종양 미세 환경의 모방 : 세포 간 통신을 농축 세포 인구를 생성 및 조사를위한 간단한 방법

이 간단한 체외 공동 배양 모델의 전반적인 목표는 생체 내 종양 미세환경의 특성을 모방하고, 개별 세포 집단을 풍부하게 하며, 다양한 세포 간 통신 모드를 조사하는 것입니다. 이 방법은 암 및 방사선 생물학 분야의 주요 질문, 특히 암 관련 섬유아세포의 생성과 치료제에 대한 반응의 기저에 있는 요인에 대한 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 스트레스를 유발하는 형광 태깅 또는 세포 분류 없이 혼합 세포 배양에서 개별 세포 집단을 생성할 수 있다는 것입니다.

먼저 관심 세포 배양액을 PBS 5ml로 두 번 세척합니다. 두 번째 세척 후 실온에서 2분 동안 1ml의 실온 트립신-EDTA로 세포를 분리합니다. 그런 다음 9ml의 완전 성장 배지로 반응을 끄고 플라스크 표면에 배지를 부드럽게 10회 피펫팅하여 세포를 해리합니다.

계수 후, 신선한 배지에서 10 밀리리터 농도의 5 번째 세포로 세포를 2.5 배 10으로 희석하고 세포를 멸균 15 밀리리터 원심 분리기 튜브로 옮깁니다. 원심분리에 의하여 세포를 회전시키고 중간 농도의 70 마이크로리터 당 다섯번째 세포에 2.5 시간 10에 50%fetal bogine 혈청으로 보충된 신선한 성장 매체에 있는 펠릿을 resuspend. 다음으로, 적절한 실험용 기공 크기의 삽입물을 포장에서 다중 웰 접시의 개별 웰로 옮기고 접시를 덮습니다.

그런 다음 양손으로 접시를 잡고 인서트 바닥이 위쪽을 향할 때까지 접시를 부드럽게 뒤집습니다. 접시 바닥을 제거합니다. 한 손에 멸균 집게를 사용하여 한 삽입물을 제자리에 잡고 다른 손을 사용하여 70마이크로리터의 세포를 마이크로피펫 팁으로 천천히 흡인합니다.

그런 다음 현재 삽입물의 윗면이 있는 표면을 가로질러 세포를 천천히 분배합니다. 각 삽입물을 파종한 후 접시 바닥을 조심스럽게 교체하고 거꾸로 된 접시를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%의 습도에서 30-45분 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 층류 생물 안전 캐비닛에서 인서트의 바닥이 이제 아래를 향하도록 접시를 조심스럽게 뒤집습니다.

그런 다음 각 인서트의 바닥을 예열된 완전 배지 2ml에 천천히 조심스럽게 담그고 접시를 가습 인큐베이터에 다시 넣습니다. 48시간 후 각 웰 바닥에 있는 배지를 2ml의 신선한 성장 배지로 교체합니다. 모든 배지가 새로 고쳐지면 두 번째 관심 집단의 다섯 번째 세포에 2.5 배 10을 1 밀리리터의 신선한 배지에 삽입물 상단에 파종하고 접시를 인큐베이터로 되돌립니다.

24시간, 48시간 및 96시간 후에 각 인서트 상단의 매체를 1ml의 새 완전 배지로 교체합니다. 그리고 각 웰의 바닥에 있는 매체는 2밀리리터의 신선한 완전한 배지가 있습니다. 120시간의 공동 배양 후, PBS 1밀리리터를 함유한 개별 35mm 세포 배양 접시에 한 번에 하나의 삽입물을 옮깁니다.

그리고 인서트의 바닥과 윗면을 1ml의 PBS로 세척하십시오. 삽입물 바닥에서 자란 세포를 수집하려면 삽입물 바닥면을 아래로 향하게 하여 실온 트립신-EDTA 200마이크로리터에 넣습니다. 실온에서 2분 후 800마이크로리터의 완전 성장 배지로 반응을 중지합니다.

그런 다음 삽입물을 약간의 각도로 잡고 세포 표면에 상등액을 부드럽게 피펫으로 10 번 넣어 접시에 세포를 모으십시오. 모든 삽입물이 제거되면 성장 배지 밀리리터당 5번째 세포까지 10의 2배 농도로 세포를 재현탁합니다. 그리고 250마이크로리터의 세포를 멸균된 개별 유리 커버슬립에 추가합니다.

커버슬립을 가습 인큐베이터에 1시간 동안 넣습니다. 배양이 끝나면 층류 생물 안전 캐비닛에서 2ml의 완전 성장 배지를 접시에 조심스럽게 추가하고 섭씨 37도, 이산화탄소 5%%, 습도에서 48시간 동안 배양합니다. 그런 다음 PBS로 세포를 세 번 씻습니다.

세 번째 세척 후 PBS의 4% 포름알데히드에 있는 세포를 실온에서 10분 동안 고정한 다음 Tris-buffered Saline으로 5회 세척합니다. 마지막 세척 후 0.25% Triton X-100에 0.1 사포닌을 보충한 실온에서 5분간 세포를 투과시킨 후 실온에서 1시간 동안 차단 용액에서 배양합니다. 다음으로, 하룻밤 동안 섭씨 4도의 차단 용액에 관심 있는 1차 항체로 샘플을 라벨링합니다.

다음날 아침, 세척액으로 3분 세척하여 결합되지 않은 항체를 제거한 다음 차단 용액에서 적절한 2차 항체를 1시간 실온에서 배양합니다. 배양이 끝나면 방금 설명한 대로 결합되지 않은 2차 항체를 세척하고 DAPI를 함유한 페이드 방지 장착 매체를 사용하여 개별 슬라이드에 커버슬립을 장착합니다. 커버슬립 가장자리를 투명한 매니큐어로 밀봉합니다.

그런 다음 형광 여기를 위한 외부 광원이 장착된 도립 현미경에서 63배 오일 배율로 세포를 이미지화합니다. 이 시스템을 사용하면 세포 배양 삽입물의 다공성 멤브레인 양쪽에서 최소 120시간 동안 두 개의 서로 다른 세포 집단을 성장시킬 수 있으며, 0.4 또는 1미크론 공극이 있는 삽입물을 사용할 때 멤브레인 양쪽의 세포 집단에서 99% 이상의 순도를 유지할 수 있습니다. 그러나 3개의 미크론 기공이 있는 삽입물은 GFP 양성 인간 유방암 세포주를 사용하여 이 실험에서 관찰된 바와 같이 세포가 멤브레인을 가로질러 이동할 수 있을 만큼 충분히 큽니다.

또한 0.4 미크론 공극 삽입물은 삽입물의 양쪽에 있는 세포 배양 사이에 기능적 간극 연접의 형성을 제한하여 분비 인자에 대한 통신을 제한합니다. 그러나 1미크론 및 3미크론 공극이 있는 삽입물은 이러한 공동 배양에서 멤브레인을 가로질러 형광 라벨이 전달되는 것으로 표시된 대로 간극 연접을 통해 세포의 기능적 결합을 허용합니다. 중요한 것은, 이 시스템은 인간 유방암 세포와 공동 배양된 섬유아세포에서 카베올린-1의 발현이 감소한 것에서 입증된 바와 같이 유방암 세포와의 공동 배양 후 정상적인 인간 이배체 섬유아세포로부터 암 관련 섬유아세포를 효과적으로 생성하는 데 사용될 수 있다는 것입니다.

이 절차를 시도하는 동안 탐색 중인 질문에 적합한 기공 크기를 가진 인서트를 선택하는 것이 중요합니다. 그리고 매질에서 삽입물의 아래쪽에 있는 첫 번째 세포 집단을 보는 것은 그들의 부착을 용이하게 합니다. 이 절차에 따라 면역 블로팅, 현장 면역형광 또는 대부분의 다른 세포 기반 분석과 같은 다른 방법을 수행하여 단백질 발현 변화, 침입 및 이동의 변화 또는 치료제에 대한 반응의 차이에 대한 추가 질문에 답할 수 있습니다.

개발 후, 이 기술은 암 생물학 및 방사선 생물학 분야의 연구자들이 종양 미세환경의 발달, 진화, 그리고 우리의 경우 방사선을 가진 표적 세포의 전리 방사선의 유해한 영향이 주변의 방관자 세포로 확산되는 데 기여하는 요인을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 혼합 세포 배양을 준비하고, 공동 배양을 유지하고, 추가 분석을 위해 공동 배양에서 고순도 농축 세포 집단을 수확하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 인간 세포 균주 또는 세포주를 다루는 작업은 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 적절한 적절한 개인 보호 장비를 착용하고 적절한 생물 안전 규정을 준수해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.