인간의 장 점막의 다세포 3 차원의 Organotypic 모델의 개발은 미세 중력 하에서 성장

이 절차의 전반적인 목적은 회전벽 용기 생물 반응기(rotating wall vessel bioreactors)가 제공하는 미세 중력 하에서 배양된 인간 장 점막의 다세포 3D 기관형 모델의 개발 과정을 설명하는 것입니다. 이 방법은 병원체와의 상호작용, 항원 수송 및 염증 과정을 포함하여, 건강 및 질병 상태 모두에서 발견을 위한 도구로서 폭넓은 잠재력을 가지고 있습니다.

이 기술의 주요 장점은 고양이의 표현형 다양성을 모방한다는 점과 영양소 및 산소의 효율적인 확산을 가능하게 하는 D-12 용기 바이오리액터를 사용한다는 점입니다. 먼저 배양 용기의 주입구 캡을 돌려 열고 PMI 50 milliliters를 추가합니다. 용기가 가득 차면 캡을 다시 닫고, 흘린 배지는 70% ethanol로 닦아냅니다.

용기를 상온에서 최소 15분부터 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 단계로 넘어갈 준비가 되면, 주입구를 통해 배양액을 버리고 30 milliliters의 3-D 배양액을 용기에 추가합니다. 주입구 캡을 다시 닫고, 흘러나온 배양액을 70%ethanol로 닦아냅니다.

인간 제대 정맥 내피 세포와 인간 결장 섬유아세포가 포함된, 거의 합류(confluence) 상태에 도달한 플라스크를 배양기에서 꺼내 PBS로 2회 세척합니다. 그 다음, 0.05%trypsin EDTA가 포함된 0.25%trypsin 용액으로 세포를 덮어 세포를 분리합니다. 세포가 분리되면, 30%FBS가 포함된 DMEM 30 mL가 미리 채워진 50 milliliter 튜브에 세포를 수집합니다.

세포를 펠렛화하기 위해 튜브를 10분 동안 원심 분리합니다. 그런 다음, 30% FBS가 포함된 DMEM 30 milliliters에 세포를 재현탁합니다. 다음으로, 재현탁된 세포 20 microliters를 trypan blue 염색약 20 micro-liters로 희석합니다.

헤모사이토미터에 세포 혼합물을 넣고 생존 세포의 농도를 측정합니다. 그 다음, 30% FBS가 포함된 DMEM에서 각 세포 유형을 mL당 5,000만~8,000만 개로 재부유시킵니다. 먼저, 6-웰 플레이트의 웰에 적절한 수의 배양 인서트를 배치합니다.

다음으로, 먼저 50 milliliter 원심분리관(conical tube)에 10x DMEM, 10x Reconstitution Media, 200 millimolar L-glutamine 및 열 불활성화된 FBS를 넣어 콜라겐 혼합액을 준비합니다. 그다음 bovine collagen type one, laminin, collagen type four, fibronectin, heparin sulfate proteoglycan을 추가하고, 마지막으로 수산화나트륨을 넣어 용액의 pH를 중화합니다. 혼합액이 노란색을 띠며 산성 상태로 변할 경우, 멸균된 1 normal 수산화나트륨을 몇 방울 첨가하여 혼합액을 중화하십시오.

튜브 뚜껑을 닫고 기포가 생기지 않도록 주의하며 여러 번 뒤집어 용액을 혼합합니다. 혼합하지 않을 때는 중합 반응을 방지하기 위해 용액을 얼음에 보관하십시오. 혼합이 완료되면 세포 현탁액을 콜라겐 준비물에 첨가하고, 기포가 생기지 않도록 튜브를 부드럽게 여러 번 뒤집어 혼합합니다.

그런 다음 다시 얼음 위에 둡니다. 각 인서트에 콜라겐이 포함된 세포 용액 4~5 mL를 넣고, 후드 내에서 거의 또는 전혀 움직이지 않게 하여 1시간 동안 콜라겐이 젤화되도록 합니다. 1시간 후, 6-웰 플레이트를 인큐베이터로 옮겨 1~2시간 더 배양합니다.

다음으로, 플레이트를 조직 배양 후드에 넣고 멸균 핀셋과 메스를 사용하여 인서트에서 막을 무균적으로 절단합니다. 막에서 세포가 포함된 겔을 분리한 후, 분리된 겔을 작은 정사각형 모양으로 자릅니다. 주입구를 통해 세포가 포함된 작은 콜라겐 조각들을 미리 채워진 50 milliliter 용기 중 하나에 넣습니다.

다음으로, 함께 제공된 텍스트 프로토콜에 따라 HCT-8 인간 상피 세포 현탁액을 준비합니다. 30% FBS가 포함된 DMEM에서 세포를 mL당 1,000만 개의 농도로 재현탁합니다. 그런 다음, 충전구를 통해 50 mL 용기에 HCT-8 세포 현탁액 1 mL를 첨가합니다.

세포를 넣은 후, 용기가 거의 찰 때까지 3-D 배양 배지 20 mL를 추가로 넣습니다. 캡을 닫고 충전구의 가장자리를 70% ethanol로 적십니다. 다음으로, 3-D 배양 배지 3~4 mL가 담긴 5 mL 주사기를 용기의 한쪽 포트에 넣고, 빈 5 mL 주사기를 다른 쪽 포트에 넣습니다.

다른 주사기를 통해 배지를 용기로 주입하는 동시에, 빈 주사기로 끌어당겨 보이는 기포를 모두 제거합니다. 공기가 모두 제거되면 용기를 바이오리액터에 넣고, 전원을 켠 후 속도를 분당 13~14회전으로 설정합니다. 세포가 용기 벽면에 접촉하지 않도록 필요에 따라 속도를 조절하십시오.

세포를 미세중력 상태에서 배양하고 3~4일마다 배양액을 교체하십시오. 배양액을 교체하려면 이중 시린지 방법을 사용하여 사용한 배양액 약 30 milliliters를 신선한 3-D 배양액으로 교체하십시오. 3~5일간 배양한 후, 함께 제공된 텍스트 프로토콜에 기술된 대로 말초혈액단핵구를 분리하십시오.

그런 다음 용기를 바이오리액터에서 꺼내고, 충전 포트를 통해 림프구와 단핵구로 구성된 약 2,000만 개의 세포를 용기에 추가합니다. 용기를 다시 바이오리액터에 넣고 4~6일 동안 추가로 배양합니다. 배양 9일째쯤에 림프구와 단핵구로 구성된 2,000만 개의 세포를 용기에 추가로 넣고 최대 12일 동안 배양을 계속합니다.

실험이 끝나면 전이 피펫을 사용하여 이제 컨스트럭트(construct)라고 불리는 각 작은 겔 조각을 회수하고, 10 mL의 10% formalin 완충액이 들어 있는 6-웰 플레이트의 웰에 넣습니다. 컨스트럭트를 상온에서 3시간 동안 고정한 후, 표준 조직학적 매립, 절편 제작 및 염색 프로토콜을 진행합니다. 이 비디오에서 제시한 방법은 인간 장 점막의 다세포 3D 장기형 모델을 생성합니다.

미세 중력 배양 시, 세포는 잘 분화되어 20일 차까지 질서 정연한 융모 유사 구조를 형성합니다. 이 기술을 숙달하면 적절히 수행했을 때 6시간 만에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때는 우수한 세포 배양 지침을 준수하는 것이 중요합니다.

세포의 생존력, 마이코플라스마 오염 및 세포 성장 거동의 변화를 체계적으로 제어하는 것은 매우 중요합니다. 이 절차를 거친 후, 면역조직화학법과 같은 다른 방법을 통해 계보 및 세포 분화 마커를 식별할 수 있습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 미세 중력 환경에서 배양된 인간 장점막의 다세포 3D 장기모사 모델을 구축하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.