원자 힘 현미경, 충격 들여 쓰기 및 유변학를 사용하여 뇌 조직의 멀티 스케일 기계 속성을 특성화

이러한 기계적 특성 분석 기술의 전반적인 목표는 다양한 길이 스케일과 하중 속도에서 생체 조직의 점탄성 특성을 측정하는 것입니다. 이러한 방법들은 생물 공학의 핵심적인 질문들에 답하는 데 활용될 수 있습니다. 예를 들어, 매우 높은 하중 속도에서 뇌가 어떻게 변형되는지, 또는 다발성 경화증이나 자폐증과 같은 질환이 뇌 조직의 기계적 특성에 어떤 영향을 미치는지 등을 분석할 수 있습니다.

이러한 기술의 주요 장점은 생체 조직과 같이 강성이 매우 낮고 수화도가 매우 높은 재료에 대해 광범위한 하중 조건에서 테스트할 수 있으며, 단일 세포 수준부터 뇌 전체 수준까지 매우 넓은 범위의 재료 부피에 대해 테스트가 가능하다는 점입니다. 이러한 기술적 함의는 보호 전략 수립에 중요한 뇌 손상 시의 반응 모델링으로 확장됩니다. 이 방법은 뇌의 기계적 특성에 대한 통찰을 제공할 뿐만 아니라, 심장 및 간과 같은 다른 유연한 생체 조직에도 적용될 수 있습니다.

유연한 조직의 기계적 특성을 분석할 때는 측정 프로브와 조직 사이에 적절한 접촉을 형성하는 것이 매우 중요합니다. 공칭 용수철 상수가 0.03 N/m이고 직경이 20 µm인 붕규산 유리 비드를 부착한 AFM 프로브를 프로브 홀더에 조심스럽게 장착하십시오. 페트리 접시에 고정된 뇌 절편을 37 °C로 예열된 AFM 스테이지 장착 히터 위에 놓으십시오.

그런 다음 미리 데워둔 배지를 약 2 mL 추가합니다. 다음으로, AFM 프로브를 배지에 내릴 때 표면 장력으로 인해 파손되는 것을 방지하기 위해 프로브 위에 배지를 한 방울 조심스럽게 떨어뜨립니다. 그런 다음 AFM 헤드를 스테이지 위로 다시 배치하고, 헤드가 배지에 잠길 때까지 천천히 내리기 시작합니다.

광학 현미경을 사용하여 관심 영역이 보정된 AFM 프로브 아래에 오도록 스테이지를 이동한 다음, AFM 프로브를 내려 조직 표면에 접촉시킵니다. 크리프 컴플라이언스(creep compliance) 실험을 수행하기 위해, 소프트웨어의 함수 편집기에서 인가 힘 함수를 구성합니다. 이 함수는 5 nanonewton의 설정값까지 0.1초 동안 램프(ramp) 증가, 20초 동안 유지, 그리고 이어서 0 nanonewton까지 1초 동안 램프 감소하는 과정으로 구성됩니다.

소프트웨어는 인가 힘 함수가 작동하는 동안 조직으로 들어가는 AFM 프로브의 압입 데이터를 기록합니다. 크리프 컴플라이언스 실험을 마친 후, 소프트웨어에서 인가 압입 함수를 생성하여 힘 완화 실험을 수행합니다. 소프트웨어가 조직에 압입되는 AFM 프로브가 받는 힘에 대한 데이터를 수집하는 동안 이 함수를 실행하십시오.

충격 압입 시험을 시작하려면 핀셋을 사용하여 구형 프로브를 펜듈럼에 밀어 넣어 맞춥니다. 그런 다음 용융 석영 시료 포스트를 플레이트에 부착하고 플레이트를 이동 스테이지에 나사로 고정합니다. 수화된 뇌 조직에 대한 동적 충격 실험을 수행하려면 먼저 액체 셀 보정을 실시하십시오.

소프트웨어의 Calibration 메뉴로 이동하여 Liquid Cell을 선택하고, 소프트웨어의 안내에 따라 용융 석영 시료와 접촉하십시오. 다음으로 Indenter Type에서 Normal을 선택하고, Indenter Load의 기본값인 0.05 millinewtons를 사용하십시오. 그런 다음 continue를 클릭하여 수직 압입자 구성에 대한 보정을 수행하십시오.

이제 시료 스테이지를 최소 5mm 뒤로 이동시킨 후 레버 암을 장착하십시오. 인덴터 유형에서 Liquid Cell을 선택하여 새로운 구성에서 액체 셀 보정을 반복하십시오. Continue를 클릭하여 액체 셀 보정 계수를 얻으십시오.

다음으로, 커패시터 판 간격을 넓힙니다. 커패시터 판 간격을 넓히면 최대 측정 가능 깊이가 증가하며, 이는 컴플라이언스가 매우 높은 재료를 테스트할 때 필요합니다. 렌치를 사용하여 커패시터 판 간격을 조절하는 세 개의 너트를 시계 방향으로 조금씩 돌립니다.

시계 방향으로 한 바퀴 완전히 돌릴 때마다 유지보수(Maintenance) 메뉴에서 브릿지 박스 조정(Bridge Box Adjustment)을 선택하여 양호한 진자 테스트(pendulum test) 결과를 얻으십시오. 근사 깊이 보정(Approx. Depth Calibration) 값이 70,000 nanometers per volt 이상이 될 때까지 너트를 천천히 계속 조정하십시오.

그 다음, 전원 공급 장치를 통해 켜고 끌 수 있는 새로운 리미트 스톱을 펜듈럼 하단에 배치합니다. 펜듈럼 뒤에 위치한 기존의 리미트 스톱을 제거하여 펜듈럼의 움직임에 발생할 수 있는 방해 요소를 없애고, 더 높은 충격 속도와 유연한 샘플에 대한 더 깊은 관통 깊이를 확보합니다. 솔레노이드의 전원을 켜고 10 V로 설정합니다.

다음으로, Experiment 메뉴로 이동하여 Impact and Adjust Impulse Displacement를 선택하십시오. 소프트웨어의 지침에 따라 펜듈럼의 스윙 거리를 교정하십시오. 충격 함몰 설정이 완전히 완료되면, 배지를 흡입하고 뇌 절편을 건조시키십시오.

그 다음, 시아노아크릴레이트 접착제를 얇게 도포하여 절편화된 뇌를 알루미늄 샘플 포스트에 고정합니다. 이어서 리퀴드 셀을 샘플 포스트의 두 번째 O-링 위로 밀어 넣고, 조직이 완전히 잠기도록 리퀴드 셀에 5 mL의 이산화탄소 독립 배지를 채웁니다. 레버 암의 팁이 배스 위에 적절히 위치할 때까지 배스를 -X 방향으로 이동시킵니다.

다음으로, 팁이 용액에 완전히 잠기고 샘플 앞에 위치할 때까지 Z 양의 방향으로 이동합니다. Sample Stage Control 창을 사용하여 조심스럽게 접촉시킨 후, 스테이지를 샘플 표면에서 약 30 micrometers 정도 떨어뜨립니다. Experiment 메뉴에서 Impact를 클릭하고 충격 실험을 설정합니다.

스윙 거리 보정 결과에 따라 결과 충격 속도와 직접적으로 연관되는 특정 충격 하중을 선택하십시오. 그런 다음 예정된 실험을 수행하십시오. 펜듈럼이 되돌아오고 샘플 표면이 측정 평면으로 계속 이동하면, 하단 리미트 스위치를 끄십시오.

시간에 따른 프로브의 변위가 소프트웨어에 의해 기록됩니다. 지름 25 millimeter 측정 프로브에 사포를 부착하십시오. 그다음, 열 시스템을 연결하고 프로브를 장착하십시오.

마지막으로, 상부 플레이트와 정렬하여 하부 플레이트에 또 다른 사포 조각을 부착합니다. 제조사의 지침에 따라 레오미터를 보정합니다. 먼저, 프로브의 힘을 영점 조절합니다.

둘째, 프로브와 바닥 플레이트 사이의 접촉을 설정합니다. 그런 다음 프로브의 관성을 측정합니다. 마지막으로 모터 조정을 수행합니다.

그 후 측정 플레이트를 천천히 내립니다. 플레이트가 조직에서 1mm 이내에 도달하면, 플레이트가 조직의 상부 표면에 완전히 접촉하고 측정된 수직 항력이 원하는 값에 도달할 때까지 0.1mm씩 간격으로 내립니다. 절차 동안 수분 상태를 유지하기 위해 샘플 가장자리에 소량의 배지를 파이펫으로 분주합니다.

써멀 후드를 내립니다. 다음으로 File, New를 클릭하고 Gel 탭 아래에서 Frequency Sweep을 선택하십시오. 그런 다음 window measurement one frequency sweep을 클릭하고 oscillation 박스를 더블 클릭하십시오.

주파수 범위, 변형률, 측정 지점 수를 입력하십시오. 마지막으로 OK를 선택하고 Start를 클릭하여 주파수 스윕을 시작합니다. 다음은 크리프 컴플라이언스와 응력 완화 실험 모두에 대한 대표적인 압입 및 힘 대 시간 반응 결과입니다.

이러한 데이터와 시스템의 기하학적 구조를 이용하여 뇌의 서로 다른 영역에 대한 크리프 컴플라이언스(creep compliance)와 힘 완화 계수(force relaxation moduli)를 계산할 수 있습니다. 충격 압입법은 공간적 및 시간적으로 집중된 고속 하중 상태에서 조직의 기계적 특성을 측정합니다. 결과로 얻어지는 충격 응답 파라미터는 다양한 충격 속도에서 정량화할 수 있으며, 이는 조직의 속도 의존적 특성을 연구하는 수단을 제공합니다.

레올로지(Rheology)는 저장 탄성률(storage modulus)과 손실 탄성률(loss modulus)을 통해 벌크 조직의 주파수 의존적 점탄성 특성을 측정합니다. 저주파수에서 저장 탄성률은 손실 탄성률보다 거의 한 자릿수 더 크게 나타나며, 이는 뇌 조직의 거동에서 탄성 특성이 지배적임을 나타냅니다. 이 절차를 수행할 때는 조직이 충분히 수화된 상태를 유지하거나, 조직이 적절한 구조를 유지할 수 있도록 돕는 용액에 침전시키는 것이 중요합니다.

이러한 입증된 기술들의 개발을 통해 재료 연구자들은 뇌의 기계적 응답을 모방할 수 있는 합성 겔을 설계하고 최적화할 수 있는 길이 열렸습니다. 이 영상을 시청한 후에는 원자 힘 현미경 기반의 압입 시험, 충격 압입 시험 및 레올로지가 조직의 점탄성 기계적 특성을 규명하는 데 어떻게 사용되는지 충분히 이해하게 될 것입니다. 수집된 데이터를 해석할 때, 변형된 조직의 부피가 구조적으로 균질하고 탄성적으로 등방성이라는 기본 가정을 기억하십시오.

이는 모든 생물학적 조직에 반드시 적용되는 것은 아닙니다. 생물학적 조직의 역학에 관한 질문이 더 명확해짐에 따라, 관심 있는 적절한 길이 스케일이나 시간 스케일에서 해당 질문에 답하기 위해 이러한 역학 실험 중 하나 또는 그 이상을 선택할 수 있습니다.