공장 Polysom​​e 프로파일 링을위한 쉬운 방법

안녕하세요, 저는 세실입니다. 저는 마르세유의 LGBP에서 일합니다. 이 비디오에서 설명할 프로토콜은 활발하게 번역되는 mRNA를 식별하고 번역 조절을 연구하기 위해 다양한 식물 조직에서 폴리솜과 모노솜을 분리하는 간단한 방법입니다.

예를 들어, 6일 된 애기장대(Arabidopsis thaliana) 묘목에서 폴리솜(polysome)을 분리하고 RNA를 분리하고 결과를 분석하는 방법을 보여드리겠습니다. 접시에 씨앗을 뿌리고 4도에서 이틀 동안 그대로 두십시오. 그런 다음 6일 동안 식물을 재배합니다.

묘목을 수확하고 액체 질소로 갈아줍니다. 식물 가루 300mg의 무게를 측정하고 폴리솜 완충액 2.4ml를 추가합니다. 식물 조각을 수집하고 자당 구배의 상단에 상층액을 로드하는 원심분리기.

Ultra-centrifuge gradient는 OD를 지속적으로 판독하여 아래에서 위로 수집합니다. 분획을 폴리솜(polysome), 단일솜(monosome) 및 상층액 분획(supertatang segment)으로 끌어당겨 하룻밤 사이에 RNA를 침전시킵니다. 초원심분리기, 펠릿을 재현탁시키고 후속 분석을 위해 RNA를 추출합니다. 폴리솜 프로파일링을 수행하기 며칠 전에 슈크로스 그래디언트를 준비합니다.

50, 35 및 20 % 자당 용액을 준비하고 4 도로 유지하십시오. 50% 자당 층을 붓습니다. 영하 40도의 냉동고에 얼린다.

6 시간 후 35 % 층을 추가하고 영하 40 냉동고에서 밤새 얼립니다. 처음 20% 레이어를 붓고 얼립니다. 실험 당일에는 냉동실에서 필요한 수의 그래디언트를 제거합니다.

마지막 20%자당 층을 추가하고 추운 방에서 그라디언트를 해동시킵니다. 우리가 갓 채취 한 식물을 샘플로 준비합니다. 여기에서는 6일 된 애기장대 탈리아나(Arabidopsis thaliana) 묘목을 사용하고 있습니다.

액체 질소 냉동 식물을 수확하고 철저히 분쇄하십시오. 무게 식물 가루 300mg. 2.4 ml의 새로운 폴리솜 완충액을 빠르게 첨가하고 균질화합니다.

용액을 두 개의 1.5 밀리리터 튜브에 피펫으로 넣습니다. 세포질 추출물을 원심 분리하십시오. 상층액을 피펫팅합니다.

식물 파편을 피하도록주의하십시오. 그들은 다음 단계에서 프로필을 망칠 것입니다. 그래디언트를 방해하지 않고 sucrose gradient에 상등액을 로드합니다.

그래디언트를 SW 41 로터 버킷에 넣습니다. 원심 분리기. 폴리솜 프로파일을 시각화하고 분획을 수집하기 위해 우리는 구배로 뛰어드는 모세관 튜브로 만들어진 간단한 시스템을 사용합니다. UV 큐벳에 연결됩니다.

연동 펌프에 자체 연결됩니다. UV 분광 광도계는 큐벳을 통해 구배가 진행됨에 따라 OD를 지속적으로 등록합니다. 분획 분취기는 2mL 분획을 분취할 수 있습니다.

큐벳을 청소하고 분광 광도계에 놓습니다. 버킷을 방해하지 않고 버킷에서 그라디언트를 제거합니다. 엽록소는 구배의 맨 위에 집중되어야 합니다.

모세관 튜브를 기울기의 맨 아래로 떨어뜨립니다. 연동 펌프를 시작합니다. 그래디언트는 아래에서 위로 수집되고 OD는 지속적으로 판독됩니다.

2 밀리리터 분획이 수집됩니다. 다음은 고전적인 프로필의 모양입니다. RNA 침전은 구아니디늄 염산염과 이소프로판올을 사용하여 수행됩니다.

먼저 50ml 튜브에 1부피의 구아니디늄 염산염을 붓고 분획을 추가합니다. 그런 다음 1.5 부피의 이소프로판올과 50 마이크로 그램의 동일한 택배를 추가합니다. 하룻밤 사이에 RNA를 영하 20도에서 침전시킵니다.

분획을 40ml 초원심분리기 튜브로 옮기고 튜브를 이소프로판올로 균형을 맞춥니다. 원심 분리기. 상등액을 제거하고 펠릿을 자연 건조시킵니다. 펠릿을 200마이크로리터의 따뜻한 TE 완충액에 재현탁합니다.

또한 고전적인 페놀 클로로포름 추출을 수행하여 RNA를 추출합니다. 애기장대(Arabidopsis) 6일 된 묘목에서 추출한 폴리솜의 대표적인 프로필이 여기에 나와 있습니다. main peak는 단일 리보솜과 연관된 mRNA인 monosome에 해당합니다.

프로파일의 첫 번째 부분은 다염색체 분획, 즉 많은 리보솜과 관련된 mRNA에 해당합니다. 각 피크는 mRNA에 대한 새로운 리보솜의 연관성과 일치합니다. 프로파일의 마지막 부분은 자유 리보솜 소단위체와 RNA를 포함하는 소위 상등액 분획에 해당합니다.

많은 양의 60S 소단위체가 모노솜 피크 옆에 어깨를 형성합니다. 무결성을 평가하기 위해 분획에서 추출한 RNA를 추가 실험에 사용하기 전에 고전적인 Aragose gel에서 실행할 수 있습니다. 우리는 이 프로토콜을 사용하여 Arabidopsis thaliana 묘목뿐만 아니라 젊고 오래된 장미뿐만 아니라 Nicotiana benthamiana, 토마토 및 쌀잎에서도 폴리솜을 분리하여 다양한 식물 및 조직에서 작동해야 합니다.

정제된 RNA는 마이크로 어레이 분석뿐만 아니라 다염색체 분획과 관련된 작은 RNA의 식별에도 적합합니다.