활용 칙 신경 튜브에서 뉴런의 유전 정의된 그룹 Axonal 경로를 벗기기 비켜에서 Electroporation

안녕하세요, 저는 예루살렘 히브리 대학의 의학 신경생물학과 Dr.Review Klar 실험실에서 근무하는 Ham입니다. 안녕하세요, 저는 소피 에스만(Sophie Esman)이고 라스(Lars) 연구실에서 왔습니다. 오늘은 Innovo, electroporation 및 척수 오픈 북 준비 절차를 보여 드리겠습니다.

우리는 실험실에서 이 절차를 사용하여 배아 척수에서 유전적으로 정의된 신경 세포 집단의 축삭 궤적을 연구합니다. 시작하겠습니다. 이 절차를 시작하려면 수정한 흰다리뿔 닭 알을 실온에서 가습 인큐베이터로 옮기고, 가급적이면 섭씨 37-38도의 흔들 트레이를 사용합니다.

실행 가능하고 동기화된 배아를 얻기 위해 인큐베이터의 온도와 습도를 모니터링하는 것이 중요합니다. 병아리 배아는 햄버거와 해밀턴 또는 HH 단계 18에서 20에 도달했을 때 전기천공되며, 이는 인핸서 의존성 특이적 발현을 위한 최적의 단계입니다. 이 단계에서 머리는 몸통과 직각으로 놓여 있습니다.

또한 HH 18기에서 20기에는 전방, 후방 우측 및 좌측 바이탈 라인 혈관과 같은 광범위한 추가 배아 혈관도 볼 수 있어야 합니다. 병아리 배아는 부화 66 시간 후 19-20 단계에 도달하며, 그 때 인큐베이터에서 알을 제거합니다 알을 제거한 후 수평으로 놓고 5-10 분 동안 기다립니다. 배아는 이제 난자의 위쪽 극에 위치합니다.

전기 주입 전에 배아는 페니실린 1밀리리터당 100단위와 스트렙토마이신 밀리리터당 0.1밀리그램으로 행크 용액을 준비합니다. 마이크로리터당 2-5마이크로그램의 속도로 원하는 DNA 혼합물을 준비하고 주입된 DNA를 쉽게 시각화할 수 있도록 빠른 녹색 염료 몇 알을 추가합니다. 구강 피펫, 멸균 주사기 바늘, 작은 가위 및 테이프도 준비하십시오.

피펫 풀러로 0.5mm 직경의 유리 모세관을 당겨 마이크로 모세관을 준비합니다. 텅스텐 전극을 마이크로 매니퓰레이터에 놓고 전극을 펄스 발생기에 연결합니다. 펄스 발생기의 전압을 마이너스 30볼트로, 각 펄스의 길이를 50밀리초로, 펄스 수를 3으로 설정합니다.

배아를 노출시키고 다루기 전에 전기천공을 진행하십시오. 난자의 좁은 기둥에 주사기를 삽입하고 각 난자에서 5-6ml의 알부민을 제거합니다. 알부민이 쏟아지는 것을 방지하기 위해 알부민을 제거합니다.

다음 단계에서 자를 때는 작은 가위를 사용하여 자릅니다. 병아리 배아를 드러낸 후 난자의 윗면에 있는 타원형 창을 열고 0.5-1ml의 행크와 페니실린 스트렙토마이신 용액으로 적십니다. 다음으로, 입 퍼펫을 사용하여 유리 마이크로 모세관을 로드합니다.

DNA 염료 혼합물을 사용하면 올바른 직경의 미세 모세관에 DNA가 쉽게 로드되어야 합니다. 양안 위치 아래에서 DNA를 신경관에 주입하기 위한 배아. 꼬리가 몸 쪽으로 향하도록 배아를 놓습니다.

이 발달 단계에서는 척수가 명확하게 보이기 때문에 대조적인 기술이 필요하지 않습니다. 척수는 머리와 꼬리 끝이 모두 밀봉되어 있습니다. 그러나 미세 모세관이 신경관에 더 많은 구멍을 뚫고 얕은 각도로 관통하기 때문에 충분히 얇고 올바른 직경의 미세 모세관이 튜브를 손상시키지 않고 관통해야 합니다.

입 퍼펫을 사용하여 DNA를 주입합니다. 올바른 직경의 미세 모세관은 규칙적인 호기로 DNA를 방출해야 합니다. 녹색 염료는 꼬리 끝에서 발달 중인 뇌의 소포까지 퍼져야 합니다.

신경관이 DNA로 채워질 때까지 주입 주입된 DNA가 먼저 세포에 들어가기 위해서는 전기천공이 필요합니다. 전극을 신경관과 평행하게 놓고 튜브 자체를 건드리지 않고 가능한 한 신경관에 가깝게 놓습니다. 펄스 동안 전기 전도성을 허용하기 위해 전극이 액체로 덮여 있는지 확인하십시오.

일반적으로 배아를 노출시킨 직후에 첨가하는 행크 용액으로 충분합니다. 그러나 전극이 전기 작동을 위해 액체 펄스에 배치되고 잠긴 펄스 직전에 Hank의 용액이 한 방울도 떨어지지 않으면 전극을 조심스럽게 제거하고 창과 달걀을 테이프로 밀봉하십시오. 다음 잠복기 동안 배아가 건조되지 않도록 난자를 완전히 밀봉하는 것이 중요합니다.

난자를 다시 인큐베이터에 넣고 병아리 배아가 발달 배아에 도달할 때까지 부화합니다. 6일차 또는 6일차, 전기천공된 배아가 발달 배아에 도달했을 때 이미징 시간. 6일차, 전기천공법 3일 후 E 6일, 난자에서 난자를 제거하고 가는 가위를 사용하여 PBS가 들어 있는 실리콘으로 코팅된 페트리 접시에 넣습니다.

멤브레인을 잘라내고 실리콘에 밀어 넣은 핀을 사용하여 배아를 복부 쪽에서 늘려 제자리에 고정합니다. 날카로운 텅스텐 마이크로 모세관을 사용합니다. 뒷뇌에서 꼬리까지 지붕 플레이트를 따라 세로로 절개합니다.

척수 양쪽에 두 개의 추가 세로 절개를 만들어 척수에서 등쪽 뿌리 신경절 또는 DRG를 분리합니다. 꼬리에서 시작하여 뒷뇌까지 조직에서 바닥판을 분리하고 척수는 그대로 둡니다. 마지막으로, 가는 가위를 사용하여 뒷뇌의 횡단면에서 척수를 자르고 척수를 몸에서 분리합니다.

이제 척수가 분리되었으므로, 핀을 사용하여 뒷뇌에서 꼬리까지 고정하는 PBS가 들어 있는 새로운 실리콘 코팅된 페트리 접시에 척수를 펴서 플랫 마운트 준비물을 만듭니다. 면역조직화학 절차, 척수를 개방하기 위한 상세하고 수반되는 서면 프로토콜에 따라 실온 면역 염색에서 PBS의 4%파라알데히드에 척수를 1시간 동안 고정합니다. 이미징을 위한 책 준비.

슬라이드에 그리스나 실리콘을 직사각형 모양으로 펴고 직사각형 안에 PBS를 떨어뜨립니다. 핀셋을 사용하여 척수를 배치하고 직사각형의 중앙을 늘린 다음 그 주위의 액체를 끌어냅니다. 반려동물 한 마리당 파스타를 사용하여 척수에 장착 매체 1-2방울을 떨어뜨리고 커버 슬립으로 덮습니다.

커버 슬립에 압력을 가합니다. 기포를 피하기 위해. 슬라이드를 섭씨 4도의 어두운 곳에 보관하십시오.

컨포칼 현미경을 사용하여 척수를 검사합니다. 다음은 CMV의 유비쿼터스 인핸서 요소를 사용하는 모든 뉴런에서 RFP가 발현되는 대조 실험에서 병아리 척추 뉴런의 축삭 거부 반응의 몇 가지 대표적인 결과이며, 대부분의 뉴런과 축삭돌기가 라벨링되어 있습니다. 뉴런 하위 집단의 축삭 궤적을 해독하는 것은 불가능합니다.

그러나 특정 enhance elements를 적용할 때 이 예에서 특정 하위 집단 DI 두 뉴런의 정의된 축삭 경로가 드러납니다. 그래서 우리는 E 3에서 특정 신경 강화제로 뺨 신경관을 전기 수술하는 방법과 E 6에서 오픈 북 척수를 준비하는 방법을 보여드렸습니다. 이 절차를 수행할 때 신중하고 인내심을 가져야 한다는 것을 기억해야 합니다.

그래서 이게 다야. 지켜봐 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다. 행운을 빌어.