공장 Polysom​​e 프로파일 링을위한 쉬운 방법

안녕하세요, 저는 마르세유의 LGBP에서 근무하는 Cecile입니다. 이 비디오에서 설명할 프로토콜은 활발하게 번역되는 mRNA를 식별하고 번역 조절을 연구하기 위해 다양한 식물 조직에서 폴리솜과 모노솜을 분리하는 간단한 방법입니다.

예를 들어, 6일 된 Arabidopsis thaliana 유묘에서 폴리솜(polysome)을 분리하고, 이어서 RNA를 분리하여 그 결과를 분석하는 과정을 보여드리겠습니다. 종자를 플레이트에 파종하고 4°C에서 2일 동안 둡니다. 그 후 식물을 6일 동안 성장시킵니다.

유묘를 수확하여 액체 질소에서 분쇄합니다. 식물 분말 300 mg을 정량하여 폴리좀 버퍼 2.4 mL를 첨가합니다. 원심분리를 통해 식물 파편을 제거하고, 상층액을 수크로스 밀도 구배 상단에 로딩합니다.

초원심분리기로 밀도 구배를 형성한 후, OD 값을 지속적으로 측정하면서 하단부터 상단까지 분획을 수집합니다. 폴리솜(polysome), 모노솜(monosome) 및 상층액 분획으로 나누어 분리하고 RNA를 하룻밤 동안 침전시킵니다. 초원심분리 후 펠릿을 재현탁하고 RNA를 추출하여 후속 분석을 수행합니다. 폴리솜 프로파일링을 수행하기 며칠 전에 숙로스 밀도 구배를 준비하십시오.

50%, 35%, 20% sucrose 용액을 준비하여 4°C에 보관하십시오. 50% sucrose 층을 붓습니다. -40°C 냉동고에서 이를 냉동시키십시오.

6시간 후에 35% 층을 추가하고 -40°C 냉동고에서 하룻밤 동안 동결합니다. 첫 번째 20% 층을 붓고 동결합니다. 실험 당일에 필요한 수의 그래디언트를 냉동고에서 꺼냅니다.

마지막 20%sucrose 층을 추가하고 저온실에서 농도 구배가 해동되도록 둡니다. 새로 수집한 식물 샘플을 준비합니다. 여기서는 6일 된 Arabidopsis thaliana 유묘를 사용합니다.

액체 질소로 급속 냉동시킨 식물을 수확하여 완전히 분쇄합니다. 식물 분말 300 mg을 칭량합니다. 신선한 폴리좀 완충액 2.4 mL를 빠르게 첨가하고 균질화합니다.

용액을 두 개의 1.5 milliliter 튜브에 피펫으로 옮깁니다. 세포질 추출물을 원심분리합니다. 상층액을 피펫으로 취합니다.

식물 파편이 섞이지 않도록 주의하십시오. 이는 다음 단계의 프로파일을 망칠 수 있습니다. 농도 기울기를 깨뜨리지 않도록 상층액을 sucrose gradient에 로딩하십시오.

SW 41 로터 버킷에 기울기(gradient)를 넣습니다. 원심분리합니다. 폴리솜 프로필을 시각화하고 분획을 수집하기 위해, 기울기에 담그는 모세관으로 구성된 간단한 시스템을 사용합니다. 이는 UV 큐벳과 연결되어 있습니다.

이는 연동 펌프에 자체 연결되어 있습니다. UV 분광광도계는 큐벳을 통해 기울기가 진행됨에 따라 OD를 지속적으로 기록합니다. 분획 수집기를 통해 2 mL 분획을 수집할 수 있습니다.

큐벳을 세척하고 분광광도계에 넣습니다. 기울기 원심분리 층이 흐트러지지 않게 주의하며 버킷에서 꺼냅니다. 엽록소는 기울기 층의 상단에 농축되어 있어야 합니다.

모세관을 기울기 층의 바닥까지 넣습니다. 연동 펌프를 작동시킵니다. 기울기 층을 바닥에서 위쪽 방향으로 수집하며 OD를 지속적으로 측정합니다.

2 mL 분획을 수집합니다. 다음은 전형적인 프로파일의 형태입니다. RNA 침전은 guanidinium hydrochloride와 isopropanol을 사용하여 수행합니다.

먼저, 50 mL 튜브에 1부피의 guanidinium hydrochloride를 붓고 분획물을 추가합니다. 그런 다음 1.5부피의 isopropanol과 50 µg의 courier를 추가합니다. RNA를 -20 °C에서 하룻밤 동안 침전시킵니다.

분획물을 40 milliliter 초원심분리 튜브에 옮기고 isopropanol로 튜브의 무게 균형을 맞춥니다. 원심분리를 수행합니다. 상층액을 제거하고 펠렛을 공기 중에서 건조시킵니다. 펠렛을 200 microliters의 따뜻한 TE buffer에 다시 현탁합니다.

전형적인 페놀 클로로포름 추출법을 수행하여 RNA를 추가로 추출합니다. Arabidopsis 6일 차 묘목에서 추출한 폴리솜의 대표적인 프로필이 여기에 제시되어 있습니다. 주요 피크는 단일 리보솜과 결합된 mRNA인 모노솜에 해당합니다.

프로파일의 첫 번째 부분은 폴리솜 분획, 즉 많은 리보솜과 결합된 mRNA에 해당합니다. 각 피크는 새로운 리보솜이 mRNA에 결합하는 것과 일치합니다. 프로파일의 마지막 부분은 소위 상층액 분획에 해당하며, 여기에는 유리 리보솜 하위 단위와 RNA가 포함되어 있습니다.

다량의 60S 소단위체가 모노솜 피크 옆에 숄더(shoulder)를 형성합니다. 이들의 무결성을 평가하기 위해, 분획에서 추출한 RNA를 추가 실험에 사용하기 전 전통적인 아가로스 겔에서 전기영동할 수 있습니다. 본 프로토콜을 사용하여 Arabidopsis thaliana 유묘뿐만 아니라 어린 및 오래된 로제트, 그리고 Nicotiana benthamiana, 토마토 및 벼 잎에서 폴리솜을 분리하였으므로, 광범위한 식물 및 조직에 적용 가능할 것입니다.

정제된 RNA는 마이크로어레이 분석뿐만 아니라 폴리솜 분획과 관련된 소형 RNA의 동정에도 적합합니다.