의 IgG 및 IgM의자가 항체의 동시 검출을위한 2 색 항원 마이크로 어레이의 생성

이 기술의 전반적인 목표는 다중 방식으로 자가항체를 신속하게 스크리닝하는 것입니다. 이 방법은 어떤 자가항체가 서로 다른 질병 상태와 상관관계가 있는지와 같이 자가면역 분야의 핵심 질문들을 규명하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 자가항체를 병렬 방식으로 스크리닝할 수 있고, 단 몇 µL의 혈청과 몇 µg의 항원만으로도 가능하다는 점입니다.

항원 마이크로어레이를 제작하려면, 우선 항원을 PBS로 희석하여 최종 농도를 2 mg/mL로 맞춥니다. 최대 162종의 고유 항원을 중복으로 프린팅할 수 있도록 9개의 핀으로 마이크로 어레이어 설정을 구성합니다. 양성 대조군으로 IgG 및 IgM 항원을 항원 라이브러리에 포함시키십시오.

음성 대조군으로는 PBS만 포함하십시오. 프린트 헤드의 설정과 동일한 그룹으로 각 항원 20 µL를 384웰 소스 플레이트에 첨가하십시오. 소스 플레이트를 호일로 덮고, 어레이를 프린트할 때까지 -80 °C에서 냉동 보관하십시오.

탈이온수를 채운 초음파 세척기에서 1분씩 3회 인큐베이션하여 고체 마이크로어레이 핀을 세척하십시오. 핀을 랙에 꽂아 건조시킵니다. 그 다음 핀을 마이크로어레이 프린트 헤드에 배치하십시오.

9개의 핀을 사용하는 경우, 3x3 구성으로 배치하십시오. 다음으로, 프린트 헤드의 핀 수, 프린트할 슬라이드 수, 각 슬라이드의 패드 수, 그리고 각 항원당 반복 스폿 수를 설정하여 마이크로어레이어의 프린트 실행을 프로그래밍하십시오. 또한, 서로 다른 항원 그룹 사이에서 핀을 물로 초음파 세척하도록 마이크로어레이어를 프로그래밍하십시오.

다음으로, 소스 플레이트를 해동한 후 100 ×g에서 1분 동안 원심분리합니다. 소스 플레이트를 마이크로어레이어의 지정된 위치에 배치한 다음, 인쇄할 첫 번째 항원 그룹을 덮고 있는 호일 부분을 제거합니다. 인쇄되지 않은 슬라이드를 어레이어 표면에 배열하고 인쇄 프로그램을 실행합니다. 습도를 55~60%로 설정한 어레이어에서 실온으로 슬라이드를 인쇄합니다. 각 항원 그룹이 모든 슬라이드에 인쇄되면 마이크로어레이어를 일시 중지합니다.

방금 프린팅한 항원들이 증발하지 않도록 호일로 덮고, 다음에 프린팅할 항원 그룹의 덮개를 엽니다. 그런 다음, 프린팅 프로그램을 계속 진행합니다. 모든 항원의 프린팅이 완료되면 소스 플레이트를 새 호일로 덮어 -80 °C에서 냉동 보관합니다.

인쇄된 슬라이드를 슬라이드 박스에 넣고 진공 밀봉합니다. 슬라이드는 다음 날 또는 최대 한 달 후에 사용할 수 있습니다. 배양 챔버를 사용하여 희석된 혈청으로 마이크로어레이를 탐침하려면 슬라이드를 프레임에 배치하십시오.

그런 다음 각 어레이 표면에 700 µL의 블로킹 버퍼를 추가합니다. 프레임 위에 접착 필름을 덮고 젖은 티슈와 함께 밀폐 용기에 옮깁니다. 그 후, 슬라이드를 4 °C의 로커 위에서 하룻밤 동안 배양합니다.

다음 날, 혈청 샘플을 블로킹 버퍼로 1:100 비율로 희석합니다. 그 다음, 어레이에서 블로킹 용액을 흡입하여 제거하고, 희석된 샘플 500 µL를 각 어레이 표면에 첨가합니다. 이어서 어레이를 접착 필름으로 덮고, 4 °C에서 1시간 동안 로킹하며 배양합니다.

그런 다음, 어레이에서 혈청 샘플을 흡입하여 제거하고, 린스 버퍼를 슬라이드 위에 붓고 빠르게 털어내는 방식으로 어레이 표면을 4회 세척합니다. 700 µL의 블로킹 버퍼를 사용하여 각 어레이 표면을 세척하고, 실온에서 10분 동안 로킹하며 인큐베이션합니다. 그다음, 희석된 2차 항체 500 µL를 각 슬라이드 표면에 첨가하고 점착 필름으로 덮어줍니다.

슬라이드를 4 °C에서 45분 동안 로킹하며 배양합니다. 배양이 끝나면, 앞서 시연한 것과 같이 슬라이드에서 2차 항체 혼합액을 흡입하여 제거하고 4회 헹굽니다. 그다음, 700 µL의 블로킹 희석 버퍼로 슬라이드를 10분씩 3회 세척합니다.

프레임에서 슬라이드를 제거한 후, 금속 슬라이드 랙에 놓고 PBS에 담급니다. 상온에서 오비탈 쉐이킹을 하며 20분 동안 배양합니다. 슬라이드 랙을 탈이온수가 담긴 용기에 15초 동안 넣습니다.

그 다음 랙을 새로운 증류수 용기에 넣고 15초 동안 더 배양합니다. 슬라이드를 건조시키려면, 슬라이드 랙을 원심분리기의 ELISA 플레이트 어댑터에 놓고 실온에서 220 ×g로 5분간 원심분리합니다. 스캔 준비가 될 때까지 슬라이드를 차광 상자에 보관하십시오.

슬라이드를 스캔하려면 Cy3 및 Cy5 형광 신호를 검출할 수 있는 마이크로어레이 스캐너를 사용하십시오. 2차 항체로만 프로빙한 전체 항원 라이브러리 슬라이드를 사전 스캔하여 최적의 배율 튜브 또는 PMT 설정을 결정하십시오. 하드웨어 버튼을 눌러 Cy3 채널의 인간 IgG 피처와 Cy5 채널의 인간 IgM 피처가 유사한 배경 감산 중앙 형광 강도(MFIB, 일반적으로 40,000)를 갖도록 PMT 값을 설정하십시오.

다음으로, 스캔 버튼을 눌러 두 채널에서 실험 슬라이드를 스캔합니다. 각 스캔 후 두 채널의 슬라이드 이미지를 저장합니다. 파일 버튼을 사용하여 분석할 슬라이드를 마이크로어레이 소프트웨어로 불러옵니다.

그런 다음, 파일 버튼을 사용하여 어레이 레이아웃과 어레이 특징들의 식별 정보가 포함된 유전자 어레이 리스트(gene array list) 또는 GAL 파일을 로드합니다. 스캔된 이미지 위에 어레이 템플릿을 배치하여 어레이 특징들이 템플릿과 최대한 일치하도록 합니다. 정렬 버튼을 눌러 모든 블록의 특징들을 템플릿에 맞게 정렬합니다.

그 후 소프트웨어는 각 항원에 대해 배경값을 뺀 MFI를 계산합니다. 마지막으로, 파일 버튼을 사용하여 결과를 텍스트 파일로 내보내고, 텍스트 프로토콜에 따라 데이터를 분석하십시오. 양성 및 음성 대조군 슬라이드를 보여주는 이 그림에서, 음성 슬라이드는 2차 항체로만 프로빙되었으며, 양성 대조군 슬라이드는 전신성 홍반성 루푸스 환자의 혈청으로 프로빙되었습니다.

여기에 표시된 바와 같이, riboP에 대한 반응성이 확인된 양성 대조군 혈청은 단일 가닥 DNA에 대한 IgM 항체와 riboP에 대한 IgG 항체를 가지고 있는 것으로 나타납니다. 모든 혈청 희석 배수에서 IgM의 선형 반응이 관찰되었으며, IgG의 경우 배경값을 뺀 MFI가 약 30,000일 때까지 선형 반응이 관찰되었습니다. 본 실험에서는 IgG에 대한 IgM 항체인 류마티스 인자가 확인된 한 한랭글로불린혈증성 혈관염 환자의 인간 혈청을 사용하여 어레이를 분석합니다.

환자 혈청 내의 IgM이 어레이에 고정된 IgG에 결합하였기 때문에 IgG 특성이 황록색으로 나타납니다. 2차 항체만을 사용했을 때는 어레이에 점적된 IgG에 대해 IgM 반응성이 나타나지 않습니다. 여기에 표시된 바와 같이, 어레이에 점적된 마우스 IgM과 IgG는 각각 IgM 및 IgG에 대한 항-마우스 2차 항체로만 검출됩니다.

이 그림은 마이크로어레이 분석 소프트웨어를 사용하여 스캔된 어레이 이미지 위에 템플릿 그리드를 정렬한 모습을 보여줍니다. 정렬이 완료되면, 각 피처의 배경값을 뺀 중앙값 형광 강도를 얻기 위해 어레이 피처를 분석할 수 있습니다. 숙련된 경우, 적절한 절차를 따르면 항원 마이크로어레이의 프로빙을 4시간 이내에 완료할 수 있습니다.

이 절차 이후에는 항원 마이크로어레이에서 얻은 결과를 검증하기 위해 ELISA와 같은 다른 기술을 수행할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 항원 마이크로어레이를 프린팅하는 방법, 혈청으로 항원 마이크로어레이를 프로빙하는 방법, 그리고 스캐너로 항원 마이크로어레이를 스캔하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 인간 혈청을 다루는 것은 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안 표준 예방 조치를 준수해야 함을 잊지 마십시오.