Name: Deep-Tissue Three-Photon 형광 현미경 검사 in Intact Mouse and Zebrafish Brain (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: 배우세요 생체 내 뇌 조직의 고해상도 심층 영상화를 위한 삼광자 현미경법을 Danio rerio와 생쥐 모델에서. 이 기술은 알츠하이머병 및 자폐증과 같은 신경 질환의 메커니즘 연구에 활용됩니다.

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이 작업은 NSF DBI-1707312 Cornell NeuroNex Hub 및 NIH 1U01NS103516이 지원했습니다.

<ol><li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li>
<li>Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+tissue+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Deep tissue two-photon microscopy.</a> Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).</li>
<li>Horton, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+three-photon+microscopy+of+subcortical+structures+within+an+intact+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Photonics%22%5BJournal%5D)">In vivo three-photon microscopy of subcortical structures within an intact mouse brain.</a> Nature Photonics. 7 (3), 205-209 (2013).</li>
<li>Wang, T., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-photon+neuronal+imaging+in+deep+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Optica%22%5BJournal%5D)">Three-photon neuronal imaging in deep mouse brain.</a> Optica. 7 (8), 947-960 (2020).</li>
<li>Ouzounov, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+three-photon+imaging+of+activity+of+GCaMP6-labeled+neurons+deep+in+intact+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo three-photon imaging of activity of GCaMP6-labeled neurons deep in intact mouse brain.</a> Nature Methods. 14 (4), 388-390 (2017).</li>
<li>Weisenburger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volumetric+Ca2%2B+imaging+in+the+mouse+brain+using+hybrid+multiplexed+sculpted+light+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Volumetric Ca2+ imaging in the mouse brain using hybrid multiplexed sculpted light microscopy.</a> Cell. 177 (4), 1050-1066 (2019).</li>
<li>Yildirim, M., Sugihara, H., So, P. T. C., Sur, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+imaging+of+visual+cortical+layers+and+subplate+in+awake+mice+with+optimized+three-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Functional imaging of visual cortical layers and subplate in awake mice with optimized three-photon microscopy.</a> Nature Communications. 10, 177(2019).</li>
<li>Takasaki, K., Abbasi-Asl, R., Waters, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superficial+bound+of+the+depth+limit+of+two-photon+imaging+in+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Superficial bound of the depth limit of two-photon imaging in mouse brain.</a> eNeuro. 7 (1), (2020).</li>
<li>Guesmi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-color+deep-tissue+three-photon+microscopy+with+a+multiband+infrared+laser%5BTitle%5D)+AND+%22Light%2C+Science+%26+Applications%22%5BJournal%5D)">Dual-color deep-tissue three-photon microscopy with a multiband infrared laser.</a> Light, Science & Applications. 7, 12(2018).</li>
<li>Hontani, Y., Xia, F., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+three-photon+fluorescence+imaging+with+single-wavelength+excitation+deep+in+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Multicolor three-photon fluorescence imaging with single-wavelength excitation deep in mouse brain.</a> Science Advances. 7 (12), 3531(2021).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+deep-brain+structural+and+hemodynamic+multiphoton+microscopy+enabled+by+quantum+dots%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">In vivo deep-brain structural and hemodynamic multiphoton microscopy enabled by quantum dots.</a> Nano Letters. 19 (8), 5260-5265 (2019).</li>
<li>Chow, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+three-photon+imaging+of+the+brain+in+intact+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Deep three-photon imaging of the brain in intact adult zebrafish.</a> Nature Methods. 17 (6), 605-608 (2020).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-photon+imaging+of+mouse+brain+structure+and+function+through+the+intact+skull%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Three-photon imaging of mouse brain structure and function through the intact skull.</a> Nature Methods. 15 (10), 789-792 (2018).</li>
<li>Xu, C., Webb, W. W. Multiphoton excitation of molecular fluorophores and nonlinear laser microscopy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aXu%2C+C+%22Topics+in+Fluorescence+Spectroscopy.+5%22">Topics in Fluorescence Spectroscopy. 5</a>. , Springer. Boston, MA. 471-540 (2002).</li>
<li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+craniotomy+surgery+procedure+for+chronic+brain+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (12), e680(2008).</li>
<li>Łukasiewicz, K., Robacha, M., Bożycki, Ł, Radwanska, K., Czajkowski, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+two-photon+in+vivo+imaging+of+synaptic+inputs+and+postsynaptic+targets+in+the+mouse+retrosplenial+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Simultaneous two-photon in vivo imaging of synaptic inputs and postsynaptic targets in the mouse retrosplenial cortex.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (109), e53528(2016).</li>
<li>Kyweriga, M., Sun, J., Wang, S., Kline, R., Mohajerani, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large+lateral+craniotomy+procedure+for+mesoscale+wide-field+optical+imaging+of+brain+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">A large lateral craniotomy procedure for mesoscale wide-field optical imaging of brain activity.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (123), e52642(2017).</li>
<li>Gordon, J. P., Martinez, O. E., Fork, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+dispersion+using+pairs+of+prisms%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Letters%22%5BJournal%5D)">Negative dispersion using pairs of prisms.</a> Optics Letters. 9 (5), 150-152 (1984).</li>
<li>Entenberg, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Setup+and+use+of+a+two-laser+multiphoton+microscope+for+multichannel+intravital+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging.</a> Nature Protocols. 6 (10), 1500-1520 (2011).</li>
<li>Horton, N. G., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dispersion+compensation+in+three-photon+fluorescence+microscopy+at+1%2C700+nm%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Dispersion compensation in three-photon fluorescence microscopy at 1,700 nm.</a> Biomedical Optics Express. 6 (4), 1392-1397 (2015).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+1300-nm+three-photon+calcium+imaging+in+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of 1300-nm three-photon calcium imaging in the mouse brain.</a> eLife. 9, 53205(2020).</li>
<li>Cheng, L. -C., Horton, N. G., Wang, K., Chen, S. -J., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurements+of+multiphoton+action+cross+sections+for+multiphoton+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Measurements of multiphoton action cross sections for multiphoton microscopy.</a> Biomedical Optics Express. 5 (10), 3427-3433 (2014).</li>
<li>Huang, K. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+virtual+reality+system+to+analyze+neural+activity+and+behavior+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A virtual reality system to analyze neural activity and behavior in adult zebrafish.</a> Nature Methods. 17 (3), 343-351 (2020).</li>
<li>Jacobson, G. A., Rupprecht, P., Friedrich, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experience-dependent+plasticity+of+odor+representations+in+the+telencephalon+of+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Experience-dependent plasticity of odor representations in the telencephalon of zebrafish.</a> Current Biology. 28 (1), 1-14 (2018).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+development+of+functional+spatial+maps+in+the+zebrafish+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Early development of functional spatial maps in the zebrafish olfactory bulb.</a> Journal of Neuroscience. 25 (24), 5784-5795 (2005).</li>
<li>Barbosa, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+adult+neural+stem+cell+behavior+in+the+intact+and+injured+zebrafish+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Live imaging of adult neural stem cell behavior in the intact and injured zebrafish brain.</a> Science. 348 (6236), 789-793 (2015).</li>
<li>Dray, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+live+imaging+of+adult+neural+stem+cells+in+their+endogenous+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Large-scale live imaging of adult neural stem cells in their endogenous niche.</a> Development. 142 (20), 3592-3600 (2015).</li>
<li>Kobat, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+tissue+multiphoton+microscopy+using+longer+wavelength+excitation%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Deep tissue multiphoton microscopy using longer wavelength excitation.</a> Optics Express. 17 (16), 13354-13364 (2009).</li>
<li>Wang, M., Wu, C., Sinefeld, D., Li, B., Xia, F., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparing+the+effective+attenuation+lengths+for+long+wavelength+in+vivo+imaging+of+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Comparing the effective attenuation lengths for long wavelength in vivo imaging of the mouse brain.</a> Biomedical Optics Express. 9 (8), 3534-3543 (2018).</li>
<li>Vogel, A., Noack, J., Hüttman, G., Paltauf, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+femtosecond+laser+nanosurgery+of+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Physics+B%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of femtosecond laser nanosurgery of cells and tissues.</a> Applied Physics B. 81 (8), 1015-1047 (2005).</li>
<li>Li, B., Wu, C., Wang, M., Charan, K., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+adaptive+excitation+source+for+high-speed+multiphoton+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">An adaptive excitation source for high-speed multiphoton microscopy.</a> Nature Methods. 17 (2), 163-166 (2019).</li>
<li>Kobat, D., Horton, N. G., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+microscopy+to+1.6-mm+depth+in+mouse+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon microscopy to 1.6-mm depth in mouse cortex.</a> Journal of Biomedical Optics. 16 (10), 106014(2011).</li>
<li>Akbari, N., Rebec, M. R., Xia, F., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+deeper+than+the+transport+mean+free+path+with+multiphoton+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Imaging deeper than the transport mean free path with multiphoton microscopy.</a> Biomedical Optics Express. 13, 452-463 (2022).</li>
</ol>

저자는 경쟁 이익이 없다고 선언합니다.

이 프로토콜은 상용 현미경 및 레이저 소스로 3P 이미징을 설정하는 단계별 절차를 설명합니다. 2PM에 비해, 3PM은 마우스 뇌 해마에서와 같이 더 깊은 영역에서의 광학 접근을 필요로 하는 어플리케이션에서 이점을 갖는다. 3PM은 주로 신경 과학에 사용되지만 3PM은 심부 조직 관찰을 위해 림프절, 뼈 및 종양과 같은 다른 조직에 잠재적으로 적용될 수 있습니다.
이미징 시스템이 샷 노이즈 제한에 근접하여 수행되는지 확인하는 것이 중요하며, 이는 감지 및 데이터 수집 전자 장치가 PMT 후 이미지에 무시할 수 있는 노이즈를 기여하도록 보장합니다. 검출된 광자 수의 불확실성은 근본적으로 광자 샷 노이즈에 의해 제한된다. 샷-노이즈 제한 성능은 고이득 광검출기(예를 들어, PMT)를 사용하는 전형적인 다중 광자 현미경에서 달성될 수 있다. 광자 샷 노이즈는 푸아송 통계 분포를 따르며, 여기서 분포의 표준 편차는 분포 평균의 제곱근과 같습니다. 샷 노이즈 제한 성능을 확인하려면 프로토콜 섹션의 1.14단계를 따르십시오.
H2O에 의한 광 감쇠를 피하기 위해, 침지용으로D2O를 사용하는 것이 특히 ~1,700nm 여기의 경우 도움이 된다. D2O를 사용하는 경우 ~10분마다 D2O를 새로 고치거나 이미징 중에 D2O/H2O교환을 피하기 위해대량의D2O를사용해야 합니다. 하나는 또한 방 환경(3)으로부터D2O를 밀봉할 수 있다. 장거리 작동 거리(WD) 대물 렌즈(예: 4mm 이상의 WD)를 이미징에 사용하는 경우, 침지 액체 두께는 2-3mm를 초과할 수 있습니다. 증가 된 두께는 ~ 1,300 nm21에서도H2O 흡수를 무시할 수 없게 만듭니다. 따라서,D2O는 긴 WD 대물렌즈를 사용하는 경우 1,300 nm 3PM의 경우에도 필요할 수 있다.
3P 형광 강도는 초점에서의 여기 펄스 에너지의 큐브(Eq. (1))에 의존하기 때문에, 적절한 레이저 파워를 설정하는 것은 살아있는 조직에서 열적 및 비선형 손상을 피하면서 적절한 3P 형광 신호를 얻기 위해 특히 중요하다. 평균 레이저 전력은 열 손상 임계값 이하로 유지되어야 합니다. 예를 들어, 마우스 뇌에서, 열 조직 손상을 피하기 위해, 마우스 뇌 표면의 평균 전력은 1 mm 깊이에서 ~1,300 nm 여기 및 230 μm x 230 μm 21의 시야각(FOV)을 위해 ~100 mW 이하로 유지되어야 한다. 마찬가지로, ~1,700nm에서의 평균 전력은 ~1mm 깊이에서 ~50mW 이하로 유지되어야 하고, FOV는 ~230μm x 230μm(미공개 데이터)로 유지되어야 한다. 또한, 여기 포화 및 잠재적 비선형 손상을 피하기 위해, 여기 펄스 에너지는 ~1,300 nm 및 ~1,700 nm 여기, 각각 30 내지 2 nJ 및 <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq03v2.jpg">3 nJ로 유지<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq03v2.jpg">되어야 한다.
조직의 광 흡수 및 산란으로 인해 초점의 펄스 에너지는 1 EAL에 의해 조직 침투 후 1 / e (~ 37 %)로 감쇠됩니다. EAL은 상이한 조직 및 여기 파장에 따라, 예를 들어, 마우스 뇌의 신피질에서, EAL은 ~1,300 nm 및 ~1,700 nm에서 각각 ~300 μm 및 ~400 μm이고, 각각 3,29이다(도 5). 따라서, 동일한 펄스 에너지를 n개의 EAL의 깊이에서 초점(예를 들어, 1nJ/펄스)으로 유지하려면, 표면 펄스 에너지에 1nJ × en을 곱해야 한다. 구조적 및 기능적 역학의 빠른 이미징을 위해, 높은 반복률(1MHz 이상에서)을 갖는 여기 레이저가 높은 프레임 레이트5,6,7,10을 달성하는 것이 바람직하다. 그러나 펄스 에너지 요구 사항 및 평균 레이저 전력 제한은 적용 가능한 반복률을 제한합니다.
예를 들어, 4 EALs에서 적당히 깊은 영역을 이미지 할 때 (즉, 1,300 nm 여기가있는 마우스 피질에서 ~ 1.2 mm), 표면에서 ~ 55 nJ / 펄스가 1 nJ / 펄스의 초점을 유지해야합니다. 평균 전력 제한이 100mW인 경우 ~2MHz 레이저 반복률을 적용할 수 있습니다. 그러나 7 EAL의 깊이에서 더 깊이 이미지화하려면 초점에서 1 nJ / 펄스를 유지하기 위해 표면에서 ~ 1,100 nJ / 펄스가 필요합니다. 열 손상을 피하기 위해 최대 평균 전력이 100mW라고 가정하면 레이저 반복률을 0.1MHz로 줄여 표면에서 1,100nJ/펄스를 달성해야 합니다. 표 1은 마우스 뇌 피질에서의 전형적인 영상화 조건을 요약한 것이다. 표 1의 이미징 깊이는 EAL이 전체 마우스 피질에서 균일하다고 가정한다.
더욱이, 심부 조직 3PM에서의 레이저 전력 제한으로 인해, 프레임 레이트와 이미지 픽셀 크기 사이에 트레이드오프가 존재하며, 이는 칼슘 이미징과 같은 기능적 이미징에 특히 중요하다. 최대 가용 레이저 반복률은 초점에서 요구되는 펄스 에너지 및 위에서 논의된 바와 같이 적용 가능한 평균 레이저 전력, 예를 들어, 1,300nm 여기와 함께 ~4 EAL에 상응하는 깊이에서 2MHz에 기초하여 각 깊이에서 결정된다. 일반적으로 이미징에는 픽셀당 적어도 하나의 펄스가 필요합니다. 따라서, 최소 이용가능한 픽셀 체류 시간은 레이저 반복률, 예를 들어, 2MHz 여기를 갖는 0.5μs/픽셀에 의해 결정된다.
3P 이미지에서 높은 공간 해상도(측면 1μm)를 유지하려면 1픽셀을 ~1μm2의 영역, 예를 들어 250 x 250μm2의 FOV의 경우 256 x256픽셀로 설정하는 것이이상적입니다. 따라서, 상당히 큰 FOV로 빠른 이미징을 수행하기 위해(예를 들어, 250 x 250 μm2, 256 x256 픽셀), 0.5 MHz, 1 MHz 및 2 MHz 펄스 반복률은 각각 ~7.6, ~15 및 ~30 프레임/s의 이론적인 최대 프레임 레이트를 제공한다. 마찬가지로, 레이저 반복률의 최적화는 목표 깊이, 스캔 속도 및 FOV에 따라 열 손상 임계값 하에서 적절한 펄스 에너지를 적용하는 데 필수적입니다. 이미징 속도를 증가시키기 위해, 적응형 여기 소스가 뉴런(31)에 필요에 따라 레이저 펄스를 전달함으로써 뉴런(즉, 관심 영역) 상의 모든 여기 펄스를 집중시키는데 사용될 수 있다.
3PM은 마우스 뇌의 두개골, 뼈 및 백질층(즉, 외부 캡슐)과 같은 고도로 산란된 매질을 통해 그리고 살아있는 조직 내의 심층 영상화에서 2PM과 비교할 때 유리하다. EIL이 길수록 3PE의 고차 비선형 여기가 심부 조직 이미징에 도움이됩니다. 예를 들어, 마우스 피질에서 GCaMP6을 이미지화하기 위해, 920 nm 여기를 갖는 2P 형광 신호는 690 μm에서 얕은 영역에서 1,300 nm 여기를 갖는 3P 형광 신호보다 높다(즉, 1,300 nm에서 <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq03v2.jpg">∼2.3 EALs)21. 그러나, 920 nm에 비해 1,300 nm에서 더 긴 EEL로 인해, 3PE는 ~690 μm의 깊이에서 2P 여기(2PE)보다 더 강한 형광을 제공하고 21 더 깊은21에서 더 강한 형광을 제공한다. 이 깊이는 '신호 크로스오버 깊이'로 정의되며, 여기서 2PE 및 3PE의 형광 신호 강도는 동일한 반복률 및 동일한 최대 허용 평균 전력(21)과 동일하다. 신호 크로스오버 깊이는 2PE 및 3PE 및 형광단에 대한 여기 파장에 따라 달라집니다.
실제로, 920nm 여기는 더 적은 흡수로 인해 1,300nm 여기보다 더 높은 평균 레이저 파워를 허용합니다. 그러나 2PE의 평균 전력이 높을수록 신호 크로스 오버 깊이가 0.9 EALs4 만 푸시됩니다. 또한, 샘플이 조밀하게 라벨링될 때, 3PE는 훨씬 더 높은 SBR의 추가적인 이점을 갖는다. 따라서 신호 크로스 오버 길이에 도달하기 전에도 3PM은 2PM보다 이미징에 더 좋을 수 있습니다. 예를 들어, ~2%의 부피 분율(즉, 라벨링 밀도)을 갖는 마우스 뇌 혈관조직을 영상화할 때, 100 mW의 여기 파워를 갖는 1,300 nm 3PM은 플루오레세인에 대해 ∼700 μm의 깊이에서 200 mW의 여기 파워로 920 nm 2PM을 능가한다.
도 3PM은 얇지만 고도로 산란되는 층을 통해 이미징할 때 여기 빔의 포인트 확산 기능을 왜곡시키고 디포커스 배경(4)을 생성할 수 있는 장점이 있다. 예를 들어, 마우스 뇌의 무손상 두개골을 통해, 2PM 이미지는 뇌 표면(13)으로부터 &lt;100 μm의 얕은 깊이에서도 디포커스 배경을 겪는다. 유사한 디포커스 배경이 2PM에서 마우스 뇌(32)에서 백질을 통한 1,280 nm 여기와 함께 관찰되었다. 따라서, 조직이 탁한 층을 통해 영상화되는 경우, 라벨링 밀도에 관계없이 고콘트라스트 이미징을 위해 3PM이 2PM보다 바람직하다.
우리는 최근에 비드 팬텀과 3PM의 이미징 깊이 한계가 8EALs 33 이상임을 보여주는 이론적 분석을보고했습니다. 8 EAL은 마우스 피질에서 ~ 1,700 nm 여기가있는 ~ 3 mm와 동일합니다. 그러나 현재 사용 가능한 레이저는 마우스 뇌에서 8 EAL을 달성하기에 충분한 펄스 에너지를 가지고 있지 않습니다. 더 강한 레이저의 추가 개발은 현재 3PM의 이미징 깊이 제한을 밀어 낼 것입니다.

생명 과학에서 2PM 및 3PM과 같은 다중 광자 현미경 (MPM) 기술은 높은 시공간 분해능과 산란 조직의 높은 대비로 심층적 인 생체 내 이미징을위한 강력한 도구였습니다. 또한, 이러한 방법은 1 광자 공초점 현미경1,2,3,4와 비교할 때 더 적은 광표백을 유발합니다. 3PM은 두 가지 주요 특징으로 인해 2PM과 비교할 때 더 깊은 조직 이미징에 유리합니다 : (i) 장파장 여기 (~ 1,300 nm 또는 ~ 1,700 nm)의 고용은 조직 산란을 감소시키고, (ii) 고차 여기 과정 (즉, 형광 신호는 원하지 않는 배경 형광을 억제하는 2PM의 여기 전력의 제곱 대신 3PM에서의 여기 전력의 입방체에 의존한다)3 . 결과적으로, 3PM은 손상되지 않은 성인 마우스 뇌 3,5,6,7,8,9,10,11의 해마와 같은 살아있는 조직의 더 깊은 영역과 Ca2+를 포함한 성인 제브라피쉬 12의 전뇌 전뇌에서 고대비 이미징을 가능하게합니다. 활동 기록 및 다색 관찰. 또한, 마우스와 성인 제브라피쉬12,13의 손상되지 않은 두개골을 통해 오후 3시로 고대비 이미지가 얻어졌습니다.
오늘날 ~1,300nm 및 ~1,700nm에서 3P 여기(3PE)에 적합한 여기 레이저 소스가 상용화되어 있습니다. 레이저 스캐닝 시스템은 2PM 및 3PM에 대해 본질적으로 동일하기 때문에, 기존의 2P 셋업을 3P 셋업으로 변환하는 것은 3PE용 상용화된 레이저의 설치와 함께 생물학 실험실에서 가능하다. 3P 형광 신호는 대물 렌즈의 레이저 전력, 펄스 지속 시간, 레이저 반복률 및 수치 조리개 (NA)에 따라 달라집니다. 회절-제한된 초점(즉, 대물 렌즈의 백 애퍼처가 여기 빔에 의해 오버필됨)을 가정하면, Eq(1)은 3PE로부터 생성된 초점 부피로부터의 시간-평균화된 형광 광자 플럭스를 기술한다.
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq01v3.jpg"> (1)
여기서 f는 레이저 반복률이고, τ는 레이저 펄스 지속시간(반값에서 전폭), φ는 시스템 수집 효율이고, η는 형광 양자 효율이고, σ3은 3P 흡수 단면이고, C는 형광단 농도이고, n0은 샘플 매질(예를 들어, 물)의 반사 지수이고, λ는 진공에서의 여기 파장이고, NA는 대물 렌즈의 개구수이고, 3은 초점 볼륨의 공간 적분 상수이며, 대물 렌즈 아래의 시간 평균 여기 광자 플럭스(광자/s)이고, z는 이미지화된 깊이이고,<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63213/62313eq02.jpg"> EAL은 유효 감쇠 길이(14)이다. 여기서 우리는 EAL (전형적으&gt; 100 μm)이 현미경의 축 분해능 (전형적으로 &lt; 10 μm)보다 훨씬 크다고 가정하였다. 역축 근사치에서3은 28.114와 같습니다. gp(3)은 여기 소스의 3차수 시간적 일관성이고, gp(3)은 하이퍼볼릭-세컨트-제곱 펄스 및 가우시안 펄스에 대해 각각 0.41 및 0.51이다. φ 수집 효율은 대물렌즈에 의한 형광 수집, 대물렌즈의 투과율, 이색성 거울의 반사율, 필터의 투과율, 및 검출기(예를 들어, 광승수관, 또는 PMT)의 검출 효율을 고려하여 추정될 수 있다. 3P 형광 강도는 다양한 파라미터에 크게 의존하기 때문에 3P 형광 신호를 최대화하기 위해서는 3P 설정의 최적화가 필요합니다.
이 프로토콜은 일반적인 3P 설정의 최적화 프로세스를 보여 주며, 이는 특히 2P 설정을 가지고 있으며 3P 이미징으로 기능을 확장하거나 상용 3P 설정을 최적의 성능으로 유지하려는 생물학 실험실에 유용합니다. 이 비디오 기사는 또한 살아있는 동물의 두뇌에서 심부 조직 3P 이미징을 보여줍니다. 첫 번째 섹션에서는 상용 레이저 소스 및 다중 광자 현미경을 사용한 일반적인 3P 설정의 최적화에 대해 설명합니다. 두 번째 및 세 번째 섹션에서는 뉴런 구조 및 활동의 3PM에 대한 제브라 피쉬 및 마우스 준비에 대해 각각 설명합니다. 마우스 두개골 절제술은 이전에 프로토콜 논문 및 15,16,17에보고되었습니다. 네 번째 섹션은 제브라 피쉬와 마우스 뇌에서 생체 내 3P 이미징을 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td>5 % 포비돈 요오드</td><td>아마존</td><td>NDC 67818-155-32</td><td>수술 부위의 수용 세척</td></tr><tr><td>70 % 에탄올</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>CAS 64-17-5</td><td>수술 부위의 수용 세척</td></tr><tr><td>아가로 오스</td><td>시그마</td><td>A4718-256</td><td>제브라 피쉬 챔버 준비</td></tr><tr><td>아트로핀</td><td>코넬 수의학 관리</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bergamo II</td><td>Thorlabs</td><td></td><td>다광자 이미징 현미경</td></tr><tr><td>Bupivacaine</td><td>Cornell Veterinary Care</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dexamethasone</td><td>Cornell Veterinary Care</td><td></td><td></td></tr><tr><td>도넛 모양 유리(ID4.5, OD6.5)</td>개두술 눈 연고(또는 국소 안과 연고<td>)에 사용되는</td> <td>포토맥 포토닉스</td><td></td> 커버 유리</tr><tr><td>Puralube Vet Ointment</td><td></td> <td>NDC 17033-211-38</td><td>수술 및 마취 중 자극을 예방하거나 안구건조를 완화하기 위한 윤활제로 사용</td></tr><tr><td>GaAsP 증폭 PMT</td><td>Thorlabs</td><td>PMT2100</td><td>PMT 검출기</td></tr><tr><td>포도</td>당 <td>Cornell Veterinary Care</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glycopyrrolate</td><td>Cornell Veterinary Care</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heater (800 W)</td><td>Finnex</td><td></td><td>Aquarium heater for zebrafish water)</td></tr><tr><td>Isoflurane USP 250 mL</td><td>Piramal</td><td>NDC 66794-0013-25</td><td>생쥐 마취용</td></tr><tr><td>케토 프로펜</td><td>코넬 수의학 관리</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimtech</td><td></td><td>실험실 조직</td></tr><tr><td>36G 바늘</td><td>WPI</td><td>NANOFIL + NF36BV</td><td>주사기 및 판쿠로늄 브로마이드 주입 용 바늘</td></tr><tr><td></td><td>Norland</td><td>NOA 68</td><td>둥근 커버 슬립과 도넛 모양의 유리를 함께 붙입니다.</td></tr><tr><td>Pancuronium Bromide</td><td>Cornell Veterinary Care</td><td></td><td></td></tr><tr><td>연동 펌프</td><td>Elemental Science</td><td>ESI MP2</td><td>제브라피쉬 설치용 워터 펌프</td></tr><tr><td>폴리에틸렌 튜빙(I.D. 0.58mm, O.D. 0.965mm)</td><td>Elemental Science</td><td>MP2 펌프 튜빙</td><td>제브라피쉬의 입에 들어가는 튜빙</td></tr><tr><td>라운드 커버 슬립 독일 유리 #1.5, 5mm</td><td>전자 현미경 과학</td><td>7229605</td><td>개두술에 사용되는 커버 유리</td></tr><tr><td>Spirit-NOPA</td><td>Spectra Physics</td><td></td><td>조정 가능한 광학 파라메트릭 증폭기</td></tr><tr><td>SR400</td><td>Stanford Research Systems</td><td>SR400</td><td>광자 계수기</td></tr><tr><td>표준 포토다이오드 전력 센서</td><td>Thorlabs</td><td>S122C</td><td>전력 감지기</td></tr><tr><td>멸균 인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>Millipore Sigma</td><td>SKU 806552-500ml</td><td>마우스 뇌 수술 중 사용</td></tr><tr><td>수술용 드레이프</td><td>Dynarex 일회용 수건 드레이프</td><td>4410</td><td>수용성 마우스 수술용</td></tr><tr><td>얇은 스트립 복싱 왁스</td><td>Corning Rubber Co., Inc.</td><td></td><td>제브라피시 챔버에 튜브를 고정하는</td></tr><tr><td>ThorImage</td><td>Thorlabs</td><td></td><td>이미지 수집 소프트웨어</td></tr><tr><td>Tricaine(에틸-m-아미노벤조에이트 메탄설포네이트 염)</td><td>MP</td><td>103106</td><td>제브라피시 마취 및 안락사</td></tr><tr><td>Tygon 튜브(ID 1/16 in., OD 1/8 in.)</td><td>제브라 피쉬 준비를위한 물 흐름을위한</td> <td>Tygon</td><td></td> 튜빙</tr><tr><td>VaporGuard</td><td>VetEquip</td><td>931401</td><td>이소 플루란 재활용을위한</td></tr><tr><td>Vetbond 조직 접착제</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td>쥐 두개골의 유리창을 붙이고 물고기를 준비 할 때 실험실 조직을 붙입니다.</td></tr><tr><td>XLPLN25XWMP2</td><td>Olympus</td><td></td><td>다광자 여기 전용 대물렌즈</td></tr></tbody></table>

deep-tissue three-photon 형광 현미경 검사 in intact mouse and zebrafish brain

Deep-Tissue Three-Photon Fluorescence Microscopy in Intact Mouse and Zebrafish Brain

2광자 현미경 (2PM) 및 3 광자 현미경 (3PM)과 같은 다중 광자 현미경 기술은 세포 내 해상도로 생체 내 심부 조직 이미징을위한 강력한 도구입니다. 3PM은 생물학 실험실에서 널리 사용 된 2PM 이상의 심부 조직 이미징에 대한 두 가지 주요 이점을 가지고 있습니다 : (i) ~ 1,300 nm 또는 ~ 1,700 nm 여기 레이저를 사용하여 산란 조직에서 더 긴 감쇠 길이; (ii) 고차 비선형 여기로 인한 배경 형광 생성 감소. 그 결과, 3PM은 피질층에서 해마, 성인 제브라피쉬의 전뇌 전체에 이르기까지 온전한 마우스 뇌와 같은 산란 조직 깊숙한 곳에서 고대비 구조 및 기능적 이미징을 허용합니다.
오늘날 3PM에 적합한 레이저 소스가 상용화되어 기존의 2P(2P) 이미징 시스템을 3광자(3P) 시스템으로 전환할 수 있습니다. 또한 여러 상업용 3P 현미경을 사용할 수 있으므로 생물학 연구소에서이 기술을 쉽게 사용할 수 있습니다. 이 논문은 전형적인 3PM 설정, 특히 이미 2P 설정이있는 생물학 그룹을 대상으로하는 최적화를 보여 주며 손상되지 않은 마우스 및 성인 제브라 피쉬 뇌에서 생체 내 3D 이미징을 보여줍니다. 이 프로토콜은 현미경 정렬, ~ 1,300 및 ~ 1,700 nm 레이저 펄스의 프리 치핑, 동물 준비 및 성인 제브라 피쉬 및 마우스 두뇌 깊숙한 곳에서 중요한 3P 형광 이미징을 포함한 3P 이미징의 전체 실험 절차를 다룹니다.

이 프로토콜의 성공적인 완성은 최적의 광 파라미터 (예를 들어, 펄스 지속시간, NA) 및 생체내 3PM에 적합한 동물 제제를 갖는 적절하게 정렬된 현미경을 초래할 것이다. 상업적으로 입수가능한 3P 셋업은 ~1,300 nm 및 ~1,700 nm 모두에 적합한 미러 및 렌즈를 포함한다; 따라서 여기 파장이 1,300nm와 1,700nm 사이에서 전환될 때 광학의 변화가 필요하지 않습니다. 3P 셋업의 렌즈에 1,300 및 1,700nm에 적합한 코팅이 없는 경우 레이저 전력 손실을 줄이기 위해 적절한 렌즈로 교체해야 합니다. 최적화 된 3PM과 적절한 동물 준비로 높은 콘트라스트를 가진 생체 내 형광 및 THG 이미지를 뇌 깊숙이 수집 할 수 있습니다.
도 3은 온전한 성인 제브라피쉬의 대표적인 3P 이미지를 보여준다. 성인 제브라피쉬 뇌에서 유전자 표지된 뉴런의 고해상도, 비침습적, 심층 영상화는 3PM을 사용하여 달성된다. 텔렌스팔론 영역의 영상이 2PM24,25,26,27을 사용하여 성인 제브라피쉬 뇌에서 보고되었지만, 3PM은 텔렌스팔론 전체와 다른 기술을 사용하여 관찰하기가 더 어렵거나 불가능한 영역에 접근할 수 있게 한다. 광학 구조체 및 소뇌에서 세포층의 분포는 도 3C에서 관찰될 수 있다. 성공적인 이미징 세션에서, 뼈는 THG 채널에서 볼 수 있고 형광 채널에서 볼 수 있는 뉴런이다. 성인 제브라피쉬 영상의 경우, 현미경의 카메라 기능을 사용하여 물고기를 찾습니다(그림 3A). 이 단계는 유리 창이 뇌에 쉽게 접근 할 수있을만큼 충분히 크기 때문에 마우스 뇌 영상에 필요하지 않습니다. 성인 제브라피쉬 뇌의 고해상도 구조 이미지는 이전 섹션에서 설명한 시스템을 사용하여 얻어졌다. 두개골은 THG 채널 (그림 3B)에서 볼 수 있으며, 이는 뇌를 탐색하고 상단 표면을 찾는 데 도움이됩니다. 도 3C에서 관찰된 바와 같이, 뉴런은 성인 뇌 깊숙한 곳에서 높은 신호-배경비(SBR)로 구별될 수 있다. 뇌 위의 조직은 자기 형광으로 인해 형광 채널에서 볼 수 있습니다.
도 4는 1,340 nm 여기10을 갖는 성인 마우스 뇌에서 THG (파란색) 신호와 함께 GCaMP6s 표지된 뉴런 (녹색) 및 텍사스 레드 표지된 혈관 (적색)의 다색 3P 이미지를 도시한다. 이미지는 이전 작품(10)으로부터 재생된다. 도 4에서, 초점에서의 펄스 에너지는 충분한 형광 및 THG 신호를 얻기 위해 전체 깊이에서 ∼1.5 nJ로 유지되었고, 최대 평균 레이저 전력은 ∼70 mW였다. 펄스 지속 시간은 ∼60 fs로 조정되었고, 유효 NA는 ~0.8이었다. 3PM 설정을 최적화하여 CA1 해마 영역에서 뇌 표면에서 1.2mm까지 고대비 이미지를 성공적으로 얻을 수 있었습니다(그림 4A,B). 도 4C, D는 10분 기록 세션 동안 750μm의 깊이에서 GCaMP6s 표지된 뉴런의Ca2+ 활성 흔적을 보여주며, 높은 기록 충실도를 보여준다.
여기 레이저가 잘못 정렬되면 시야각을 가로 지르는 신호 밝기의 불균일성이 관찰 될 수 있습니다. 추가적으로, 펄스 지속시간, 초점에서의 여기 펄스 에너지 및 효과적인 NA와 같은 레이저 파라미터가 최적화되지 않으면, 물고기 두개골 또는 마우스 뇌의 두개골 절제술 창으로부터의 THG 이미지가 보이지 않을 것이고/있거나 높은 여기 펄스 에너지(예를 들어, 초점에서 &gt;2nJ/펄스)를 필요로 할 것이다. 따라서 뇌 표면의 THG 신호는 심부 조직 이미징을 시작하기 전에 최적화 된 3PM 설정을위한 지표로 사용할 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63213/63213fig1v5.jpg"> 그림 1: 오후 3시 설정의 개략적인 그림. 여기 레이저의 파장은 ~1,300nm 또는 ~1,700nm로 설정되며, NOPA의 아이들러 포트에서 출력됩니다. 프리즘 쌍 압축기와 Si 플레이트 압축기는 여기 레이저 펄스를 프리처프하기 위해 각각 ~ 1,300 nm 및 ~ 1,700 nm 레이저에 사용됩니다. ~1,300nm 및 ~1,700nm 레이저 빔은 플리퍼 미러로 전환할 수 있습니다. NOPA의 신호 포트는 트리거링 신호를 획득하는데 사용된다. 반파판 및 PBS가 여기 전력을 제어하기 위해 사용된다. 형광과 THG는 GaAsP PMT에 의해 검출됩니다. 이색성 미러와 대역 통과 필터의 적절한 조합은 형광과 THG 신호를 분리하는 데 사용됩니다. 약어 : 3PM = 3 광자 현미경; NOPA = 비공선형 광학 파라메트릭 증폭기; PBS = 편광 빔 스플리터; THG = 세 번째 고조파 생성; DAQ = 데이터 수집; PMT = 광배수 튜브. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63213/63213fig1v5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63213/63213fig2v5.jpg"> 그림 2: 물고기의 생체 내 이미징을 위한 대표적인 스크린샷(프로토콜 섹션 4.1). (A) 4x 대물 렌즈가 장착된 이미지 수집 소프트웨어의 카메라 모드 보기. 소프트웨어의 주요 기능은 다음과 같이 개요 및 번호가 매겨집니다 : 1. 이미지 획득 소프트웨어의 이미징 모드. 모드 옵션은 카메라, 멀티 광자 및 멀티 광자 GG입니다. CCD 카메라를 사용한 백색광 이미징의 경우 카메라 모드가 선택됩니다. 2. 라이브 버튼을 클릭하면 카메라 (또는 다중 광자 옵션의 경우 PMT)가 켜지고 현미경의 실시간 뷰를 관찰 할 수 있습니다. 3. 캡처 설정 탭에서 원하는 이미징 파라미터(전력, 위치, 깊이)가 설정됩니다. 4. 캡처 탭에서 이미지를 저장할 폴더 위치가 할당됩니다. 이 탭에서 이미징을 시작할 수 있습니다. 5. Z Control 설정은 z 스테이지 모터를 이동하여 이미징의 깊이를 제어합니다. 6. 제브라 피쉬 머리의 대표 이미지. 머리의 로스트랄 쪽은 왼쪽에 있습니다. (B) 25x 대물 렌즈를 사용한 카메라 모드의 대표적인 모습. (C) (B)에서 본 영상의 THG 이미지를 포함하는 다중광자 GG 모드의 대표도. 약어: CCD = 전하 결합 장치; PMT = 광승수 튜브; THG = 세 번째 고조파 세대. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63213/63213fig2v5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63213/63213fig3v5.jpg"> 그림 3: 이미지 획득 소프트웨어로 획득한 성인 제브라피쉬 뇌의 대표적인 이미지. (A) 4x 대물 렌즈로 획득한 성인 제브라피쉬 머리의 카메라 모드 이미지. 이미지의 맨 위는 로스트랄 방향입니다. OT 로브와 CB가 윤곽을 그립니다. (B) (A)의 THG 이미지가 포함된 25x 대물렌즈로 멀티광자 GG 모드에서 획득한 대표적인 영상. (C) 소뇌와 다양한 깊이의 뉴런의 세포질에서 GFP가 발현되는 광학 텍텀의 교차점에서 성인 제브라 피쉬 뇌의 형광 이미지. 스케일 바 = 100 μm. 약어: OT = 옵틱 텍탐; CB = 소뇌; THG = 세 번째 고조파 생성; GFP = 녹색 형광 단백질. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63213/63213fig3v5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63213/63213fig4v5.jpg"> 그림 4: 마우스 뇌에서 1,340 nm 여기 시 GCaMP6 s 표지된 뉴런(녹색), 텍사스 적색 표지된 혈관(적색) 및 3차 고조파 생성(파란색)의 다색 3 PM. (A) 270 x 270 μm(프레임당 512 x 512 픽셀)의 시야각을 갖는 뇌 표면으로부터 1,200 μm까지 내려오는 Z-스택 이미지. 레이저 파워는 초점에서 ~1.5 nJ 펄스 에너지를 유지하기 위해 이미징 깊이에 따라 변화되었다. 목표 하에서의 최대 평균 전력은 70mW였다. (B) 다양한 이미징 깊이에서 선택된 2D 이미지. (c) 270 x 270 μm (256 x 256 픽셀)의 시야각을 갖는 경막 아래 750 μm의 활동 기록 부위. (d) (C)에 표시된 표지된 뉴런으로부터 깨어 있는 마우스에 기록된 자발적인 뇌 활동 흔적. 프레임 속도는 8.3Hz였고, 픽셀 체류 시간은 0.51μs였다. 레이저 반복률은 2MHz이고 대물 렌즈 아래의 평균 전력은 56mW였습니다. 각 트레이스는 기준선으로 정규화되고 0.72s 시간 상수의 해밍 창을 사용하여 저역 통과를 필터링했습니다. 스케일 바 = 50 μm. 이 그림과 그림 전설은 10에서 재현됩니다. 약어 : 3PM = 3 광자 현미경. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63213/63213fig4v5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63213/63213fig05.jpg"> 그림 5: 마우스 뇌의 신피질에서 효과적인 감쇠 길이. EAL (마젠타 라인)은 75% 물 조성을 가정하여 조직 산란 (적색 선) 및 조직 (청색 선)에서의 수분 흡수로부터 계산된다. 검은 별은 마우스 뇌의 신피질에서 EIL의 보고된 실험 데이터 3,21,28,29를 나타낸다. EAL은 조직마다 다릅니다. 약어: EAL = 유효 감쇠 길이. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63213/63213fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>여기 파장 (nm)</td>
			<td>침수</td>
			<td>최대 레이저 전력 (엠W)</td>
			<td>초점에서 최대 펄스 에너지* (nJ)</td>
			<td>마우스 피질의 전형적인 EAL (μm)</td>
			<td>마우스 피질의 영상 깊이** (mm)</td>
			<td>목표 하의 펄스 에너지 *** (nJ)</td>
			<td>최대 레이저 반복률**** (메가헤르츠)</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">1300</td>
			<td rowspan="4">H2O또는D2O</td>
			<td rowspan="4">
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq03v2.jpg">100</td>
			<td rowspan="4">
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq03v2.jpg">2</td>
			<td rowspan="4">~300</td>
			<td>0.8</td>
			<td>~14</td>
			<td>~7</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.2</td>
			<td>~55</td>
			<td>~2</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.6</td>
			<td>~210</td>
			<td>~0.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>2.1</td>
			<td>~1100</td>
			<td>~0.1</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">1700</td>
			<td rowspan="4">D2O</td>
			<td rowspan="4">
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq03v2.jpg">50</td>
			<td rowspan="4">
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq03v2.jpg">3</td>
			<td rowspan="4">~400</td>
			<td>0.8</td>
			<td>~7</td>
			<td>~7</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.2</td>
			<td>~20</td>
			<td>~2.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.6</td>
			<td>~55</td>
			<td>~1</td>
		</tr>
<tr>
<td>2.1</td>
			<td>~190</td>
			<td>~0.3</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 마우스 피질 영상화를 위한 전형적인 3P 여기 조건. * 높은 NA (~ 1.0) 목표, ~ 50 fs의 펄스 폭 및 형광 단백질 (예 : GFP 및 RFP)과 같은 전형적인 형광단. ** EAL이 전체 피질에서 균일하다는 가정하에. 초점에서 ~1nJ/펄스를 달성하기 위해, EAL 및 이미징 깊이로부터 계산. 목표 하의 펄스 에너지와 최대 허용 레이저 전력으로부터 계산됩니다. 약어: 3P = 삼광자; NA = 수치 개구; GFP = 녹색 형광 단백질; RFP = 적색 형광 단백질; EAL = 유효 감쇠 길이.

삼광자 현미경 검사는 마우스와 제브라피쉬 뇌와 같은 살아있는 생물학적 조직 깊숙한 곳에서 높은 시공간 분해능으로 고대비 형광 이미징을 가능하게 합니다.

Deep-Tissue Three-Photon 형광 현미경 검사 in Intact Mouse and Zebrafish Brain

Multiphoton microscopy techniques, such as two-photon microscopy (2PM) and three-photon microscopy (3PM), are powerful tools for deep-tissue in vivo ...

이 프로토콜은 마우스 뇌 및 성인 제브라피쉬에서 생체 내 심부 조직 삼광자 현미경 검사를 수행하는 방법을 보여줍니다. 생명 과학에서 두 가지 중요한 모델 시스템. 장파장 삼광자 현미경 검사는 이광자 현미경으로 접근 할 수없는 깊이에서 손상되지 않은 조직 또는 장기의 생체 내 고공간 해상도 이미징을 가능하게합니다.이 기술은 질병이 뇌에 어떻게 영향을 미치는지에 대한 완전한 이해가 부족한 알츠하이머 및 자폐증과 같은 신경 질환의 기본 메커니즘을 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다. 마우스 뇌 영상 시술을 시연하는 것은 우리 실험실의 박사후 연구원이자 제브라피쉬 뇌 영상 절차를 시연하는 Kibaek Choe가 될 것이며, Fetcho Research Laboratory의 연구원 인 Kristine Kolkman이 될 것입니다. 시작하려면 레이저를 켜고 비공선형 광학 파라메트릭 증폭기의 아이들러 출력의 중심 파장을 1, 300 또는 1, 700 나노미터로 설정한 다음 광 경로에 펄스 압축기를 배치하여 펨토초 레이저를 미리 처프하고 3광자 이미징을 위한 펄스 지속 시간을 최적화합니다.실리콘 플레이트와 레이저 경로 사이의 각도를 브루스터의 각도로 설정하여 레이저 투과율을 최대화한 다음, 실리콘 플레이트를 회전시켜 반사를 최소화하여 브루스터의 각도를 달성하십시오. 다음으로, 플리퍼 미러를 배치하여 1, 300 및 1, 700 나노미터 빔 라인 사이를 편리하게 전환할 수 있습니다. 회전 스테이지에 장착된 반파판과 편광 빔 스플리터를 배치하여 레이저의 강도를 제어한 다음 빔 스플리터의 반사 경로에 빔 차단기를 배치합니다.0.5 센티미터의 2 % 고융점 한천으로 페트리 요리를 준비하십시오. 한천이 냉각되고 응고되면 한천의 직사각형 구멍을 물고기보다 길고 약간 넓게 자릅니다. 왁스를 사용하여 한쪽 끝이 직사각형인 페트리 접시에 얇은 튜브를 부착하고 페트리 접시의 가장자리에 직경이 큰 튜브를 부착하십시오.다음으로, 밀리리터 트리카인 용액 당 0.2 밀리그램에 물고기를 넣어 마취 한 다음 마취 된 물고기를 젖은 스폰지 위에 옆으로 놓은 다음 미세 주사기를 사용하여 역궤도로 3 마이크로 리터의 판쿠로늄 브로마이드를 주입하여 물고기를 마비시키고 행크의 용액에 간단히 넣어 완전히 마비되도록하십시오. 다음으로, 머리를 튜브쪽으로 향하게하여 페트리 접시에 물고기 등쪽을 올려 놓은 다음 포셉을 사용하여 물고기의 입을 부드럽게 열고 튜브를 입으로 밀어 넣으십시오. 튜빙이 물고기의 입 뒤쪽에 오도록 물고기를 튜빙 쪽으로 부드럽게 밀어 넣습니다.빨리, 그러나 부드럽게, 물고기 주위의 한천을 말리고 물고기 꼭대기에있는 물을 제거하십시오. 실험실 조직의 작은 조각을 실험실 접착제에 담그고 물고기의 양쪽에있는 한천과 아가미에 물고기의 등 꼬리 위에 조직을 넣으십시오. 다음으로, 머리 표면에 직접 작은 부피바카인 방울을 올려 물고기의 피부를 마취 한 다음 물고기가있는 페트리 접시를 현미경으로 가져 오십시오.접시에 생선 시설 물을 채우고 튜브에 워터 펌프를 연결하여 시스템 물을 물고기의 입으로 펌핑하십시오. 물이 버블러로 산소를 공급하고 수족관 히터로 섭씨 30도까지 따뜻하게하십시오. 이미징을 위해 삼광자 현미경에 저배율 목표를 놓은 다음 물고기와 튜브가 들어있는 페트리 접시를 현미경 아래에 놓고 LED 광원을 사용하여 페트리 접시를 비추십시오.이미지 수집 소프트웨어에서 카메라 모드를 열고 라이브를 클릭한 다음 화면 오른쪽에서 채널 A를 선택하고 히스토그램 설정을 조정하여 이미지를 명확하게 볼 수 있습니다. 모터 컨트롤러의 모터 설정을 기본으로 설정 한 후 물고기가 보일 때까지 목표를 낮 춥니 다. 물고기 머리의 중심을 시야의 중앙에 놓은 다음 목표를 위로 움직여 물고기의 머리에서 멀리 떨어 뜨립니다.저배율 대물 렌즈를 삼광자 이미징을 위해 고수치 조리개 대물 렌즈로 교체한 다음 물고기의 머리 쪽으로 가까이 움직입니다. 모든 모터의 축 값을 0으로 설정합니다. 대물 렌즈를 천천히 낮추어 목표물이 머리에 물리적으로 닿지 않도록하십시오.CCD 카메라 소프트웨어에서 머리 상단이 보이면 목표 이동을 중지하고 X, Y 및 Z 위치를 0으로 설정합니다. LED 광원을 끄고 시스템 주변의 어두운 커튼을 닫은 다음 이미징 수집 소프트웨어를 삼광자 이미징을 위해 다중 광자 GG 모드로 설정하고 대물 렌즈 아래의 전력을 1 밀리와트 미만으로 설정하십시오. 이미지 수집 소프트웨어에서 라이브 버튼을 클릭하십시오.PMT 채널을 열고 필요에 따라 PMT 게인 및 배경 레벨을 조정합니다. 대물 렌즈를 천천히 위로 움직여 큰 혈관과 윈도우 글라스 표면으로부터 THG 채널을 모니터링하여 머리 표면을 찾습니다. 대물 렌즈를 창 가까이로 이동한 후 목표와 두개골 창 사이에 물을 바른 다음 모든 모터의 축 값을 0으로 설정합니다.이미지 수집 소프트웨어에서 라이브 버튼을 클릭하십시오. PMT 채널을 열고 필요에 따라 PMT 게인 및 배경 레벨을 조정한 다음, 대물 렌즈를 천천히 위로 이동하여 큰 혈관과 윈도우 글라스 표면으로부터 THG 채널을 모니터링하여 커버 슬립의 표면을 찾습니다. 필요한 경우 창 방향을 조정 한 다음 모터를 제로로 설정하여 뇌 표면을 정의하십시오.이미징을 수행하고 이미징 깊이에 따라 전력 레벨을 조정합니다. 성인 제브라피쉬 뇌에서 유전자 표지된 뉴런의 고해상도, 비침습적, 심층 이미징은 삼광자 현미경을 사용하여 달성된다. 시신경 구조체와 소뇌에서 세포층의 분포도 관찰 할 수 있습니다.현미경의 카메라 기능은 물고기를 찾는 데 사용되었습니다. 두개골은 THG 채널에서 볼 수 있으며, 이는 뇌를 탐색하고 상단 표면을 찾는 데 도움이됩니다. 뉴런은 성인 뇌 깊숙한 곳에서 높은 신호 대 배경 비율로 구별 할 수 있습니다.성인 마우스 뇌에서 THG 신호와 함께 GCaMP6s 표지 뉴런 및 텍사스 레드 표지 혈관의 다색 삼광자 이미지가 여기에 표시됩니다. 설정 최적화를 통해 CA1 해마 영역의 뇌 표면에서 1.2mm까지 고대비 이미지를 성공적으로 얻을 수 있었습니다. GCaMP6s 표지된 뉴런의 칼슘 활성 흔적은 10분 기록 세션 동안 750마이크로미터의 깊이에서 높은 기록 충실도를 나타냈다.이 설정은 뇌 기능을 이해하기 위해 신경 활동을 시각화하는 데 도움이 될 수 있습니다. 또한 다양한 생물학적 시스템을 이해하기 위해 생물학적 조직 내에서 세포 이동을 추적하는 데 사용할 수 있습니다. 또한 동물의 건강을 모니터링하기 위해 혈류 속도를 측정 할 수도 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

여기 우리는 장기적인 영상, 두 광자 이미징 및 조직 손상을 기술하고, 시간 경과 공촛점 이미징에 대한 zebrafish 배아를 장착하는 방법을 설명합니다.

라이브 zebrafish의 배아에서 두 광자의 axotomy하고 시간이 경과 공촛점 영상

여기 세미 두께 뇌 조각의 이미지 찬란 표시된 셀에 신속하고 간단한 방법을 설명합니다. , 고정 깔끔히 및 광학 뇌 조직을 취소하여 우리는 표준 epifluorescent 또는 공촛점 이미지가 손상 신경 조직 내의 개별 세포의 연결 네트워크를 시각화하는 데 사용할 수있는 방법에 대해 설명합니다.

세미 두께 뇌 조각의 고해상도 형광 이미징에 대한 빠른 접근

전체 마우스 기관의 Multiphoton 현미경은 광학 이미징 전에 장기를 삭제하면 가능하지만, 모든 프로토콜은 형광 단백질의 형광 신호를 보존 할 수 있습니다. 에탄올 기반의 탈수 및 벤질 알코올 광학 개간 방법 사용 : 벤질 벤조산의 개간을, 우리는 전체 마우스 두뇌가 YFP을 표현의 고해상도 multiphoton 이미지를 보여줍니다.

YFP를 표현 잡습니다 마우스 뇌의 Multiphoton 현미경

출처: Hontani, Y., et al. 온전한 마우스와 제브라피쉬 뇌의 심부 조직 3광자 형광 현미경. J. Vis. 경험. (2022년)이 비디오는 마취된 제브라피쉬 뇌에서 3광자 이미징의 설정 및 실행을 보여줍니다. 이 프로토콜은 형광 표지된 뉴런의 심부 조직 시각화를 가능하게 하여 신경과학 연구 응용 분야를 위한 실시간 뉴런 활동 및 구조를 밝힙니다.

3광자 형광 현미경을 사용한 제브라피쉬 뇌의 심부 조직 이미징

애벌레 제브라 피쉬의 뇌 발달의 영상이 설명되어 있습니다. 3D 영상을 촉진하고 화학적 처리를 사용하여 뇌 혈관 발달을 수정하는 기술도 제공됩니다.

이미징 및 배아 제브라 피쉬의 뇌 혈관 구조의 3 차원 재구성

이 문서에서 우리는 높은 해상도, 형광 표지 된 마우스의 뇌의 미세 뇌 해부학과, 재구성하는 전체 실험 절차를 설명합니다. 설명 프로토콜은 샘플 준비 및 청소, 영상, 데이터 후 처리 및 다중 스케일의 시각화를 위해 설치 표본이 포함되어 있습니다.

공 초점 빛 시트 현미경 전체 마우스 두뇌의 마이크론 규모의 해상도 광학 단층 촬영

대규모 2D 전자 현미경(EM) 또는 나노토미는 나노 단위 해상도 EM의 조직 전체 응용 분야입니다. 여기에서는 제브라피시 유충의 뇌의 건강과 비침습적 뇌 손상을 조사하기 위해 적용되는 보편적인 나노절개술 방법을 설명합니다.

건강 및 부상 Zebrafish의 두뇌의 대규모 스캐닝 투과 전자 현미경 (Nanotomy)

여기서 우리는 생체 내 최대 애벌레와 청소년 단계에서 제브라피시 배아 뇌를 이미지화하는 방법을 제시합니다. 전기 생리학적 접근법에서 채택된 이 미세침습 절차는 성숙한 뉴런의 세포 및 세포 세포 이하 세부 사항에 대한 액세스를 제공하며 뇌 기능 및 약물 개입을 특성화하기 위한 광유전학 및 신경 약리학과 결합될 수 있습니다.

두개골과 피부 제거에 의해 깨어 얼룩말 물고기 애벌레와 청소년에서 완전히 활성 뇌 조직의 생체 내 이미징

이 연구는 이광자 현미경을 사용하여 뉴런 발현 EGFP의 후속 생체 내 이미징을 위해 마우스에 반복적인 외상성 뇌 손상을 전달하고 두개골 창을 동시에 이식하는 방법을 보여줍니다.

Intravital Imaging of Fluorescent Protein Expression in Mice with a Closed-Skull Traumatic Brain Injury and Cranial Window Using a Two-Photon Microscope(2광자 현미경을 사용한 폐쇄 두개골 외상성 뇌 손상 및 두개골 창이 있는 마우스의 형광 단백질 발현의 생체 내 이미징)

여기에 제시된 것은 3차원 형광 현미경을 사용한 유충 제브라피쉬의 생체 내 전뇌 이미징을 위한 프로토콜입니다. 실험 절차에는 샘플 준비, 이미지 획득 및 시각화가 포함됩니다.

생체 내 3차원 형광 현미경을 사용한 제브라피쉬 유충의 전뇌 이미징

이 프로토콜은 형광 스티렌 미세구를 이용한 생 체 내 2광자 현미경 영상에 최적화된 만성 두개골 창문 및 미세혈관 색전증 마우스 모델에 대한 단계별 접근법을 상세히 설명하고 있습니다.

형광 폴리스티렌 미세구를 이용한 생체 내 2광자 현미경용 미세혈관 색전증 마우스 모델

배우세요 생체 내 뇌 조직의 고해상도 심층 영상화를 위한 삼광자 현미경법을 Danio rerio와 생쥐 모델에서. 이 기술은 알츠하이머병 및 자폐증과 같은 신경 질환의 메커니즘 연구에 활용됩니다.

Deep-Tissue Three-Photon 형광 현미경 검사 in Intact Mouse and Zebrafish Brain

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