Name: 인간의 장 점막의 다세포 3 차원의 Organotypic 모델의 개발은 미세 중력 하에서 성장 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: 학습하세요 회전벽 용기 바이오리액터를 이용한 미세중력 환경에서 인간 장 점막의 다세포 3D 오가노타이픽 모델 개발 방법을. 이 기술은 세포 상호작용 및 질병 메커니즘 연구에 활용됩니다.

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이 작업은 MBS에 대한 NIAID, NIH, DHHS 연방 연구 보조금 R01 AI036525 및 U19 AI082655(CCHI)과 AF에 대한 NIH 보조금 DK048373의 지원을 부분적으로 받았습니다. 이 내용은 전적으로 저자의 책임이며 미국 국립알레르기·전염병연구소(National Institute of Allergy and Infectious Diseases) 또는 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 공식 견해를 대변하는 것은 아닙니다.

윤리 문 : 모든 혈액 표본이 프로토콜 번호 HP-00040025-1에 참여한 자원 봉사자들로부터 수집 하였다. 메릴랜드 임상 시험 심사위원회의 대학은이 프로토콜을 승인하고이 원고에 포함 된 연구를위한 건강한 지원자에서 혈액 표본의 수집을 승인했다. 이 연구의 목적은 자원 봉사자들에게 설명하고, 모든 자원 봉사자는 정보를 준, 혈액 그리기 전에 동의를 체결했다. 주 : 매체 보충 준비를 위해 표 1을 참조하십시오. 3-D 배양 배지의 제조 표 2 참조. 문화 선박 1. 준비 <ol><li> 50 ML-용기의 충전 포트의 뚜껑을 풀고 무균 배지 50 ㎖ (예., RPMI)를 입력합니다. 층류 후드에서 무균 조건 하에서 모든 절차를 수행합니다. </li><li> 뚜껑을 교체하고 70 % 에탄올로 어떤 표면에 어떤 유출 매체를 닦아냅니다. </li><li> 선박이 incub 허용RT에서 O / N에 적어도 15 분 동안 먹었다. </li><li> 배양액을 버리고 3-D 배지 30 ㎖를 추가 충전 포트를 사용한다. </li><li> 70 % 에탄올로 어떤 표면에 어떤 유출 매체를 닦아주십시오. </li></ol> 세포의 제조 2 <ol><li> 인간 상피 세포주 (HCT-8) 24,40. <ol><li> RPMI에서 배양 세포를 100 U / ㎖ 페니실린, 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신, 50 μg의 / ml의 겐타 마이신, 2 mM L- 글루타민이, 1 mM 피루브산 나트륨, 10 mM의 HEPES는 (버퍼 및 10 % 열 - 불 활성화 소 태아 혈청 FBS로 보충 ) (보충 1). 70 % 컨 플루 언시, 하나의 비율로 분할 셀 : 5이다. </li></ol></li><li> 인간 대장 섬유 아세포 (CCD-18Co 세포) 24,41. <ol><li> 보충 1 풍부 기저 이글 배지에서 배양 세포 포화 상태에서, 1의 비율로 분할 세포 :. 3. </li></ol></li><li> 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC) 셀 <suP&gt; 24,42. <ol><li> 내피 기저 중간 (EBM)에서 배양 세포를 배지 100 μg의 / ㎖ 헤파린, 3 μg의 / ml의 내피 세포 성장 보충 (심전도)가 풍부하고, 1을 보충 70 % 컨 플루 1의 비율로 분할 세포에서 :. 2. </li></ol></li><li> 림프구 / 단핵구 <ol><li> 표준 기술 (43)을 사용하여 밀도 구배 원심 분리에 의해 혈액으로부터 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 분리. <ol><li> 간략하게, 10 ml의 피펫을 사용하여 조심스럽게 희석 혈액 30 ㎖를 추가 (1 : 1 혈액 : 인산 완충 식염수 (PBS)) 밀도 원심 분리 배지 10ml를 함유 한 50㎖ 원추형 튜브에. 원심 분리 단계 후, 림프구 및 단핵구는 밀도 원심 분리 매체와 플라즈마 층 사이의 &quot;화이트&quot;레이어에있는 것입니다. </li><li> 전송 피펫을 사용하여 백색 층을 수집합니다. 밀도 원심 분리 매체의 수집을 제한하여 과립구 오염을 방지. (43)를 세척 한 후, 유같은 자체 PBMC는 또는 액체 N 2 냉동 보관. 참고 : PBMC 크게 수지상 세포와 다른 세포 유형의 작은 비율로, 림프구 및 단핵구로 구성되어 있음을 강조하는 것이 중요하다. </li></ol></li></ol></li><li> 5 % CO 2 분위기하에 37 ℃에서 표준 배양 조건에서 모든 셀을 성장한다. </li></ol> 콜라겐 임베디드 세포의 3. 준비 <ol><li> 인서트의 개수를 결정하는 것은 실험 조건의 수에 기초하여 필요가 셋업된다. 6 잘 판의 우물에 삽입 적절한 수를 놓습니다. </li><li> HUVEC 및 섬유 아 세포의 현탁액을 준비합니다 : <ol><li> PBS 두 번 플라스크를 씻고 0.05 % 트립신 테트라 에틸렌 (트립신 - EDTA)와 트립신, 0.25 % (1 배)를 사용하여 세포를 분리. 세포 배양 면적의 전체를 커버하기에 충분한 트립신 용액을 첨가. 분리는 일반적으로 15 분에 5 내에서 발생 </li><li> 수집둘 베코 변형 이글 배지 (DMEM) -30 % FBS 배지 30 ㎖를 함유하는 50 ㎖ 튜브에서 분리 된 세포. </li><li> 10 분 동안 500 XG에 튜브를 원심 분리기. </li><li> DMEM-30 % FBS 배지 30 ㎖로 세포를 재현 탁. </li><li> 트리 판 블루 염색 20 μL에 재현 탁 된 세포를 20 ㎕의 희석하여 생존 세포의 수를 계산. 세포 혼합물과 혈구를 넣습니다. 유력한 PBMC를 분명 흰색 될 것입니다; 생존 할 PBMC는 염료를 획득하고 파란색이 될 것입니다. <ol><li> 8 × 107 셀 ML - - (5)의 농도로 DMEM-30 % FBS 배지에서 각 세포 유형을 재현 탁 1. </li></ol></li></ol></li><li> 세포 함유 콜라겐 젤을 준비 참고 : 각 선박이 세포 함유 콜라겐 겔 ~ 5 ㎖의 준비가 필요합니다. <ol><li> 한 50㎖ 원추형 튜브를 50㎍ / ml의 겐타 마이신, 2 mM L- 글루타민 및 10 % 열 - inactivat 보충 한 X DMEM 배지를 첨가하여 콜라겐 혼합물을 제조에드 FBS 플러스 3 ㎎ / ㎖ 소 콜라겐 I, 10 μg의 / ㎖ 라미닌, 40 μg의 / ㎖ 콜라겐 IV, 10 μg의 / ㎖ 피브로넥틴, 2 μg의 / ㎖ 헤파린 황산 프로테오글리칸 15 mM의 수산화 나트륨 (생리적 산도에 도달하기 위해). </li><li> 상기 튜브를 닫고, 혼합물을 완전히 균질화 될 때까지 수회 반전시켜 혼합한다. 거품 형성을 피할 것. 중요 : 겔화를 방지하기 위해 얼음에 혼합 보관하십시오. <ol><li> 중요한 단계 : 혼합물을 산성 외관 (노란 색)을 전개하면, 혼합물을 중화 멸균 1 N NaOH를 몇 방울을 추가한다. </li></ol></li><li> 각각 농축 된 콜라겐 혼합물 (전술)에 2.0 × 106 세포 / ml - 1.2 1.5 - 1.0 밀도 농축 HUVEC 및 섬유 아세포를 추가한다. 튜브를 닫고, 혼합물을 완전히 균질화 될 때까지 수회 반전시켜 혼합한다. 거품 형성을 피할 것. 중요 : 겔화를 방지하기 위해 얼음에 혼합 보관하십시오. </li><li> 셀 함유 콜라겐의 5 ml의 - 4 추가각 삽입에 젤, 이전에 6 잘 플레이트에로드하고, 1 시간 동안 거의 또는 전혀 운동과 후드에서 겔화하는 것을 허용했다. </li><li> 2 개의 추가 시간 - 1 시간 후, 1 37 ° C, 5 % CO 2 배양기로 6 웰 플레이트를 전송할 수 있습니다. </li><li> 후드에 6 웰 플레이트를 반환하고, 멸균 집게의 도움으로 무균 차단 메스 막을 막에서 세포 함유 겔을 분리 삽입에서. 작은 사각형으로 분리 된 겔 (~ 5 × 5mm)를 잘라. </li><li> 충진 포트를 사용하여 50 mL의 HARV에 소세포 함유 사각형을 추가한다. </li></ol></li><li> HCT-8 상피 세포의 현탁액을 준비합니다 : <ol><li> PBS 두 번 플라스크를 세척하고 트​​립신 - EDTA 처리와 트립신, 0.25 % (1 배)를 사용하여 세포를 분리. 세포 배양 면적의 전체를 커버하기에 충분한 트립신 용액을 첨가. 분리는 일반적으로 10 ~ 15 분 이내에 발생합니다. </li><li> DMEM-30 % FBS 배지 30 ㎖에서 분리 세포를 수집. </li><li> Centrif10 분 동안 500 XG에 튜브를 함유 UGE DMEM-30 % FBS 배지. </li><li> DMEM-30 % FBS 배지 30 ㎖로 세포를 재현 탁. </li><li> 3.2.5에 기술 된 바와 같이 생존 세포의 총 수를 계산. </li><li> 10 7 세포 ml의 농도로 DMEM-30 % FBS 배지에서 HCT-8 상피 세포를 재현 탁 - 1. </li><li> 충진 포트를 사용하여 50 mL의 HARV로 농축 HCT-8 상피 세포에 1 ml의 추가. </li></ol></li><li> 선박이 거의 가득 찰 때까지 충진 포트를 사용하여 (~ 20 ml)에 추가로 3-D 배양 배지를 추가한다. </li><li> 뚜껑을 교체하고 70 % 에탄올로 충전 포트의 입술을 닦아냅니다. </li><li> RWV 각 주사기 포트 주사기 넣 장소 3 함유하는 5 ㎖ 주사기 - (4) 하나의 포트에서의 3-D 배양 배지 ㎖의 다른 포트에 5 ㎖ 빈 주사기. </li><li> 매체의 거의 같은 볼륨이 다른 주사기 포트를 통해 주입하는 동안 빈 주사기로 당겨 눈에 보이는 거품을 제거합니다. </li><li> VES 배치SELS 생물 반응기에서, 전원을 켜고 분당 약 13 ~ 14 회전에 속도를 설정합니다. 주 : 긴급 단계 : 회전 속도하여 혈관 벽과의 접촉을 피하고, 상기 용기 내에 선회 세포를 유지하기 위해 실험 중에 몇 번 조정될 필요가있다. </li><li> RWV 생물 반응기에서 제공하는 37 ° C, 미세 중력에서 5 % CO 2에서 배양 세포. </li><li> 새로운 3-D 배양 배지에 약 30 mL로 대체하여 4 일 - 매 3 변경 배지. </li><li> 사일 (± 1 일) 후, 생물 반응기에서 혈관을 제거하고 혈관 (× 10 7 / 용기 (2))에 림프구 / 단핵 세포를 추가합니다. </li><li> 추가 오일 (± 1 일), 37 ° C, 5 % CO 2에서 다시 생물 반응기의 용기를 놓습니다. </li><li> 추가 오일 (문화의 날 9) 한 후, 선박 (2 × 10 7 / 용기)에 림프구 / 단핵구를 추가하고 최대 12 개의 추가 일 동안 문화를 계속합니다. </l난&gt; <li> 새로운 3-D 배양 배지에 약 30 mL로 대체하여 4 일 - 매 3 변경 배지. </li></ol> 조직학 4. 수확은 3-D 문화 <ol><li> 10 % 포르말린 버퍼 10 ㎖를 포함하는 여섯 잘 플레이트로 전송 피펫 수확의 도움을 지금라는 각각의 작은 젤 조각, &quot;건설,&quot;와. 실온에서 3 시간 동안 떠나거나 12 - 4 ℃에서 16 시간. </li><li> 라벨링 각 카세트에 생검 폼 패드의 두 부분을 추가함으로써, 조직 처리 및 매립 카세트를 준비한다. </li><li> 10 % 포르말린 버퍼에 카세트를 담가. </li><li> 집게의 도움으로 두 폼 패드 사이의 고정 구조를 배치합니다. </li><li> 10 % 포르말린 버퍼에 카세트를 담가. </li><li> , 내장 절편, 44를 염색에 대한 표준 절차를 진행합니다. </li></ol>

저자는 미국 비임시 특허 출원이 미국 특허청에 제출되었음을 선언합니다(번호: 13/360,539).

이 논문에서는 일차 인간 림프구, 섬유 모세포, 및 내피 세포뿐만 아니라 소장 상피 세포주를 포함한 24 배수 종류의 세포로 구성된 인간 장 점막의 생체 공학 모델의 개발을 기술한다. 이 3-D 모델에서 세포는 미세 중력 상태 (24)에서 콜라겐이 풍부한 세포 외 기질 내에서 배양된다. 전술 한 바와 같이,이 모델의 주요 기능은 다음과 같다 : (i) 상피 조직의 단층 조직을 모방하는 능력, 상피 세포 꽉 접합, 데즈 모섬 및 융모 적절한 극성 (II) 유도 (ⅲ) 장기 높은 차 세포의 생존 능력 (예., 섬유 아세포 및 내피 세포)와 장기 문화 (20 일), (ⅳ) 표현 villin, 사이토 케라틴, E-cadherin의 및 무 포함하여 조직 등의 분화 마커CIN, (ⅴ)</strong...

과학자들은 다른 골격 유형 (예., 라미닌, 콜라겐 타입 I 콜라겐 IV 및 피브로넥틴) 및 개선하는 성장 인자의 칵테일을 조사하기 시작했을 때, 3-D 모델을 구축하는 제 침투는 1980 년대 초에보고 세포 간 및 &quot;정적&quot;3-D 모델 1-7의 ECM 상호 작용. 그 이후로,이 모델의 주요 문제는 매체 및 조직 구조 (8) 내에서 영양소의 전송 및 산소 제한하고있다. 혈관의 네트워크 주변에서 일정한 영양분 및 산소의 흐름을 수용하는 생체 환경에서 세포와 대조적으로,이 모델의 정적 특성은 세포로의 효과적인 분산을 방해한다. 예를 들어, 크기가 몇 mm를 초과 체외 정적 모델에서 생성 된 세포 집합체는 변함없이 저산소, 괴사 코어 (9)을 개발할 것입니다. RWV 생물 반응기는이 문제를 피할 수 있습니다영양분과 산소 10-12의 효율적인 확산을 허용 유체 역학을 제공하여. 그러나, 지금까지 RWV 생물 반응기를 사용하여 작업이 하나 또는 두 종류의 세포 13-17의 포함에 한정되었다. 또한, 대신에 기본 조직과 동일한 공간 배향, 이러한 세포는 세포 응집체를 형성했다. 이러한 제한에 대한 가장 큰 이유는 통합 된 방식으로 세포를 통합 할 수있는 발판의 부족이었다. 현재까지 RWV의 생물 반응기에 사용되는 지지체는 주로 합성 마이크로 비즈, 관 실린더 또는 작은 시트 13-15,19-23의, 몇 가지 예외를 제외하고 16 ~ 18으로 구성되어 있습니다. 이러한 조성 및 유연성 조작 할 수없고, 어떤 셀이 그 표면에 부착 된 강성 물질이다. 따라서, 이러한 모델은 통합 된 방식으로 평가하기 위해서는 시스템을 제공 할 가능성은, 다양한 세포와 같은 간질 세포와 같은 구성 요소 (예., 섬유 아세포, 내피 세포 및 면역) 즉이야hould 밀접하게 인간의 조직을 모방하는 발판 내에 분산 될 수있다. 여기서 우리는 장 상피 세포주 및 일차 인간 림프구, 내피 세포로 구성된 인간 장 점막의 다세포 3 차원의 Organotypic 모델의 개발을 기술하고, 섬유 아세포 (24). 이 세포는 미세 중력 하에서 RWV 생물 반응기 13,25-30에 의해 제공 배양 하였다. 우리의 3-D 모델에서 ECM 많은 별개 이러한 배지 유사한 삼투압 (예., 배양 중에 무시할 확산 감금) 세포 및 다른 중요한 세포 외 기질 단백질을 포함하는 능력과 같은 특성뿐만 아니라, 같은 보유 적절한 강성 생물 반응기 (24)에 사용될 수있다. 생물학적 시스템은 매우 복잡하고, 지난 몇 년간, isolatio 그들을 공부보다는 주변 환경과 세포의 상호 작용의 시험 향해 점막 연구의 초점의 변화가 있었다엔. 특히, 장 세포 생존 및 분화에 영향을 미치는 세포 - 세포 상호 작용의 중요성을 잘 31-34를 설명되어 있습니다. 구체적으로는, 상피 세포 및 그들의 틈새 사이의 통신은 상피 세포의 확장 및 분화 (35)에 큰 영향을 미친다. 실제로, 널리 사용되는 전용 세포 간뿐만 아니라, 세포 간 상호 작용 ECM 3-D 배양 모델에서 상피 세포의 유지와 분화에 중요하다. 이전의 연구는 콜라겐 I 24,36,37, 라미닌 (38) 및 피브로넥틴 (39)는 원래 점막과 유사한 공간 방향을 취득 장내 상피 세포에 영향을 미치는 수단이되기 때문에 그 직감 ECM 단백질을 증명하고있다. 연구자들은 복잡한 세포 및 구조 아키텍처를 다시하려는 경우 따라서, 새로운 기술의 개발은 우리의 3-D 모델 (24)처럼, 그 창자의 표현형의 다양성이 요구되는 모방 할 수그리고 장내 미세 환경의 기능. 이러한 모델은 새로운 경구 용 약물과 백신 후보들의 평가 및 개발에 중요한 수단을 나타낸다.

<table><tbody><tr><td>쿼드 로테이터/독립 회전 벽 용기(RWV) 생물반응기&nbsp;</td><td>Synthecon</td><td>RCCs-4DQ</td><td>최대 4개의 선박용. 더 많거나 적은 선박이 있는 모델도 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>일회용 50 ml-용기</td><td>Synthecon</td><td>D-405</td><td>상자에는 4개의 용기</td></tr><tr><td>HCT-8 상피 세포가</td> 포함되어 있습니다.<td>ATCC</td><td>CCL-244</td><td></td></tr><tr><td>CCD-18Co 섬유아세포&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>CRL-1459</td><td></td></tr><tr><td>인간 배꼽 정맥 내피 세포</td><td>ATCC</td><td>CRL-1730</td><td>HUVEC</td></tr><tr><td>섬유아세포 성장 인자-기본&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>F0291</td><td>bFGF</td></tr><tr><td>줄기 세포 인자&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S7901</td><td>SCF</td></tr><tr><td>간세포 성장 인자&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H1404</td><td>HGF</td></tr><tr><td>Endothelin 3</td><td>Sigma</td><td>E9137</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma</td><td>L2020</td><td>쥐에서 분리 Engelbreth-Holm-Swarm 종양</td></tr><tr><td>혈관 내피 성장 인자&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>V7259</td><td>VEGF</td></tr><tr><td>백혈병 억제 인자&nbsp;</td><td>산타크루즈</td><td>sc-4377</td><td>(LIF</td></tr><tr><td>아데닌</td><td>시그마</td><td>A2786</td><td></td></tr><tr><td>인슐린</td><td>시그마</td><td>I-6634</td><td></td></tr><tr><td>3,3',5-트리요오도-L-티로닌&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T-6397</td><td>T3</td></tr><tr><td>콜레라 독소 Sigma</td><td></td><td>C-8052</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>BD</td><td>354008</td><td>인간 플라즈마에서 분리</td></tr><tr><td>apo-Transferrin</td><td>Sigma</td><td>T-1147</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>Heparan sulfate&nbsp; 프로테오글리칸</td><td></td><td>Sigma H4777</td><td>마우스의 기저막에서 분리&nbsp; Engelbreth-Holm-Swarm 종양</td></tr><tr><td>콜라겐 IV</td><td>시그마</td><td>C5533</td><td>인간 태반에서 분리</td></tr> 열<tr><td>비활성화 태아 소 혈청&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>D-MEM, 분말</td><td>Invitrogen</td><td>12800-017</td><td></td></tr><tr><td>10% 포르말린; PBS&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>SF100-4</td><td></td></tr><tr><td>소 I형 콜라겐&nbsp;</td><td>인비트로젠</td><td>A1064401</td><td></td></tr><tr><td>트립신-EDTA&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 피루브산</td><td>인비트로젠</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>겐타마이신&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토민신&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Invitrogen</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Invitrogen</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Ham's F-12</td><td>Invitrogen</td><td>11765-054</td><td></td></tr><tr><td>Basal Medium Eagle</td><td>Invitrogen</td><td>21010-046</td><td>BME</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Invitrogen</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>내피 기초 매체</td><td>Lonza</td><td>CC-3156</td><td>EBM-2</td></tr><tr><td>내피 세포 성장 보충제</td><td>Millipore</td><td>02-102</td><td>ECGS</td></tr></tbody></table>

인간의 장 점막의 다세포 3 차원의 organotypic 모델의 개발은 미세 중력 하에서 성장

Development of a Multicellular Three-dimensional Organotypic Model of the Human Intestinal Mucosa Grown Under Microgravity

3 차원 (3-D) 환경에서 성장하는 세포는 다수의 2 차원 환경에서 세포 배양 간격 (예., 플라스크 또는 요리)을 해소 할 가능성이 있기 때문이다. 사실, 널리 접시 또는 플라스크에서 배양 세포 분화 디 그들이 유래 된 조​​직에서의 특화된 기능을 상실하는 경향이 인정된다. (a) 정적 모델 생물을 이용하여 (b) 모델 : 현재 원시 세포 외 기질 (ECM)을 흉내 낸 세포를 지지체로 시딩 3-D 배양 시스템의 두 종류가 주로 존재한다. 제 획기적인 정적 3-D 모델이었다. 이러한 회전 벽 혈관 등의 생물을 이용하여 3-D 모델 (RWV) 생물 반응기는 더 최근의 개발이다. RWV 생물 반응기의 원래 개념은 1990 년대 초에 NASA의 존슨 우주 센터에서 개발 및 저산소, 괴사 코어의 개발로 정적 모델의 한계를 극복 할 것으로 생각된다. RWV의 생물 반응기는 일을 피할 수 있습니다영양분과 산소의 효율적인 확산을 허용 유체 역학을 제공하여 문제가된다. 이 생물 반응 장치 지원 및 폭기 소스 유형에 따라 다릅니다 문화 선박의 두 가지 형식을 회전시키는 역할을 회 전자의 기본 구성 : 공동 축 중앙에 형산, 또는 (1) 느린 켜기 측면 용기 (STLVs) (2 평평한 실리콘 고무 가스 이송 멤브레인을 통해 산소와) 높은 화면 비율 용기 (HARVs). 거품 형성과 그에 따른 혼란을 피하면서이 선박은 효율적인 가스 전송을 할 수 있습니다. 이러한 조건은 모델 배양 용기 중의 중력 (무중력)를 감소 층류 최소 전단력 초래한다. 여기서 우리는 RWV 바이오 리액터에 의해 제공된 소장 상피 세포주 및 일차 인간 림프구 무중력 하에서 배양 된 내피 세포 및 섬유 아세포 이루어지는 인간의 장 점막의 다세포 3 차원의 Organotypic 모델의 개발을 기술한다. &lt;/ P&gt;

<html> 이전에, 우리는 장 상피 세포주 및 일차 인간 림프구 무중력 상태 (24) (도 1)에서 배양 내피 세포 및 섬유 아세포 이루어진 인간 장 점막의 다세포 3 차원의 Organotypic 모델을 설계했다. 섬유 아 세포와 내피 세포는 내가 추가 장내 지하 막 단백질 45 (예., 라미닌, 콜라겐 IV, 피브로넥틴 및 헤파린 황산 프로테오글리칸) 풍부 행렬 콜라겐에 포함하고 생물 반응기를 RWV 추가되었습니다. 10 후 - 십오일 조직 학적 염색 분석은 구조의 융모와 같은 구조의 존재를 입증 하였다. 약 60 -이 상피 세포의 80 %는 잘 분화 된 세포 (그림 2)의 주요 특징 인 ECM, 근처의 기초 위치에있는 자신의 핵으로 편광 세포의 단일 층으로 구성되었다. <html> 1 &quot;&gt; :&quot;유지 - together.w...

3 차원 (3-D) 환경에서 성장하는 세포는 2-D 환경 (예 : 플라스크 또는 종) 세포 배양에 비해 현저한 개선을 나타낸다. 여기에서 우리는 회전 벽 혈관 (RWV) 생물 반응기에서 제공하는 미세 중력에서 배양 인간의 장 점막의 다세포 3 차원의 Organotypic 모델의 개발을 설명합니다.

인간의 장 점막의 다세포 3 차원의 Organotypic 모델의 개발은 미세 중력 하에서 성장

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., ...

이 절차의 전반적인 목적은 회전벽 용기 생물 반응기(rotating wall vessel bioreactors)가 제공하는 미세 중력 하에서 배양된 인간 장 점막의 다세포 3D 기관형 모델의 개발 과정을 설명하는 것입니다. 이 방법은 병원체와의 상호작용, 항원 수송 및 염증 과정을 포함하여, 건강 및 질병 상태 모두에서 발견을 위한 도구로서 폭넓은 잠재력을 가지고 있습니다.이 기술의 주요 장점은 고양이의 표현형 다양성을 모방한다는 점과 영양소 및 산소의 효율적인 확산을 가능하게 하는 D-12 용기 바이오리액터를 사용한다는 점입니다. 먼저 배양 용기의 주입구 캡을 돌려 열고 PMI 50 milliliters를 추가합니다. 용기가 가득 차면 캡을 다시 닫고, 흘린 배지는 70% ethanol로 닦아냅니다.용기를 상온에서 최소 15분부터 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 단계로 넘어갈 준비가 되면, 주입구를 통해 배양액을 버리고 30 milliliters의 3-D 배양액을 용기에 추가합니다. 주입구 캡을 다시 닫고, 흘러나온 배양액을 70%ethanol로 닦아냅니다.인간 제대 정맥 내피 세포와 인간 결장 섬유아세포가 포함된, 거의 합류(confluence) 상태에 도달한 플라스크를 배양기에서 꺼내 PBS로 2회 세척합니다. 그 다음, 0.05%trypsin EDTA가 포함된 0.25%trypsin 용액으로 세포를 덮어 세포를 분리합니다. 세포가 분리되면, 30%FBS가 포함된 DMEM 30 mL가 미리 채워진 50 milliliter 튜브에 세포를 수집합니다.세포를 펠렛화하기 위해 튜브를 10분 동안 원심 분리합니다. 그런 다음, 30% FBS가 포함된 DMEM 30 milliliters에 세포를 재현탁합니다. 다음으로, 재현탁된 세포 20 microliters를 trypan blue 염색약 20 micro-liters로 희석합니다.헤모사이토미터에 세포 혼합물을 넣고 생존 세포의 농도를 측정합니다. 그 다음, 30% FBS가 포함된 DMEM에서 각 세포 유형을 mL당 5,000만~8,000만 개로 재부유시킵니다. 먼저, 6-웰 플레이트의 웰에 적절한 수의 배양 인서트를 배치합니다.다음으로, 먼저 50 milliliter 원심분리관(conical tube)에 10x DMEM, 10x Reconstitution Media, 200 millimolar L-glutamine 및 열 불활성화된 FBS를 넣어 콜라겐 혼합액을 준비합니다. 그다음 bovine collagen type one, laminin, collagen type four, fibronectin, heparin sulfate proteoglycan을 추가하고, 마지막으로 수산화나트륨을 넣어 용액의 pH를 중화합니다. 혼합액이 노란색을 띠며 산성 상태로 변할 경우, 멸균된 1 normal 수산화나트륨을 몇 방울 첨가하여 혼합액을 중화하십시오.튜브 뚜껑을 닫고 기포가 생기지 않도록 주의하며 여러 번 뒤집어 용액을 혼합합니다. 혼합하지 않을 때는 중합 반응을 방지하기 위해 용액을 얼음에 보관하십시오. 혼합이 완료되면 세포 현탁액을 콜라겐 준비물에 첨가하고, 기포가 생기지 않도록 튜브를 부드럽게 여러 번 뒤집어 혼합합니다.그런 다음 다시 얼음 위에 둡니다. 각 인서트에 콜라겐이 포함된 세포 용액 4~5 mL를 넣고, 후드 내에서 거의 또는 전혀 움직이지 않게 하여 1시간 동안 콜라겐이 젤화되도록 합니다. 1시간 후, 6-웰 플레이트를 인큐베이터로 옮겨 1~2시간 더 배양합니다.다음으로, 플레이트를 조직 배양 후드에 넣고 멸균 핀셋과 메스를 사용하여 인서트에서 막을 무균적으로 절단합니다. 막에서 세포가 포함된 겔을 분리한 후, 분리된 겔을 작은 정사각형 모양으로 자릅니다. 주입구를 통해 세포가 포함된 작은 콜라겐 조각들을 미리 채워진 50 milliliter 용기 중 하나에 넣습니다.다음으로, 함께 제공된 텍스트 프로토콜에 따라 HCT-8 인간 상피 세포 현탁액을 준비합니다. 30% FBS가 포함된 DMEM에서 세포를 mL당 1,000만 개의 농도로 재현탁합니다. 그런 다음, 충전구를 통해 50 mL 용기에 HCT-8 세포 현탁액 1 mL를 첨가합니다.세포를 넣은 후, 용기가 거의 찰 때까지 3-D 배양 배지 20 mL를 추가로 넣습니다. 캡을 닫고 충전구의 가장자리를 70% ethanol로 적십니다. 다음으로, 3-D 배양 배지 3~4 mL가 담긴 5 mL 주사기를 용기의 한쪽 포트에 넣고, 빈 5 mL 주사기를 다른 쪽 포트에 넣습니다.다른 주사기를 통해 배지를 용기로 주입하는 동시에, 빈 주사기로 끌어당겨 보이는 기포를 모두 제거합니다. 공기가 모두 제거되면 용기를 바이오리액터에 넣고, 전원을 켠 후 속도를 분당 13~14회전으로 설정합니다. 세포가 용기 벽면에 접촉하지 않도록 필요에 따라 속도를 조절하십시오.세포를 미세중력 상태에서 배양하고 3~4일마다 배양액을 교체하십시오. 배양액을 교체하려면 이중 시린지 방법을 사용하여 사용한 배양액 약 30 milliliters를 신선한 3-D 배양액으로 교체하십시오. 3~5일간 배양한 후, 함께 제공된 텍스트 프로토콜에 기술된 대로 말초혈액단핵구를 분리하십시오.그런 다음 용기를 바이오리액터에서 꺼내고, 충전 포트를 통해 림프구와 단핵구로 구성된 약 2,000만 개의 세포를 용기에 추가합니다. 용기를 다시 바이오리액터에 넣고 4~6일 동안 추가로 배양합니다. 배양 9일째쯤에 림프구와 단핵구로 구성된 2,000만 개의 세포를 용기에 추가로 넣고 최대 12일 동안 배양을 계속합니다.실험이 끝나면 전이 피펫을 사용하여 이제 컨스트럭트(construct)라고 불리는 각 작은 겔 조각을 회수하고, 10 mL의 10% formalin 완충액이 들어 있는 6-웰 플레이트의 웰에 넣습니다. 컨스트럭트를 상온에서 3시간 동안 고정한 후, 표준 조직학적 매립, 절편 제작 및 염색 프로토콜을 진행합니다. 이 비디오에서 제시한 방법은 인간 장 점막의 다세포 3D 장기형 모델을 생성합니다.미세 중력 배양 시, 세포는 잘 분화되어 20일 차까지 질서 정연한 융모 유사 구조를 형성합니다. 이 기술을 숙달하면 적절히 수행했을 때 6시간 만에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때는 우수한 세포 배양 지침을 준수하는 것이 중요합니다.세포의 생존력, 마이코플라스마 오염 및 세포 성장 거동의 변화를 체계적으로 제어하는 것은 매우 중요합니다. 이 절차를 거친 후, 면역조직화학법과 같은 다른 방법을 통해 계보 및 세포 분화 마커를 식별할 수 있습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 미세 중력 환경에서 배양된 인간 장점막의 다세포 3D 장기모사 모델을 구축하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

향상된 이미징 기술은 발달 중에 장기의 3차원 이미징을 가능하게 합니다. 여기에서는 태아 쥐의 장에서 발달 중인 융모의 실시간 이미징을 허용하는 전체 장기 배양 시스템에 대해 설명합니다.

에 대한 마우스 태아의 전체 소장 문화 시스템 전의 VIVO 신호 전달 경로와 융모 개발의 3 차원 라이브 영상의 조작

여기, 우리 문화 인간 enteroid 또는 셀룰러 및 생 화 확 적인 수준에서 호스트 상피 microbiota 상호 작용 연구를 그대로 배리어 기능이 있는 colonoid monolayers 프로토콜을 제시.

병원 균, 공생, 그리고 호스트 창 자 상피 사이 상호 작용을 공부 하는 인간 Colonoid Monolayers

여기에서, 우리는 장 장벽 기능, 투과성 및 수송을 연구하기 위한 인간 오가노이드 유래 장 상피 단층의 제조를 기술한다. 오가노이드가 외부 자극에 대한 원래의 상피 조직 반응을 나타내기 때문에, 이들 모델은 세포주의 확장성과 일차 조직의 관련성 및 복잡성의 이점을 결합한다.

오가노이드 유래 상피 단층: 장 장벽 기능을 위한 임상적으로 관련된 시험관내 모델

여기서는 장 적정별 상호 작용을 모델링할 수 있는 두 가지 프로토콜을 제시합니다. 오르가노이드 유래 장 단층층 및 공기-액체 인터페이스(ALI) 배양은 발광 및 바생측 모두에서 접근할 수 있는 잘 차별화된 상피생성을 용이하게 하는 반면, 극성 반전장 기관가의 측면은 그들의 정면을 노출시키고 높은 처리량 분석에 적합합니다.

장 관성 오르가노이드 모델을 사용하여 정법별 상호 작용을 연구하는 문화 방법

생검 유래 장 오가노이드 및 장기 온 칩 기술은 미세 생리학 플랫폼으로 결합되어 영역 별 장 기능을 재구성합니다.

인간 오가노이드와 장기 온 칩 기술을 결합하여 장 영역별 기능 모델링

본 프로토콜은 claudin-7 녹아웃 모델에서 결장 줄기 세포의 활성 및 기능을 연구하기 위해 쥐 결장 오가노이드 시스템을 확립하는 것을 설명합니다.

생체 외 장내 줄기세포 기능을 연구하기 위한 쥐 결장 음와의 3차원 배양

우리는 쥐의 소장 선와와 배양 장 3D 오가노이드를 선와에서 분리하는 프로토콜을 설명합니다. 또한, 우리는 상피하 세포 틈새가 없는 단일 장 줄기 세포에서 오가노이드를 생성하는 방법을 설명합니다.

쥐 장 선와에서 오가노이드와 오가노이드 연구를 위한 단일 줄기 세포의 3D 배양

여기서는 쥐의 장 오가노이드를 생성하고 여러 다운스트림 응용 분야에서 사용하는 프로토콜을 제시합니다. 쥐는 종종 선호되는 전임상 모델이며, 강력한 장 오가노이드 시스템은 in vivo 연구에 수반되는 in vitro 시스템의 필요성을 충족시킵니다.

쥐 장 오가노이드의 생성과 조작

여기서는 기본 3차원(3D) 장 세포주 모델 시스템과 고정 장 등가물의 광학 현미경 평가를 위한 파라핀 임베딩 프로토콜을 구성하는 방법을 설명합니다. 선택한 단백질의 염색을 통해 단일 실험에서 여러 시각적 파라미터를 분석하여 전임상 약물 스크리닝 연구에 사용할 수 있습니다.

면역 성분이 있는 기본 3차원(3D) 장 모델 시스템

개의 장 오가노이드와 Gut-on-a-Chip 미세유체 시스템의 통합은 인간 장 질환에 대한 관련 번역 모델을 제공합니다. 제시된 프로토콜은 장의 3D 형태 형성 및 동적 체외 모델링을 가능하게 하여 One Health를 통해 개와 인간의 장 질환에 대한 효과적인 치료법 개발을 지원합니다.

염증성 장 질환 환자에서 유래한 장 오가노이드를 사용한 개 장내 칩의 3차원 형태 형성

이 연구는 소장과 대장에서 유래한 돼지 오가노이드의 2D 단층을 생성하기 위한 프로토콜을 설명합니다. 이러한 단층의 성장은 TEER 값의 증가로 표시되며, 이는 견고한 상피 무결성을 나타냅니다. 게다가, 이 단층은 forskolin의 신청에 따르는 Ussing 약실 실험에 있는 생리적인 분비 반응을 전시합니다.

토종 장의 생리학적 특성을 반영하는 2차원 돼지 장 오가노이드(Two-dimensional Porcine Intestinal Organoids)

학습하세요 회전벽 용기 바이오리액터를 이용한 미세중력 환경에서 인간 장 점막의 다세포 3D 오가노타이픽 모델 개발 방법을. 이 기술은 세포 상호작용 및 질병 메커니즘 연구에 활용됩니다.

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