Name: 의 IgG 및 IgM의자가 항체의 동시 검출을위한 2 색 항원 마이크로 어레이의 생성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: 학습하세요 항원 마이크로어레이를 이용한 IgG 및 IgM 자가항체의 동시 검출 방법을. 소량의 혈청으로 고효율 자가면역 질환 바이오마커 스크리닝이 가능합니다.

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A.C.는 캐나다 심장 및 뇌졸중 재단(Heart and Stroke Foundation of Canada)의 박사 후 연구원과 재생 의학 교육 프로그램(Canadian Institutes of Health Research)의 지원을 받았습니다.F.Y.Y.H.는 재생 의학 교육 프로그램(Training Program in Regenerative Medicine)의 지원을 받았습니다. 이 연구는 Astellas Pharma Canada의 보조금으로 지원되었습니다. 또한 Mark Menenghini 박사(토론토 대학교)의 Axon 마이크로어레이 스캐너를 사용해 주신 데 대해 감사드립니다.

1. 희석 항원 및 생성 항원 마이크로 어레이 <ol><li> 0.2 mg / ml의 최종 농도로 PBS에 희석 항원. 9 핀과 미세 배열 구성과 중복에서 162까지 고유의 항원을 인쇄합니다. 항원 라이브러리로 양성 대조군에서의 IgG 및 IgM의 항원을 포함합니다. 단지 음성 대조군으로 PBS를 포함합니다. </li><li> 384 잘 소스 판에 각 항원의 20 μl를 추가합니다. 프린트 헤드의 설치 미러 그룹의 소스 플레이트에 항원을 추가 (9 핀 인쇄에 사용하는 경우 등, (9)의 그룹이 항원을 준비). </li><li> 배열을 인쇄 할 준비가 될 때까지 -80 ° C에서 박 및 동결와 커버 소스 판. </li><li> 3 × 1 분 동안 탈 이온수와 초음파 처리 조에서이를 배양하여 고체 미세 배열 핀을 청소합니다. 랙에 배치 핀은 건조 후 마이크로 어레이 프린트 헤드의 핀을 배치합니다. 9 핀, 3 × 3 구성을 사용합니다. </li><li> 프린트 헤드 번호 핀을 설정하여 실행 인쇄 프로그램 미세 배열,슬라이드의 수는 각 슬라이드에, 패드의 번호를 인쇄하고, 각 항원에 대한 복제 지점 수 있습니다. 일반적으로 9 핀, 70 슬라이드, 2 패드 / 슬라이드, 각 항원에 대한 2 복제 지점을 사용합니다. 프로그램 미세 배열은 항원의 다른 그룹 사이에 물에 핀을 초음파 처리합니다. </li><li> 해동 소스 플레이트와 100 × g에서 1 분 후 원심 분리 판. 미세 배열의 지정된 자리에 소스 판을 놓습니다. 인쇄 할 항원의 첫 번째 그룹을 덮고 박의 부분을 제거합니다. </li><li> Arrayer에 표면 및 실행 인쇄 프로그램에 인쇄되지 않은 슬라이드를 정렬합니다. 어레이 시스템의 가습기의 빌드 60 % - 습도 RT에서 인쇄 슬라이드 (55)에 Arrayer에에 설정합니다. </li><li> 항원의 각 그룹은 모든 슬라이드 상에 인쇄 된 후, 미세 배열을 일시. 다만 호일로 인쇄 된 표지 항원 (증발을 방지하기 위해) 및 항원의 다음 그룹에 인쇄 될 발견. 인쇄 프로그램을 계속합니다. </li><li> 모든 항원에 인쇄 한 후, 커버 소스 PL-80 ° C에서 박 및 동결의 새로운 조각을 먹었다. 슬라이드 상자와 진공 밀봉에 인쇄 된 슬라이드를 놓습니다. 슬라이드 다음날를 사용하거나 최대 한 달 후에 할 수있다. </li></ol> 2. 희석 혈청과 항원 마이크로 어레이를 프로빙 <ol><li> 배양 챔버를 사용하여 프레임으로 슬라이드를 놓습니다. 각 배열 표면에 차단 버퍼 (2.5 %의 [권 / 권] 태아 혈청 (FCS), PBS에 트윈 20 0.1 % [의 / 권 권])의 700 μl를 추가합니다. </li><li> 젖은 조직의 조각 밀폐 용기에 프레임과 장소를 통해 접착 필름을 배치합니다. 로커에 4 ° C에서 O / N을 품어. </li><li> 혈청 샘플 1을 희석 : (100) 버퍼를 차단에서. 대기음 배열에서 솔루션을 차단 및 각 배열 표면에 희석 한 시료 500 μl를 추가합니다. </li><li> 접착 필름으로 덮고 락으로 4 ° C에서 1 시간 동안 배양한다. </li><li> 버퍼를 차단에서 이차 항체를 희석. 인간 연구의 경우, 0.33 μg의 / ㎖ 및 Cy5에로 Cy3가 표지 된 염소 항 - 인간 IgG 항체가 희석 된 염소 항 - 구호 물자 표지0.25 μg의 / ㎖에 대한 IgM 항체 n은. 마우스 연구를 들면, Cy3에가 ㎖의 0.38 μg의 /에 염소에게 항 - 마우스 IgG 항체를 표지와 Cy5에가 / ㎖ 0.7 μg의에 염소 항 - 마우스 IgM의 항체를 표지 희석. </li><li> 어레이에서 대기음 샘플 및 배열 표면을 세척 완충액 (PBS 중 0.1 % 트윈 20)로 4 회 헹군다. 슬라이드에 버퍼 빠르게 떨어져 가볍게 붓는다. </li><li> 락과 RT에서 각 배열 표면을 씻어 10 분 부화 버퍼를 차단의 700 μl를 추가합니다. 반복 세척 단계를 두 번 더. </li><li> 각 슬라이드 표면에 희석 차 항체의 500 μl를 추가하고 접착 필름 커버. 락과 4 ° C에서 45 분을 품어. </li><li> 대기음 차 항체 슬라이드에서 혼합하고 위의 4 번 헹군다. 워시는 상기 차단 / 희석액 700 ㎕를 3 번​​ 슬라이드. </li><li> PBS에 침지 금속 슬라이드 랙 프레임과 장소에서 슬라이드를 제거합니다. 궤도 흔들림와 실온에서 20 분을 품어. PBS의 새로운 용기에 놓고 다른 20m를 품다진탕한다. </li><li> 탈 이온수 15 초 용기에 넣어 슬라이드 랙. 물이 새 컨테이너에 선반을 놓고 다른 15 초를 품어. </li><li> 건조 슬라이드, RT에서 5 분 220 XG에 원심 분리기와 스핀에서 ELISA 플레이트 어댑터에 장소 슬라이드 랙. </li><li> 스캔 할 준비가 될 때까지 빛을 꽉 상자에 슬라이드를 놓습니다. </li></ol> 3. 스캔 항원 마이크로 어레이 및 데이터 내보내기 <ol><li> 를 Cy3 및 Cy5의 형광 신호를 검출 할 수있는 마이크로 어레이 스캐너를 사용하여 스캔 슬라이드. 스캐너의 광전자 증 배관 (PMT) 레벨을 조정하기 위해, 단지 이차 항체로 프로빙 하였다 슬라이드 사전 스캔. 참고 :이 슬라이드 전체 양 (IgG에와 IgM의)를 포함하여 그것에 인쇄 항원 라이브러리뿐만 아니라 음 (PBS) 컨트롤이 있어야합니다. 프리 스캔 최적 PMT 설정을 찾기 위해 신속하게 사용자를 허용하는 낮은 해상도로 스캔한다. </li><li> PMT를 값을 설정되도록합니다 (Cy3에 채널에서) 인간 IgG 기능과 잡음합니다 (Cy5에 채널)을 IgM의 기능은 비슷한 평균 형광 강도를 뺀 배경 (MFI-B) (일반적으로 40000)가 있습니다. PMT를 레벨은 &quot;하드웨어&quot;버튼을 누름으로써 설정된다. 일단 설정되면, 일정이 PMT 설정을 유지. </li><li> 은 &quot;스캔&quot;버튼을 누름으로써 두 개의 채널에 대한 실험 슬라이드 스캔. 각 스캔 한 후 슬라이드 이미지 (두 채널 모두)를 저장합니다. </li><li> 슬라이드를로드하는 &quot;파일&quot;버튼을 사용하여 마이크로 어레이 소프트웨어로 분석된다. </li><li> &quot;파일&quot;버튼을 이용하여 유전자 배열 목록 (GAL) 파일을로드합니다. 는 GAL 파일 어레이 피처들의 신원을 가진 어레이의 레이아웃을 가진다. </li><li> 배열 기능을 최대한 가깝게 템플릿을 일치하도록 스캔 한 이미지를 통해 배열 템플릿을 놓습니다. </li><li> 은 &quot;정렬&quot;버튼을 눌러 템플릿으로 모든 블록의 기능을 맞 춥니 다. 프로그램은 일반적으로 원형의 기능의 개요를 확인할 수 있지만, 일부 수동 조정이 필요할 수있다. 이러한 조정 기능 모드를 입력 할 수있다. 소프트웨어는 각 항원에 대해 MFI-B를 계산한다. </li><li> 텍스트 파일로 결과를 내보내려면 &quot;파일&quot;버튼을 사용합니다. </li></ol> 마이크로 어레이의 의미 분석 4. 분석 배열 데이터 (SAM) <ol><li> 엑셀로 개별 텍스트 파일을로드하고를 Cy3와 Cy5에 채널 MFI-B가 열을 식별합니다. </li><li> 중복 기능의 평균을 계산합니다. </li><li> 어떤 부정적인 MFI-B의 경우, (10)와 음수 로그베이스 (2)를 계산하여 다음 100 원 MFI-B를 나누고하여 데이터를 변환 대체합니다. </li><li> 이전에 7 설명한 바와 같이 마이크로 어레이 (SAM)의 의미 분석과 로그 변환 된 데이터를 분석 할 수 있습니다. </li><li> 두 그룹 (예를 들어, 건강한 대조군 대 명), 하나의 그룹 라벨 「1」및 그룹을 이용하여 연구를위한 &quot;2&quot; 의있는 항원의 반응성을 식별하기 위해 SAM의 두 클래스 짝이 분석을 사용하여두 군간 ignificantly 다른 (Q 값 &lt;0.05). </li><li> 프리젠 테이션 8 이미지를 만들기 위해 클러스터링 및 열 맵 생성 소프트웨어를 사용합니다. </li></ol>

<ol><li>Naparstek, Y., Plotz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+autoantibodies+in+autoimmune+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The role of autoantibodies in autoimmune disease.</a> Annu Rev Immunol. 11, 79-104 (1993).</li>
<li>Damoiseaux, J., Andrade, L. E., Fritzler, M. J., Shoenfeld, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantibodies+2015%3A+From+diagnostic+biomarkers+toward+prediction%2C+prognosis+and+prevention%5BTitle%5D)+AND+%22Autoimmun+Rev%22%5BJournal%5D)">Autoantibodies 2015: From diagnostic biomarkers toward prediction, prognosis and prevention.</a> Autoimmun Rev. 14, 555-563 (2015).</li>
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</ol>

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여기에 설명 된 프로토콜 항원 마이크로 어레이 기술을 이용하여자가 항체의 정량을 허용한다. 항원 마이크로 어레이는자가 항체 선별에 기존의 ELISA에 비해 여러 가지 장점을 제공한다. 우선, 핵산, 단백질, 펩티드, 및 세포 용 해물을 포함하는 다양한 항원에 따라서 다중화자가 항체 스크리닝을 허용 니트로 셀룰로스 - 코팅 된 슬라이드 상에 배치 될 수있다. 항원 나노 리터 각 슬라이드에 발견되기 때문에, 또, 항원의 마이크로 그램의 어레이를 생성 할 필요가있다. 100 샘플 희석 혈청의 5 μL가 1 배열 표면을 조사하는 데 필요한대로 배열은 매우 작은 환자 샘플을 필요로한다. 마지막으로, 배열은 니트로 셀룰로오스에자가 항체 9 검사에서 기존의 ELISA보다 더 민감한 것으로 나타났다 발견했다. 자가 항체에 대한 항원 스크리닝 마이크로 어레이를 사용하는 것 외에도, 상기 배열은 사용 될 수D는 단일 클론 항체의 특이성을 정의하고, 이전에 설명 된 바와 같이...

자가항체는 많은 질병 상태에 존재하며 종종 직접적인 병원성 활성을 가질 수 있습니다1. 자가항체의 확인은 특정 질병의 진단, 질병 결과의 예후, 특정 치료법의 혜택을 받을 수 있는 환자의 분류에 중요하다2. 자가항체는 일반적으로 ELISA 기술을 사용하여 환자 혈청에서 식별됩니다. 그러나 이 기법으로 여러 항원을 스크리닝하는 것은 힘들고 많은 양의 환자 샘플을 소비합니다. 따라서 더 큰 규모로 자가항체를 프로파일링하기 위해서는 새로운 기술이 필요합니다.
항원 마이크로어레이 기술은 자가항체를 멀티플렉스 방식으로 프로파일링할 수 있는 단백질체 기술입니다3. 이 프로세스의 첫 번째 단계에서는 로봇 마이크로어레이어를 사용하여 항원 라이브러리를 슬라이드 표면에 배열합니다. 슬라이드를 희석된 혈청으로 프로빙한 다음 형광 표지된 2차 항체를 추가합니다. 항체 반응성은 마이크로어레이 스캐너로 슬라이드를 스캔하여 시각화하고 형광 강도로 정량화합니다. 항원 마이크로어레이는 자가항체를 스크리닝하는 데 ELISA 기술에 비해 여러 가지 이점을 제공합니다: 1) 여러 항원에 자가항체를 동시에 프로파일링하기 위해 마이크로리터의 혈청만 필요하고, 2) 나노리터의 항원만 어레이에 발견되기 때문에 항원을 드물게 사용하며, 3) ELISA에 비해 향상된 감도3를 가지고 있으며 4) 아직 동시성을 허용합니다. 하나 이상의 항체 동형을 별도로 검출합니다. 항원 마이크로어레이는 류마티스 관절염, 다발성 경화증 및 전신성 홍반성 루푸스4-6과 같은 자가면역 질환에서 자가항체를 프로파일링하는 데 사용되었습니다. 이 세 가지 질병 모두에서 어레이를 사용하여 대규모로 자가항체를 프로파일링하여 질병 발병에 대한 새로운 통찰력을 얻었습니다. 
여기에서는 니트로셀룰로오스 코팅 슬라이드를 사용하여 항원 마이크로어레이를 생성하는 프로토콜에 대해 설명합니다. 단백질, 펩타이드 및 세포 용해물을 포함한 다양한 항원을 이 기술을 사용하여 슬라이드에 배열할 수 있습니다. 어레이는 antigen library를 보유하는 source plate에 관심 항원을 포함하여 쉽게 사용자 정의할 수 있습니다. 또한 한 쌍의 2차 항체를 사용하여 동일한 슬라이드 표면에서 IgG 및 IgM 반응성을 분리하는 방법을 보여줍니다. 우리는 이제 인간과 생쥐 모두의 자가항체를 측정하기 위해 이 기술을 최적화했습니다.

<table><tbody><tr><td>Ribosomal P0</td><td>Diarect</td><td>14100</td>은 PBS 인간 IgG Jackson Immuno 009-000-003<td>에서 0.2mg/</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>ml로 희석, PBS</td></tr><tr><td>인간 IgM</td><td>Jackson Immuno</td><td>009-000-012</td>에서 <td>0.2mg/ml로 희석, PBS</td></tr><tr><td>마우스 IgG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5381</td>에서 <td>0.2mg/ml로 희석, PBS 마우스 IgM Biolegend 401601</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>에서 0.2mg/ml로 희석PBS 이중 가닥 DNA에서 0.2 mg/ml로 희석</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1626</td>은 PBS 단일 가닥 DNA<td>에서 0.2 mg/ml로 희석</td></tr>, <tr><td></td><td>PBS</td><td></td> microarrayer<td>에서 0.2 mg/ml로 희석</td></tr>, <tr><td></td><td>Virtek</td><td>VersArray Chipwriter Pro</td>, <td>많은 유형의 어레이어가 적합합니다</td></tr>. <tr><td>Arrayer, Arrayit Corporation</td><td>SSP015</td><td></td><td></td></tr><tr><td>로봇 마이크로어레이 Virtek</td><td></td><td>Chipwriter Pro를 위한 소프트웨어&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FAST 슬라이드(2 패드)</td><td>GVS Northa America</td><td>10485317</td><td></td></tr><tr><td>FAST 프레임</td><td>GVS Northa America</td><td>10486001</td><td></td></tr><tr><td>FAST 인큐베이션 챔버(2 패드)</td><td>GVS Northa America</td><td>10486242</td><td></td></tr><tr><td>384웰 플레이트</td><td>Whatman</td><td>7701-5101</td><td></td></tr><tr><td>플레이트 실러</td><td>VWR</td><td>60941-062</td><td></td></tr><tr><td>호일 플레이트 커버</td><td>VWR</td><td>60941-124</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>태아 송아지 혈청</td><td>Invitrogen</td><td>12483020</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 염소 항인간 IgG</td><td>Jackson Immuno</td><td>109-165-096</td><td>50% glyercol</td></tr><tr><td>Cy5 염소 항인간 IgM</td><td>Jackson Immuno</td><td>109-175-129</td><td>사용 50% glyercol</td></tr><tr><td>Cy3 염소 안티 마우스 IgG</td><td>Jackson Immuno</td><td>115-165-071</td><td>50% glyercol</td></tr><tr><td>Cy5 염소 안티 마우스 IgM</td><td>Jackson Immuno</td><td>115-175-075</td><td>사용 작업 재고 50% glyercol</td></tr><tr><td>Microarray 스캐너</td><td>분자 장치 Molecule Devices</td><td>Axon 4200A</td><td></td></tr><tr><td>Microarray 소프트웨어</td><td>분자 장치</td><td>Genepix 6.1</td><td></td></tr><tr><td>클러스터링 소프트웨어</td><td>eisenlab.org</td><td>Cluster 3.0</td><td></td></tr><tr><td>Heatmap software</td><td>eisenlab.org</td><td>Treeview 1.60</td><td></td></tr><tr><td>Microarray 통계 소프트웨어</td><td>Stanford University</td><td>SAM 4.0 (Significance Analysis of Microarrays)</td><td></td></tr></tbody></table>

의 igg 및 igm의자가 항체의 동시 검출을위한 2 색 항원 마이크로 어레이의 생성

Generation of Two-color Antigen Microarrays for the Simultaneous Detection of IgG and IgM Autoantibodies

자가항체는 자가항원에 대항하는 항체로, 많은 질병 상태에 존재하며 질병 활성도의 표지자 역할을 할 수 있습니다. 특정 항원에 대한 자가항체 수준은 일반적으로 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 기법으로 검출됩니다. 그러나 ELISA로 여러 자가항체를 스크리닝하는 것은 시간이 많이 걸리고 많은 양의 환자 샘플이 필요할 수 있습니다. 항원 마이크로어레이 기술은 멀티플렉스 방식으로 자가항체를 스크리닝하는 데 사용할 수 있는 대체 방법입니다. 이 기술에서는 항원을 로봇 마이크로어레이어를 사용하여 특별히 코팅된 현미경 슬라이드에 배열합니다. 슬라이드는 환자 혈청 샘플로 조사된 후 형광 표지된 2차 항체를 추가하여 혈청 자가항체가 항원에 결합하는 것을 검출합니다. 자가항체 반응성은 형광 신호를 감지할 수 있는 스캐너로 슬라이드를 스캔하여 드러나고 정량화됩니다. 여기에서는 맞춤형 항원 마이크로어레이를 생성하는 방법에 대해 설명합니다. 당사의 현재 어레이는 9개의 솔리드 핀으로 인쇄되어 있으며 중복으로 발견된 최대 162개의 항원을 포함할 수 있습니다. 어레이는 microarrayer에 의해 사용되는 소스 플레이트의 항원을 변경하여 쉽게 사용자 정의 할 수 있습니다. 당사는 동일한 슬라이드 표면에서 IgG와 IgM 반응성을 구별할 수 있는 2색 2차 항체 검출 체계를 개발했습니다. 검출 시스템은 인간과 쥐 자가항체의 결합을 연구하도록 최적화되었습니다.

도 1에 나타낸 바와 같이 항원 로봇 미세 배열로 슬라이드 상에 384 웰 플레이트에 배치되어 인쇄된다. 2는 배양 챔버와 처리 후의 스캔 슬라이드 프레임에 배치 된 슬라이드를 나타낸다. (3) 양성 및 음성 대조군 슬라이드를 나타낸다. 네가티브 슬라이드은 이차 항체로 프로빙하고, 양성 대조군 슬라이드 전신성 홍 반성 루푸스 환자의 혈청으로 프로브된다. 두 별도로 표지 이차 항체를 이용하여 IgG를 및 IgM의 반응성이 동일한 슬라이드 표면에서 분리 될 수있다. (4)도 단일 가닥 DNA (ssDNA를) 및 IgG를 다양한 위에 리보솜 P (Ribo를 P)에 대한 항체에 대한 IgM의 항체의 형광 강도를 나타낸다 혈청 희석의 범위. P Ribo에 대해 알려진 반응성 전신성 홍 반성 루푸스 ...

여기에서는 인간과 생쥐의 혈청 IgG 및 IgM 자가항체를 동시에 검출하는 데 사용할 수 있는 맞춤형 항원 마이크로어레이를 생성하는 방법을 설명합니다. 이러한 어레이를 통해 관심 항원 또는 항원결정기에 대한 항체를 고처리량 및 정량적으로 검출할 수 있습니다.

의 IgG 및 IgM의자가 항체의 동시 검출을위한 2 색 항원 마이크로 어레이의 생성

Autoantibodies, which are antibodies against self-antigens, are present in many disease states and can serve as markers for disease activity. The levels ...

이 기술의 전반적인 목표는 다중 방식으로 자가항체를 신속하게 스크리닝하는 것입니다. 이 방법은 어떤 자가항체가 서로 다른 질병 상태와 상관관계가 있는지와 같이 자가면역 분야의 핵심 질문들을 규명하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 자가항체를 병렬 방식으로 스크리닝할 수 있고, 단 몇 µL의 혈청과 몇 µg의 항원만으로도 가능하다는 점입니다.항원 마이크로어레이를 제작하려면, 우선 항원을 PBS로 희석하여 최종 농도를 2 mg/mL로 맞춥니다. 최대 162종의 고유 항원을 중복으로 프린팅할 수 있도록 9개의 핀으로 마이크로 어레이어 설정을 구성합니다. 양성 대조군으로 IgG 및 IgM 항원을 항원 라이브러리에 포함시키십시오.음성 대조군으로는 PBS만 포함하십시오. 프린트 헤드의 설정과 동일한 그룹으로 각 항원 20 µL를 384웰 소스 플레이트에 첨가하십시오. 소스 플레이트를 호일로 덮고, 어레이를 프린트할 때까지 -80 °C에서 냉동 보관하십시오.탈이온수를 채운 초음파 세척기에서 1분씩 3회 인큐베이션하여 고체 마이크로어레이 핀을 세척하십시오. 핀을 랙에 꽂아 건조시킵니다. 그 다음 핀을 마이크로어레이 프린트 헤드에 배치하십시오.9개의 핀을 사용하는 경우, 3x3 구성으로 배치하십시오. 다음으로, 프린트 헤드의 핀 수, 프린트할 슬라이드 수, 각 슬라이드의 패드 수, 그리고 각 항원당 반복 스폿 수를 설정하여 마이크로어레이어의 프린트 실행을 프로그래밍하십시오. 또한, 서로 다른 항원 그룹 사이에서 핀을 물로 초음파 세척하도록 마이크로어레이어를 프로그래밍하십시오.다음으로, 소스 플레이트를 해동한 후 100 ×g에서 1분 동안 원심분리합니다. 소스 플레이트를 마이크로어레이어의 지정된 위치에 배치한 다음, 인쇄할 첫 번째 항원 그룹을 덮고 있는 호일 부분을 제거합니다. 인쇄되지 않은 슬라이드를 어레이어 표면에 배열하고 인쇄 프로그램을 실행합니다. 습도를 55~60%로 설정한 어레이어에서 실온으로 슬라이드를 인쇄합니다. 각 항원 그룹이 모든 슬라이드에 인쇄되면 마이크로어레이어를 일시 중지합니다.방금 프린팅한 항원들이 증발하지 않도록 호일로 덮고, 다음에 프린팅할 항원 그룹의 덮개를 엽니다. 그런 다음, 프린팅 프로그램을 계속 진행합니다. 모든 항원의 프린팅이 완료되면 소스 플레이트를 새 호일로 덮어 -80 °C에서 냉동 보관합니다.인쇄된 슬라이드를 슬라이드 박스에 넣고 진공 밀봉합니다. 슬라이드는 다음 날 또는 최대 한 달 후에 사용할 수 있습니다. 배양 챔버를 사용하여 희석된 혈청으로 마이크로어레이를 탐침하려면 슬라이드를 프레임에 배치하십시오.그런 다음 각 어레이 표면에 700 µL의 블로킹 버퍼를 추가합니다. 프레임 위에 접착 필름을 덮고 젖은 티슈와 함께 밀폐 용기에 옮깁니다. 그 후, 슬라이드를 4 °C의 로커 위에서 하룻밤 동안 배양합니다.다음 날, 혈청 샘플을 블로킹 버퍼로 1:100 비율로 희석합니다. 그 다음, 어레이에서 블로킹 용액을 흡입하여 제거하고, 희석된 샘플 500 µL를 각 어레이 표면에 첨가합니다. 이어서 어레이를 접착 필름으로 덮고, 4 °C에서 1시간 동안 로킹하며 배양합니다.그런 다음, 어레이에서 혈청 샘플을 흡입하여 제거하고, 린스 버퍼를 슬라이드 위에 붓고 빠르게 털어내는 방식으로 어레이 표면을 4회 세척합니다. 700 µL의 블로킹 버퍼를 사용하여 각 어레이 표면을 세척하고, 실온에서 10분 동안 로킹하며 인큐베이션합니다. 그다음, 희석된 2차 항체 500 µL를 각 슬라이드 표면에 첨가하고 점착 필름으로 덮어줍니다.슬라이드를 4 °C에서 45분 동안 로킹하며 배양합니다. 배양이 끝나면, 앞서 시연한 것과 같이 슬라이드에서 2차 항체 혼합액을 흡입하여 제거하고 4회 헹굽니다. 그다음, 700 µL의 블로킹 희석 버퍼로 슬라이드를 10분씩 3회 세척합니다.프레임에서 슬라이드를 제거한 후, 금속 슬라이드 랙에 놓고 PBS에 담급니다. 상온에서 오비탈 쉐이킹을 하며 20분 동안 배양합니다. 슬라이드 랙을 탈이온수가 담긴 용기에 15초 동안 넣습니다.그 다음 랙을 새로운 증류수 용기에 넣고 15초 동안 더 배양합니다. 슬라이드를 건조시키려면, 슬라이드 랙을 원심분리기의 ELISA 플레이트 어댑터에 놓고 실온에서 220 ×g로 5분간 원심분리합니다. 스캔 준비가 될 때까지 슬라이드를 차광 상자에 보관하십시오.슬라이드를 스캔하려면 Cy3 및 Cy5 형광 신호를 검출할 수 있는 마이크로어레이 스캐너를 사용하십시오. 2차 항체로만 프로빙한 전체 항원 라이브러리 슬라이드를 사전 스캔하여 최적의 배율 튜브 또는 PMT 설정을 결정하십시오. 하드웨어 버튼을 눌러 Cy3 채널의 인간 IgG 피처와 Cy5 채널의 인간 IgM 피처가 유사한 배경 감산 중앙 형광 강도(MFIB, 일반적으로 40,000)를 갖도록 PMT 값을 설정하십시오.다음으로, 스캔 버튼을 눌러 두 채널에서 실험 슬라이드를 스캔합니다. 각 스캔 후 두 채널의 슬라이드 이미지를 저장합니다. 파일 버튼을 사용하여 분석할 슬라이드를 마이크로어레이 소프트웨어로 불러옵니다.그런 다음, 파일 버튼을 사용하여 어레이 레이아웃과 어레이 특징들의 식별 정보가 포함된 유전자 어레이 리스트(gene array list) 또는 GAL 파일을 로드합니다. 스캔된 이미지 위에 어레이 템플릿을 배치하여 어레이 특징들이 템플릿과 최대한 일치하도록 합니다. 정렬 버튼을 눌러 모든 블록의 특징들을 템플릿에 맞게 정렬합니다.그 후 소프트웨어는 각 항원에 대해 배경값을 뺀 MFI를 계산합니다. 마지막으로, 파일 버튼을 사용하여 결과를 텍스트 파일로 내보내고, 텍스트 프로토콜에 따라 데이터를 분석하십시오. 양성 및 음성 대조군 슬라이드를 보여주는 이 그림에서, 음성 슬라이드는 2차 항체로만 프로빙되었으며, 양성 대조군 슬라이드는 전신성 홍반성 루푸스 환자의 혈청으로 프로빙되었습니다.여기에 표시된 바와 같이, riboP에 대한 반응성이 확인된 양성 대조군 혈청은 단일 가닥 DNA에 대한 IgM 항체와 riboP에 대한 IgG 항체를 가지고 있는 것으로 나타납니다. 모든 혈청 희석 배수에서 IgM의 선형 반응이 관찰되었으며, IgG의 경우 배경값을 뺀 MFI가 약 30,000일 때까지 선형 반응이 관찰되었습니다. 본 실험에서는 IgG에 대한 IgM 항체인 류마티스 인자가 확인된 한 한랭글로불린혈증성 혈관염 환자의 인간 혈청을 사용하여 어레이를 분석합니다.환자 혈청 내의 IgM이 어레이에 고정된 IgG에 결합하였기 때문에 IgG 특성이 황록색으로 나타납니다. 2차 항체만을 사용했을 때는 어레이에 점적된 IgG에 대해 IgM 반응성이 나타나지 않습니다. 여기에 표시된 바와 같이, 어레이에 점적된 마우스 IgM과 IgG는 각각 IgM 및 IgG에 대한 항-마우스 2차 항체로만 검출됩니다.이 그림은 마이크로어레이 분석 소프트웨어를 사용하여 스캔된 어레이 이미지 위에 템플릿 그리드를 정렬한 모습을 보여줍니다. 정렬이 완료되면, 각 피처의 배경값을 뺀 중앙값 형광 강도를 얻기 위해 어레이 피처를 분석할 수 있습니다. 숙련된 경우, 적절한 절차를 따르면 항원 마이크로어레이의 프로빙을 4시간 이내에 완료할 수 있습니다.이 절차 이후에는 항원 마이크로어레이에서 얻은 결과를 검증하기 위해 ELISA와 같은 다른 기술을 수행할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 항원 마이크로어레이를 프린팅하는 방법, 혈청으로 항원 마이크로어레이를 프로빙하는 방법, 그리고 스캐너로 항원 마이크로어레이를 스캔하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 인간 혈청을 다루는 것은 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안 표준 예방 조치를 준수해야 함을 잊지 마십시오.

generation-two-color-antigen-microarrays-for-simultaneous-detection

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 동영상은 서로 다른 항원과 결합된 형광 자기 구슬 또는 마이크로스피어를 사용하여 혈청 샘플에서 다양한 항체 동형을 동시에 검출하는 면역분석 기술에 대해 설명합니다. 이 분석은 감염 중 또는 백신 접종 후 혈청전환을 이해하는 데 도움이 됩니다.

Multianalyte Immunobead Assay: 인간 혈청 샘플에서 여러 항체 아형을 동시에 검출하기 위한 흐름 기반 면역분석 기법

이 비디오에서는 인플루엔자 바이러스 균주의 항원 아형이 인쇄된 마이크로어레이 슬라이드를 사용하여 여러 인간 혈청 샘플에서 항체 동형을 검출하는 프로세스를 보여줍니다.

바이러스 항원에 대한 혈청 내 항체 동형을 검출하기 위한 바이러스 항원 마이크로어레이 분석

이 동영상은 마우스 혈청에서 순환하는 항글라이칸 항체를 분석하기 위한 인쇄된 글라이칸 어레이 기술을 보여줍니다. 혈청의 항체는 칩의 특정 글라이칸과 상호 작용하며, 이는 면역 염색 후 형광 스캔으로 확인됩니다.

Printed Glycan Array를 사용한 순환 항글라이칸 항체 검출

이 비디오는 교차 반응성이 없는 멀티플렉스 샌드위치 면역 분석을 위한 스냅 칩 기술의 구현을 보여줍니다. 각각 다른 시약을 포함하는 두 개의 마이크로어레이 슬라이드를 스냅하는 간단한 동작으로 교차 오염 없이 시약 전달을 보장하고 샌드위치 면역 분석을 사용하여 여러 단백질을 검출하는 데 도움이 됩니다.

Cross-Reactivity-Free Multiplexed Sandwich 면역분석을 위한 Snap Chip 기술

두 슬라이드를 간단 하 게 스냅 하 여 교차 reactivity 무료 다중화 샌드위치 immunoassays를 수행 하기 위한 스냅 칩 기술을 설명 합니다. 스냅 기구 시 약 microarray microarray에서 안정적으로 전송 하는 데 사용 됩니다. 어떤 생 화 확 적인 반응을 교차 오염 없이 다른 시 약의 colocalization를 요구에 대 한 스냅 칩을 사용할 수 있습니다.

교차 reactivity 무료 및 정찰 병 무료 스냅 칩 샌드위치 Immunoassays 다중화

여기, 우리는 인간의 섬 자가 electrochemiluminescence (ECL) 분석 실험을 사용 하 여 검색 하는 방법을 제시. 타입 1 당뇨병을 예측 하는 데 사용 되는 프로토콜 자가 다른 자가 면역 질환에 대 한 검색에 따라 확장할 수 있습니다.

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우리는 다른 바이러스 긴장에서 250개 이상의 항원에 대하여 다중 항체 이소타입을 위한 혈청을 동시에 조사하기 위하여 니트로셀룰로오스 코팅된 슬라이드에 인플루엔자 항원을 인쇄해서 건설된 단백질 마이크로어레이를 이용하기 위한 프로토콜을 제시합니다, 이렇게 바이러스 특수형에 걸쳐 혈청 항체의 폭의 측정을 허용.

바이러스 특수형에 걸쳐 혈청 항체의 폭을 측정하기 위해 인플루엔자 항원 마이크로어레이의 사용

7개의 자가항체 분석을 함께 결합하는 간단한 멀티플렉스 ECL 분석을 모델링합니다. 이 분석은 체강 질병,자가 면역 갑상선 질환 및자가 면역 다선 증후군 1을 포함하여 T1D 및 여러 다른자가 면역 질환을 동시에 스크리닝 할 수 있습니다.

고처리량 전기화학발광 7-Plex 분석으로 제1형 당뇨병 및 다발성 자가면역질환 동시 스크리닝

2리포터 판독값을 제공하는 비드계 멀티플렉스 분석분석을 위한 유량 분석 시스템은 SARS-CoV-2에 대한 중화 IgG 및 IgM 항체를 동시에 측정할 수 있는 멀티플렉스 세론및 항체 중화 분석분석의 개발에 사용되었다.

멀티플렉스 비드 기반 유량 분석 시스템을 위한 신속한 멀티플렉스 듀얼 리포터 IgG 및 IgM SARS-CoV-2 중화 분석

유럽과 북미에서 라임 보렐리아증을 유발하는 다양한 보렐리아 종의 여러 항원에 대해 유도된 IgG 및 IgM에 대한 혈청 샘플을 동시에 평가하는 비드 기반 다중 면역분석을 개발하기 위해 3채널 이중 리포터 형광 흐름 분석 시스템을 사용했습니다.

다중 혈청학적 검사에서 다양한 항체 등급의 동시 검출

학습하세요 항원 마이크로어레이를 이용한 IgG 및 IgM 자가항체의 동시 검출 방법을. 소량의 혈청으로 고효율 자가면역 질환 바이오마커 스크리닝이 가능합니다.

의 IgG 및 IgM의자가 항체의 동시 검출을위한 2 색 항원 마이크로 어레이의 생성

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