명합니다. GESS를 사용한 세 가지 다른 페놀 기질(p-니트로페닐 아세테이트, p-니트로페닐-β-D-셀로비오시드 및 페닐 포스페이트)을 사용하여 각각 세 가지 다른 효소(리파아제, 셀룰라아제 및 알칼리성 인산가수분해효소)를 스크리닝하고 식별했습니다. 선택된 메타게놈 효소 활성은 유세포 분석으로만 확인되었지만, DNA 염기서열분석 및 다양한 in vitro 분석을 통해 추가 유전자 동정을 할 수 있습니다.

세 페놀 기판은 제안 된 프로토콜에 따라 태안, 한국의 바다 - 갯벌 퇴적물의 metagenome 라이브러리에서 새로운 군 유전체학 효소를 식별하기 위해 조사 하였다. 라이브러리 건설, 평균 30~40킬로바이트의 metagenome 시퀀스는 E. 기반으로 fosmids에 삽입했다 대장균 F 인자 플리와 셀의 단일 사본으로 제시했다. fosmids 널리 인해 안정적인 전파 8 복잡한 게놈 라이브러리를 구성하기 위해 사용되어왔다 있습니다. 도 1은 음의 정렬과 위양성의 제거 R1 및 R2는 게이트 (도 1 B)을 정렬 한 플러스 히트 선택 하였다 (도 1 A)을 포함하는 스크리닝 프로토콜의 간략한 흐름도를 도시한다. 조회수...

본 연구는 200개 이상의 효소에 이론적으로 적용할 수 있는 보편적인 유전 효소 스크리닝 시스템을 이용한 고처리량 스크리닝 방법을 제시합니다. 여기서 단일 스크리닝 시스템은 사용된 기질(p-니트로페닐 아세테이트, p-니트로페닐-β-D-셀로비오시드 및 페닐 포스페이트)을 간단히 변경하여 세 가지 다른 효소(리파아제, 셀룰라아제 및 알칼리성 인산가수분해효소)를 식별합니다.

The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a ...

본 방법론의 전반적인 목표는 단일 고속 대량 스크리닝 시스템을 사용하여 여러 효소를 평가하는 것입니다. 이 방법은 메타게놈 스크리닝 및 효소 공학과 관련된 미생물 및 바이오공학 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 본 연구진은 페닐렌 화합물에 반응하는 MPL 돌연변이체와 그 하위 GFP 리포터로 구성된 유전적 효소 스크리닝 시스템을 개발하였습니다.제공된 기질과 반응하여 메타게놈 유전자가 우리가 관심 있는 효소 활성을 나타내면, 반응 생성물인 페닐렌 화합물이 Dmp 돌연변이체를 활성화하고 GFP 리포터 발현을 유도하며, 이는 형광 측정기로 쉽게 포착할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 기존의 스크리닝 기술과 달리, 적절한 기질을 사용함으로써 이 단일 방법으로 여러 종류의 서로 다른 효소를 스크리닝하는 데 적용 가능하다는 점입니다. 이 과정의 시연은 저희 실험실의 대학원생인 권길광 학생이 맡아 진행하겠습니다.fosmid 라이브러리 제작 키트를 사용하여 fosmid 벡터로 E.Coli 내에 메타게놈 라이브러리를 구축한 후, pGESS(E135K)DNA를 메타게놈 라이브러리 세포로 운반합니다. 그런 다음 형질전환된 라이브러리 세포를 -70 °C에서 20 µL씩 분주하여 보관합니다. 위양성을 제거하려면, 먼저 메타게놈 라이브러리 세포 분주액을 얼음 위에서 해동합니다.그 다음, 해동된 세포 10 µL를 ampicillin과 chloramphenicol이 포함된 lysogenate broth 2 mL가 담긴 14 mL 라운드 바텀 튜브에 접종하고, 37 °C, 200 RPM 조건에서 4시간 동안 배양합니다. 그동안, 기본 FACS 소프트웨어를 사용하여 메타게놈 라이브러리 세포를 분석할 수 있도록 FACS 장비의 적절한 파라미터를 설정합니다. 배양이 끝나면, 세포 5 µL를 5 mL 라운드 바텀 튜브에 담긴 PBS 1 mL로 옮깁니다.그런 다음, 희석된 라이브러리 시료를 로드하고 이벤트 발생률을 초당 1000~1500개 이벤트로 조정합니다. Global Worksheet에서 로그 스케일의 전방 산란광(forward scatter) 면적 대 로그 스케일의 측방 산란광(side scatter) 면적 산점도를 생성하려면, 도트 플롯(dot-plot)을 만들고 박테리아 집단이 포함된 싱글렛(singlet) 이벤트 주변에 폴리곤 게이트(polygon gate)를 그립니다. 세포 수 대 로그 스케일의 FITC-area 히스토그램을 그리려면, 히스토그램을 열고 종 모양 분포의 정점이 FITC-area의 10²보다 작아지도록 FITC 전압을 조정합니다.다음으로, 또 다른 도트 플롯(dot-plot)을 열어 로그 스케일의 전방 산란 영역(forward scatter area) 대비 로그 FITC-영역 플롯을 생성하고, 분포의 중심으로부터 세포의 +5%와 -5% 사이에 R2 소팅 게이트(sorting gate)를 설정합니다. 모든 게이트 설정이 완료되면, 항생제가 첨가된 lysogenate 배지 1.2 milliliters가 담긴 수집 튜브를 FACS 장비 배출구에 배치하고, 게이트 내 세포 1×10⁶개를 배지로 소팅합니다. 소팅이 끝나면 수집 튜브의 캡을 닫고 세포를 부드럽게 볼텍싱(vortex)합니다.관심 있는 메타게놈 효소를 스크리닝하기 위해, 분리된 세포를 OD600이 0.5에 도달할 때까지 37 °C, 200 RPM에서 배양한 다음, 세포 내 fosmid 복제 수를 증폭시키기 위해 copy induction solution 1 µL를 첨가합니다. 37 °C, 250 RPM에서 3시간 동안 배양한 후, 14 mL 라운드 바텀 튜브에 세포 0.5 mL와 적절한 기질을 최종 농도가 100 µM이 되도록 혼합합니다. 그런 다음 대조군과 실험군 샘플을 37 °C, 200 RPM에서 3시간 동안 더 배양합니다.샘플을 흔드는 동안, 앞서 시연한 대로 FACS 기기 파라미터를 설정하십시오. 그런 다음, 각 샘플의 세포 5 µL를 1 mL의 PBS가 들어 있는 개별 5 mL 라운드 바텀 튜브에 넣습니다. 다음으로, 샘플 세포를 로드하고 이벤트 속도를 초당 1000에서 3000 이벤트로 설정하십시오.로그 스케일의 전방 산란 면적(forward scatter area) 대 로그 스케일의 측방 산란 면적(side scatter area) 산점도를 생성하고, 단일 세포(singlet event) 박테리아 세포를 포함하도록 R1 산란 게이트를 조정합니다. 그런 다음 로그 스케일의 전방 산란 대 로그 스케일의 FITC-area 산점도를 생성하고, 음성 세포가 0.1% 미만으로 검출되도록 R2 분류 게이트를 설정합니다. 이제 샘플 튜브를 로드하고, 필요에 따라 이벤트 발생률을 초당 1000~3000건으로 다시 조정합니다.그 다음, 0.5 mL의 lysogenate 배지가 담긴 수집 튜브를 FACS 기기의 배출구에 놓고 R1 및 R2 게이트 내의 세포를 1×10⁴개 수집합니다. 모든 세포가 분리되면 수집 튜브의 캡을 닫고 세포를 부드럽게 볼텍싱합니다. 이어서 수집된 샘플 0.5 mL를 항생제가 첨가된 lysogenate 배지가 포함된 90 mm 아가 플레이트 2개에 도말한 후, 플레이트를 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.이 그림에서는 음성 소팅(negative sorting)을 통한 위양성 제거와 R1 및 R2 소팅 게이트를 이용한 양성 히트(positive hit) 선택을 포함하여 시연된 스크리닝 프로토콜이 설명되어 있습니다. 이후 기질의 유무에 따른 샘플의 형광을 비교함으로써 히트를 평가할 수 있습니다. 이 대표적인 p-nitrophly acetate 매개 스크리닝에서, 기질 처리된 세포의 형광이 대조군 세포보다 높게 나타나 본 실험에서 5종의 lipase 후보군이 확인되었습니다.이 세 가지 셀룰로오스 후보군의 광범위한 분포에도 불구하고, 개체군의 평균 FITC 강도에서 뚜렷한 차이가 관찰됩니다. 이 네 가지 포스파타아제 후보군 또한 대조군 세포와 비교하여 높은 형광 수준을 나타냅니다. 또한, orf가 삽입된 벡터의 알칼리 포스파타아제 활성은 유세포 분석법으로 확인할 수 있으며, 공벡터를 보유한 세포보다 효소 히트(enzyme hit)에서 더 강한 형광 신호가 관찰됩니다.적절한 기질과 농도 비율을 선택함으로써 이 기술을 광범위한 효소 스크리닝에 적용할 수 있다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 이어, 차세대 염기서열 분석과 같은 다른 방법들을 수행하여 고처리량 방식으로 효소 후보의 식별 및 특성 규명에 관한 추가적인 질문들에 답할 수 있습니다. 개발 이후, 이 고처리량 효소 스크리닝 기술은 효소 공학 분야의 연구자들이 효소 특이성을 미리 알 필요 없이 다양한 메타게놈 효소를 탐색할 수 있는 길을 열어주었습니다.이 영상을 시청하고 나면, 광범위한 효소 표적을 대상으로 하는 메토제닉 회로 기반 고속 스크리닝 시스템의 사용 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 프로토콜은 대장균의 표현 metagenomic 도서관에서 cellulolytic 활동에 높은 처리량 화면을 설명합니다. 화면이 솔루션을 기반으로하고 고도의 자​​동화, 그리고 흡광도 측정으로 최종 판독과 384 잘 microplates에 한 냄비 화학을 사용합니다.

Metagenomic 도서관에서 Cellulase 활동 Biomining에 대해 높은 처리량 화면

우리의 곰팡이 endoglucanase 활동을위한 화면으로 저렴한 비용, 높은 처리량 방법을...

에서 곰팡이 Endoglucanase 활동의 높은 처리량 검사 대장균</em

출처: Kim, H. 외, 고처리량 유전효소 스크리닝 시스템을 이용한 다효소 스크리닝. J. Vis. 경험 (2016)이 영상은 메타게놈 포스미드 라이브러리와 염색 기질을 이용한 효소 발현을 검출하는 유전적 스크리닝 방법을 시연합니다. 유세포분석은 색소 생성물을 생성하는 단일 세포를 식별하고 분리하여 활성 효소 발현 세포의 고처리량 선택을 가능하게 합니다.

유전자 변형 박테리아 세포에서 표적 효소 발현 검출

이 비디오에서는 불용성 발색 폴리머 하이드로겔 기질을 사용하여 탄수화물 활성 효소 스크리닝을 위한 고처리량 분석을 시연합니다. 효소는 이러한 기질을 용해성 착색 산물로 분해하며, 이는 산물의 색 강도를 측정하여 정량화할 수 있습니다.

발색 고분자 하이드로겔 기반 효소 스크리닝 분석: 합성 기질을 사용하여 탄수화물 활성 효소를 스크리닝하는 고처리량 방법

우리는 높은 처리량 로봇 형질과 집에서 만든 듀얼 글로우 루시 페라 제 분석을 사용하여 전사 규제를 식별하기위한 신속하고 저렴한 검사 방법을 제시한다. 이 프로토콜은 빠른 속도로 유전자의 수천을 위해 직접 나란히 기능 데이터를 생성하고, 관심의 유전자를 대상으로 쉽게 변경 가능합니다.

집에서 만든 듀얼 글로우 루시 페라 제 분석 실험을 사용하여 높은 처리량 기능 검사

여기에서는 세포 기반 리포터 유전자 분석을 3' UTR을 통해 발휘되는 전사 후 제어 메커니즘을 조절하는 화합물에 대한 화학 라이브러리를 스크리닝하는 유용한 도구로 설명합니다.

후 전사적으로 규제 유전자의 화학 변조기에 대한 높은 처리량 검사

단백질 인산화는 세포가 세포 외 환경에서 정보를 해석하고 반응하는 방법의 핵심 기능입니다. 여기에서는 포유류 세포에서 정제된 kinase를 사용하여 관심 기질을 인산화하는 kinase를 신속하게 식별하는 고처리량 스크리닝 프로토콜을 제시합니다.

높은 처리량 검열을 사용 키나제 기판 쌍의 식별

효소 스크리닝을 위한 고처리량 분석에 대해 설명합니다. 즉시 사용 가능한 이 멀티플렉스 분석 키트는 사전 선택된 Chromogenic Polymer Hydrogel (CPH) 기질과 complex Insoluble Chromogenic Biomass (ICB) 기질로 구성됩니다. 표적 효소는 다당류를 분해하는 내효소(endo-enzymes)와 프로테아제(protease)입니다.

소설 불용성 발색 기질 분석 키트를 사용하여 탄수화물 분해 효소의 높은 처리량 검열

이 프로토콜은 산업 미생물을 위한 표준 고처리량 스크리닝 워크플로우를 제공합니다. 이 과정은 ARTP 돌연변이 유발을 통해 돌연변이 라이브러리를 구축하고, 자동화된 마이크로플루이딕스를 이용한 양성 액상 스크리닝을 수행하며, 이후 결과를 검증하는 과정을 포함합니다. 이 워크플로우의 신뢰성은 고수율 B. coagulans 균주를 스크리닝하여 검증되었습니다.

자동 액상 마이크로플루이딕 플랫폼을 이용한 L-락산을 과생산하는 바실루스 응고 체 돌연변이체의 고처리량 스크리닝

의 액체 기반 culturing 및 분배를위한...

형광등과 높은 처리량 검사 및 Biosensing C. 엘레간스 레인스

학습하세요 다중 효소 고처리량 스크리닝 방법을 유전자 효소 스크리닝 시스템과 GFP 리포터를 사용하여. 이 기술은 리파아제, 셀룰라아제, 알칼리성 포스파타아제 등 다양한 효소를 식별하여 효소 공학 및 메타게놈 연구의 효율성을 크게 향상시킵니다.

멀티 효소 높은 처리량 유전자 효소 검사 시스템을 사용하여 상영

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