인간의 장 점막의 다세포 3 차원의 Organotypic 모델의 개발은 미세 중력 하에서 성장

이 절차의 전반적인 목표는 회전벽 혈관 생물반응기에 의해 제공되는 미세중력 하에서 배양된 인간 장 점막의 다세포 3-D 유기형 모델의 개발을 설명하는 것입니다. 이 방법은 건강과 질병 모두에서 발견하기 위한 도구로서 광범위한 잠재력을 가지고 있습니다. 병원체와의 상호 작용, 항원 운반 및 염증 과정을 포함합니다.

이 기술의 주요 장점은 고양이의 표현형 다양성을 모방하고 영양소와 산소를 효율적으로 확산시킬 수 있는 D-12 혈관 생물 반응기를 사용한다는 것입니다. 먼저 배양 용기의 주입 포트에서 캡을 풀고 PMI 50ml를 추가합니다. 용기가 가득 차면 캡을 교체하고 엎질러진 매체를 70% 에탄올로 닦아냅니다.

용기가 실온에서 최소 15분에서 하룻밤 동안 배양할 수 있도록 합니다. 계속할 준비가 되면 주입 포트를 사용하여 배양 배지를 버리고 30ml의 3D 배양 배지를 용기에 추가합니다. 주입 포트의 캡을 다시 끼우고 다시 70% 에탄올로 엎질러진 매체를 닦아냅니다.

인큐베이터에서 인간 제대 정맥 내피 세포와 인간 결장 섬유아세포가 포함된 거의 합류 플라스크를 제거하고 PBS로 두 번 세척합니다. 그런 다음 0.05% 트립신 EDTA와 함께 0.25% 트립신 용액을 사용하여 세포를 덮어 세포를 분리합니다. 세포가 분리되면 30%FBS가 포함된 30ml의 DMEM이 미리 로드된 50ml 튜브에 세포를 수집합니다.

세포를 펠릿화하기 위해 튜브를 10분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 30%FBS를 함유한 DMEM 30밀리리터에 세포를 다시 현탁시킵니다. 다음으로, 20마이크로리터의 재현탁액을 20마이크로리터의 트리판 블루 염료로 희석합니다.

혈구계에 세포 혼합물을 로드하고 생존 가능한 세포의 농도를 계산합니다. 그런 다음 30%FBS를 포함하는 DMEM에서 밀리리터당 50-8,000만 개의 세포로 각 세포 유형을 다시 현탁시킵니다. 먼저, 적절한 수의 배양 삽입물을 6개의 웰 플레이트의 웰에 넣습니다.

다음으로, 먼저 10x DMEM, 10x 재구성 매체, 200밀리몰 L-글루타민을 첨가하고 50ml 원추형 튜브에 FBS를 가열하여 콜라겐 혼합물을 준비합니다. 그런 다음 소 콜라겐 1형, 라미닌, 콜라겐 4형, 피브로넥틴, 헤파린 설페이트 프로테오글리칸을 추가하고 마지막으로 수산화나트륨을 추가하여 용액의 pH를 중화합니다. 언제든지 혼합물이 황색을 띤 산성 외관을 나타내면 멸균 1 일반 수산화나트륨 몇 방울을 첨가하여 혼합물을 중화시킵니다.

튜브를 닫고 기포 형성을 피하면서 여러 번 뒤집어 용액을 혼합합니다. 혼합하지 않을 때는 용액이 중합되는 것을 방지하기 위해 얼음 위에 보관하십시오. 혼합되면 세포 현탁액을 콜라겐 제제에 추가하고 기포 형성을 방지하기 위해 튜브를 여러 번 부드럽게 뒤집어 튜브를 혼합합니다.

그런 다음 얼음 위에 다시 놓습니다. 콜라겐 용액이 들어있는 세포를 4-5 밀리리터의 세포를 각 삽입물에 넣고 콜라겐이 1 시간 동안 거의 또는 전혀 움직이지 않고 후드에서 겔화되도록합니다. 1시간 후, 6웰 플레이트를 인큐베이터로 옮겨 1-2시간 더 사용합니다.

다음으로, 플레이트를 조직 배양 후드로 되돌리고 한 쌍의 멸균 집게와 메스를 사용하여 삽입물에서 멤브레인을 무균 절단합니다. 멤브레인에서 젤이 포함된 세포를 분리한 다음 분리된 젤을 작은 사각형으로 자릅니다. 콜라겐 사각형이 포함된 작은 세포를 채우기 포트를 사용하여 미리 채워진 50ml 용기 중 하나에 추가합니다.

다음으로, 동봉된 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 HCT-8 인간 상피 세포의 현탁액을 준비합니다. 30%FBS를 함유한 DMEM에서 밀리리터당 1,000만 개의 세포 농도로 세포를 다시 현탁시킵니다. 그런 다음 주입 포트를 사용하여 1ml의 HCT-8 셀 현탁액을 50ml 용기에 추가합니다.

세포를 추가한 후 20ml의 3D 배양 배지를 용기에 추가하여 거의 가득 차도록 합니다. 캡을 교체하고 주입 포트의 립을 70% 에탄올로 적십니다. 다음으로, 3-4밀리리터의 3-D 배양 배지가 들어 있는 5밀리리터 주사기를 용기의 한 포트에 넣고 빈 5밀리리터 주사기를 다른 포트에 놓습니다.

거의 동일한 부피의 매체가 다른 주사기를 통해 용기에 주입되는 동안 빈 주사기로 당겨 눈에 보이는 기포를 제거합니다. 이제 모든 공기가 제거되면 용기를 생물 반응기에 넣고 전원을 켠 다음 속도를 분당 13-14 회전으로 설정하십시오. 세포가 혈관 벽과 접촉하지 않도록 필요에 따라 속도를 조정합니다.

미세 중력 하에서 세포를 배양하고 3-4일마다 배양 배지를 교체합니다. 배지를 교체하려면 이중 주사기 방법을 사용하여 사용된 배지 약 30ml를 새로운 3D 배양 배지로 교체합니다. 배양에서 3-5일 후, 동봉된 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 말초 혈액 단핵 세포를 분리합니다.

그런 다음 생물반응기에서 용기를 제거하고 림프구와 단핵구로 구성된 약 2,000만 개의 세포를 충전 포트를 통해 용기에 추가합니다. 용기를 생물 반응기에 다시 넣고 추가로 4-6일 동안 배양합니다. 배양 9일째 경에 림프구와 단핵구로 구성된 2,000만 개의 세포를 혈관에 추가하고 최대 12일 동안 추가로 배양을 계속합니다.

실험이 끝나면 전사 피펫을 사용하여 현재 구조체라고 하는 각 작은 젤 조각을 수확하고 10ml의 10% 포르말린 완충액이 들어 있는 6개의 웰 플레이트의 웰에 넣습니다. 실온에서 3시간 동안 구조체를 고정한 다음 표준 조직학적 포매, 절편 및 염색 프로토콜을 진행합니다. 이 비디오에 제시된 방법은 인간 장 점막의 다세포 3D 조직형 모델을 생성합니다.

미세중력 배양에서 세포는 잘 분화되고 20일째까지 질서 정연한 융모와 같은 특징을 형성합니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 6시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 좋은 세포 배양 지침을 준수하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

생존력, 마이코플라스마 오염 및 세포 성장 행동의 변화를 위해 세포를 체계적으로 제어하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 계통 및 세포 분화의 마커를 식별하기 위해 면역조직화학과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 미세중력 하에서 배양된 인간 장 점막의 다세포 3D 조직형 모델을 개발하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.