척색에서 배아 미세 주입 및 Electroporation에 Ciona intestinalis의

Ciona 배아에서 일시적 형질주입 기술의 전반적인 목표는 유충과 같은 올챙이를 형성하는 데 필요한 유전자 조절 및 기능을 연구하고, 불변 세포 계통과 소형 무척추 동물 게놈을 활용하여 맥락막 무척추 동물의 기원에 대한 통찰력을 얻는 것입니다. 이 방법은 줄기세포 연구 및 약물 발견과 관련된 척삭 발달 프로그램의 보존 메커니즘과 같은 분자 유전학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 배아 전기천공법을 통해 하루에 수백 또는 수천 개의 동기화된 배아를 처리할 수 있다는 것입니다.

일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 취약한 배아의 결핵 형성 때문에 어려움을 겪을 것이고 효율적인 마이크로 주입 기술을 개발하는 것이 까다롭기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 섭씨 18도의 냉각된 배아실에서 Ciona 성체를 해부하는 것으로 시작합니다. 작은 가위를 사용하여 사이펀의 반대쪽 끝과 짧은 사이펀 쪽을 절개하여 그 아래에 난관과 정관을 연결합니다.

절개 부위를 늘려 난관이 드러나도록 합니다. 그런 다음 가위 끝을 사용하여 난관을 정확하게 절개합니다. 닫힌 가위로 난관을 부드럽게 누르고 난자를 벗겨냅니다.

계란이 HEPES가 함유 된 인공 해수가 들어있는 6 개의 우물 플레이트에 직접 떨어뜨리도록합니다. ASWH로 미리 헹군 파스퇴르 피펫을 사용하여 남은 난자를 수집하고 옮깁니다. 정자를 채취하려면 가위로 정관을 자른 다음 별도의 파스퇴르 피펫을 사용하여 농축된 정자를 수집하고 1.5ml 튜브로 옮깁니다.

1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에 ASWH 1ml와 Tris 50마이크로리터를 결합하여 정자를 활성화합니다. 그런 다음 농축된 정자 20마이크로리터를 넣고 뚜껑을 닫은 다음 튜브를 뒤집거나 파스퇴르 피펫을 사용하여 부드럽게 섞습니다. 다음으로, 100-200 마이크로 리터의 활성화 정자 용액을 난자의 각 웰에 첨가하고 난자가 배지에 떠 있도록 위아래로 피펫팅하여 잘 혼합합니다.

접합자를 모아 유리관에 분배하여 탈옥을 시작합니다. 수동 원심분리기를 사용하여 약 20초 동안 G를 1200회 회전시킨 다음 원심분리기를 천천히 멈춥니다. 파스퇴르 피펫으로 펠릿에서 ASWH를 제거합니다.

각 튜브의 펠릿에 4ml의 활성 탈이온 용액을 추가합니다. 작은 고무 배를 얹은 수돗물 처리 파스퇴르 피펫을 사용하여 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 접합자를 매달아 놓습니다. 용액은 1-3분 후에 노랗게 변해야 합니다.

dechorionation 동안, 파스퇴르 피펫을 사용하여 dechorionating 현탁액의 작은 부분 표본을 제거합니다. 슬라이드에 한 방울을 떨어뜨리고 해부 현미경으로 관찰합니다. zygote 서스펜션을 위아래로 피펫팅하고 20-30초마다 슬라이드를 확인합니다.

먼저 난포 세포가 분리되고, 그 다음에는 융모막이 노랗고 불투명하게 변하고, 마지막으로 접합자에서 분리됩니다. 분홍색 dechorionated zygotes는 유리관 바닥으로 가라앉습니다. 접합자의 50% 이상이 제거되면 튜브를 ASWH로 채웁니다.

약 10-15초 동안 매우 부드럽게 원심분리하여 탈이온화된 접합자를 침전시키기에 충분합니다. 원심분리기를 천천히 멈춥니다. 부유 물질을 포함하여 유리관에서 거의 모든 액체를 제거하고 ASWH로 교체합니다.

천천히 위아래로 피펫팅하여 세척한 다음 이전과 같이 부드럽게 원심분리합니다. 융모막 찌꺼기가 남지 않을 때까지 다시 씻으십시오. 중력은 실리콘화 된 1.5 밀리리터 튜브에서 탈환 접합자로 세척을 침전시킵니다.

침전 후 ASWH를 튜브의 100 마이크로 리터 표시까지 제거합니다. 이제 파스퇴르 피펫을 사용하여 이전에 준비된 만니톨 용액에 담긴 DNA 250마이크로리터를 접합체 튜브 하나에 추가합니다. 부드럽게 혼합하고 즉시 혼합물을 4mm 전기천공법 큐벳에 옮깁니다.

큐벳을 electroporation holder에 넣고 16볼트에서 50밀리초의 단일 펄스를 제공합니다. 그런 다음 동일한 파스퇴르 피펫을 사용하여 큐벳에서 접합자를 제거하고 신선하고 여과된 ASWH가 포함된 배양 접시로 배출합니다. 접합자를 펴기 위해 접시를 저어줍니다.

ASWH 비커에 피펫을 헹구고 다음 샘플로 이동합니다. 모든 접합자를 elecroporating 한 후 섭씨 15-20도에서 접합자를 배양합니다. 마이크로 매니퓰레이터를 섭씨 18도의 냉방실에 설치하십시오.

플라스틱 튜브와 바늘 홀더를 미네랄 오일로 채워진 10ml 유리 주사기에 연결합니다. 튜브와 바늘 홀더에 오일을 다시 채우고 기포를 배출합니다. 바늘 홀더에 녹색 바이탈 염료가 든 0.5마이크로리터의 주사 용액이 들어 있는 주사 바늘을 삽입합니다.

그리고 홀더를 마이크로 매니퓰레이터에 놓습니다. 바늘 홀더가 표면에 대해 45도 각도로 직선을 따라 움직이도록 조정합니다. 움푹 들어간 곳을 따라 작은 아가로스 코팅된 배양 접시에 탈이온화된 난자를 배치하여 해부 현미경으로 난자를 하나씩 주입할 수 있습니다.

필요한 경우 아가로스에 놓인 유리 커버 슬립 조각에 바늘을 부드럽게 밀어 바늘 끝을 부러뜨립니다. 바늘 끝이 열려 있는지 확인하기 위해 약간의 압력을 가합니다. 수정되지 않은 난자를 하나씩 주입하고, 먼저 바늘을 난자에 넣고 약간 흡인하여 난막을 파괴합니다.

그런 다음 녹색 주사 용액을 난자 중간에 세포 직경의 최대 1/3까지 주입합니다. 난자를 모두 주입한 후 바늘을 제거하고 주입된 수정되지 않은 난자를 신선한 배양 접시에 옮기고 수정될 때까지 섭씨 15도에서 18도에서 배양합니다. 마이크로 주입은 Ciona intestinalis myelin transcription factor 또는 Ciona 배아의 gastrula 단계에서 MyT의 조절을 연구하는 데 사용되었습니다.

인사이트 교잡화(insitu hybridization)에 의해 모니터링되는 내인성 발현은 야생형의 6열 신경판 전구체에서 관찰됩니다. 전사 인자(transcription factor)인 포크헤드 박스 A(Forkhead box A)와 같은 초기 배아 인자(embryonic factor)를 없애기 위한 모르폴리노(morpholinos)의 마이크로 주입은 전반적인 MyT 발현을 제거합니다. 반대로, MyT 발현은 결절의 하향 조절 시 외측적으로 활성화되며, 이는 결절이 일반적으로 이러한 측면 신경삭 전구체에서 MyT 발현을 억제한다는 것을 시사합니다.

전사 인자 GATAa는 Venus 태그로 태그되고 pfog driver를 사용하여 외배엽 할구로 전기 천공되었습니다. 여기에서 볼 수 있듯이 GATAa는 전사 인자에 대해 예상되는 대로 대부분 핵에 국한되어 있습니다. 반면 금성 표현은 어디에나 있습니다.

이 동영상을 시청한 후에는 동기화된 Ciona 접합자에 전기천공법을 통해 일시적인 transfection을 수행하는 방법, 취약한 dechorionated 배아를 처리하는 방법 및 올바른 미세 주입 각도를 찾는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 개발 후 이러한 기술은 기능 유전체학을 향한 길을 열었습니다. 유전자 기능, 유전자 조절 네트워크를 탐색하고 인간의 조직 형성에 중요한 발달 모듈을 보존합니다.