의 IgG 및 IgM의자가 항체의 동시 검출을위한 2 색 항원 마이크로 어레이의 생성

여기에서는 인간과 생쥐의 혈청 IgG 및 IgM 자가항체를 동시에 검출하는 데 사용할 수 있는 맞춤형 항원 마이크로어레이를 생성하는 방법을 설명합니다. 이러한 어레이를 통해 관심 항원 또는 항원결정기에 대한 항체를 고처리량 및 정량적으로 검출할 수 있습니다.

이 기술의 전반적인 목표는 멀티플렉스 방식으로 자가항체를 신속하게 스크리닝하는 것입니다. 이 방법은 어떤 자가항체가 다른 질병 상태와 상관관계가 있는지와 같은 자가면역 분야의 핵심 질문을 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 자가항체를 병렬 방식으로 스크리닝할 수 있고, 마이크로리터의 혈청만 필요하며, 마이크로그램의 항원만 필요하다는 것입니다.

항원 마이크로어레이를 생성하려면 PBS의 항원을 밀리리터당 2밀리그램의 최종 농도로 희석하는 것으로 시작합니다. 9개의 핀이 있는 마이크로 어레이어 구성을 설정하여 최대 162개의 고유 항원을 복제하여 인쇄할 수 있습니다. 항원 라이브러리에 IgG 및 IgM 항원을 양성 대조군으로 포함합니다.

PBS는 음수 대조군으로만 포함합니다. 각 항원 20마이크로리터를 프린트 헤드의 설정을 반영하는 그룹으로 384웰 소스 플레이트에 추가합니다. 호일을 사용하여 소스 플레이트를 덮고 어레이를 인쇄할 준비가 될 때까지 플레이트를 섭씨 영하 80도에서 동결합니다.

고체 마이크로어레이 핀을 탈이온수를 탄 초음파 처리 수조에서 각각 1분씩 3회 배양하여 청소합니다. 핀을 랙에 넣어 말리십시오. 그런 다음 마이크로어레이 프린트 헤드에 핀을 정렬합니다.

9개의 핀의 경우 3x3 구성을 사용합니다. 다음으로, 프린트 헤드에 핀의 수, 인쇄할 슬라이드의 수, 각 슬라이드의 패드 수 및 각 항원에 대한 복제 지점의 수를 설정하여 인쇄 실행을 위한 마이크로어레이어를 프로그래밍합니다. 또한 마이크로어레이를 프로그래밍하여 서로 다른 항원 그룹 사이의 물 속의 핀을 초음파 처리합니다.

다음으로, 근원 판을 녹인 후에, 100배 G.Place에 1개 분 동안 그것을 분리기 microarrayer에 있는 지정된 장소에 있는 근원 판, 그 후에 인쇄될 항원의 첫번째 그룹을 덮고 있는 호일의 단면도를 제거하십시오. 인쇄되지 않은 슬라이드를 어레이어 표면에 정렬하고 인쇄 프로그램을 실행합니다. 55에서 60%에 arrayer에 놓인 습도를 가진 실내 온도에 활주를 인쇄하십시오항원의 각 그룹이 모든 활주에 인쇄된 후에, microarrayer를 일시정지하십시오.

방금 인쇄된 항원을 증발을 방지하기 위해 호일로 덮고 인쇄할 다음 항원 그룹을 밝힙니다. 그런 다음 인쇄 프로그램을 계속합니다. 모든 항원을 인쇄한 후 소스 플레이트를 새 호일 조각으로 덮고 섭씨 영하 80도에서 얼립니다.

인쇄된 슬라이드를 슬라이드 상자에 넣고 진공 밀봉합니다. 슬라이드는 다음날 또는 최대 한 달 후에 사용할 수 있습니다. 배양 챔버를 사용하여 희석된 혈청이 있는 마이크로어레이를 프로브하려면 슬라이드를 프레임에 배치합니다.

그런 다음 각 어레이 표면에 700마이크로리터의 차단 버퍼를 추가합니다. 프레임 위에 접착 필름을 놓고 젖은 티슈 조각과 함께 밀봉된 용기에 옮깁니다. 그런 다음 하룻밤 동안 로커에서 섭씨 4도의 슬라이드를 배양합니다.

다음 날, 혈청 샘플을 차단 버퍼에서 1에서 100까지 희석합니다. 그런 다음 어레이에서 차단 용액을 흡인하고 각 어레이 표면에 500마이크로리터의 희석된 샘플을 추가합니다. 다음으로, 어레이를 접착 필름으로 덮고 섭씨 4도에서 1시간 동안 흔들면서 배양합니다.

그런 다음 어레이에서 혈청 샘플을 흡인하고 헹굼 버퍼를 사용하여 버퍼를 슬라이드에 붓고 빠르게 튕겨내어 어레이 표면을 4번 헹굽니다.700마이크로리터의 블로킹 버퍼를 사용하여 각 어레이 표면을 세척하고 실온에서 흔들림과 함께 10분 동안 배양합니다. 그런 다음 각 슬라이드 표면에 500마이크로리터의 희석된 2차 항체를 추가하고 접착 필름으로 덮습니다.

섭씨 4도에서 45분 동안 흔들면서 슬라이드를 배양합니다. 배양 후, 슬라이드에서 2차 항체 혼합물을 흡인하고 방금 설명한 것처럼 4번 헹굽니다. 그런 다음 700마이크로리터의 차단 희석 완충액으로 슬라이드를 각각 10분씩 3회 세척합니다.

프레임에서 슬라이드를 제거한 다음 금속 슬라이드 랙에 놓고 PBS에 담그십시오. 실온에서 안와 쉐이킹으로 20분 동안 배양합니다. 슬라이드 랙을 탈이온수 용기에 15초 동안 놓습니다.

그런 다음 랙을 새 물통에 넣고 15초 더 배양합니다. 슬라이드를 건조시키려면 슬라이드 랙을 원심분리기의 ELISA 플레이트 어댑터에 놓고 220배 G와 실온에서 5분 동안 회전합니다. 스캔할 준비가 될 때까지 슬라이드를 가볍고 밀폐된 상자에 넣습니다.

슬라이드를 스캔하려면 SI 3 및 SI 5 형광 신호를 감지할 수 있는 마이크로어레이 스캐너를 사용하십시오. 2차 항체로만 조사된 전체 항원 라이브러리 슬라이드를 사전 스캔하여 최적의 승수 튜브 또는 PMT 설정을 결정합니다. SI 3 채널의 human IgG feature와 SI 5 channel의 human IGM feature가 일반적으로 40, 000인 배경(MFIB)을 뺀 유사한 중앙값 형광 강도를 갖도록 하드웨어 버튼을 눌러 사용되는 PMT 값을 설정합니다.

다음으로, 스캔 버튼을 눌러 두 채널에서 실험 슬라이드를 스캔합니다. 각 스캔 후 두 채널 모두에 슬라이드 이미지를 저장합니다. 파일 버튼을 사용하여 분석할 슬라이드를 마이크로어레이 소프트웨어에 로드합니다.

그런 다음 파일 버튼을 사용하여 유전자 배열 목록 또는 배열의 레이아웃이 있는 GAL 파일을 배열 기능의 ID와 함께 로드합니다. 스캔한 이미지 위에 배열 템플릿을 배치하여 배열 기능이 템플릿과 최대한 가깝게 일치하도록 합니다. align 버튼을 눌러 모든 블록의 피처를 템플릿에 정렬합니다.

그런 다음 소프트웨어는 각 항원에 대한 MFI에서 배경을 뺀 값을 계산합니다. 마지막으로 파일 버튼을 사용하여 결과를 텍스트 파일로 내보내고 텍스트 프로토콜에 따라 데이터를 분석합니다. 양성 및 음성 대조군 슬라이드를 보여주는 이 그림에서 음성 슬라이드는 2차 항체로만 프로브하고 양성 대조군 슬라이드는 전신성 홍반성 루푸스 환자의 혈청으로 프로브합니다.

여기에 나타난 바와 같이, 리보P에 대한 반응성이 알려진 양성 대조 혈청은 단일 가닥 DNA에 대한 IgM 항체 및 리보P에 대한 IgG 항체를 가지고 있는 것으로 나타났습니다. 선형 반응은 모든 혈청 희석액에 걸쳐 IgM으로, 그리고 약 30, 000의 MFI에서 백그라운드를 뺀 IgG로 관찰되었습니다. 이 실험에서는 IgG에 대한 IgM 항체인 문서화된 류마티스 인자와 함께 냉동 글로불린혈증 혈관염 환자의 인간 혈청으로 어레이를 조사합니다.

IgG 특징은 환자의 혈청에 있는 IgM이 어레이의 고정된 IgG에 결합하기 때문에 황록색입니다. 2차 항체만 사용하면 어레이에서 발견된 IgG에 대한 IgM 반응성이 나타나지 않습니다. 여기에서 볼 수 있듯이, 어레이에 발견된 마우스 IgM 및 IgG는 각각 IgM 및 IgG에 대한 항마우스 2차 항체에서만 검출됩니다.

이 그림은 마이크로어레이 분석 소프트웨어를 사용하여 스캔된 어레이 이미지에서 템플릿 그리드의 정렬을 보여줍니다. 정렬이 완료되면 어레이 기능을 분석하여 각 기능에 대한 배경을 뺀 중앙값 형광 강도를 얻을 수 있습니다. 일단 마스터하면 항원 마이크로어레이의 프로빙이 제대로 수행되면 4시간 안에 완료할 수 있습니다.

이 절차에 따라, ELISA와 같은 다른 기술은 항원 마이크로어레이로부터 얻어진 결과를 검증하기 위해 수행될 수 있다. 이 비디오를 시청한 후에는 항원 마이크로어레이를 인쇄하는 방법, 혈청으로 항원 마이크로어레이를 프로브하는 방법, 스캐너로 항원 마이크로어레이를 스캔하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 인간 혈청으로 작업하는 것은 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 보편적인 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.